Αφηρημένο

Ιστορικό και Στόχοι

Σποραδικές καρκίνου του παχέος εντέρου (CRC) ανάπτυξη είναι μια διαδοχική διαδικασία δείχνει την ηλικία-εξάρτηση, ανεξέλεγκτη επιθηλιακά πολλαπλασιασμό και μειωμένη απόπτωση. Κατά τη διάρκεια της νεανικής ανάπτυξης κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την απόπτωση είναι καλά ισορροπημένη, η οποία μπορεί να διαταραχθεί κατά τη γήρανση. Ο στόχος μας ήταν να συσχετίσει πολλαπλασιαστικών και αποπτωτικών δραστηριότητες σε γήρανση ανθρώπινο κολονικό επιθήλιο και του παχέος εντέρου. Δοκιμάσαμε επίσης την υποκείμενη μοριακής βιολογίας σχετικά με την proliferation- και αλλαγές της γονιδιακής έκφρασης απόπτωση-ρύθμιση.

Υλικά και Μέθοδοι

παχέος βιοψίες από υγιή παιδιά (n

1 = 14), υγιή ενήλικες (n

2 = 10), ενήλικος αδενώματα (n

3 = 10) και CRCs (n

4 = 10) σε ενήλικες ελέγχθηκαν για Ki-67 ανοσοϊστοχημεία και δοκιμασία απόπτωσης TUNEL. Mitosis- και γονιδιακή έκφραση απόπτωση σχετίζεται μελετήθηκε επίσης σε υγιή παιδιά (n

1 = 6), των ενηλίκων (n

2 = 41) δείγματα και σε CRC (n

3 = 34) σε HGU133plus2. 0 πλατφόρμα μικροσυστοιχιών. Μετρημένες μεταβολές επιβεβαιώθηκαν με RT-PCR τόσο στα εξαρτώμενα και ανεξάρτητα σύνολα δείγματος (n

1 = 6, n

2 = 6, n

3 = 6).

Αποτελέσματα

μιτωτικό δείκτη (ΜΙ) ήταν σημαντικά υψηλότερη (p & lt? 0,05) σε άθικτα ανηλίκων (MI = 0,33 ± 0,06) και τα δείγματα CRC (MI = 0.42 ± 0.10) σε σύγκριση με υγιή ενήλικα δείγματα (MI = 0,15 ± 0,06). Αντίθετα, αποπτωτικό δείκτη (ΑΙ) ήταν μειωμένη σε παιδιά (0,13 ± 0,06) και σημαντικά χαμηλότερο σε καρκίνο (0,06 ± 0,03) σε σύγκριση με υγιή ενήλικα δείγματα (0,17 ± 0,05). Οκτώ proliferation- (π.χ. MKI67, CCNE1) και 11 απόπτωση που σχετίζονται με τα γονίδια (π.χ. TNFSF10, IFI6) είχε μεταβληθεί η έκφραση του mRNA τόσο κατά τη διάρκεια της φυσιολογικής γήρανσης και την καρκινογένεση, προκαλώντας κυρίως τον πολλαπλασιασμό και τη μείωση της απόπτωσης σε σύγκριση με τους υγιείς ενήλικες. Οκτώ γονίδια πολλαπλασιασμό που σχετίζεται συμπεριλαμβανομένων CCND1, CDK1, CDK6 και 26 απόπτωση ρυθμίζει γονίδια (π.χ. SOCS3) έχουν διαφορετικά εκφράζεται μεταξύ ανηλίκων και του καρκίνου ομάδες κυρίως την υποστήριξη της έντονη ανάπτυξη των κυττάρων σε CRC.

Συμπέρασμα

δείγματα παχέος από παιδιά και οι ασθενείς CRC μπορεί να χαρακτηρίζεται από ομοίως αυξημένη πολλαπλασιαστική και μειωμένη αποπτωτική δραστηριότητα σε σύγκριση με υγιείς κολονικής δείγματα από ενήλικες. Ως εκ τούτου, η κυτταρική κινητική μεταβολές κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του καρκίνου του παχέος δείχνουν ανεξέλεγκτη ξανάνιωμα, σε αντίθεση με την ελεγχόμενη κυτταρική ανάπτυξη σε νεαρά κολονικό επιθήλιο

Παράθεση:. Leiszter K, Galamb O, Sipos F, Krenács Τ, Veres G, Wichmann Β, et al. (2013) Σποραδικές παχέος την ανάπτυξη του καρκίνου Δείχνει ξανάνιωμα Αναφορικά Τα επιθηλιακά πολλαπλασιασμό και την απόπτωση. PLoS ONE 8 (10): e74140. doi: 10.1371 /journal.pone.0074140

Συντάκτης: Μινγκ Tat Λινγκ, Queensland University of Technology, Αυστραλία

Ελήφθη: 19 Μάρτη του 2013? Αποδεκτές: 29 του Ιούλη, 2013? Δημοσιεύθηκε: 3 Οκτ 2013

Copyright: © 2013 Leiszter et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από την ουγγρική επιστημονική Ταμείου Έρευνας (Országos Tudományos Kutatási Alapprogram /OTKA-Κ /) 105530. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου.

ανταγωνιστικά συμφέροντα: Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η κανονική ανανέωση των κυττάρων του υγιούς παχέος επιθηλίου διαρκεί περίπου 5 ημέρες, μέσα από τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, τη διαφοροποίηση και την απόπτωση.. Η θέση των διαφόρων τύπων επιθηλιακών κυττάρων στις κρύπτες είναι πολύ χαρακτηριστική. Τα πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα ως επί το πλείστον κατοικούν στη βάση των κρυπτών, διαφοροποιημένα κύτταρα στη μέση ζώνη, ενώ τα αποπτωτικά κύτταρα βρίσκονται κοντά στην επιφάνεια του αυλού. Αρκετές μοριακές οδοί παίζουν σημαντικό ρόλο στο φυσιολογικό αυτο-ανανέωση των επιθηλιακών κυττάρων στο ανθρώπινο παχύ έντερο [1] – [4].

Ωστόσο, η ρύθμιση του πολλαπλασιασμού και αποπτωτικών μηχανισμών μπορεί να μεταβληθούν κατά τη διάρκεια της κανονικής γήρανσης και του παχέος καρκινογένεση. Η γήρανση είναι μια φυσιολογική μηχανισμό που ξεκινά μετά τη σύλληψη. Επηρεάζει σχεδόν κάθε κύτταρο στον οργανισμό με την πιθανή εξαίρεση των βλαστικών κυττάρων και των κυττάρων του όγκου. Μακροσκοπική και μικροσκοπικές αλλαγές υπάρχουν στο γαστρεντερικό σωλήνα γήρανση συμπεριλαμβανομένου του παχέος εντέρου [5] – [6]. Οι αλλαγές σε πολλαπλασιαστική δραστηριότητα κατά τη διάρκεια της γήρανσης έχουν αναλυθεί σε μοντέλα ζώων και σε προηγούμενες μελέτες [7] – [8]. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα του

Mandir et al

, η πιο εντατική επιθηλιακά αναγέννηση (πολλαπλασιασμό και απόπτωση) έχει αποδειχθεί σε νεαρούς αρουραίους.? και οι συγγραφείς συμπέραναν ότι δραματικές αλλαγές σε νεαρά κολονικό επιθήλιο μπορεί να σχετίζεται με την ανάπτυξη των εντέρων. Ωστόσο, η κανονική γαστρεντερική γήρανση έχει καμία επίδραση σε επιθηλιακά ανανέωση [7]. Αντιθέτως, σε πληθυσμούς ηλικίας ζώο αυξημένο πολλαπλασιασμό των κυττάρων και μειωμένη απόπτωση σε κολονικό επιθήλιο παρατηρήθηκε και πιστεύεται ότι διευκολύνει τη ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την καρκινογένεση, η οποία θα μπορούσε να εξηγήσει την υψηλότερη συχνότητα εμφάνισης ορθοκολικού καρκίνου στον ηλικιωμένο ανθρώπινο [8].

Επιπλέον, ορισμένες από αυτές τις αλλαγές μπορεί επίσης να σχετίζεται με ορθοκολικό καρκινογένεση. Αλλαγές στην επιθηλιακή κυτταρική ανάπτυξη και προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο επίσης προηγουμένως μελετήθηκαν σε διάφορα στάδια της καρκινογένεσης του παχέος, αλλά τα αποτελέσματα δεν είναι σύμφωνη. κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την απόπτωση μπορεί να γίνει απορυθμισμένη και η μη ισορροπημένη παραγωγή κυττάρων και κυττάρων απώλεια καθορίζουν τη συμπεριφορά των προκαρκινικών ή κακοήθων παθήσεων και την ανάπτυξη του όγκου [9] – [12]

Το ποσοστό ανίχνευσης των αδενωμάτων και η συχνότητα των προηγμένων. αδενώματα του παχέος εντέρου και του καρκίνου ανεβάζουν συνεχώς μετά την ηλικία των 40-50, δείχνοντας ισχυρή ηλικία εξάρτηση [13] – [14]. Σποραδικές καρκίνων του παχέος εντέρου αποδεικνύονται κυρίως στον πληθυσμό των ηλικιωμένων ενηλίκων παρόμοια με πολυάριθμες νεοπλασματικές και προκαρκινικές αλλοιώσεις. Σύμφωνα με το μοντέλο Vogelstein [15], ορθοκολικό καρκίνο αναπτύσσεται από φυσιολογικό επιθήλιο μέσω προ-κακοήθη αδενώματος σε μία διαδικασία πολλαπλών σταδίων η οποία διαρκεί αρκετά χρόνια. Εκτός από τα γονίδια (π.χ. APC, KRAS, DCC και ΤΡ53) παραδοσιακά εμπλέκονται σε αυτό το μοντέλο εξέλιξης του καρκίνου, πρόσφατα νέα γονίδια με τροποποίηση της έκφρασης του mRNA έχουν επίσης προταθεί ότι είναι συνεισφέρουν στην κακοήθη μετασχηματισμό του ορθοκολικού επιθήλιο [16] – [18].

υπάρχουν αρκετές γενετικές και επιγενετικές αλλοιώσεις που μπορούν να επιδείξουν μια πιθανή σχέση μεταξύ της γήρανσης και του παχέος καρκινογένεση. Συσσώρευση μεταλλάξεων του DNA και ζημιές, υπερμεθυλίωση προαγωγού, μεταβολές στην επιδιόρθωση του DNA, τη δράση της τελομεράσης και του κυτταρικού μεταβολισμού μπορεί να επηρεάσει όλο και περισσότερο ηλικιωμένους πληθυσμούς που οδηγεί σε πολλαπλασιασμό αυξημένα κυττάρων και μειωμένη απόπτωση, που μπορεί να καταλήξει σε κακοήθη μετασχηματισμό και ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό των κυττάρων [19].

Παράλληλα, αρκετές μελέτες ανθρώπινων και ζωικών έχουν αποκαλύψει την αντίθετη ρύθμιση ορισμένων μοριακών οδών κατά την κανονική γήρανση και την καρκινογένεση. Σε αντίθεση με την κανονική γήρανση, πολλαπλασιαζόμενα καρκινικά κύτταρα εμφανίζουν αυξημένη μεταβολισμού, που χαρακτηρίζεται από συνεχή δραστηριότητα πολλαπλασιαστικών και de-διαφοροποίηση, μπορούν να παράγουν πρωτεΐνες εμβρυϊκά και είναι δυνητικά αθάνατα με διαφυγή απόπτωση [20]. Ειδικότερα, απόπτωση ρύθμισης πρωτεΐνες δείχνουν διακριτή έκφραση σε γηρασμένα και καρκινικά κύτταρα χαρακτηρίζονται από την προς τα κάτω ρύθμιση της διέγερσης απόπτωσης όγκου πρωτεΐνη καταστολέας ρ53 [21] και /πρωτεΐνη CD95 Fas [22] και την υπερέκφραση του αντιαποπτωτικών πρωτο-ογκογονιδίου Bcl-2 στον καρκίνο, σε αντίθεση με την κανονική γήρανση κύτταρα [23] – [25]. Ογκογονίδια όπως Ras, παράγοντες μεταγραφής π.χ. Myc, και το σήμα της ανάπτυξης που σχετίζονται με μεταγωγή τυροσίνης κινάσης υποδοχέων π.χ. μέλη της οικογένειας EGFR είναι πάνω ρυθμισμένα σε μερικούς καρκίνους, ενώ προς τα κάτω σε γηρασμένα κύτταρα [26] – [28]

ανάπτυξη του καρκίνου μπορεί να θεωρηθεί ως μια τοπική, μη ελεγχόμενη «αναζωογόνηση» που χρησιμοποιεί τα ίδια μοριακά μονοπάτια. αλλά με αντίθετη ρύθμιση. Απελευθερωμένης μονοπάτια κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την απόπτωση μπορεί να επιτρέψει πλεονεκτήματα επιβίωσης για τα καρκινικά κύτταρα ενάντια σε παρακείμενες γηρασμένα κύτταρα, λόγω χάσει την ικανότητά του καρκίνου για φυσιολογικής γήρανσης [20]. Αυξημένο πολλαπλασιασμό των επιθηλιακών κυττάρων στον γαστρεντερικό σωλήνα μπορεί να δει κανείς όχι μόνο στο καρκίνο του παχέος εντέρου, αλλά επίσης σε εμβρυϊκά και νεανική ανάπτυξη. Ένα βασικό μονοπάτι που διαδραματίζει θεμελιώδη ρόλο τόσο στην ανάπτυξη του εντέρου και στην σποραδική ή οικογενής του παχέος εντέρου είναι η Wnt /β-κατενίνης σηματοδότησης [29] – [30].

Όπως γνωρίζουμε, δεν υπάρχει καμία μελέτη που εστιάζεται για τη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού και απόπτωσης στην νεανική ανθρώπινο ορθοκολικό επιθηλίου σε σχέση με την κανονική γήρανση και την καρκινογένεση. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν η ανάλυση της πολλαπλασιαστικής και αποπτωτική δραστικότητα σε ανθρώπινο κολονικό επιθήλιο κατά τη διάρκεια της φυσιολογικής γήρανσης και του παχέος καρκινογένεση τόσο σε επίπεδο έκφρασης πρωτεΐνης και γονιδίου. Παχέος βιοψίες που αντιπροσωπεύει την νεανική ελεγχόμενη στάδιο της ανάπτυξης, την υγιή κατάσταση των ενηλίκων και της ανεξέλεγκτης ανάπτυξης του καρκίνου του παχέος ελέγχθηκαν για τους πιθανούς συσχετισμούς.

Υλικά και Μέθοδοι

Ασθενείς και δείγματα

Μετά την συγκατάθεση, του παχέος δείγματα βιοψίας ελήφθησαν κατά τη διάρκεια της ρουτίνας ενδοσκοπική επέμβαση στο 2ο Τμήμα Παθολογίας και 1ο Τμήμα Παιδιατρικής, Πανεπιστήμιο Semmelweis, Βουδαπέστη, Ουγγαρία. Συνολικά, 44 δείγματα ιστών αναλύθηκαν στην ανοσοϊστοχημική μελέτη (14 υγιή παιδιά, 10 υγιείς ενήλικες, 10 αδενώματα από τους ενήλικες και 10 CRCs από τους ενήλικες)? 81 βιοψίας δείγματα αναλύθηκαν σε ανάλυση μικροσυστοιχιών (6 υγιή παιδιά, 41 υγιείς ενήλικες και 34 CRCs από τους ενήλικες)? και 36 δείγματα βιοψίας είχαν εμπλακεί σε πραγματικό χρόνο PCR επικύρωση (12 υγιή παιδιά, 12 υγιείς ενήλικες και 12 CRCs από τους ενήλικες). Εβδομήντα-πέντε μικροσυστοιχίες (τα ενήλικα δείγματα) είχε σε υβριδισμό νωρίτερα? αρχεία δεδομένων τους χρησιμοποιήθηκαν σε μία προηγουμένως δημοσιευμένες μελέτες χρησιμοποιώντας διαφορετικές συγκρίσεις [31] – [32] και είναι διαθέσιμες στη βάση δεδομένων Gene Expession Omnibus (σειρά αριθμός πρόσβασης: GSE10714 και GSE37364). Τα σύνολα δεδομένων από τα πρόσφατα υβριδοποιείται 6 μικροσυστοιχίες καταχωρηθεί με τον αριθμό σειριακών ένταξη GSE37267. παιδιά ελέγχου που αναφέρεται στην κλινική εξωτερικών ασθενών με αιμορραγία από το ορθό, δυσκοιλιότητα ή χρόνιο κοιλιακό άλγος. Ileocolonoscopy ήταν μέρος της διαγνωστικής διαδικασίας τους (αποκλείει οργανική νόσο) και τα δείγματα βιοψίας έδειξαν κανονική μακροσκοπική εμφάνιση και ιστολογία. Κάθε δείγμα ελέγχθηκε από ιστοπαθολόγους.

Για ανοσοϊστοχημεία παχέος δείγματα βιοψίας συνήθως σταθερό σε φορμαλδεΰδη και ενσωματωμένα σε παραφίνη. Για τις μελέτες mRNA, κολονοσκόπηση δείγματα αποθηκεύτηκαν σε Αντιδραστήριο RNAlater (Qiagen Inc, Germantown, US) στους -80 ° C πριν συνολικός εξαγωγή RNA για ανάλυση γονιδιακής έκφρασης και μελέτη Taqman RT-PCR. Ηθικές εγκρίσεις (Αρ .: 69/2008 και 202/2009) για αυτή τη μελέτη είχαν εκδοθεί από την περιφερειακή και την Επιτροπή Θεσμικών Επιστήμης και Έρευνας Ηθικής του Πανεπιστημίου Semmelweis (Βουδαπέστη, Ουγγαρία). Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε πριν από όλους τους ενήλικες συμμετέχοντες και από τον πλησιέστερο συγγενή, επιστάτες, φύλακες ή για λογαριασμό των ανηλίκων /παιδιών εγκριθεί από τις επιτροπές δεοντολογίας. Λεπτομερής κλινικοπαθολογοανατομικών προδιαγραφές των δειγμάτων των ασθενών συνοψίζονται στο

Πίνακας 1

και

Πίνακας 2

.

Η

Η ανοσοϊστοχημεία για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων

Αρχείο δείγματα από 14 ιστολογικά φυσιολογικό κολονικό βιοψίες από παιδιά, 10 φυσιολογικούς του κόλου βιοψίες από τους ενήλικες, καθώς και 10 ενήλικα αδενώματα και 10 CRCs συλλέχθηκαν κατά τη διάρκεια της ρουτίνας ενδοσκόπηση. πυρήνες mm διαμέτρου 1 αποκόπηκαν από παραφίνη μπλοκ δειγμάτων ενηλίκων και συλλέγονται σε ιστικές μικροσυστοιχίες (ΤΜΑ). Τέσσερις μm πάχους τομές κόβονται τόσο από την TMAs και από μεμονωμένα παιδιά δείγματα βιοψίας αποκηρώθηκαν και επανυδατώθηκαν για ανοσοχρώση.

Μετά την ανάκτηση αντιγόνου σε ένα ρυθμιστικό ρΗ TRIS-EDTA 9,0 χρησιμοποιώντας ένα φούρνο μικροκυμάτων στους 900 W για 10 λεπτά και στη συνέχεια στους 370 W για 40 λεπτά, το κλείδωμα των ενδογενών υπεροξειδασών σε υπεροξείδιο του υδρογόνου 1% διαλύθηκε σε μεθανόλη και των μη ειδικών θέσεων σύνδεσης χρησιμοποιώντας 1% αλβουμίνη βόειου ορού για 20 λεπτά κάθε διεξήχθησαν. Τα πλακίδια επωάστηκαν με αντι Ki-67-μονοκλωνικού αντισώματος ποντικού (Κλώνος: ΜΙΒ-1, 1:100, Dako, Glostrup, Denmark) για 60 λεπτά σε υγροποιημένο θάλαμο και, στη συνέχεια, με αντι-ποντικού IgG F (ab ‘)

2 Alexa Fluor 546 συζυγούς (1:200, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) για 30 λεπτά.

ανίχνευση απόπτωση χρησιμοποιώντας το Tdt μεσολάβηση dUTP Nick End Labeling (ΤΟΥΝΕΛ) δοκιμασία

Μετά από πέψη με πρωτεϊνάση-Κ (20 μg /ml, 20 λεπτά), 50 μλ TUNEL (TUNEL In Situ κυτταρικού θανάτου Detection Kit, φλουορεσκεΐνη, Roche, 11684795910) μίγμα της αντίδρασης (5 μΐ ενζύμου TdT + 45 μl dUTP) προστέθηκε στο τομές ιστών και διαφάνειες TMA. Στη συνέχεια, τα δείγματα επωάστηκαν σε ένα σκοτεινό θάλαμο με υγρασία στους 37 ° C επί 120 λεπτά. πυρήνες κυττάρων χρωματίστηκαν με Hoechst (5 μΙ Hoechst χρωστική + ml TBS 10, 1 λεπτό, Sigma-Aldrich, St. Louis, Μο, USA).

Καταμέτρηση των μιτωτικών και αποπτωτικό δείκτη σε ψηφιακή διαφάνειες

Βιτρώ δείγματα βιοψίας και διαφάνειες TMA ήταν ψηφιοποιημένο με υψηλή ανάλυση ψηφιακό σαρωτή (Pannoramic σάρωσης, 3DHISTECH Ltd. Βουδαπέστη, Ουγγαρία) με τη χρήση πολλαπλών στρώσεων φθορισμού σάρωσης με υψηλό αριθμητικό άνοιγμα (0,8) × 20 αντικειμενικό φακό και ένα υψηλό δυναμικό εύρος AxioCam Mrm Rev.3 μαύρο και άσπρο κάμερα συνδεδεμένη με το σαρωτή. Ψηφιακή πλάκες προσβάσιμες μέσω μια οθόνη υπολογιστή και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Pannoramic Viewer (έκδοση 1.11.43.0). Η μονάδα λογισμικού Counter Marker με αποτέλεσμα μόνιμη σχολιασμούς στις μετρήθηκαν τα κύτταρα χρησιμοποιήθηκε για να εκτιμηθεί η σχετική αναλογία πολλαπλασιαστικών, αποπτωτικών και φυσιολογικά κύτταρα.

Ki-67, TUNEL και Hoechst positivities εμφανίστηκε όλων ως ισχυρή πυρηνική επισήμανση στην διαφάνειες. Ανάλογα με το μέγεθος του δείγματος, 500-1000 επιθηλιακά κύτταρα μετρήθηκαν σε διαμήκη κρύπτες καλά προσανατολισμένη. Έχουμε προσδιορίσει την αναλογία πολλαπλασιαστική-αποπτωτική (PAR: αναλογία πολλαπλασιαστικών και αποπτωτικών κυττάρων στις κρύπτες), ο μιτωτικός δείκτης (MI: η αναλογία πολλαπλασιαστικών κυττάρων και των συνολικών μετρήθηκαν κυττάρων στις κρύπτες) και το αποπτωτικό δείκτη (ΑΙ: η αναλογία των αποπτωτικών κύτταρα και συνολική καταμέτρηση κυττάρων στις κρύπτες).

mRNA microarray ανάλυση έκφρασης

το ολικό RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας RNeasy Mini Kit (Qiagen Inc., Germantown, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ποσότητα των απομονωμένων RNA χαρακτηρίστηκε με μέτρηση της απορρόφησης (NanoDrop ND-1000 Φασματοφωτόμετρο, NanoDrop Technologies, Inc., Wilmington, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής). Ποιότητα των απομονωμένων RNA ελέγχθηκε με ηλεκτροφόρηση τριχοειδούς γέλης (2100Bioanalyzer και RNA 6000 Pico Kit /Agilent Inc., Santa Clara, CA, USA /). Βιοτινυλιωμένα cRNA ανιχνευτές συντέθηκαν από 1 έως 8 μg ολικού RNA και κατακερματισμένη χρησιμοποιώντας το One-Cycle Target επισήμανση και τον έλεγχο Kit (https://www.affymetrix.com/support/downloads/manuals/expression_s2_manual.pdf), σύμφωνα με την Affymetrix περιγραφή. Είκοσι μικρογραμμάρια του κάθε δείγματος κατακερματισμένων cRNA υβριδίστηκε σε HGU133 Plus2.0 array (Affymetrix) στους 45 ° C για 16 ώρες. Τα πλακίδια πλύθηκαν και χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας το σταθμό ρευστονικής 450 και τη μέθοδο χρώσης ενίσχυσης αντίσωμα σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Φθορίζοντα σήματα ανιχνεύονται από GeneChip Scanner 3000 (Affymetrix).

TaqMan RT-PCR

Μετά την ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης μικροσυστοιχιών, τα αποτελέσματα συγκρίθηκαν με άλλα δεδομένα που διατίθενται στην Omnibus βάση δεδομένων γονιδιακής έκφρασης (http : //www.ncbi.nlm.nih.gov/geo? αριθμός ένταξη σειρά είναι GSE18105). TaqMan αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης χρησιμοποιήθηκε για να μετρηθεί η έκφραση του mRNA της 12 επιλεγμένων γονιδίων, που συμμετέχουν στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, του πολλαπλασιασμού ή απόπτωση, σε πρωτότυπο (6 ιστολογικά άθικτη παιδιά, 6 ιστολογικά άθικτη ενηλίκων και 6 ενηλίκων δείγματα CRC) και ανεξάρτητη σύνολα δειγμάτων ( 6 ιστολογικά άθικτη παιδιά, 6 ιστολογικά άθικτο ενήλικο, 6 CRC ενηλίκων δείγματα). 18S ριβοσωμικό RNA και GAPDH χρησιμοποιήθηκαν ως αναφορά.

Σύνολο εκχύλιση RNA, ποιότητας και ποσότητας έλεγχοι διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Χρησιμοποιώντας την υψηλής χωρητικότητας cDNA Reverse Transcription Kit με RNase Αναστολέας, 1 μα συνολικού RNA ανά δείγμα υποβλήθηκε σε αντίστροφη μεταγραφή (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Η ποιότητα του cDNA ελέγχθηκε με SDHA PCR πραγματικού χρόνου (F. Hoffmann-La Roche Ltd., Basel, Switzerland). Στη συνέχεια, 16,7 ng cDNA εκμαγείο ανά δείγμα χρησιμοποιήθηκε για ανάλυση έκφρασης επιλεγμένων γονιδίων με Expression TaqMan Gene Master Mix (Life Technologies). Η μέτρηση διεξήχθη σε LightCycler 480 (Roche) με μορφή ανίχνευση Mono Χρώμα Υδρόλυση Probe /UPL Probe. Μετά από μετουσίωση στους 95 ° C για 10 λεπτά, 40 κύκλοι PCR διεξήχθησαν (ενίσχυση στους 95 ° C για 15 δευτερόλεπτα, και στους 60 ° C για 1 λεπτό).

Στατιστική αξιολόγηση

για τη στατιστική ανάλυση των Ki-67 ανοσοχρώση και TUNEL αποτελέσματα εφαρμόστηκαν το τεστ ANOVA και Tukey HSD post-test. Και στις δύο κριτήρια σημαντικότητας των μεθόδων ήταν p & lt?. 0.05

Για την έκφραση του mRNA προφίλ οι συστοιχίες έκφρασης Affymetrix ήταν κατά κύριο λόγο προ-επεξεργασία με φόντο GCRMA μέθοδο διόρθωσης με quantile εξομάλυνση και μεσαίο βερνίκι περιλήψεων. ανάλυση SAM εφαρμόστηκε για τον προσδιορισμό των proliferation- και την απόπτωση ρύθμισης γονιδίων με την αλλαγή της έκφρασης του mRNA. Χρησιμοποιήθηκαν τα ακόλουθα κριτήρια SAM: LogFC≥abs 1, p-value & lt? 0,05. Όλα αυτά τα γονίδια συγκρίθηκαν και οι εκφράζονται διαφορικά αυτά ερευνήθηκαν περαιτέρω. Η έκφραση του κάθε επιλεγμένου γονιδίου μεταξύ των διαφόρων ομάδων δείγμα αναλύθηκε περαιτέρω με ANOVA και μετα-τεστ Tukey HSD

Τα σύνολα δεδομένων είναι διαθέσιμα στο Omnibus βάση δεδομένων γονιδιακής έκφρασης (http:. //www.ncbi.nlm.nih .gov /geo /), σειρά αριθμών πρόσβασης:. GSE10714, GSE37364 και GSE37267

Για πραγματικού χρόνου PCR επικύρωση 12 δείγματα αναλύθηκαν σε κάθε στάδιο (παιδιά, υγιείς /κανονικούς ενήλικες και ενήλικες CRCs). Για κανονικοποίηση, 18S ριβοσωμικού RNA χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Για τη στατιστική ανάλυση εφαρμόστηκαν τεστ ANOVA και Tukey HSD post-test. Χρησιμοποιήθηκαν τα ακόλουθα κριτήρια: Διπλώστε change≤0.5 ή Πάσο change≥2 και τιμή-p & lt? 0,05

Αποτελέσματα

πολλαπλασιασμό και την απόπτωση σε νεανική, φυσιολογικό ενήλικα, τα δείγματα καρκινώματος αδενώματος και ορθοκολικού

τα πολλαπλασιαζόμενα επιθηλιακά κύτταρα εντοπίζεται κυρίως στη βάση των κρυπτών, ενώ αποπτωτικών κυττάρων ήταν κοντά στην επιφάνεια του αυλού στην κανονική βλεννογόνο του κόλου

(

Σχήμα 1

)

. Πολλαπλασιαστικές-αποπτωτικών αναλογία (PAR: αναλογία πολλαπλασιαστικών και αποπτωτικών επιθηλιακών κυττάρων στις κρύπτες) και ΜΙ ήταν σημαντικά υψηλότερα σε παιδιά (PAR = 3,51 ± 2,49? ΜΙ = 0,33 ± 0,06) και τα δείγματα CRC (PAR = 9.83 ± 7.72? ΜΙ = 0,42 ± 0,10) από ό, τι σε υγιείς ενήλικες δείγματα (PAR = 0,88 ± 0,22? ΜΙ = 0.15 ± 0.06) (ρ & lt? 0,05). Έδειξαν συνεχή αύξηση κατά τη διάρκεια της ακολουθίας αδενώματος-καρκινώματος (ACS). PAR ήταν 3,99 φορές υψηλότερη σε υγιή παιδιά κολονικό επιθήλιο και 11.17 φορές υψηλότερες σε CRC σε σύγκριση με υγιή ενήλικα επιθήλιο? και PAR ήταν 2,8 φορές υψηλότερη στην CRC σε αντίθεση με τα νεανική δείγματα. Με βάση την immunhistochemical τα αποτελέσματά μας, MI ήταν 2,2 φορές υψηλότερη σε παιδιά και 2,8 φορές υψηλότερη σε σύγκριση CRC ότι σε υγιή φυσιολογικά, και 1,27 φορές υψηλότερη σε CRC σε αντίθεση με νεανική δείγματα. Η υψηλότερη PAR και ΜΙ βρέθηκαν στην παχέος δείγματα καρκίνου

(

Σχήμα 2

)

.

μπλε κηλίδες αντιπροσωπεύουν τους πυρήνες των ανενεργών κυττάρων. Εικόνες ελήφθησαν με ψηφιακή μικροσκόπιο: κανονικό παιδί ιστού (Χ), φυσιολογικό ενήλικα ιστό (Ν), αδένωμα (AD) και καρκίνωμα (CRC) σε ενήλικες. Μιτωτική δραστηριότητα μειώνεται κατά τη γήρανση και αυξάνει κατά τη διάρκεια της ACS σε αντίθεση με την αποπτωτική δραστηριότητα.

Η

PAR και MI μείωση κατά τη γήρανση και την αύξηση κατά τη διάρκεια της καρκινογένεσης, σε αντίθεση με AI.

Η

AI μειώθηκε σε υγιή δείγματα παιδιά (0,13 ± 0,06) και σημαντικά χαμηλότερο σε ορθοκολικό καρκίνο δείγματα (0,06 ± 0,03) από ό, τι στα ιστολογικά δείγματα του κόλου άθικτα ενήλικα (0,17 ± 0,05) (ρ & lt? 0,05). AI έδειξαν συνεχή μείωση παράλληλα με την παχέος ACS. δείκτης αποπτωτικά αποδείχθηκε 0,76 φορές χαμηλότερη σε παιδιά, και 0,35 φορές χαμηλότερη σε CRC σύγκριση με τους υγιείς κανονικά δείγματα? και ήταν 0,46 φορές χαμηλότερη σε σύγκριση CRC να νεανική δείγματα. Το χαμηλότερο AI ανιχνεύθηκε στα δείγματα ορθοκολικού καρκίνου

(

Σχήμα 1

–

2

).

Η

σημαντική μεταβολή στις πολλαπλασιαστική δραστικότητα δεν βρέθηκε ανάμεσα υγιή ενήλικα βλεννογόνο του κόλου (PAR = 0,88 ± 0,22? ΜΙ = 0,15 ± 0,06) και τα δείγματα αδένωμα (PAR = 1,45 ± 0,89? ΜΙ = 0,13 ± 0,05)? ενώ το AI βρέθηκε να είναι σημαντικά χαμηλότερη σε δείγματα αδένωμα (Κανονική AI = 0,17 ± 0,05? Adenoma AI = 0.10 ± 0.04) (p & lt? 0,05).

Η έκφραση της proliferation- και την απόπτωση ρύθμισης γονιδίων σε νεαρά , δείγματα κανονική ενηλίκων και ορθοκολικού καρκινώματος

έκφραση του mRNA από 117 γονίδια πολλαπλασιασμό ρύθμισης μελετήθηκαν σε HGU133 Plus2.0 μικροσυστοιχίες. Η γονιδιακή έκφραση του 5 ανιχνευτές (που ανήκουν σε 4 γονίδια) μεταβάλλεται κατά τη διάρκεια της γήρανσης και μόνο σε ιστολογικά άθικτο κολονικό βλεννογόνο? έκφραση του mRNA του 18 ανιχνευτές (που ανήκουν σε 13 γονίδια) έχουν μεταβληθεί κατά τη διάρκεια του παχέος καρκινογένεση? και 11 ανιχνευτές (που ανήκουν σε 8 γονίδια /BRCA1, CCNB1, CCNE1, CDC20, CDK1, CDKN2B, MKI67 και TFDP1 /) έχουν διαφορετικά εκφράζεται σε δύο ομάδα των δειγμάτων (

Εικόνα

3Α). Ομοίως, η γονιδιακή έκφραση του 534 γονιδίων απόπτωσης ρύθμισης αναλύθηκε επίσης σε αυτή τη μελέτη. mRNA έκφραση του 15 ανιχνευτές (που ανήκουν σε 9 γονιδίων) μεταβάλλεται κατά τη διάρκεια της γήρανσης και μόνο σε ιστολογικά άθικτο κολονικό βλεννογόνο? 46 ανιχνευτές (που ανήκουν σε 32 γονίδια) παρουσίασαν μεταβολές κατά τη διάρκεια του παχέος καρκινογένεση? και 12 ανιχνευτές (που ανήκουν σε 11 γονίδια /ACVR1B, BRCA1, CHEK2, DYRK2, IFI6, SERPINB9, SFRP1, SOCS3, SST, TNFSF10 και ΖΑΚ /) έχουν διαφορετικά εκφράζεται σε δύο ομάδα δειγμάτων

(

Σχήμα 3Β

)

.

στον χάρτη θερμότητας, αυξημένη έκφραση του γονιδίου αντιπροσωπεύεται με κόκκινες γραμμές, ενώ η μειωμένη έκφραση με πράσινο. Τα πρώτα 6 δείγματα με γαλάζια γονίδια δείχνουν στα παιδιά, το σκούρο μπλε είναι από υγιείς ενήλικες, ενώ τα τελευταία δείγματα στο πράσινο είναι από ασθενείς με καρκίνο.

Η

μεταβολές της γονιδιακής έκφρασης μεταξύ των ανηλίκων και των δειγμάτων CRC

Proliferation- και γονιδίων της απόπτωσης που ρυθμίζουν ερευνήθηκαν περαιτέρω για να βρουν γονίδια με έκφραση ανόμοια mRNA που μπορεί να εξηγήσει τις διαφορές μεταξύ της ελεγχόμενης και ανεξέλεγκτης κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Δώδεκα ανιχνευτές που ανήκουν σε 8 γονίδια πολλαπλασιασμό ελέγχου (BCL2, CDKN2B, RAD9A, BRCA2, CCND1, CDK1, CDK6 και RBL1)

(

Εικόνα 4Α

)

και 26 γονίδια απόπτωση ρύθμισης (AIFM2, AIFM3, ΒΤΚ, CIDEB, CIDEC, DAPK2, MAL, NLRP1 (LOC728392), SFRP1, SIVA1, SPN, SST, TR53I3, TNFRSF25, ANXA1, CBX4, CASP4, INHBA, MYC, PLAGL2, PMAIP1, POLB, pRok2, SOCS3, TNFRSF10B και ΖΑΚ) με 39 ανιχνευτές

(

Εικόνα 4Β

)

έδειξαν σημαντική μεταβολή μεταξύ των παιδιών και των ομάδων του καρκίνου, σύμφωνα με το p-value .

στον χάρτη θερμότητας, αυξημένη έκφραση του γονιδίου αντιπροσωπεύεται με κόκκινες γραμμές, ενώ η μειωμένη έκφραση με πράσινο. Τα σκούρο μπλε δείγματα από υγιείς παιδιά βλεννογόνο του κόλου (Χ) και το γαλάζιο είναι από ορθοκολικό καρκίνο δείγματα (CRC).

Η

Επικύρωση της γονιδιακής έκφρασης χρησιμοποιώντας TaqMan RT-PCR

έκφραση του mRNA του 10 γονιδίων, συμπεριλαμβανομένων CDKN2B, MKI67, CDC2 /CDK1, CCNE1, ACVR1B, TNFSF10, DYRK2, SOCS3, IFI6 και SERPINB9 επικυρώθηκαν με TaqMan RT-PCR

(

Πίνακας 3

)

.

η

Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της ανάλυσης μικροσυστοιχιών γονιδίων πολλαπλασιασμό ρύθμισης (CDKN2B, MKI67, CDC2 /CDK1 και CCNE1), σημαντικές αλλαγές έκφρασης του mRNA ανιχνεύτηκαν από την αξία των Διπλώστε αλλαγές (FC≤0.5 ή FC≥2) και την ANOVA-test (ρ & lt? 0,05) σε παιδιά έναντι Κανονική και Κανονική εναντίον CRC συγκρίσεις? και τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώθηκαν επίσης με Tukey-test σε περίπτωση CDC2 /CDK1 και CCNE1. επικύρωση PCR επιβεβαίωσε την τάση μεταβολών γονιδιακής έκφρασης σε όλες τις περιπτώσεις σε σχέση με ρύθμιση πολλαπλασιασμού. CDKN2B, MKI67, CDC2 /CDK1 και CCNE1 παρουσίασαν οριακά σημαντικές αλλαγές έκφρασης mRNA σε αναφέρθηκε προηγουμένως συγκρίσεις, σύμφωνα με Πάσο αλλαγή. Tukey post-test προσληφθεί μεταβολές της γονιδιακής έκφρασης κατά τη διάρκεια της γήρανσης και του παχέος καρκινογένεση σε περίπτωση CDC2 /CDK1 (p & lt? 0,05).

Ο αριθμός των γονιδίων της απόπτωσης ρύθμισης (ACVR1B, TNFSF10, DYRK2, SOCS3, IFI6 και SERPINB9) αναλύθηκαν επίσης με RT-PCR. Γονιδιακή έκφραση του ACVR1B, TNFSF10 και DYRK2 ήταν σημαντικά χαμηλότερη στα παιδιά και τα δείγματα CRC σε σύγκριση με φυσιολογικούς ενήλικες βλεννογόνο του κόλου (FC≤0.5 ή FC≥2? Ρ & lt? 0,05)? και αυτά τα αποτελέσματα επικυρώθηκαν με RT-PCR, καθώς και. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της μελέτης Affymetrix, η έκφραση του mRNA των αντι-αποπτωτικών γονιδίων, όπως SOCS3, IFI6 και SERPINB9, έδειξε σημαντικά υψηλότερη έκφραση σε παιδιά και δείγματα CRC σε σύγκριση αυτή να είναι του παχέος δείγματα ιστολογικά άθικτη ενήλικα. επικύρωση PCR επιβεβαίωσε την τάση των αλλαγών της γονιδιακής έκφρασης μεταξύ των παιδιών εναντίον Ενηλίκων Κανονικό και Ενηλίκων Κανονικό εναντίον CRC. ANOVA και ανάλυση Tukey-test των αποτελεσμάτων RT-PCR έχουν επαληθεύσει αυτά αλλοιώσεις σε περίπτωση SOCS3 και IFI6 (ρ & lt? 0,05). Οι αλλαγές έκφραση των επιλεγμένων γονιδίων συνοψίζονται στο

Πίνακας 4

.

Η

Συζήτηση

Η γήρανση συνδέεται με αυξημένη συχνότητα εμφάνισης σποραδικές παχέος κακοήθειες, το οποίο είναι ένα από τα κύριες αιτίες θνησιμότητας στις δυτικές χώρες [33]. καρκίνος του παχέος εντέρου σχετίζεται με ανεξέλεγκτο κυτταρικό πολλαπλασιασμό και απορυθμισμένη απόπτωση. Juvenile ανάπτυξη, από την άλλη πλευρά, χαρακτηρίζεται από ελεγχόμενη αύξηση, τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την απόπτωση [34].

Σε αυτή τη μελέτη η πολλαπλασιαστική και αποπτωτική δραστικότητα σε άθικτα ανθρώπινα παχέος επιθήλιο από παιδιά και ενήλικες σε σύγκριση με εκείνη σε αδένωμα και του παχέος εντέρου διερευνήθηκε. Η έκφραση των σχετικών γονιδίων ελέγχθηκε επίσης σε μικροσυστοιχίες mRNA. Βρήκαμε μια αυξημένη πολλαπλασιαστική και μειωμένη αποπτωτική δραστηριότητα στα παιδιά και τα δείγματα καρκίνου σε σύγκριση με το φυσιολογικό ενήλικα επιθήλιο.

Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν μια αντίθετη μοριακή ρύθμιση του πολλαπλασιασμού και της απόπτωσης κατά τη διάρκεια της φυσιολογικής γήρανσης και του παχέος καρκινογένεση. Ενισχυμένη κυτταρικό πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων χωρίς «γήρανση» μπορεί να συμβάλει στην πλεονέκτημα επιβίωσης τους πάνω γειτονικά γηρασμένα κύτταρα.

Μια αυξημένη κυτταρικού πολλαπλασιασμού ανιχνεύεται σε παιδιά παχέος βλεννογόνο μπορεί να σχετίζεται με την φυσιολογική ανάπτυξη του παχέος εντέρου, ωστόσο, ο την ανανέωση των κυττάρων επιβραδύνεται κατά τη διάρκεια της φυσιολογικής γήρανσης στην ιστολογικά παχέος κρύπτη άθικτο ενήλικο. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων και τη ρύθμιση της απόπτωσης μεταξύ ελεγχόμενη ανάπτυξη στην παιδική ηλικία και την ανεξέλεγκτη αύξηση των CRC δεν έχουν συσχετιστεί πριν από τον κολικό βλεννογόνο. Εδώ βρήκαμε αρκετές πολλαπλασιασμό προώθηση γονίδια συμπεριλαμβανομένων κυκλίνης Β1 /CCNB1 /, κυκλίνη Ε1 /CCNE1 και /κυκλίνη εξαρτώμενη κινάση (CDK1) να ρυθμίζεται προς τα πάνω τόσο σε νέους και καρκίνο δείγματα σε σύγκριση με το φυσιολογικό ενήλικα βλεννογόνο (

Σχήμα 3

). Αυτά τα αποτελέσματα συσχετίζονται καλά με μας εύρεση σημαντικά υψηλότερη πολλαπλασιαζόμενα κυτταρικά κλάσματα σε παιδιά και τομές καρκινικού ιστού σε σύγκριση με φυσιολογικό ενήλικα δείγματα. CDKs, πράγματι, έχουν κρίσιμο ρόλο στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου και την ανάπτυξη σε ευκαρυωτικά κύτταρα. σύμπλοκα CDK είναι μια εξαιρετικά διατηρημένη οικογένεια των πρωτεϊνικών κινασών Ser /Thr, που αποτελείται από μια καταλυτική υπομονάδα CDK και μία ενεργοποίηση υπομονάδα κυκλίνης. Διαφορετικές CDKs μπορούν να ελέγχουν διάφορα μέρη του κύκλου κυττάρου? Αυτά τα σύμπλοκα μπορούν να ενεργοποιηθούν με φωσφορυλίωση, δέσμευση ενεργοποιώντας ή αναστέλλοντας κυκλίνες υπομονάδες [35] – [36]. CCNB1, CCNE1 και CDK1 εκφράσεις, οι οποίες μπορούν να συσχετίζονται με αυξημένη πολλαπλασιαστική δραστηριότητα, ήταν υψηλότερες στα παιδιά και νεοπλασματικές βλεννογόνο του κόλου σε σύγκριση με φυσιολογικό ενήλικα βλεννογόνο. Επιπλέον, η κυκλίνη D1 (CCND1), τα επίπεδα CDK1 και CDK6 mRNA ήταν σημαντικά υψηλότερα σε CRC σύγκριση με τα φυσιολογικά δείγματα παιδιά, η οποία μπορεί να σχετίζεται με την ανεξέλεγκτη κυτταρικό πολλαπλασιασμό στον καρκίνο (

Σχήμα 4

). Η κυκλίνη D1 έχει πολλές ρυθμιστικές επιδράσεις σε φυσιολογικούς κυτταρική διαφοροποίηση, την ανάπτυξη και το μεταβολισμό? Ωστόσο, η υπερέκφραση του CCND1 είναι ένα από τα πιο συχνά παρατηρούνται μεταβολή σε ανθρώπινους καρκίνους, καθώς έχει κυτταρικού κύκλου ρυθμιστικές επιδράσεις στη φάση G1 [37]. Σύμφωνα με

Zhang et al.

Αποτελέσματα, η μη φυσιολογική αυξητική ρύθμιση της κυκλίνης D1 μπορεί να είναι ένα πρώιμο γεγονός στην εντερική καρκινογένεση [38].

Sahl et al.

Έχουν διερευνήσει την έκφραση διαφορετικών εξαρτώμενων από κυκλίνη κινασών στο ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου. Παρατήρησαν ότι η ενεργοποίηση του CDK1, CDK2 και CDK6, το οποίο μπορεί να φωσφορυλιώσει την πρωτεΐνη ρετινοβλαστώματος, με αποτέλεσμα την απελευθέρωση από την αναστολή της προόδου της προς τα εμπρός G1 φάση, είναι σε σχέση με την ανθρώπινη παχέος καρκινογένεση [39].

υπάρχουν αρκετές ρυθμιστικών μορίων που μπορούν να διαμορφώσουν και να μπλοκάρει την λειτουργία του CKDs, που ονομάζονται αναστολείς της εξαρτώμενης από κυκλίνη κινάσης. Στην παρούσα μελέτη μας, μελετήσαμε τις αλλαγές έκφρασης του mRNA των CDKN2B στις διαδικασίες της γήρανσης και του παχέος καρκινογένεση. CDKN2B είναι επίσης γνωστή ως καταστολέας πολλαπλών όγκων 2 (MTS2), εξαρτώμενες από κυκλίνη κινάσες 4 και 6 πρωτεΐνη ή ρ15-INK4b (ρ15) σύνδεση. CDKN2B βρίσκεται δίπλα ογκοκατασταλτικά CDKN2A στο χρωμόσωμα 9, η οποία είναι συχνά μεταλλάσσεται και διαγράφεται σε μια ευρεία ποικιλία νεοπλασιών. Αυτό το γονίδιο κωδικοποιεί έναν αναστολέα κινάσης που εξαρτάται από κυκλίνη που μπορούν να παράγουν συμπλέγματα με CDK4 και CDK6, αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης ή κυτταρικού κύκλου. Στην ανάλυση μικροσυστοιχιών μια μέτρια έκφραση mRNA του CDKN2B βρέθηκε σε καλά ελεγχόμενες, υπερ-πολλαπλασιαστική κολονικής βιοψίας δείγματα από τα παιδιά, σε σύγκριση με ιστολογικά άθικτη ενηλίκων κολονικό βλεννογόνο, καθώς και μια αξιοσημείωτη μείωση γονιδιακής έκφρασης παρατηρήθηκε σε δείγματα CRC (

Σχήμα 3

). Σύμφωνα με προηγούμενες μελέτες, CDKN2B μπορεί να δρα ως ογκοκατασταλτικό γονίδιο και μια πιθανή τελεστή του ΤΟΡβ-επαγόμενη διακοπή του κυτταρικού κύκλου [40].

Herman et al.

Πιστοποιηθεί ότι γονιδιακή σίγηση της p15 από CpG νησί υπερμεθυλίωση μπορεί να προκαλέσει νεοπλασματικές διαταραχές [41]. Σημαντική απώλεια των λειτουργιών αυτών των γονιδίων »μπορεί να συνεισφέρει στην ανεξέλεγκτο κυτταρικό πολλαπλασιασμό σε CRC.

ανοσοϊστοχημική ανάλυση, μια μέτρια μειωμένη αποπτωτική δραστικότητα βρέθηκε σε υγιή παιδιά παχέος δείγματα βιοψίας σε σύγκριση με υγιείς ενήλικες και ήταν δραματικά μειωμένος σε η διάρκεια της ακολουθίας αδενώματος-καρκινώματος. αλλοιώσεις της έκφρασης του mRNA της που επάγει απόπτωση ή ανασταλτικές γονίδια που αναλύθηκαν στη μελέτη μας (π.χ. ACVR1B, TNFSF10, DYRK2, SOCS3, IFI6 και SERPINB9) μπορεί να εξηγήσει αυτό το φαινόμενο.