Αφηρημένο

Ιστορικό

καρκίνος του θυρεοειδούς είναι η πιο κοινή ενδοκρινική που σχετίζονται με τον καρκίνο με αυξανόμενη συχνότητα εμφάνισης κατά τη διάρκεια των τελευταίων πέντε ετών. Οι τρέχουσες θεραπείες για τον καρκίνο του θυρεοειδούς, όπως η χειρουργική επέμβαση ή θεραπεία με ραδιενεργό ιώδιο, συχνά απαιτούν από τους ασθενείς να είναι σε θεραπεία ορμονικής δια βίου θυρεοειδούς και λόγω των σημαντικά ποσοστά επανεμφάνισης του καρκίνου του θυρεοειδούς, οι νέες προληπτικές ρυθμίσεις που απαιτούνται. Η παρούσα μελέτη διερευνά την ιδιοκτησία ενός φυσικού διαιτητική ένωση που βρίσκεται στα σταυρανθή λαχανικά, 3,3′-Diindolylmethane (DIM), με στόχο την μεταστατικό φαινότυπο του καρκίνου του θυρεοειδούς κυττάρων μέσω ενός λειτουργικού υποδοχέα οιστρογόνων.

Μεθοδολογία /Principal ευρήματα

κυτταρικές σειρές καρκίνου του θυρεοειδούς υποβλήθηκαν σε θεραπεία με οιστρογόνα και /ή DIM και υποβάλλεται σε

in vitro

προσκόλληση, η μετανάστευση και δοκιμασίες εισβολής για τη διερεύνηση των αντι-μεταστατική και αντι-οιστρογονική αποτελέσματα της ΔΗΜ. Παρατηρήσαμε ότι DIM αναστέλλει οιστρογόνων μεσολαβείται αύξηση της μετανάστευσης κυττάρων θυρεοειδούς, την προσκόλληση και εισβολή, το οποίο υποστηρίζεται επίσης από ER-α μειορύθμιση μελέτες (siRNA). κηλίδα Western και ζυμογραφία αναλύσεις που προβλέπονται άμεσες αποδείξεις για αυτό το DIM μεσολαβεί αναστολή της Ε

2 ενισχυμένη συνδέονται μετάσταση γεγονότα λόγω της στόχευσης ουσιωδών πρωτεολυτικών ενζύμων, δηλαδή ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9.

Συμπέρασμα /Σημασία

αναφορές δεδομένων μας για πρώτη φορά ότι DIM εμφανίζει αντι-οιστρογονική δραστικότητα παρόμοια με την αναστολή της οιστραδιόλης ενισχυμένη θυρεοειδούς τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και

in vitro

συνδέονται μετάσταση γεγονότα, δηλαδή προσκόλληση, μετανάστευση και εισβολή. Πιο σημαντικά, ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9, τα οποία είναι γνωστά για την προώθηση και την ενίσχυση της μετάστασης, προσδιορίστηκαν να είναι στόχοι της DIM. Αυτή η αντι-οιστρογόνα όπως ιδιοκτησία της DIM μπορεί να οδηγήσει στην ανάπτυξη ενός νέου προληπτική ή /και θεραπευτική συμπλήρωμα διατροφής για ασθενείς με καρκίνο του θυρεοειδούς με τη στόχευση εξέλιξη της νόσου

Παράθεση:. Rajoria S, Suriano R, Γιώργος Α , Shanmugam Α, Schantz SP, Geliebter J, et al. (2011) Το οιστρογόνο Induced Μεταστατικός Διαμορφωτές ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 είναι στόχοι 3,3′-Diindolylmethane στον καρκίνο του θυρεοειδούς. PLoS ONE 6 (1): e15879. doi: 10.1371 /journal.pone.0015879

Συντάκτης: Τσαντ Creighton, Baylor College of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 6 Οκτ, 2010? Αποδεκτές: 25 του Νοέμβρη 2010? Δημοσιεύθηκε: 18 Γενάρη, 2011

Copyright: © 2011 Rajoria et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το National Cancer Institute 1R01CA131946 και κλινικές χρηματοδότηση από την Νέα Υόρκη μάτι και το αυτί θεραπευτήριο, Νέα Υόρκη, Νέα Υόρκη. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Οι συχνότητες εμφάνισης θυρεοειδικής πολλαπλασιαστικών ασθενειών (TPD) συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του θυρεοειδούς και βρογχοκήλη, είναι συνεχώς αυξανόμενη με καρκίνο του θυρεοειδούς είναι η πιο συχνή μεταξύ των ενδοκρινών καρκίνους [1], [2]. Πρόσφατες στατιστικές δείχνουν 37.000 νέα κρούσματα διαγνώστηκαν μόνο στις ΗΠΑ το 2009 και σε όλο τον κόσμο σχεδόν 27 εκατομμύρια ασθενείς που πάσχουν [2]. Τα καλά διαφοροποιημένο θηλώδες και θυλακιώδες καρκίνων του θυρεοειδούς παραλλαγές αντιπροσωπεύουν περισσότερο από το 90% όλων των καρκίνων του θυρεοειδούς και είναι επεμβατική & amp? μεταστατικό [3]. Οι τρέχουσες θεραπείες για TPD περιλαμβάνουν χειρουργική επέμβαση περιλαμβάνει την πλήρη ή μερική αφαίρεση του θυρεοειδούς αδένα, ραδιενεργό ιώδιο (Ι

131) θεραπεία, χημειοθεραπεία ή συνδυασμό όλων [4]. Αυτές οι θεραπείες απαιτούν συχνά τους ασθενείς να λαμβάνουν αντικατάστασης ορμονών του θυρεοειδούς σε όλη τη ζωή [4], [5] με το ποσοστό υποτροπής είναι σε απαράδεκτα υψηλά επίπεδα, φθάνοντας σχεδόν το 20-30% [5], [6]. Τα τελευταία χρόνια, το ποσοστό υποτροπής και μη ανταπόκρισης στις συμβατικές θεραπείες του θυρεοειδούς αυξήθηκε δικαιολογούν έτσι διερεύνηση νέων προληπτικών και θεραπευτικών μέτρων, κατά προτίμηση με τη χρήση φυσικών ενώσεων που υπάρχουν στη διατροφή.

Διατροφή ανέκαθεν πρωταρχική σημασία στην ένωσή του με την ανάπτυξη του καρκίνου και την πρόληψη [7] – [9]. Όσον αφορά την πρόληψη του καρκίνου, αρκετές μελέτες έχουν βρει μια αντίστροφη συσχέτιση του κινδύνου για καρκίνο με την κατανάλωση των διαιτητικών προϊόντων, όπως ντομάτες, σόγια και σταυρανθή λαχανικά [7] – [10]. Συγκεκριμένα, έχουν σταυρανθή λαχανικά όπως το μπρόκολο, το λάχανο, το κουνουπίδι και το λάχανο γίνει αποδεκτή από διάφορους οργανισμούς, συμπεριλαμβανομένου του National Cancer Institute και Ομοσπονδιακή Drug Administration, να έχει προληπτική δράση κατά της ανάπτυξης όγκων, ιδιαίτερα των οιστρογόνων ανταποκρίνεται ιστό [7], [8 ]. Σταυρανθή λαχανικά περιέχουν διάφορες φυτο-χημικές ουσίες, συμπεριλαμβανομένων ινδολο-3-καρβινόλη (I3C), που είναι ένας αποτελεσματικός από του στόματος χημειοπροληπτικός παράγοντας κατά των καρκίνων του μαστού και του προστάτη [11] – [13]. I3C μετατρέπει αυθόρμητα να διμερούς προϊόντος του, 3,3′-Diindolylmethane (DIM) σε χαμηλό ρΗ [11] – [14]. ΔΗΜ είναι μια σταθερή ένωση και μια αξιολόγηση της ασφάλειας αποκαλύπτει ότι η μακροχρόνια χορήγηση του DIM (μέχρι 12 μήνες) σε ποντίκια δεν οδήγησε σε καμία εμφανή νεφρική, καρδιο ή γαστρεντερική τοξικότητα [15]. Αυτό υποδηλώνει ότι DIM μπορεί να είναι μια πολλά υποσχόμενη φυσικά διαθέσιμα βιοδραστική ένωση η οποία μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως αντικαρκινική παράγοντας καθώς παρέχει μια ασφαλέστερη και προβλέψιμη απόκριση.

Επί του παρόντος, η ακριβής κυτταρικών και βιοχημικών μηχανισμός με τον οποίο DIM εξασκεί αντικαρκινική αποτελέσματά της Μένει να διευκρινιστεί πλήρως, αλλά με βάση την διαθέσιμη βιβλιογραφία, ΔΗΜ παρεμβαίνει με διάφορα μονοπάτια μεταγωγής σήματος. Σε καρκίνους του μαστού και του προστάτη, DIM έχει παρατηρηθεί ότι επάγουν δοσοεξαρτώμενη απόπτωση με αναστολή ΑΚΤ κινάσης και ΙΚΚ μεσολάβηση ΙκΒα φωσφορυλίωση, οδηγώντας έτσι σε αδρανοποίηση των ΑΚΤ και μετατόπιση του ΝΡκΒ στον πυρήνα, με αποτέλεσμα την μειωμένη ανάπτυξη των κυττάρων και τον πολλαπλασιασμό [16] , [17]. Επίσης, έχει αναφερθεί ότι η DIM εξασκεί χημειοπροληπτική επιδράσεις του στην ορμόνη καρκίνων που εξαρτώνται όπως του μαστού με προς τα πάνω ρύθμιση του p21

WAFI /Cip1 και την ενεργοποίηση της οδού της JNK [18]. Είναι ενδιαφέρον, ένα πιθανός στόχος της δραστηριότητας ΔΗΜ είναι μεταβολισμό των οιστρογόνων. Dalessandri et al. έχει δείξει ότι DIM αύξησε τα επίπεδα του 2-hydroxyestrones σε μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες με ιστορικό καρκίνου του μαστού με αποτέλεσμα μια συνολική αύξηση σε 2-hydroxyestrones να 16α–υδροξυεστρόνη αναλογία [19] ευνοώντας έτσι αντι-πολλαπλασιαστικές συνθήκες. Smith et al. έχουν αποδείξει ότι DIM, μαζί με ένα φυτοοιστρογόνα, γενιστεΐνη μπορεί να ρυθμίζουν το μεταβολισμό των οιστρογόνων προς 2-υδροξυλίωση των οιστρογόνων ευαίσθητων κυττάρων καρκίνου του προστάτη [20]. Πρόσφατα, έχουμε επίσης ανακαλύψει στο εργαστήριο μας ότι DIM μπορεί να διαμορφώσει τον μεταβολισμό των οιστρογόνων σε ασθενείς με TPD με αποτέλεσμα την αύξηση του λόγου του 2-hydroxyestrones να 16α–υδροξυεστρόνη (αδημοσίευτα δεδομένα), υποδεικνύοντας τη χρήση των διαιτητικών ενώσεων, όπως DIM, σε πρόληψης TPD.

με βάση όλες τις διαθέσιμες πληροφορίες και να συζητηθούν στη βιβλιογραφία, η μελέτη αυτή σχεδιάστηκε για να καθοριστεί ο μηχανισμός (ες), υπεύθυνο για τις αντικαρκινικές επιδράσεις του DIM στον καρκίνο του θυρεοειδούς. Αναφέρουμε ότι DIM μπορεί να έχει θεραπευτικά αποτελέσματα ενεργώντας ως χημειο-προληπτικός παράγοντας που διαθέτουν αντι-οιστρογονική ιδιότητες στα κύτταρα του θυρεοειδούς λόγω της προς τα κάτω ρύθμιση του οιστρογόνου που προκαλείται κυτταρική φαινότυποι πρόσφυσης, εισβολή και τη μετανάστευση. Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι το αντι-οιστρογόνο όπως ιδιότητα του DIM αποδίδεται στην στόχευση της έκφρασης των μεταλλοπρωτεϊνασών μήτρας (MMPs), οι οποίες είναι απαραίτητες πρωτεάσες που εμπλέκονται στην προσκόλληση, εισβολή και τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων. Επιπλέον, το γεγονός ότι οι MMPs είναι υπό την μεταγραφική ρύθμιση του στοιχείου απόκρισης οιστρογόνου (ERE) προσδίδει περαιτέρω αξιοπιστία ότι ΔΗΜ διαθέτει αντι-οιστρογονική ιδιότητες.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια

Τέσσερις κυτταρικές σειρές θυρεοειδούς χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη, BCPAP (ανθρώπινα θηλώδους καρκίνου του θυρεοειδούς κυτταρική γραμμή), 8505C (ανθρώπινη θηλώδους καρκίνου του θυρεοειδούς κυτταρική γραμμή), CGTHW-1 (ανθρώπινη θυλακιώδη κυτταρική σειρά καρκίνου του θυρεοειδούς) και ML-1 (ανθρώπινο θυλακιώδη καρκίνο του θυρεοειδούς). BCPAP, 8505C και CGTHW-1 καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 (Mediatech, Herndon, VA) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) (Atlanta Biologicals, Atlanta, GA), πενικιλλίνη 10.000 IU /ml, στρεπτομυκίνη 10,000 μg /ml (Mediatech) και 2 mM L-γλουταμίνη (Mediatech) mL-1 αναπτύχθηκε σε ϋΜΕΜ (Mediatech) συμπληρωμένο με 10% FBS, πενικιλίνη 10000 IU /ml, στρεπτομυκίνη 10,000 μg /ml και 2 mM L-γλουταμίνη. BCPAP, 8505C, CGTHW-1 και ML-1 κυτταρικές σειρές αγοράστηκαν από την DSMZ, Braunschweig, Γερμανία. MCF-7 (ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών μαστού γραμμή) ελήφθη από την American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA) και αναπτύχθηκαν σε DMEM συμπληρωμένο με 10% FBS, πενικιλίνη, στρεπτομυκίνη, ινσουλίνη και L-γλουταμίνη.

Western Blot ανάλυση

τα κύτταρα συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας 0.25% θρυψίνη (Mediatech), πλύθηκαν με PBS και λύθηκαν (1 × 10

6/100 μι ρυθμιστικού λύσης) χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ραδιοανοσοκατακρήμνισης (RIPA) ρυθμιστικό [50 mM Tris-HCl (ρΗ 7,4), 150 mM NaCl, 0.2% δεοξυχολικό νάτριο, 0,1% SDS, 0,5% ΝΡ40, 1 μΜ Pefabloc] και επωάζεται σε πάγο για 30 λεπτά με διαλείπουσα περιδίνηση. Τα προϊόντα λύσης φυγοκεντρήθηκαν στις 14.000 rpm για 30 λεπτά στους 4 ° C και το υπερκείμενο συλλέχθηκαν. Τα κυτταρικά λύματα (20 μα πρωτεΐνης) υποβλήθηκαν σε 12% SDS-PAGE υπό αναγωγικές συνθήκες (παρουσία του β-μερκαπτοαιθανόλη) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [21], [22]. Εν συντομία, οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες Immobilon-P στα 220 mA για 2 ώρες και οι μεμβράνες αποκλείσθηκαν με 4% ξηρό γάλα σε TBST [200 mM Tris-HCl, ρΗ 7.4, 150 mM NaCl, και 0,01% Tween-20 προστίθεται φρέσκο /λίτρο 1 × TBS (TBST)] για τουλάχιστον 2-3 ώρες σε έναν αναδευτήρα σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, οι μεμβράνες επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C είτε με ER-α (Abcam, Cambridge, ΜΑ), ER-β (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) ή αντίσωμα ακτίνης (Santa Cruz Biotechnology) σε TBST. Οι μεμβράνες πλύθηκαν τρεις φορές με TBST και επωάστηκαν με το αντίστοιχο υπεροξειδάση (HRP) δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο, για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου σε TBST που περιείχε 2% γάλα. Μετά από τέσσερις πλύσεις με ΤΒδ-Τ και μία πλύση με TBS, οι μεμβράνες αναπτύχθηκαν με ECL υποστρώματος (Pierce Rockford, IL) και ανιχνεύθηκαν σε Denville ταινίες αυτοραδιογραφία.

ΧΤΤ δοκιμασία πολλαπλασιασμού των κυττάρων

Δύο χιλιάδες κύτταρα σε 200 μΙ μέσου τοποθετήθηκαν σε κάθε φρεάτιο πλακών 96-φρεατίων και επωάζονται όλη τη νύκτα για να επιτρέψει προσκόλληση των κυττάρων. Το μέσο απομακρύνθηκε και 3,3′-Diindolylmethane (DIM), παραχωρήθηκε ευγενικά από τον Dr. Michael Zeligs (Βιοαντίδραση, Boulder, Colorado) προστέθηκε σε συγκεντρώσεις είτε 10, 25, 50, 75, 100, ή 500 μΜ σε μια συνολικό όγκο 200 μΐ και επωάστηκαν για 24 ώρες. Τα μέσα απορρίφθηκαν και προστέθηκαν φρέσκο ​​μέσο ανάπτυξης χωρίς DIM ακολουθούμενη από προσθήκη 50 μΐ ΧΤΤ [1 mg /ml σε RPMI άνευ ορού + φαιναζίνη (25 ηΜ)]. Μετά από 4 ώρες επώασης, η OD ελήφθη σε μία συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας σε 450 nm και αναφοράς στα 630 nm. Οι μέσες OD τιμές υπολογίστηκαν για κάθε δόση στα αντίστοιχα χρονικά σημεία και το ποσοστό επιβίωσης ως συνάρτηση του χρόνου και της δόσης για να συγκριθούν τα πειραματικά και ελέγχου ομάδων.

κλωνογονική δοκιμασία

Για προσδιοριστεί η επίδραση του DIM στις κλωνογονικότητας, BCPAP, 8505C, CGTHW-1 και ML-1 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες έξι φρεατίων (200 κύτταρα ανά φρεάτιο). Τα κύτταρα αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη την νύχτα μετά την οποία φρέσκο ​​μέσο που περιέχει ± 10

-8 Μ Ε

2 ± 50 μΜ DIM προστέθηκε ή αφεθεί χωρίς θεραπεία. Μετά από 21 ημέρες σε καλλιέργεια, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας 0.025% Coomassie brilliant blue R250 (σε 50% μεθανόλη και 10% οξικό οξύ) για να απεικονίσει κυτταρικές αποικίες. Οι αποικίες μετρήθηκαν, και το ποσοστό αναστολής της ικανότητας κλωνισμού καθορίστηκε στα επεξεργασμένα κύτταρα.

Δοκιμασία Transwell Μετανάστευση

BD Biocoat Ενθέματα Ελέγχου (BD Biosciences, Bedford, ΜΑ) με μεμβράνη πόρων 8-μm φίλτρα που χρησιμοποιούνται για τη δοκιμασία μετανάστευσης όπως περιγράφηκε προηγουμένως [21], [23]. Εν συντομία, τα κύτταρα στερήθηκαν τροφής για 18 ώρες χρησιμοποιώντας μέσο στέρησης [ελεύθερο ερυθρού φαινόλης μέσο συμπληρωμένο με 10% FBS απογυμνωμένο από ξυλάνθρακα (Sigma Chemical Co.) και πενικιλλίνη (10.000 IU /ml)]. Τα κύτταρα στη συνέχεια συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση και 2,5 χ 10

4 κύτταρα σπάρθηκαν στον άνω θάλαμο σε 500 μΙ μέσου που περιέχει 1% FBS ± 10

-8 ME

2 ± 10

-6 M fulvestrant ± 25 μΜ ΔΗΜ. Το κάτω θάλαμος περιείχε 750 μΙ μέσου συμπληρωμένου με 5% FBS. Μετά από 18 ώρες επώασης, τα μη μεταναστεύοντα κύτταρα απομακρύνθηκαν από την άνω επιφάνεια της μεμβράνης με ήπια τρίψιμο χρησιμοποιώντας βαμβάκι στυλεό. Τα κύτταρα στην κάτω επιφάνεια της μεμβράνης στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν χρησιμοποιώντας μεθανόλη και χρωματίστηκαν με τη χρήση 1% μπλε τολουϊδίνης 1% λεκές βόρακα που ακολουθείται από δύο πλύσεις με αποσταγμένο νερό. Ένθετα στη συνέχεια αφέθηκαν να airdry και μετρήθηκαν σε 10Χ πεδίο. Τα δεδομένα εκφράζονται ως αριθμοί των κυττάρων ανά μετανάστευσαν 10Χ πεδίο μικρογραφία για κάθε δείγμα καλά και ομαλοποιήθηκε ως προς τον αριθμό των κυττάρων που λαμβάνονται από το μη επεξεργασμένο μάρτυρα.

ξυστό πληγών Δοκιμασία

μεταναστευτική ικανότητα BCPAP, 8505C, CGTHW -1 και ML-1 κύτταρα εκτιμήθηκε επίσης με μία δοκιμασία γρατσουνιά πληγή. 5 × 10

5 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκα έξι και αφέθηκαν να προσκολληθούν και να αναπτυχθούν σε 60-70% συρρέουσες μονοστοιβάδες κυττάρων. Στη συνέχεια, τρεις κάθετες πληγές προκλήθηκαν ανά φρεάτιο χρησιμοποιώντας ένα 2,5 μl άκρο αποστειρωμένο σιφώνιο που ακολουθείται από απομάκρυνση οποιασδήποτε κυτταρικών υπολειμμάτων και αποσπασμένων κυττάρων. Οι τραυματίες κυτταρική μονοστιβάδα στη συνέχεια επωάζονται σε φρέσκο ​​πλήρες μέσο με ή χωρίς 25 και 50 μΜ DIM και οιστραδιόλης. Μία οριζόντια γραμμή έγινε για να επιτρέψει την απεικόνιση των κυττάρων στο ίδιο σημείο. Τα κύτταρα επιθεωρήθηκαν κάθε τρεις ώρες μέχρις ότου τα κύτταρα μηδέν για τον έλεγχο πλήρως μετανάστευσαν από το ένα άκρο της πληγής σε άλλα, το οποίο ήταν 24 ώρες για τα BCPAP, 8505C και CGTHW-1 και 48 ώρες για τα ML-1. Εικόνες ελήφθησαν ακριβώς πάνω και κάτω από το οριζόντιο σήμα χρησιμοποιώντας ένα ελαφρύ μικροσκόπιο σε 5Χ.

Πρόσφυση Κυττάρων δοκιμασία

BCPAP, 8505C, CGTHW-1 και ML-1 κύτταρα συλλέχθηκαν όπως περιγράφεται και σπάρθηκε σε πυκνότητα 5 χ 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο σε δίσκους καλλιέργειας 6 φρεατίων σε μέσα συμπληρωμένα με ± 10

-8 ME

2 ± 10

-6 Μ fulvestrant ± 25 μΜ DIM ή αφεθεί χωρίς θεραπεία και αφέθηκαν να προσκολληθούν για 2 ώρες. Μετά δεικνυόμενα χρονικά σημεία, μέσο με μη-προσκολλημένα κύτταρα απομακρύνθηκε και τα φρεάτια πλύθηκαν ήπια δύο φορές με PBS για να απομακρυνθούν οποιαδήποτε χαλαρά προσκολλημένα κύτταρα. Τα προσκολλημένα κύτταρα στη συνέχεια αποξέστηκαν και μετρήθηκαν με 0.4% μπλε της τρυπάνης διάλυμα (Sigma Chemical Co., St. Louis, ΜΟ). Οι αριθμοί των προσκολλημένων κυττάρων μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας αιμοκυτόμετρο και η επίδραση της DIM επί κυτταρικής προσκόλλησης εκφράστηκε ως επί τοις εκατό μείωση του αριθμού των προσκολλημένων κυττάρων για τη κύτταρα κατεργασμένα με DIM σχέση με τα κύτταρα ελέγχου.

δοκιμασία Invasion

δοκιμασία εισβολή πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [21] χρησιμοποιώντας BD Biocoat αυξητικός παράγοντας μειωμένη θαλάμους εισβολής σε Matrigel (BD Biosciences, Bedford, ΜΑ) με φίλτρα μεμβράνης πόρων 8-μm που επικαλύφθηκαν με matrigel. Το πρωτόκολλο ήταν ουσιαστικά η ίδια όπως δοκιμασία μετανάστευσης εκτός του ότι παράγοντας ανάπτυξης θάλαμοι εισβολής ελαττωμένη Matrigel επανυδατώθηκαν για 2 ώρες χρησιμοποιώντας μέσο ελεύθερο ορού RPMI στους 37 ° C πριν από την φόρτωση των κυττάρων ένθετα. Μόλις επανυδατώθηκαν, 2.5 × 10

4 κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε RPMI (500 μλ) που περιέχει 1% FBS με ± 10

-8 ME

2 ± 10

-6 Μ fulvestrant ± 25 μΜ DIM και μεταφέρθηκαν προσεκτικά πάνω στην άνω επιφάνεια των φίλτρων στο θάλαμο. Τα κύτταρα αφέθηκαν να εισβάλουν για 18 ώρες μετά από την οποία τα κύτταρα βάφτηκαν και μετρήθηκαν όπως περιγράφηκε για τη δοκιμασία μετανάστευσης. Ποσοστό εισβολή υπολογίστηκε με βάση το ποσοστό των κυττάρων που εισβάλλουν μέσω του παράγοντα ανάπτυξης μειώνεται θαλάμους εισβολή matrigel σε σχέση με τα κύτταρα που μεταναστεύουν μέσω της μεμβράνης ελέγχου.

ΜΜΡ

ανίχνευση

κύτταρα του θυρεοειδούς σπάρθηκαν σε πυκνότητα 5 × 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο σε δίσκους καλλιέργειας 6 φρεατίων και αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύκτα μετά τον οποίο στη συνέχεια άλλαξαν σε μέσο ελεύθερο ορού και επωάστηκαν με ± 10

-8 ME

2 ± 10

-6 M fulvestrant ± 25 μΜ DIM ή αφέθηκαν χωρίς επεξεργασία επί 24 ώρες. Ρυθμισμένο μέσο συλλέχθηκε, φυγοκεντρήθηκε για την απομάκρυνση τυχόν υπολειμμάτων και δείγματα φυλάχτηκαν στους -80 ° C μέχρι να αναλυθούν για ΜΜΡ-2 και την έκκριση ΜΜΡ-9 και η δραστικότητα όπως περιγράφεται παραπάνω [24], [25]. Εν συντομία, η ολική συγκέντρωση πρωτεΐνης του ρυθμισμένου μέσου προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη βαφή δοκιμασία πρωτεΐνης Bio-Rad και ίσες πρωτεΐνες χρησιμοποιήθηκαν για κάθε πείραμα. Για ζυμογραφία ζελατίνης, γέλες SDS-PAGE συμπολυμερίζεται με 0,1% ζελατίνη (Sigma Chemical Co.) και 1 μg πρωτεΐνη αναλύθηκε κάτω από μη αναγωγικές συνθήκες. Μετά την ηλεκτροφόρηση, τα πηκτώματα πλύθηκαν δύο φορές σε ρυθμιστικό διάλυμα αναδιάταξης (2,5% Triton Χ-100 σε απεσταγμένο νερό) για 1 ώρα σε έναν τροχιακό αναδευτήρα. Οι ζυμογραμμάτων επωάστηκαν για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου ακολουθούμενη από 36 ώρες στους 37 ° C σε ρυθμιστικό ζυμογραφία (5 mM ΟαΟ

2, 0,2 mM NaN

3 και 1 μΜ ΖηΟ

2 σε 50 mM Τρις- HCl) με ρυθμιστικό διάλυμα αλλάζει κάθε 12 ώρες. Τα πήγματα στη συνέχεια βάφτηκαν με Coomassie blue (G-250 κηλίδα, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) και αποχρωματίζονται με 10% μεθανόλη και 7,5% οξικό οξύ. Η ανάλυση στυπώματος Western διεξήχθη χρησιμοποιώντας ρυθμισμένο μέσο από καρκίνο του θυρεοειδούς κύτταρα (ίσες συγκεντρώσεις πρωτεΐνης), όπως περιγράφεται στο προηγούμενο τμήμα, χρησιμοποιώντας ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 (Cell Signaling Technology Inc, Danvers, ΜΑ) αντισώματα. Για την αναστολή ΜΜΡ, χρησιμοποιήθηκε γενική ΜΜΡ αναστολέα 1,10 φαινανθρολίνη (Sigma Chemical Co.). 2,5 × 10

4 κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε RPMI (500 μλ) που περιέχει 1% FBS με ± 10

-8 ME

2 ± 20 μΜ 1,10 φαινανθρολίνη ± 25 μΜ DIM και σπάρθηκαν σε BD Biocoat εισάγει ελέγχου για τη μετανάστευση και την matrigel επικάλυψη ένθετα για την εισβολή, όπως περιγράφεται στις προηγούμενες ενότητες.

siRNA και επιμόλυνση συνθήκες

για φίμωση μελέτες υποδοχέα οιστρογόνων, ER-α μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) και siRNA επιμόλυνση αντιδραστήριο (DharmaFECT1) ελήφθησαν από Dharmacon (Dharmacon, Inc., Lafayette, CO). BCPAP και MCF-7 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε τρυβλία 6 φρεατίων και αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύκτα. Τα κύτταρα μορφομετατράπηκαν για 48 ώρες, και ακολούθως trasfected κύτταρα συλλέχθηκαν και σπάρθηκαν επί BD Biocoat Ελέγχου Ένθετα (μετανάστευση) και matrigel επικαλυμμένα ενθέματα (εισβολή) σε μέσα που περιέχουν 1% FBS ± 10

-8 ME

2 ± 10

-6 Μ fulvestrant ± 25 μΜ ΔΗΜ. Μη επιμολυσμένα θυρεοειδούς καρκινικά κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με ± 10

-8 Μ Ε

2 ± 10

-6 Μ fulvestrant ± 25 μΜ ΔΗΜ χρησιμοποιήθηκαν ως κατάλληλη θετικοί έλεγχοι. Οι μελέτες της μετανάστευσης και της εισβολής διεξήχθησαν όπως περιγράφεται στις προηγούμενες ενότητες.

Στατιστική Υπολογισμός

Τα πειράματα που παρουσιάζονται εδώ αντιπροσωπεύουν τρεις επαναλήψεις με στατιστική σημαντικότητα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα αντιστοιχισμένο

t

test του Student με πιθανότητα ( «

σ

‘αξία) ≤0.05 χρησιμοποιείται για να απορρίψει τη μηδενική υπόθεση.

Αποτελέσματα

κύτταρα του θυρεοειδούς εκφράζουν τον υποδοχέα οιστρογόνων

Ο θυρεοειδής είναι δεν είναι γνωστό να ενεργεί ως μια παραδοσιακή οιστρογόνα αποκρίνεται ιστού όπως του μαστού. Προκειμένου να προσδιοριστεί η κατάσταση του υποδοχέα οιστρογόνου σε κύτταρα του θυρεοειδούς, χρησιμοποιήσαμε τέσσερα θυρεοειδούς κυτταρικές σειρές ως μοντέλα κυτταρικής καλλιέργειας μας. BCPAP και 8505C είναι ανθρώπινα θηλώδους κυτταρικές σειρές καρκίνου του θυρεοειδούς, CGTHW-1 και ML-1 είναι ανθρώπινες κυτταρικές σειρές θυλακιώδη καρκίνο του θυρεοειδούς. Παρατηρήσαμε ότι όλες οι κυτταρικές σειρές του θυρεοειδούς δοκιμάστηκαν εξέφρασαν τα δύο ισόμορφα του υποδοχέα οιστρογόνου (ER), ER-α και ΥΟ-β (Εικ. 1) σε συγκρίσιμα επίπεδα. MCF-7, ένα κλασσικό ER που εκφράζει καρκινικό κύτταρο μαστού γραμμή, χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος για την ανίχνευση και των δύο πολυμορφικές μορφές της Π.Α. (ER-α και ΥΟ-β).

πρωτεΐνη ολόκληρου κυττάρου (20 μg) επιλύθηκε με SDS-PAGE ακολουθούμενη από ανάλυση στυπώματος Western για ER-α (αραίωση 1:500), ER-β (αραίωση 1:1000) και ακτίνης (αραίωση 1:5000). Όλες οι κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη (BCPAP, 8505C, CGTHW-1 και ML-1) εκφράζουν τόσο ΥΟ-α και ΥΟ-β σε συγκρίσιμα επίπεδα.

Η

DIM έχει αντι-πολλαπλασιαστικό αποτέλεσμα επί θυρεοειδικών κυττάρων

DIM, μια φυσική ένωση από σταυρανθή λαχανικά έχει παρατηρηθεί ότι έχουν αντι-πολλαπλασιαστικές ιδιότητες κατά διαφόρων ορμονών αποκρίνεται καρκίνων [14], [16] – [18]. Θελήσαμε να αξιολογηθεί η επίδραση της DIM στο πολλαπλασιαστική δραστηριότητα του καρκίνου του θυρεοειδούς και για να γίνει αυτό, ένας προσδιορισμός ΧΤΤ διεξήχθη και τα αποτελέσματα φαίνονται στον Πίνακα 1. Όλες οι κυτταρικές σειρές (BCPAP, 8505C, CGTHW-1 και ML -1) που χρησιμοποιήθηκε σε αυτή τη μελέτη υποβλήθηκαν σε αγωγή με διάφορες συγκεντρώσεις DIM για 24 ώρες. Μία δοσοεξαρτώμενη αναστολή της βιωσιμότητας των κυττάρων παρατηρήθηκε με ένα 50% αναστολή σε συγκέντρωση περίπου 50 μΜ DIM κατά την διάρκεια 24 h θεραπείας σε όλες τις τέσσερις κυτταρικές σειρές, BCPAP, 8505C, CGTHW-1 και ML-1. Με βάση αυτές τις παρατηρήσεις (Πίνακας 1), τα 25 μΜ DIM συγκέντρωση αυτή χρησιμοποιήθηκε για τον περαιτέρω χαρακτηρισμό των επιπτώσεων της DIM σε κύτταρα του θυρεοειδούς τόσο σε μοριακή και φαινοτυπική επίπεδα.

Η

DIM αναστέλλει την κλωνογόνο ικανότητα του θυρεοειδούς κύτταρα

Μία από τις ιδιότητες σήμα κατατεθέν των καρκινικών κυττάρων είναι η ικανότητα να διαιρούνται υπό απομονωμένες συνθήκες χρησιμοποιώντας ελάχιστη παρακρινείς και πιθανώς περισσότερο αυτοκρινείς παράγοντες [26]. Η αντικαρκινική δράση του DIM στην ικανότητα των BCPAP, 8505C, CGTHW-1 και ML-1 κύτταρα να διαιρούνται απεριόριστα αξιολογήθηκε με δοκιμασία κλωνογόνο επιβίωση των κυττάρων. Διακόσια κύτταρα ανά φρεάτιο σε έξι τρυβλία υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 50 μΜ DIM ± οιστραδιόλη για 21 ημέρες. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 2, τα μη επεξεργασμένα κύτταρα του θυρεοειδούς έχουν την ικανότητα να σχηματίζουν κλώνους ενώ τα οιστρογόνα θεραπεία είχε ως αποτέλεσμα περίπου 8 (8505C) -33% (ML-1) αύξηση του σχηματισμού κλώνου, ανάλογα με κυτταρικές σειρές. DIM εντελώς κατάργησε κλώνος σχηματισμό όλες τις κυτταρικές σειρές, ανεξάρτητα από το εάν έλαβαν αγωγή με οιστραδιόλη. Αυτά τα πειράματα καθοριστεί η διαφορική ανταπόκριση των διαφορετικών καρκίνου του θυρεοειδούς κύτταρα για οιστραδιόλη και η αντι-οιστρογονική δράση της ΔΗΜ.

Η

ΔΗΜ μειώνει τη μεταναστευτική ικανότητα των κυττάρων του θυρεοειδούς

Τα καρκινικά κύτταρα έχουν μια ενισχυμένη ικανότητα να μεταναστεύουν σε γειτονικές ιστό και ορισμένους παράγοντες όπως η οιστραδιόλη έχουν παρατηρηθεί για να βοηθήσουν σε αυτή τη διαδικασία μετάβασης. Οι θεραπευτικοί παράγοντες που μπορούν να μειώσουν την ικανότητα αυτών των κυττάρων να μεταναστεύουν μπορεί να μειώσει πιθανώς αποτελεσματικά τον κίνδυνο μετάστασης. Εχουμε προηγουμένως αποδείξει ότι τα κύτταρα του θυρεοειδούς έχουν την ικανότητα να αυξάνουν τη μετανάστευση σε απόκριση προς τα οιστρογόνα [21] και για να καθοριστεί εάν DIM μπορεί να επηρεάσει τη μεταναστευτική δυναμικό αυτών των κυττάρων,

σε διεξήχθησαν vitro

δοκιμασίες μετανάστευσης. Πεινασμένο κύτταρα του θυρεοειδούς σπάρθηκαν σε ένα θάλαμο μετανάστευση transwell με οιστραδιόλη ± fulvestrant ή ± 25 μΜ DIM και αφέθηκε να μεταναστεύσουν. Παρατηρήσαμε ότι τα κύτταρα του θυρεοειδούς ήταν ικανά να μεταναστεύουν και αυτή η ικανότητα να μεταναστεύουν ενισχύθηκε όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Ε

2 (γκρίζες ράβδοι) σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα με 30% αύξηση στην μετανάστευση για BCPAP, 50% για 8505C, 89% για CGTHW-1 και 63% για ML-1 (Σχ. 2Α). Αυτή η αύξηση στην κυτταρική μετανάστευση καταργήθηκε όταν fulvestrant χρησιμοποιήθηκε μαζί με οιστραδιόλη [διακεκομμένη bars) υποδηλώνοντας ότι η μεταναστευτική ικανότητα αυτών των κυττάρων του θυρεοειδούς επηρεάζεται από οιστρογόνα και ένας ανταγωνιστής του υποδοχέα οιστρογόνου έχει κατήργησε την μετανάστευση αυτών των κυττάρων. ΔΗΜ (25 μΜ) μείωσε σημαντικά τη μετανάστευση των θυρεοειδικών κυττάρων (μαύρες μπάρες). Αυτή η μείωση παρατηρήθηκε να είναι περίπου 37-57% και ήταν κυτταρική γραμμή εξαρτάται. Επιπλέον, η προσθήκη της οιστραδιόλης, μαζί με 25 μΜ DIM (ριγέ μπαρ) δεν βελτίωσε τη μεταναστευτική ικανότητα των κυττάρων του θυρεοειδούς, που σηματοδοτεί την αντι-οιστρογόνο όπως η ικανότητα της ΔΗΜ.

(Α) 2,5 × 10

4 κύτταρα επανααιωρήθηκαν σε 500 μλ RPMI με 1% FBS ± 10

-8 ME

2 ± 10

-6 Μ fulvestrant ± 25 μΜ DIM και σπάρθηκαν στο άνω θάλαμο του BD Biocoat Ελέγχου Ενθέματα (8- πόρου μm φίλτρα μεμβράνης). 750 μΙ RPMI που περιέχει 5% FBS προστέθηκε στον κάτω θάλαμο ως χημειοελκτικό. Μετά από 18 ώρες, τα κύτταρα που μετανάστευσαν μονιμοποιήθηκαν, χρωματίστηκαν και μετρήθηκαν κάτω από τον αντικειμενικό φακό 10Χ. Οι ομάδες έχουν ως εξής- χωρίς θεραπεία (λευκές ράβδοι), Ε

2 αγωγή (γκρι γραμμές), Ε

2 + fulvestrant (διακεκομμένη μπαρ), 25 μΜ DIM (μαύρες μπάρες) και Ε

2 25 μΜ ΔΗΜ αγωγή (ριγέ μπαρ). Τα δεδομένα εκφράζονται ως αριθμοί των κυττάρων που μετρήθηκαν (μετανάστευσαν κύτταρα) για κάθε δείγμα και ομαλοποιήθηκε ως προς τον αριθμό των κυττάρων που λαμβάνεται από το μη επεξεργασμένο μάρτυρα. Ο αστερίσκος υποδηλώνει στατιστικώς σημαντικές διαφορές (

ρ

& lt? 0,05) μεταξύ των υποδεικνυόμενων δειγμάτων. δοκιμασία πληγή μηδέν για BCPAP (Β) και CGTHW-1 (C). 5 × 10

5 κύτταρα επιστρώθηκαν και αφέθηκαν να αναπτυχθούν σε ημι συρρέουσες μονοστιβάδες μετά από το οποίο δημιουργήθηκε ένα «κάθετο πληγή» και τα κύτταρα αφέθηκαν να μεταναστεύσουν παρουσία είτε 25 μΜ ή 50 μΜ DIM. Τα κύτταρα έγιναν ορατά κάτω από 5Χ κάθε τρεις ώρες και φωτογραφική τεκμηρίωση ελήφθη σε 18 ώρες όταν τα κύτταρα εντελώς μετανάστευσαν από το ένα άκρο του «μηδέν» στην άλλη άκρη σε χωρίς θεραπεία ελέγχους.

Η

Για την περαιτέρω επικύρωση του αποτελέσματος του DIM στο μεταναστευτικά ικανότητα των κυττάρων του θυρεοειδούς, μία δοκιμασία γρατσουνιά πληγή διεξήχθη, η οποία είναι μία μερική

in vivo

αναπαράσταση του μεταστατικού φαινοτύπου [27]. κύτταρα του θυρεοειδούς (BCPAP, 8505C, CGTHW-1 και ML-1) αναπτύχθηκαν σε μία συρρέουσα μονοστιβάδα 60-70% ακολουθούμενη από σχηματισμό του γρατσουνιές και επακόλουθη επώαση με ± DIM. Βρήκαμε ότι η DIM προκάλεσε μείωση στην κυτταρική μετανάστευση κατά 50-60% (όπως παρατηρείται οπτικά) σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο στα κύτταρα του θυρεοειδούς [BCPAP (Εικ. 2Β) και CGTHW-1 (Εικ. 2C)]. Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν με 8505C και ML-1 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Έχουμε επίσης παρατηρήσει προηγουμένως ότι η οιστραδιόλη βελτιώνει τη μετανάστευση και αυτό μετανάστευση αναστέλλεται από fulvestrant, παρόμοια με τα αποτελέσματα του προσδιορισμού μηδέν πληγή που ελήφθη σε αυτή τη μελέτη με χρήση DIM [21].

DIM μειώνει την ικανότητα προσκόλλησης των κυττάρων του θυρεοειδούς

για να μεταστάσεις με επιτυχία, τα καρκινικά κύτταρα πρέπει να συμμορφώνονται με το εξωκυττάριο μήτρα (ECM) του δευτερογενούς οργάνων [26], [28]. Αξιολογήσαμε την επίδραση της DIM στην προσκόλληση των κυττάρων του θυρεοειδούς εκτελώντας μια δοκιμασία προσκόλλησης. θυρεοειδικών κυττάρων αφέθηκαν να προσκολληθούν στην παρουσία 10

-8 ME

2 ή ± 10

-6 Μ fulvestrant (κλασσικό ανταγωνιστής υποδοχέων οιστρογόνων) ± 25 μΜ DIM για 2 ώρες και% προσκόλληση υπολογίστηκε (Εικ. 3). Παρατηρήθηκε μια αύξηση στην προσκόλληση όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Ε

2 (γκρίζες ράβδοι), η οποία καταργείται με fulvestrant (διακεκομμένη bars) γεγονός που υποδηλώνει ότι προσκόλληση είναι ένα ενεργό φαινότυπο σε κύτταρα του θυρεοειδούς απαιτώντας πιθανώς λειτουργική δραστηριότητα ER. Είναι ενδιαφέρον, παρατηρήθηκε μία σημαντική μείωση στην προσκόλληση όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 25 μΜ DIM (μαύρες μπάρες), με μείωση 58% στην προσκόλληση για BCPAP, 42% για 8505C, 70% για CGTHW-1 και 45% για ML-1 . Συνδυασμός της οιστραδιόλης και 25 μΜ DIM (ριγέ ράβδοι) δεν θα μπορούσε να βελτιώσει την προσκόλληση των κυττάρων του θυρεοειδούς, υποδηλώνοντας ότι DIM μπορεί να εμποδίσει τα οιστρογόνα ενισχυμένη πρόσφυση και μπορεί ενδεχομένως να λειτουργεί ως ένας αποτελεσματικός αντι-οιστρογόνο /μεταστατικό παράγοντα, καθώς η μείωση της κυτταρικής προσκόλλησης από DIM είναι παρόμοιο με τη μείωση της προσκόλλησης που παρατηρείται με το fulvestrant ανταγωνιστή του υποδοχέα οιστρογόνου.

5 × 10

5 κύτταρα εναιωρήθηκαν σε πλήρες μέσο που περιέχει ± 10

-8 ME

2 ± 10

-6 Μ fulvestrant ± 25 μΜ DIM και τοποθετήθηκαν σε 6 δίσκους καλλιέργειας καλά. Μετά από 2 ώρες βιώσιμα προσκολλημένα κύτταρα απομακρύνθηκαν με απόξεση και μετρήθηκαν με trypan blue. Οι ομάδες έχουν ως εξής- χωρίς θεραπεία (λευκές ράβδοι), Ε

2 αγωγή (γκρι γραμμές), Ε

2 + fulvestrant (διακεκομμένη μπαρ), 25 μΜ DIM (μαύρες μπάρες), και Ε

2 + 25 μΜ ΔΗΜ αγωγή (ριγέ μπαρ). Τα δεδομένα εκφράζονται ως% προσκολλημένα κύτταρα σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα τα οποία τέθηκαν στο 100% προσκόλληση. Ενιαία αστερίσκος υποδηλώνει στατιστικά σημαντικές διαφορές (

σ

& lt? 0,05). Μεταξύ των υποδεικνύεται δείγματα

Η

ΔΗΜ αναστέλλει την εισβολή των κυττάρων του θυρεοειδούς

Σχηματισμός δευτερογενούς μεταστατικών εστιών από κύτταρα όγκου απαιτεί εισβάλλουν στην ECM του δευτερογενούς οργάνων [26] και την αναστολή αυτής της εισβολής είναι μια στρατηγική στη θεραπεία του καρκίνου που έχει ευρέως ερευνηθεί. Η επίδραση της DIM στο επεμβατική δυναμικό των BCPAP, 8505C, CGTHW-1 και ML-1 ανιχνεύθηκε με τη χρήση ενός θαλάμου transwell εισβολή επικαλυμμένα με ένα βιολογικό μήτρα

in vitro

(matrigel). κύτταρα του θυρεοειδούς φορτώθηκαν σε ένα θάλαμο transwell με οιστραδιόλη ± fulvestrant ή ± 25 μΜ ΔΗΜ και είχαν τη δυνατότητα να εισβάλλουν μέσω του Matrigel. Παρατηρήσαμε ότι τα κύτταρα του θυρεοειδούς ήταν ικανά να εισβάλλουν μέσω Matrigel και εισβολή από αυτά τα κύτταρα ενισχύθηκε όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Ε

2 (γκρι ράβδοι) με αύξηση κατά 40% σε εισβολή για BCPAP, 36% για 8505C, 30% για CGTHW-1 και 31% για ML-1 (Εικ. 4). Αυτή η αύξηση στην κυτταρική εισβολή καταργήθηκε όταν fulvestrant χρησιμοποιήθηκε σε συνδυασμό με οιστραδιόλη (διακεκομμένη bars) υποδηλώνοντας ότι ένας ανταγωνιστής του υποδοχέα οιστρογόνου μπορεί να εμποδίσει την επεμβατική τάση των κυττάρων του θυρεοειδούς. Για να αξιολογηθεί η επίδραση της DIM επί της εισβολής των κυττάρων του θυρεοειδούς, όλες οι κυτταρικές γραμμές υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 25 μΜ DIM (μαύρες ράβδοι) και σημαντική μείωση (

ρ

& lt? 0,05) παρατηρήθηκε σε εισβολή. Αυτή η μείωση στην εισβολή ήταν περίπου 52% για BCPAP, 50% για 8505C, 80% για CGTHW-1 και 48% για ML-1 σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (κανονικοποιημένα σε 100% και

ρ

& lt? 0,05 ). Περαιτέρω, προ-πολλαπλασιαστική οιστραδιόλη, σε συνδυασμό με DIM (ριγέ ράβδοι), δεν βελτιώνουν την επεμβατική ικανότητα των κυττάρων του θυρεοειδούς. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι ΔΗΜ καταργεί τα οιστρογόνα ενισχυμένη κυτταρικές διεργασίες της εισβολής έτσι ενδεχομένως με στόχο ένα σημαντικό βήμα στην εξέλιξη του όγκου και των μεταστάσεων.

2.5 × 10

4 κυττάρων επαναιωρείται σε 500 μλ μέσου που περιέχει 1% FBS ± 10

-8 ME

2 ± 10

-6 Μ fulvestrant ± 25 μΜ ΔΗΜ σπάρθηκαν στο άνω θάλαμο θαλάμων Matrigel εισβολής αυξητικού παράγοντα μειώνεται. 750 μΙ μέσου ανάπτυξης που περιέχει 5% FBS χρησιμοποιήθηκε ως χημειοελκυστικό στον κάτω θάλαμο. Ποσοστό εισβολή υπολογίστηκε με βάση τον αριθμό των κυττάρων που εισβάλλουν μέσω των θαλάμων σε σχέση με τα κύτταρα που μεταναστεύουν μέσω της μεμβράνης ελέγχου μετά από 18 ώρες. Οι ομάδες έχουν ως εξής- χωρίς θεραπεία (λευκές ράβδοι), Ε

2 αγωγή (γκρι γραμμές), Ε

2 και ICI (διακεκομμένη μπαρ), 25 μΜ DIM (μαύρες μπάρες) και Ε

2 & amp? 25 μΜ ΔΗΜ αγωγή (ριγέ μπαρ). Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως% εισβολή το οποίο είναι μέσος αριθμός κυττάρων ανά εισέβαλαν 10Χ πεδίο μικρογραφία για κάθε φρεάτιο δείγματος σε σχέση με την μετανάστευση διαμέσου της μεμβράνης ελέγχου και ομαλοποιήθηκε ως προς το μη επεξεργασμένο μάρτυρα. Ο αστερίσκος υποδηλώνει στατιστικά σημαντικές διαφορές (

σ

& lt? 0,05). Μεταξύ των υποδεικνύεται δείγματα

Η

ΔΗΜ καταστέλλει την επαγόμενη από οιστρογόνα MMP έκκριση

MMPs είναι αξιόπιστοι δείκτες όγκου κελί εισβολή και τη μετανάστευση. Επιπλέον, οι κακοήθεις όγκοι είναι γνωστό ότι έχουν αυξημένη ΜΜΡ εκφράσεις σε σύγκριση με καλοήθεις όγκους, η οποία προκαλεί αποικοδόμηση της εξωκυττάριας μήτρας, με αποτέλεσμα αυξημένη εισβολή και τη μετανάστευση των κυττάρων του όγκου [29], [30]. έχουν φυτοχημικά όπως genistein και I3C δειχθεί να στοχεύουν τη δραστηριότητα και την έκκριση των ΜΜΡ σε οιστρογόνα αποκρίνονται καρκίνους [31].