Αφηρημένο

Το γονίδιο σύντηξης Metnase αποτελείται από έναν τομέα μεθυλοτρανσφεράσης SET ιστόνης και έναν τομέα τρανσποζάσης από Mariner τρανσποζάσης. Αυτό το μεταθετό στοιχείο εμπλέκεται σε χρωμόσωμα decatenation, ενισχύει την επιδιόρθωση του DNA, προωθεί την ενσωμάτωση ξένου DNA, και βοηθά τοποϊσομεράσης καθηκόντων II. Αυτή η μελέτη ερευνά το ρόλο της Metnase στην ομοιόσταση και συντήρηση του φαινοτύπου βλαστική ικανότητα σε καρκίνο του παχέος εντέρου βλαστοκύτταρα (ΚΕΠ) καρκίνο του παχέος εντέρου. Αποσιώπηση του Metnase διεξήχθη σε κυτταρικές σειρές ανθρώπινου καρκίνου πριν και μετά τη θεραπεία με σισπλατίνη, και ΚΕΠ κόλον. Μεταγενέστερες μεταβολές στην έκφραση των γονιδίων που εμπλέκονται σε μηχανισμούς επιδιόρθωσης, τη σύνθεση του DNA, λειτουργία τοποϊσομεράσης II και της μετάστασης, καθώς βλαστική ικανότητα παράγοντες μεταγραφής μελετήθηκαν με πειράματα RT-qPCR. Κυτταρική βιωσιμότητα και η απόπτωση εκτιμήθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι Metnase επηρεάζει την έκφραση πολλών γονιδίων που εμπλέκονται στις παραπάνω διαδικασίες. Επιπλέον, τα επίπεδα Metnase φαίνεται να επηρεάζει την έκφραση του Nanog, OCT3 /4, και SOX2. Καταστολή της Metnase οδήγησε επίσης σε αύξηση της απόπτωσης. Ως εκ τούτου, Metnase μπορεί να έχει ένα σημαντικό ρόλο στην επιδιόρθωση του DNA, η λειτουργία της τοποϊσομεράσης II, καθώς και τη διατήρηση των βλαστική ικανότητα κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του καρκίνου του παχέος εντέρου

Παράθεση:. Αποστόλου P, Toloudi Μ, Κουρτίδου Ε, Mimikakou G, Βλάχου Ι, Χατζηιωάννου M, et al. (2014) στο δυνητικό ρόλο των Metnase μεταθετάση Fusion γονιδίων στον καρκίνο του παχέος εντέρου, μέσω του κανονισμού των βασικών γονιδίων. PLoS ONE 9 (10): e109741. doi: 10.1371 /journal.pone.0109741

Επιμέλεια: Javier Σ Castresana, Πανεπιστήμιο της Ναβάρα, Ισπανία

Ελήφθη: 18 του Ιουνίου 2014? Αποδεκτές: 8 Σεπτεμβρίου του 2014? Δημοσιεύθηκε: 15 Οκτωβρίου, 2014

Copyright: © 2014 Αποστόλου et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Όλοι οι συγγραφείς είναι υπάλληλοι της έρευνας στη γενετική Cancer Centre Ltd (R.G.C.C. Ltd), και έλαβε μισθό από την R.G.C.C. Ltd, η οποία χρηματοδοτούνται αυτή τη μελέτη. Ο χρηματοδότης δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Όλοι οι συγγραφείς είναι υπάλληλοι της έρευνας στη γενετική Cancer Centre Ltd (R.G.C.C. Ltd). Η R.G.C.C. Ltd χρηματοδοτούνται αυτή τη μελέτη. Δεν υπάρχουν διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα προϊόντα για την ανάπτυξη ή την εμπορία προϊόντων που να δηλώνουν. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις πολιτικές PLoS ONE για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Metnase είναι ένα γονίδιο σύντηξης με μια περιοχή μεθυλοτρανσφεράσης SET ιστόνης και έναν τομέα τρανσποζάσης Mariner. Αρκετές από τις κύριες λειτουργίες του HsMar1 τρανσποσάσης μοιράζονται με Metnase [1]. Metnase είναι μια μη-ομόλογη ένωση άκρων πρωτεΐνη (NHEJ) επισκευή [2], και εμπλέκεται σε πολλές κυτταρικές διεργασίες συμπεριλαμβανομένης της διαμεσολάβησης της ενσωμάτωσης ξένου DNA, χρωμόσωμα decatenation [3], και την επιδιόρθωση του DNA [4] και την αντιγραφή [5]. Metnase διαμεσολαβεί περαιτέρω αντίσταση σε αναστολείς της τοποϊσομεράσης II μέσω μιας αλληλεπίδρασης με τοποϊσομεράση (DNA) II άλφα (TOP2A) [6]. Αυτά καθιερωμένους ρόλους σε συνδυασμό με τα πρόσφατα πειραματικά δεδομένα δείχνουν ότι Metnase μπορεί να έχει ένα σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του καρκίνου και της εξέλιξης, τα οποία θα μπορούσαν να αξιοποιηθούν κατά τη διάρκεια της θεραπείας του καρκίνου.

καρκίνος του παχέος εντέρου είναι η δεύτερη κύρια αιτία του καρκίνου στις γυναίκες, τα τρίτη στους άνδρες, και η τέταρτη πιο κοινή αιτία θανάτου από καρκίνο γενική [7]. Η χρήση χημειοθεραπευτικών με βάση την πλατίνα είναι κοινός τόπος σε αγωγές θεραπείας. Ωστόσο, πολλοί ασθενείς είτε κατέχουν ή αναπτύσσουν αντίσταση στις ενώσεις αυτές [8]. Επιπλέον, καρκινικά βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) έχουν την ικανότητα για αυτο-ανανέωση και την αντίσταση στη χημειοθεραπεία και την ακτινοθεραπεία [9]. Ως εκ τούτου, οι βελτιώσεις στις τρέχουσες στρατηγικές θεραπείας που απαιτείται.

Η παρούσα μελέτη εξετάζει τη σχέση μεταξύ της έκφρασης των γονιδίων Metnase και του παχέος την ανάπτυξη του καρκίνου. Δεδομένου ότι τα μεταθετά γενετικά στοιχεία που εμπλέκονται στο γονιδίωμά αναδιάταξη, μπορεί να ρυθμίζει πολλούς παράγοντες μεταγραφής. Οι παράγοντες αυτοί θα μπορούσαν με τη σειρά τους ρυθμίζουν γονίδια που εμπλέκονται στην αντοχή, μετάσταση, ή απόπτωση. Η αξιολόγηση του συμπληρώματος γονιδίων που επηρεάζονται από Metnase καθώς και η συσχέτισή τους με τις βασικές κυτταρικές δραστηριότητες μπορούν να ενισχύσουν την κατανόησή μας για το πώς Metnase επηρεάζει την ανάπτυξη του καρκίνου. Οι γνώσεις αυτές θα μπορούσαν επίσης να συμβάλουν στη βελτίωση των προγραμμάτων θεραπείας του καρκίνου.

Αυτή η μελέτη εξετάζει τα επίπεδα έκφρασης πολλών γονιδίων σημαντικών στην κυτταρική ανάπτυξη και σύνθεση του DNA και την επισκευή πριν και μετά την εξουδετέρωση των Metnase με siRNA. Αυτά τα γονίδια ήταν πρωτεΐνης επιδιόρθωση του DNA εκτομή (ERCC1), διπεπτιδυλοπεπτιδάσης IV (CD26), Met πρωτο-ογκογονίδιο (cMet), TOP2A, τοποϊσομεράσης (DNA) II βήτα (TOP2B), θυμιδυλικής συνθάσης (Tyms) και DNA (κυτοσίνη-5-) μεθυλτρανσφεράσης 1 (DNMT1). Η επίδραση της αποσιώπησης Metnase διερευνήθηκε επίσης σε ένα καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρική γραμμή μετά από θεραπεία με σισπλατίνη. Ενώ οξαλιπλατίνη χρησιμοποιείται κυρίως σε κλινικές ρυθμίσεις, εδώ θελήσαμε να διερευνηθεί ο ρόλος του Metnase σε ένα ανθεκτικό κυτταρική γραμμή. Σύμφωνα με τα πειράματα που είχαν προηγουμένως πραγματοποιήθηκαν στην κυτταρική σειρά HCT-116, έχουμε βρει ότι περισσότερους μηχανισμούς ανθεκτικότητας να αναπτυχθεί μετά τη θεραπεία με σισπλατίνη. Τέλος, μια πιθανή σχέση μεταξύ Metnase και συντήρηση του φαινοτύπου βλαστική ικανότητα του παχέος εντέρου CSC ερευνήθηκε από φίμωση Metnase και τη μέτρηση των επιπέδων του Nanog, POU κατηγορία 5 homeobox1 (OCT3 /4), και SRY (σεξ προσδιορισμό περιοχή Υ) -box2 (SOX2) , τα οποία έχουν κρίσιμο ρόλο στη διατήρηση της βλαστική ικανότητα [10], [11].

Υλικό και Μέθοδοι

Cell Culture

Ανθρώπινο ΚΕΠ του παχέος εντέρου (36112-39P ? Celprogen, CA? USA) και 116 HCT-Ανθρώπινα κύτταρα κόλου καρκινώματος (91.091.005? ECACC, UK) καλλιεργήθηκαν σε κατάλληλο μέσο ανάπτυξης (M36112-39PS? Celprogen, και D5546? Sigma-Aldrich, Steinheim? Germany) συμπληρωμένο με 10% FBS (10270-106? Gibco, ΝΥ? USA) σε 25 cm

2 φιάλες (E36102-29P-Τ25? Celprogen, και 430.639? Corning, ΝΥ: USA) στους 37 ° C σε ένα 5% CO

2 περιβάλλον. HCT-116 κύτταρα επίσης σε επεξεργασία με 1 μg /mL σισπλατίνης (P4394? Sigma-Aldrich). Για περισσότερα από 10 περάσματα και καλλιεργούνται κατά παρόμοιο τρόπο

siRNA διαμόλυνση

Κατά τη διάρκεια της εκθετικής ανάπτυξης φάση, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων (E36112-39? Celprogen, και 831.836? Sarstedt, Nümbrect? Germany) και επιμολύνθηκαν με Metnase ειδικό siRNA χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη Αντιδραστήριο 2000 (11668-027? Invitrogen, CA? USA), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το siRNA (5′-UAAAACCUCACCAGCAUAUUU-3 ‘) σχεδιάστηκε σύμφωνα με τους κανόνες του Reynolds et al. [12] και υποβλήθηκαν σε ανάλυση BLAST για να εξασφαλιστεί ειδικότητα. Μετά 48 ώρες επώαση, τα κύτταρα συλλέχθηκαν με τρυψινοποίηση (25200-072? Invitrogen). συμπεριλήφθηκαν όχημα μόνο και μη ειδικούς ελέγχους siRNA. Η knockdown mRNA υπολογίστηκε σε σχέση με το μη-στόχευσης ελέγχου siRNA σε κάθε πείραμα. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές εις τριπλούν. Το επίπεδο έκφρασης του γονιδίου που μας ενδιαφέρει και το ποσοστό νοκ ντάουν υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τη συγκριτική μέθοδο Ct:

Αξιολόγηση των κυττάρων

Τα κύτταρα αξιολογήθηκαν από την κυτταρική και μοριακή δοκιμασίες. Cellular δοκιμασίες βασίζονται στην ικανότητα των ΚΕΠ για σχηματισμό μικροσφαιρών. Οι καλλιέργειες έχουν προηγουμένως αξιολογηθεί από την ανάλυση γονιδιακής έκφρασης συγκεκριμένων παραγόντων μεταγραφής, έτσι πιστοποίηση των κυτταρικών γραμμών πραγματοποιήθηκε με τη μέτρηση της μικρής διαδοχική προφίλ επανάληψη και τη σύγκριση με το προφίλ του κατασκευαστή. Η καλλιέργεια των ΚΕΠ διεξήχθη για πάνω από 30 περάσματα για να αποκλειστεί η δυνατότητα ενσωμάτωσης εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα (ΟΚΕ) στα πειράματα, αφού ΚΕΠ είναι αθάνατα αντίθεση ΟΚΕ.

Μοριακής Αναλύσεις

RNA από κυτταροκαλλιέργειες εκχυλίζεται χρησιμοποιώντας το κιτ RNeasy μίνι (74105? Qiagen, Hilden? Γερμανία). RNA δείγματα αξιολογήθηκαν τόσο φασματοφωτομετρικά και με αγαρόζη οπτικοποίηση ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα των ζωνών 18S-28S. Γονιδιωματικό DNA απομακρύνθηκε χρησιμοποιώντας RNase DNase-Free (79254? Qiagen) .Subsequently, 1 μα αυτού του RNA χρησιμοποιήθηκε σαν εκμαγείο για σύνθεση cDNA με ένα κιτ σύνθεσης cDNA iScript (1.708.891? Bio-Rad, CA: USA). PCR πραγματικού χρόνου, πραγματοποιήθηκε με χρήση του iTaq καθολική SYBR Green Supermix (1725124? Bio-Rad) με κάθε δείγμα εις τριπλούν. Ειδικοί εκκινητές για κάθε δείκτη και για ένα ενδογενές γονίδιο ελέγχου (18S rRNA) σχεδιάστηκαν με Genamics Expression 1,1 λογισμικού [13] – [16]. Primer αλληλουχίες αναλύθηκαν με BLAST να αποκλείσει όσους ενισχυμένα ανεπιθύμητα γονίδια. Ο Πίνακας 1 δείχνει τις αλληλουχίες των εκκινητών

Η

Το πρόγραμμα της αντίδρασης PCR ήταν ως εξής: α. Την αρχική μετουσίωση στους 95 ° C, 50 κύκλοι αποδιάταξης στους 95 ° C για 10 δευτερόλεπτα που ακολουθείται από ανόπτηση στους 59 ° C για 30 sec. Ένα τελικό στάδιο επέκτασης διεξήχθη στους 72 ° C για 10 λεπτά που ακολουθείται από ανάλυση καμπύλης τήξης. Τα δεδομένα αναλύθηκαν σύμφωνα με τη μέθοδο των Livak και Schmittgen [17]. Σε όλες τις αντιδράσεις PCR, χρησιμοποιήθηκαν κατάλληλους ελέγχους. Ο θετικός μάρτυρας ήταν cDNA από ένα Παγκόσμιο Ανθρώπινο RNA αναφοράς (740000-41? Agilent, CA? USA) και αρνητικοί μάρτυρες ήταν μη-πρότυπο, χωρίς ένζυμο ελέγχει καθώς και Ανθρωπίνων γονιδιακού DNA (G304A? Promega, WI? USA). Τέλος, ένα ελέγχου μεταγραφής χωρίς αντίστροφη χρησιμοποιήθηκε στην σύνθεση του cDNA. Οι πρότυπες καμπύλες όλων εκκινητές που παρουσιάζονται στο σχήμα S1

Η κυτταρομετρία ροής

Τα κύτταρα χρωματίστηκαν με ΡΕ Annexin V και 7-αμινο-ακτινομυκίνη. (559.763? BD Biosciences, CA? USA) για 15 λεπτά που ακολουθείται από επαναιώρηση σε 0,5 mL υγρού περιβλήματος (8.546.859? Beckman Coulter, Nyon? Switzerland) και ανάλυση κυτταρομετρίας ροής πάνω από 50.000 γεγονότα. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με FCS Express Λογισμικό (DENOVO). Σε κάθε περίπτωση χρησιμοποιήθηκαν κατάλληλα θετικοί και αρνητικοί μάρτυρες

Στατιστική Ανάλυση

Η ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (qPCR) αποτελέσματα αξιολογήθηκαν σύμφωνα με τη δοκιμή Kolmogorov-Smirnov.? Όλα τα δείγματα είχαν κανονική κατανομή. Διάμεση τιμές χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση. δοκιμασίες Mann-Whitney διεξήχθησαν επίσης στα δεδομένα qPCR [18], [19]. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν τρεις φορές. Μια τιμή p & lt? 0,05 θεωρήθηκε σημαντική

Αποτελέσματα

γονιδιακής έκφρασης

Η σίγαση της έκφρασης Metnase από siRNA ήταν έως και 65% αποτελεσματικό στην HCT-116 κύτταρα, 52. % σε HCT-116 κύτταρα επεξεργασμένα με σισπλατίνη, και το 40% σε ΚΕΠ κόλον (σχήματα 1-3). Καταστολή Metnase σε HCT-116 κύτταρα οδήγησε σε μια αύξηση στην έκφραση του γονιδίου CD26 και μια μείωση στην έκφραση όλων των άλλων γονιδίων που μετράται Αυτή η μείωση ήταν υψηλότερη για TOP2A, TOP2B, ERCC1, Tyms, και DNMT1, που κυμαίνονται από 25-35%, ενώ μια μικρή πτώση της τάξης του 5-10% της έκφρασης cMet παρατηρήθηκε (Σχήμα 1). ERCC1 εμπλέκεται σε διεργασίες επισκευής του DNA, και η έκφρασή του έχει συνδεθεί με την ευαισθησία αυτής της κυτταρικής γραμμής σε ενώσεις λευκοχρύσου [20].

Σχετική έκφραση γονιδίων των παραγόντων μεταγραφής σε ΚΕΠ Colon εξής Metnase knockdown. Το ποσοστό των Metnase νοκ ντάουν έφθασε το 40%. Η μέθοδος ΔΔCt χρησιμοποιήθηκε για την εκτέλεση της ανάλυσης. Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει το μέσο όρο των τιμών Ct. Οι δοκιμασίες διεξήχθησαν εις τριπλούν και τιμή ρ & lt? 0,05 θεωρήθηκε σημαντική. Στο δείγμα ελέγχου η μέση τιμή είναι 1,00 υποδεικνύοντας ότι δεν υπάρχει αλλαγή στην έκφραση γονιδίου. Αξίες & gt? 1 δείχνουν μια αύξηση στην έκφραση του γονιδίου, ενώ οι τιμές & lt? 1 δείχνουν μια μείωση της γονιδιακής έκφρασης. Οι συνθήκες για τα επόμενα πειράματα ήταν τα ίδια.

Η

Σχετική έκφραση γονιδίων των παραγόντων μεταγραφής σε HCT-116 κύτταρα μετά από Metnase knockdown. Το ποσοστό των knockdown ανήλθε σε 65%.

Η

Σχετική έκφραση γονιδίων των παραγόντων μεταγραφής σε HCT-116 κύτταρα επεξεργασμένα με σισπλατίνη, μετά Metnase knockdown. Το ποσοστό των knockdown ανήλθε στο 52%.

Η

Παρατηρήσαμε παρόμοια αποτελέσματα HCT-116 κύτταρα επεξεργασμένα με σισπλατίνη. Η ενισχυμένη μείωση στην έκφραση του γονιδίου της τοποϊσομεράσης II φαίνεται παρακάτω Metnase σίγηση σε HCT-116 κύτταρα επεξεργασμένα με σισπλατίνη σε σύγκριση με αυτούς που δεν αντιμετωπίζονται είναι επίσης αξιοσημείωτη. Tyms και έκφραση DNMT1 μειώθηκαν έως και κατά 60%, ενώ TOP2B έκφραση μειώθηκε κατά 18-35% και cMet κατά σχεδόν 40%. επίπεδα ERCC1 δεν επηρεάστηκαν, υποδεικνύοντας ότι η θεραπεία με σισπλατίνη για πολλά περάσματα οδηγεί στην ανάπτυξη μηχανισμών αντίστασης (Σχήμα 2).

Μετά αποσιώπηση του Metnase σε ΚΕΠ κόλον, το μόνο γονίδιο που μετράται που έδειξαν αυξημένη έκφραση ήταν CD26. Μια μείωση παρατηρήθηκε για τα γονίδια Tyms και TOP2A, ενώ η έκφραση του ERCC1, cMet, και TOP2B εμφανίστηκε ανεπηρέαστη (Σχήμα 3). Αυτά τα αποτελέσματα κατέδειξαν ότι τα ΚΕΠ είναι πιο ανθεκτικά στο χημειοθεραπευτικά από διαφοροποιημένα καρκινικά κύτταρα. Συνολικά, τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων θεωρείται ως βλαστική ικανότητα παράγοντες μεταγραφής μειώθηκαν ακόλουθη αποσιώπηση της έκφρασης Metnase σε ΚΕΠ. Αυτή η μείωση στην έκφραση ήταν μέχρι 60% για SOX2, 40% για OCT3 /4 και 45% για Nanog (Σχήμα 4).

Σχετική ανάλυση γονιδιακής έκφρασης της μεταγραφής βλαστική ικανότητα παράγοντες Nanog, OCT3 /4, και SOX2 εξής Metnase knockdown.

Η

Βιωσιμότητας κυττάρων-απόπτωση

Ο αριθμός των κυττάρων που υφίστανται απόπτωση όπως προσδιορίζεται με κυτταρομετρία ροής διπλασιάστηκε εξής καταστολή της έκφρασης Metnase τόσο HCT-116 και HCT- 116 + σισπλατίνη κύτταρα. Παρατηρήθηκε επίσης μια αύξηση του αριθμού των νεκρών κυττάρων. Ωστόσο, κυτταρική βιωσιμότητα δεν άλλαξε σημαντικά. Στο ΚΕΠ του παχέος εντέρου, η βιωσιμότητα των κυττάρων μειώθηκε μετά Metnase αποσιώπηση, αλλά δεν παρατηρήθηκε καμία αλλαγή στον αριθμό των κυττάρων που υφίστανται απόπτωση. Ο πληθυσμός των νεκρών κυττάρων ήταν υψηλότερη στην κυτταρική σειρά HCT-116 από ό, τι στις άλλες δύο. Αυτό θα μπορούσε να οφείλεται σε μηχανισμούς αντίστασης που αναπτύσσονται στην σισπλατίνη επεξεργασμένο κυτταρική γραμμή, ή αυτοί οι μηχανισμοί μπορούν να υπάρχουν εγγενώς σε ΚΕΠ. Ο Πίνακας 2 απεικονίζει δεδομένα για κάθε κυτταρική σειρά.

Η

Συζήτηση

Το γονίδιο σύντηξης Metnase μεθυλιώνει ιστόνης Η3 στη λυσίνη 36 και διαθέτει πολλά χαρακτηριστικά μιας τρανσποζάσης, συμπεριλαμβανομένου του τερματικού ανεστραμμένη επανάληψη αλληλουχίας-ειδική δέσμευσης DNA και DNA επανάληψης [21]. Ωστόσο, αυτό δεν μπορεί να ολοκληρώσει τις αντιδράσεις μεταφοράς. Μέσω μεθυλίωση της δραστηριότητα, Metnase εμπλέκεται στην επιδιόρθωση του DNA από το μονοπάτι NHEJ. Αυτή η δραστηριότητα επισκευής απαιτεί αλληλεπίδραση με Pso4 [22]. Η πρωτεΐνη ERCC1 συμμετέχει επίσης μέσω νουκλεοτίδιο επιδιόρθωση εκτομής [23]. Αυτή η μελέτη προτείνει την ύπαρξη μιας σχέσης μεταξύ της έκφρασης ERCC1 και Metnase. Συγκεκριμένα, η καταστολή της Metnase οδήγησε σε μειωμένη έκφραση του γονιδίου επισκευής, ωστόσο, η μείωση αυτή ήταν λιγότερο έντονη όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με σισπλατίνη. Αυτό υποστηρίζει περαιτέρω ένα ρόλο για ERCC1 στη θεραπεία με σισπλατίνη.

TOP2A είναι το κύριο ένζυμο decatenation, την επίλυση μπερδεμένα ή catenated χρωματίδες [24]. Αυτή η μελέτη επιβεβαιώνει επίσης ότι Metnase μεσολαβεί αντίσταση στην ΙΙ α αναστολείς της τοποϊσομεράσης, με έκφραση γονιδίων TOP2A επηρεάζονται περισσότερο από ό, τι άλλα γονίδια παρακάτω Metnase νοκ ντάουν. Η μείωση αυτή ενισχύεται σε κύτταρα επεξεργασμένα με σισπλατίνη και σε ΚΕΠ. Επιπλέον, η καταστολή και των δύο TOP2A και TOP2B παρατηρήθηκε, υποδεικνύοντας ότι Metnase θα μπορούσε να είναι ένας στόχος για συνδυασμένη χημειοθεραπεία με αναστολείς της τοποϊσομεράσης II.

Η έκφραση της διπεπτιδυλοπεπτιδάσης IV (CD26) συσχετίζεται με την εξέλιξη του καρκίνου του παχέος εντέρου και CD26 + ΚΕΠ έχουν έχουν ταυτοποιηθεί σε ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου. Εδώ, η έκφραση του γονιδίου CD26 αυξήθηκε σε όλες τις περιπτώσεις Metnase νοκ ντάουν. Αυτό το ένζυμο συνδέεται με το ανοσοποιητικό ρύθμιση, μεταγωγή σήματος και την απόπτωση. Αυτό δείχνει ότι Metnase εμπλέκεται στη ρύθμιση της απόπτωσης, ίσως μέσω μιας αλληλεπίδρασης με CD26 [25].

Ο cMet πρωτο-ογκογονιδίου κωδικοποιεί τον υποδοχέα αυξητικού παράγοντα ηπατοκυττάρων και είναι στενά συνδεδεμένο με την ανάπτυξη του καρκίνου. Η ανώμαλη ενεργοποίηση του cMet οδηγεί σε ανάπτυξη όγκου, αγγειογένεση και μετάσταση τελικά. Σε αντίθεση με φυσιολογικών αρχέγονων κυττάρων, ΚΕΠ εκφράζουν cMet, διευκολύνοντας επιμονή του καρκίνου και την εξάπλωση [26]. Αρνητική ρύθμιση ανατροφοδότησης της ΚΟΑ που εξαρτώνται από επεμβατική ανάπτυξη με Notch έχει αποδειχθεί σε Drosophila [27], και τα γονίδια Notch ρυθμίζει επίσης ΚΟΑ στον άνθρωπο [28]. Ωστόσο, αυτή η μελέτη δεν διαπίστωσε καμία συσχέτιση των επιπέδων cMet με εκείνες των Metnase τρανσποζάσης.

Παρατηρήσαμε μια σχέση μεταξύ Metnase και δύο γονίδια σημαντικά στην ομοιόσταση του DNA, Tyms και DNMT1. Γονιδιακή έκφραση και των δύο ήταν μειωμένη σε όλες τις κυτταρικές σειρές εξής αποσιώπηση της έκφρασης Metnase. Tyms παράγει μονοφωσφορική θυμιδίνη, η οποία είναι στη συνέχεια φωσφορυλιώνεται τριφωσφορική θυμιδίνη για χρήση στη σύνθεση και επιδιόρθωση [29] DNA. DNMT1 είναι ένα ένζυμο που εμπλέκεται στη ρύθμιση του μεθυλιωμένου υπολειμμάτων κυτοσίνης, και παρεκκλίνουσα μεθυλίωση του σχετίζεται με την ανάπτυξη του καρκίνου [30]. Αυτή η μείωση στα επίπεδα του Tyms και DNMT1 ενισχύθηκε σε κύτταρα επεξεργασμένα με σισπλατίνη. Ως εκ τούτου, Metnase μπορεί να εμπλέκονται στην ανάπτυξη του καρκίνου και της εγκατάστασης μέσω της αλληλεπίδρασης με ή επιρροή των διαφόρων ενζύμων που κατέχουν βασικούς ρόλους στον καρκίνο.

Ερευνήσαμε επίσης τη σχέση μεταξύ Metnase και παράγοντες μεταγραφής απαραίτητη για τη διατήρηση βλαστική ικανότητα. Τα ΚΕΠ ορίζεται από την ικανότητα να αυτο-ανανέωση, διαφοροποιούνται και πολλαπλασιάζονται. ΚΕΠ εκφράζουν πολλοί δείκτες μεταγραφικός παράγοντας, αλλά το πιο σημαντικό είναι Nanog, OCT3 /4 και το γονίδιο SOX2. Nanog εκφράζεται στην ΟΚΕ και έχει καθοριστικό ρόλο στη διατήρηση της πλειοδυναμίας. υπερέκφραση του προκαλεί αυτο-ανανέωση στην ΟΚΕ, ενώ η απουσία του οδηγεί σε διαφοροποίηση [31], [32]. Για να διατηρηθεί η βλαστική ικανότητα, απαιτείται η παρουσία δύο ακόμη παράγοντες μεταγραφής, OCT3 /4 και SOX2. OCT3 /4 έκφραση συνδέεται επίσης με ένα αδιαφοροποίητο στάδιο και την αυτο-ανανέωση, που σχηματίζουν ένα ετεροδιμερές με SOX2 και μαζί οι δύο αυτές πρωτεΐνες συνδέονται με το DNA. SOX2 είναι ένας παράγοντας μεταγραφής απαραίτητη για τη διατήρηση πλειοδυναμίας, αλλά έκτοπη έκφραση του μπορεί να εμπλέκεται με την ανώμαλη διαφοροποίηση των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου [33], [34]. Εξόντωση Metnase οδηγούν σε μειωμένη γονιδιακή έκφραση όλων των παραγόντων μεταγραφής, υποδεικνύοντας ότι Metnase μπορεί να εμπλέκεται στην εγκατάσταση του καρκίνου καθώς και στην ανάπτυξη του καρκίνου και την πρόοδο.

Κινητή βιωσιμότητα εμφανίστηκε ανεπηρέαστη από Metnase knockdown. Η σισπλατίνη επεξεργασμένο κυτταρική γραμμή φαίνεται να έχουν λιγότερα νεκρά κύτταρα σε συγκρίσεις με το μη επεξεργασμένα κυτταρική γραμμή. Παρόμοια ευρήματα ελήφθησαν με τη χρήση ΚΕΠ του παχέος εντέρου. Αυτό υποστηρίζει περαιτέρω την αντίσταση στη χημειοθεραπεία που παρατηρείται σε ΚΕΠ. Ωστόσο, Metnase σίγηση είχε επίδραση από τον αριθμό των κυττάρων που υφίστανται απόπτωση. Αυτά θα μπορούσε να εξηγηθεί από την ανάπτυξη εναλλακτικών μηχανισμών απόπτωσης-αποφύγουν την ανάπτυξη των ΚΕΠ σε σύγκριση με το επεξεργασμένο κυτταρική σειρά.

Αυτή η μελέτη προσδιορίζει ότι το γονίδιο σύντηξης Metnase συμμετέχει ενεργά στους μηχανισμούς επιδιόρθωσης του DNA, τη σύνθεση του DNA, τοποϊσομεράσης II αντίσταση, απόπτωση, και η διατήρηση του φαινοτύπου βλαστική ικανότητα στον καρκίνο του παχέος εντέρου. απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για να φωτιστούν οι λεπτομέρειες αυτών των αλληλεπιδράσεων.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

Πρότυπο Curves – Πρότυπες καμπύλες για όλους τους εκκινητές που χρησιμοποιούνται. Α: 18S rRNA, Β: Metnase, C: ERCC1, D: cMet, Ε: CD26, F: TOP2A, G: TOP2B, Η: Tyms, I: DNMT1, J: Nanog, Κ: OCT3 /4, και L: . SOX2

doi: 10.1371 /journal.pone.0109741.s001

(ΔΕΘ)