Αφηρημένο

ραδιοαντοχή είναι ένα κύριο εμπόδιο για την αποτελεσματική ακτινοθεραπεία για μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC). Παρά τις διάφορες πειραματικές και κλινικές μελέτες αντοχής στην ακτινοβολία, ο ακριβής μηχανισμός της ραδιοαντοχή σε κύτταρα NSCLC και ιστών παραμένει ασαφής. Το αποτέλεσμα αυτό θα μπορούσε να εξηγηθεί από τον περιορισμό των προηγούμενων ερευνών όπως μερική κατανόηση του μηχανισμού κυτταρικής ραδιοαντοχή σε ένα μόνο επίπεδο μορίου. Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε ως στόχο να διερευνήσει εκτεταμένες ανταποκρίσεις ακτινοβολίας ανθεκτικά στην ακτινοβολία κύτταρα NSCLC και να εντοπίσει τους παράγοντες ραδιοαντοχή-συνδέει. Για πρώτη φορά, με τη χρήση RNA-seq, μια μαζική προσέγγιση προσδιορισμού αλληλουχίας που βασίζονται, εξετάσαμε σε ολόκληρο το μεταγραφικό μεταβολή ραδιοανθεκτικά κύτταρα Α549 NSCLC υπό ακτινοβολία, και επαλήθευσε σημαντική γονίδια ακτινοβολία μεταβάλλεται και σχήματα κατανομής χρωμόσωμα τους. Επίσης, βιοπληροφορικής προσεγγίσεις (ανάλυση GO και ΙΡΑ) διεξήχθησαν για να χαρακτηριστούν οι αποκρίσεις ακτινοβολία σε ραδιοανθεκτικά κύτταρα Α549. Βρήκαμε ότι τα επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ), τη μετανάστευση και φλεγμονώδεις διαδικασίες θα μπορούσαν να σχετίζονται με την ουσιαστικά ρύθμιση των αποκρίσεων ακτινοβολίας σε ραδιοανθεκτικά κύτταρα Α549. Με βάση τα αποτελέσματα της βιοπληροφορικής ανάλυσης για την ακτινοβολία που προκαλείται μεταγραφικό αλλοίωση, επιλέξαμε επτά σημαντικά γονίδια ακτινοβολία μεταβάλλεται (

SESN2, FN1, TRAF4, CDKN1A, COX-2, DDB2

και

FDXR

) και στη συνέχεια συγκρίνονται αποτελέσματα της ακτινοβολίας σε δύο τύπους κυττάρων με διαφορετικά NSCLC ακτινοευαισθησία (κύτταρα Α549 ραδιοανθεκτικά και ακτινοευαίσθητα κύτταρα ΝΟΙ-Η460). Είναι ενδιαφέρον ότι, υπό ακτινοβολία,

COX-2

έδειξε την πιο σημαντική διαφορά στην mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης μεταξύ Α549 και κύτταρα ΝΟΙ-Η460. IR-επαγόμενη αύξηση της έκφρασης COX-2 εμφανίστηκε μόνο σε ραδιοανθεκτικά κύτταρα Α549. Συλλογικά, προτείνουμε ότι η COX-2 (επίσης γνωστή ως προσταγλανδίνη-ενδοϋπεροξειδίου συνθάσης 2 (PTGS2)) θα μπορούσαν να έχουν δυνατότητα ως υποθετικό βιοδείκτη για ραδιοαντοχή στα κύτταρα NSCLC

Παράθεση:. Yang HJ, Kim Ν, Seong KM , Youn Η, Youn Β (2013) Διερεύνηση της ακτινοβολίας που προκαλείται μεταγραφικό προφίλ των ακτινοανθεκτικά μη-μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα Α549 κύτταρα χρησιμοποιώντας RNA-seq. PLoS ONE 8 (3): e59319. doi: 10.1371 /journal.pone.0059319

Συντάκτης: Eric Γ Chuang, Εθνικό Πανεπιστήμιο της Ταϊβάν, Ταϊβάν

Ελήφθη: 15 του Νοέμβρη 2012? Αποδεκτές: 13 του Φλεβάρη 2013? Δημοσιεύθηκε: 22 Μάρτη του 2013

Copyright: © 2013 Yang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από Πυρηνικής Έρευνας & amp? Πρόγραμμα Ανάπτυξης (2012-0006383) και από τη βασική επιστήμη Πρόγραμμα Έρευνας (2012-0003201) μέσω του Εθνικού Ιδρύματος Ερευνών της Κορέας που χρηματοδοτείται από το Υπουργείο Παιδείας, Επιστήμης και Τεχνολογίας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. KMS είναι σήμερα οι εργαζόμενοι της ακτινοβολίας Ινστιτούτου Ερευνών Υγείας, την Κορέα Hydro & amp? Πυρηνικής ενέργειας Co., Ltd. Άλλοι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν υπάρχουν συγκρούσεις συμφερόντων. Δεν υπάρχουν περαιτέρω διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα προϊόντα για την ανάπτυξη ή την εμπορία προϊόντων που να δηλώνουν. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Ακτινοθεραπεία, μόνα τους ή σε συνδυασμό με χειρουργική επέμβαση ή χημειοθεραπεία, διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στη θεραπεία του NSCLC. Ωστόσο, οι θεραπευτικές εκβάσεις δεν είναι πλήρως ικανοποιητικά σε πολλές περιπτώσεις. Με απρόσμενες αντιδράσεις ακτινοβολία κατά την ακτινοθεραπεία, (ενδογενής /αποκτήθηκαν) ραδιοαντοχή θεωρείται ως κύριος παράγοντας που περιορίζει την αποτελεσματικότητα της θεραπείας ακτινοβολίας για NSCLC [1].

ραδιοευαισθησία των κυττάρων και ιστών έχει συνδεθεί άμεσα με τα ποσοστά πολλαπλασιασμού , τα και προκαλούμενη από ακτινοβολία τροποποιήσεις της έκφρασης γονιδίου που εμπλέκεται κυρίως στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, την επιδιόρθωση του DNA και απόπτωση [2]. Ραδιοαντοχή σε NSCLC έχει συσχετιστεί με την απώλεια της λειτουργίας ρ53, αλλοιωμένη έκφραση των πρωτεϊνών επιβίωσης όπως ο αναστολέας φυλοσύνδετη πρωτεΐνης απόπτωσης (ΧΙΑΡ) και survivin, η ενεργοποίηση του φωσφοϊνοσιτιδίου 3-κινάσης (ΡΙ3Κ) /Akt σηματοδότηση [3], ή υπερέκφραση του Pim-1 κινάσης [4]. Επίσης, συσσωρεύοντας στοιχεία δείχνουν ότι ραδιοαντοχή συχνά συσχετίζεται με τον υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) και την υπερέκφραση του αντι-οξειδωτικού ένζυμα όπως Mn-υπεροξειδική δισμουτάση (Mn-SOD) [5], [6]. Αν και αυτές οι μελέτες έχουν συμβάλει στην κατανόηση των μηχανισμών για την κυτταρική ραδιοαντοχή, μπορούν να εξηγήσουν μόνο μια μερική όψη της ραδιοανθεκτικά αποκρίσεων, και οι ολοκληρωμένες λειτουργικούς μηχανισμούς παραμένουν σε μεγάλο βαθμό ασαφείς. Αυτό το αποτέλεσμα δεν είναι εκπληκτικό, λαμβάνοντας υπόψη τη φύση των ραδιοαντοχή ρυθμίζεται από πολύπλοκες αλληλεπιδράσεις μεταξύ πολλαπλών γονιδίων και /ή πρωτεϊνών. Επιπλέον, υπάρχουν αρκετές αναφορές ότι ραδιοευαισθησία δεν συνδέονται αποκλειστικά με προκαλούμενη από ακτινοβολία απόπτωση, και μπορεί να εξαρτάται από πρόσθετες μόρια και τις διαδικασίες που δεν έχουν ακόμη ταυτοποιηθεί [7]. Ως εκ τούτου, ήταν δύσκολο να διευκρινιστεί ο ακριβής μηχανισμός ραδιοαντοχή και να κατανοήσουν ολόκληρο μεταβολή των αποκρίσεων ακτινοβολίας σε NSCLC.

Εκτεταμένες γονιδιακής έκφρασης ανάλυση μπορεί να αυξήσει την ερμηνεία του μοριακού μηχανισμού ραδιοαντοχή διαμορφώνεται από πολύπλοκες γενετικές και βιοχημικές δικτύων. Μικροσυστοιχιών είναι η πιο ολοκληρωμένη προσέγγιση για τη μέτρηση της γονιδιακής έκφρασης και έχει οδηγήσει σε εξαιρετική προόδους στη γνώση της ραδιοαντοχή [8], [9]. Ωστόσο, μικροσυστοιχιών έχει αρκετούς περιορισμούς, όπως η κινητική της υβριδοποίησης ανιχνευτή, η επιλογή ανιχνευτή (πρέπει να γνωρίζετε γονιδιωματικής τόπους και χαρακτηριστικά), υβριδισμό υπόβαθρο και cross-platform συγκρισιμότητα [10]. ανάλυση έκφρασης Sequencing-based έχει αναπτυχθεί για να ξεπεραστούν αυτοί οι περιορισμοί σε δοκιμασία υβριδοποίησης που βασίζονται. Κατά τα τελευταία 10 χρόνια, η εισαγωγή των τεχνολογιών υψηλής απόδοσης αλληλουχίας επόμενης γενιάς (NGS) έχουν ξεσηκώσει transcriptomics με την παροχή ευκαιριών για την πολυδιάστατη μελέτες των κυτταρικών transcriptomes. Γίνεται δυνατή επειδή τα δεδομένα έκφρασης μεγάλης κλίμακας που αποκτήθηκαν με ανάλυση απλής βάσης. Ως κύρια ποσοτικά πλατφόρμα μεταγραφικό προφίλ, RNA-seq έχει θεωρηθεί μια νέα πειραματική μέθοδος για την αντικατάσταση των μικροσυστοιχιών. Στο RNA-seq, (ολική ή αγγελιοφόρου) πληθυσμός RNA μετατρέπεται σε μια βιβλιοθήκη θραυσμάτων cDNA με προσαρμογείς που συνδέονται με ένα ή δύο άκρα. Κάθε βιβλιοθήκη, με ή χωρίς ενίσχυση, είναι τότε σε ακολουθία για να ληφθεί μικρή αλληλουχία διαβάζει από το ένα άκρο (single-άκρο αλληλούχιση) ή και τα δύο άκρα (ζεύγη-end αλληλούχιση). Οι αλληλουχίες ανάγνωσης είναι τυπικά 30-400 bp σε μήκος, ανάλογα με τις πλατφόρμες αλληλούχισης: Illumina, Roche 454 ή στερεά του συστήματος. Μετά αλληλούχιση, τα προκύπτοντα διαβάζει είτε ευθυγραμμιστεί με γονιδίωμα αναφοράς ή μεταγραφές ή έχουν συναρμολογηθεί

de novo

χωρίς την γονιδιωματική αλληλουχία [11]. Λόγω της υψηλής βάθος της κάλυψης ανάγνωσης, RNA-seq παράγει μια πιο ακριβή μέτρηση για τα επίπεδα των μεταγραφημάτων και ισομορφές τους από ό, τι άλλα εργαλεία. Επιπλέον, μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να διερευνήσει τις δομές μεταγραφή σε πλαίσιο θέσεις έναρξης μεταγραφής, εναλλακτικών τρόπων μάτισμα και άλλες μετα-μεταγραφικό τροποποιήσεις. RNA-seq έχει εφαρμοστεί για τον εντοπισμό καιρό μη-κωδικοποίησης RNAs που παίζουν σημαντικό ρόλο στην μεταγραφική και μετα-μεταφραστική ρύθμιση των γονιδίων [11].

Μέχρι σήμερα, δεν έχουν υπάρξει μελέτες που να αξιολογούν τις παγκόσμιες απαντήσεις ακτινοβολία σε όλο το επίπεδο μεταγραφικό στα κύτταρα NSCLC. Εστιάσαμε σε RNA-επόμενα για να ξεπεράσει τους περιορισμούς των προηγούμενων ερευνών δείχνουν κάπως αποσπασματικά τεκμήρια radioresponses, και στη συνέχεια, πρότεινε ότι το RNA-επόμενα θα μπορούσε να είναι μια ιδανική προσέγγιση για να αποκτήσουν εικόνα για το συγκρότημα απάντηση ακτινοβολία. Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε ως στόχο να χαρακτηρίσει μεταγραφικό ακτινοανθεκτικής κύτταρα Α549 NSCLC και για τη διερεύνηση λειτουργικών ρυθμιστικών δικτύων σε γενετικό επίπεδο. Για την επίτευξη αυτών των στόχων, κάναμε πλήρη χρήση ενός στρατηγικού συνδυασμού των δεδομένων γονιδιακής έκφρασης RNA-επ-προέρχεται και τα αποτελέσματα της βιοπληροφορικής και βιολογικές αναλύσεις. Είναι η πρώτη μελέτη για την εφαρμογή αυτής της νέας τεχνολογίας, RNA-seq στο προφίλ της γονιδιακής έκφρασης που προκαλείται από ακτινοβολία σε ακτινοανθεκτικά κύτταρα NSCLC. Προτείνουμε ότι τα αποτελέσματά μας θα μπορούσαν να παρέχουν χρήσιμες πληροφορίες για την ταυτοποίηση των πιθανών βιοδεικτών radioresponses όπως ραδιοαντοχή, και, τελικά, να βοηθήσει να κατανοήσουν τις επιπτώσεις της ακτινοβολίας στα κύτταρα NSCLC.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια

μέσα καλλιέργειας κυττάρων (RPMI 1640), FBS και αντιβιοτικά (πενικιλλίνη και στρεπτομυκίνη) αποκτήθηκαν από την Hyclone (Logan, UT). Αντισώματα έναντι EGFR, p53, Sestrin2, COX-2, TRAF4 και β-ακτίνης αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Αντισώματα για φωσφο-EGFR (Tyr1068), φωσφο-EGFR (Tyr845), φωσφο-Akt (Ser473), φωσφο-Akt (Tyr308), Akt, φωσφο-ρ53 (Ser15), ρ21 και φωσφατάση και tensin ομόλογο (ΡΤΕΝ) αποκτήθηκαν από την Cell Signaling Technology (Beverly, ΜΑ). Αντίσωμα έναντι γ-H2A.X (Ser139) αγοράστηκε από την Millipore (Billerica, ΜΑ). Αντισώματος για FDXR αγοράστηκε από Abcam (Austin, TX).

Cell Culture και ακτινοβολίας

κυτταρικές σειρές ανθρώπινου NSCLC (Α549 και NCI-Η460) αποκτήθηκαν από την κορεατική Γραμμή Τράπεζας Κυττάρων (Σεούλ, Δημοκρατία της Κορέας). Αμφότερα τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με πενικιλλίνη (100 U /ml), στρεπτομυκίνη (100 U /ml) και 10% FBS. Τα κύτταρα που εκτίθενται σε ιονίζουσα ακτινοβολία (IR) χρησιμοποιώντας το

137Cs γ-ακτινοβολίας (IBL 437C, CIS bio international) με ρυθμό δόσης των 0.8 Gy /min. Ακτινοβολημένα κύτταρα επωάστηκαν για επιπλέον 4 ώρες.

RNA-seq Βιβλιοθήκη Παρασκευή και Sequencing

Ολικό RNA απομονώθηκε από ακτινοβολημένα και μη-ακτινοβολημένα κύτταρα Α549 χρησιμοποιώντας RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA). ποιότητα του RNA εκτιμήθηκε με ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης (οπτική απουσία σημαντικών 28S και 18S rRNA αποικοδόμηση) και με φασματοφωτομετρία. Στη συνέχεια, η συνολική ακεραιότητα του RNA ελέγχθηκε χρησιμοποιώντας ένα Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer με έναν αριθμό ακεραιότητα RNA αξίας (RIN) μεγαλύτερη από 8. Το mRNA καθαρίστηκε και κατακερματισμένη από ολικό RNA (2 μg) χρησιμοποιώντας πολυ-Τ ολιγο-επισυνάπτεται μαγνητικά σφαιρίδια με δύο γύρους καθαρισμού. Διασπασμένων θραυσμάτων RNA ασταρώνονται με τυχαία εξαμερή μεταγράφηκαν ανάστροφα σε cDNA πρώτου κλώνου χρησιμοποιώντας αντίστροφη μεταγραφάση και τυχαία εναύσματα. Το πρότυπο RNA αφαιρείται και συντέθηκε ένα σκέλος αντικατάστασης για να δημιουργήσει διπλό σκέλος cDNA. Τέλος επισκευή, A-ουράς, απολίνωση προσαρμογέα, cDNA καθαρισμό πρότυπο και τον εμπλουτισμό των καθαρισμένων μήτρες cDNA χρησιμοποιώντας PCR διεξήχθησαν στη συνέχεια. Κατασκευασμένο βιβλιοθήκες ήταν 100 bp σε συνδυασμό τέλος αλληλουχία από ένα sequencer Illumina GAIIx σε δύο λωρίδες του κυττάρου ροής, ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Γονιδιακή Οντολογία (GO) Ανάλυση

GO ανάλυση είναι μια ευρέως εφαρμογή μέθοδος για λειτουργικές μελέτες μεγάλης κλίμακας γονιδιωματική ή transcriptomic δεδομένα [12]. Η Toolkit Γονιδιακή Οντολογία Εμπλουτισμός Λογισμικό Ανάλυσης (GOEAST, https://omicslab.genetics.ac.cn/GOEAST/php/illumina.php) χρησιμοποιήθηκε για τον εντοπισμό σημαντικά εμπλουτισμένη όρους GO μεταξύ της δεδομένης λίστα των γονιδίων που εκφράζονται διαφορικά σε απάντηση με IR. Στατιστικά υπερεκπροσωπούνται κατηγορίες GO με τιμή p & lt?. 0.01 θεωρήθηκαν σημαντικές

Ingenuity Ανάλυση Pathway (IPA)

λογισμικό IPA (Ingenuity System, Redwood City, CA) χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση του RNA μας -SEQ δεδομένων από την άποψη των βιολογικών αποκρίσεων και κανονικών μονοπατιών. Κατάταξη και τη σημασία των βιολειτουργίες και των κανονικών μονοπατιών δοκιμάστηκαν με την ρ-τιμή. Επιπλέον, κανονικών μονοπατιών διατάχθηκαν από το λόγο (αριθμός των γονιδίων από το σύνολο δεδομένων εισόδου που χαρτογραφούν στην οδό διαιρούμενο με το συνολικό αριθμό των μορίων που υπάρχουν στο κανονικό μονοπάτι). IPA δημιουργούνται επίσης τα δίκτυα κινητής τηλεφωνίας, όπου τα διαφορικά ρυθμιζόμενα γονίδια μπορεί να σχετίζονται, σύμφωνα με προηγουμένως γνωστές ενώσεις μεταξύ γονιδίων ή πρωτεϊνών, αλλά ανεξάρτητα των καθιερωμένων κανονικών μονοπατιών. Top δίκτυα εκπροσωπούνται συνειρμική λειτουργίες του δικτύου βασίζεται σε ένα αποτέλεσμα που θεωρεί ότι η -log (

σ

-τιμή), η οποία αθροίζει την πιθανότητα των γονιδίων στο δίκτυο που βρέθηκαν μαζί λόγω τυχαία πιθανότητα. Σκοράρει ≥2 θεωρήθηκε σημαντική.

Σε πραγματικό χρόνο αντίστροφη μεταγραφή (RT) -PCR

Το συνολικό RNA υπεβλήθη σε RT με τυχαίων εξαμερών χρησιμοποιώντας το SuperScript First-Strand Synthesis System (Invitrogen, Carlsbad , CA) για να ληφθούν cDNAs. Real-time PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας έναν υδραυλικό SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. κύκλων κατωφλίου (Ct) ήταν υπολογίζονται αυτόματα από το Mastercycler ep realplex (Eppendorf, Αμβούργο, Γερμανία). προϋπόθεση PCR ήταν ως ακολούθως: η ενεργοποίηση της πολυμεράσης στους 95 ° C για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από 40 κύκλους των 95 ° C για 15 sec, 60 ° C για 1 λεπτό. Η ένταση του κάθε γονιδίου κανονικοποιήθηκε έναντι έκφραση GAPDH. Η διαφορική έκφραση υπολογίστηκε ως λόγος των επιπέδων έκφρασης των γονιδίων στόχων σε ακτινοβολημένα και μη-ακτινοβολημένα κύτταρα, σύμφωνα με την ΔΔ C

t

μέθοδο [13]. Για όλους τους εκκινητές ζεύγη, ειδική ενίσχυση των προϊόντων PCR επιβεβαιώθηκε με ανάλυση καμπύλης τήξης και ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης. Οι εκκινητές σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας Primer Express® 4.0 (Applied Biosystems, Foster, CA) και οι αλληλουχίες παρουσιάζονται στον Πίνακα 1.

Η

Ανάλυση Western Blot

Μετά από 4 ώρες ακτινοβόληση, το σύνολο των κυττάρων Προϊόντα λύσης (5 × 10

6 κύτταρα) παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό RIPA λύσης (50 mM Tris, ρΗ 7,4, 150 mM NaCl, 1% ΝΡ-40, 1 mM NaF, 1 mM EDTA, 1 mM Να

3νο

4, 1 mM PMSF, 0,25% Na-δεοξυχολικού, και 5 U /ml απροτινίνης). Για ανάλυση στυπώματος Western, λύματα μετουσιωμένης πρωτεΐνης (40 μg) υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE. Οι διαχωρισμένες πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μια μεμβράνη νιτροκυτταρίνης και δεσμεύτηκαν με 5% αποβουτυρωμένο γάλα σε TBST (10 mM Tris, 100 mM NaCl, και 0.1% Tween 20) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Οι μεμβράνες μετά ανιχνεύθηκαν με ειδικά πρωτογενή αντισώματα που ακολουθείται από δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση, και οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα σύστημα ανίχνευσης ECL (GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, England).

Αποτελέσματα

Σχεδιασμός του RNA-seq Μελέτη σε ραδιοανθεκτικά NSCLC κύτταρα

Κάθε κυτταρική γραμμή που λαμβάνεται από NSCLCs έχει αναφερθεί για διαφορετικούς ραδιοευαισθησία τους. Κύτταρα Α549, ένα καλά χαρακτηρισμένο ραδιοανθεκτικά κυτταρική γραμμή NSCLC, δείχνουν σημαντική ανοχή σε ακτινοβολία και μέτρια απώλεια της βιωσιμότητας των κυττάρων μετά από έκθεση σε IR [4], [14]. Σε αυτή τη μελέτη, θα θέλαμε να διερευνήσει την ακτινοβολία που προκαλείται από ολόκληρη την αλλοίωση μεταγραφικό στο ακτινοανθεκτικά NSCLC κύτταρα χρησιμοποιώντας RNA-επόμενα, και επιπλέον να εντοπίσει τους παράγοντες ραδιοαντοχή-συσχετίζοντας (δυναμικό βιοδείκτες της ραδιοαντοχή). Προκειμένου να επαληθεύσει τις κατάλληλες πειραματικές συνθήκες για την ανάλυση του RNA-seq, εξετάσαμε την εξαρτώμενη από το χρόνο έκφραση πολλών πρωτεϊνών που είναι γνωστή ως radioresponsive παράγοντες [15], [16], [17] το ακτινοανθεκτικά κύτταρα Α549 NSCLC υπό ακτινοβολία. Επίσης, λαμβάνοντας υπόψη σωρευτικές επιπτώσεις της ακτινοβολίας, η δόση ακτινοβολίας ορίστηκε σε 2 Gy. Αυτό ήταν εντός του εύρους δοσολογίας τυπικά χορηγούνται σε πειράματα βιολογία ακτινοβολία που περιλαμβάνει κύτταρα [18]. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Α, τα επίπεδα έκφρασης της φωσφο-EGFR (Tyr845), φωσφο-Akt (Ser473) και ρ21 έδειξε μια μέγιστη αύξηση κατά 4 ώρες μετά την ακτινοβόληση. Επιπροσθέτως, IR-επαγόμενη έκφραση ΡΤΕΝ βαθμιαία μειώθηκε, ενώ phosphoryaltion της Akt σε Ser473 αυξήθηκε σε έναν χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο.

(Α) Προσδιορισμός της κατάλληλης κατάστασης ακτινοβολίας με βάση την έκφραση των αντιπροσωπευτικών radioresponsive πρωτεϊνών. (Β) Ένα σχηματικό διάγραμμα για το σχεδιασμό και τους στόχους της μελέτης μας. ΤΟΡΗΑΤ C ευθυγραμμίζει RNA-επόμενα διαβάζει γονιδιώματος αναφοράς (hg19) και βρίσκει θέσεις ματίσματος μεταγραφή. Μανικετόκουμπα συγκεντρώσει το διαβάζει παράγεται από την ευθυγράμμιση ΤΟΡΗΑΤ C σε μεταγραφές. πακέτο μανικετόκουμπα αποτελείται από τα ακόλουθα λογισμικού – μανικετόκουμπα, συναρμολογεί μεταγραφήματα? Cuffcompare, συγκρίνει συνελεύσεις μεταγραφή για σχολιασμό? Cuffdiff, βρίσκει διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων και μεταγραφές.

Η

με το σκοπό του πειράματος, πλατφόρμες αλληλουχίας, διαβάστε μήκη και τύπους αλληλούχιση θα πρέπει να προσδιορίζεται κατάλληλα. Αυτές οι πειραματικές συνθήκες έχουν στενή σχέση με την αποτελεσματικότητα της ανάλυσης RNA-seq. πλατφόρμα αλληλούχιση Illumina φαίνεται να είναι εξαιρετικά αναπαραγώγιμο με σχετικά μικρή τεχνική παραλλαγή όπως μεταγραφή μήκους προκατάληψη [19]. Δείχνει μεγαλύτερη κάλυψη μεταγραφικό και το βάθος αλληλουχίας [10]. Επιπλέον, σε συνδυασμό άκρου αλληλούχιση είναι κατάλληλο για τη διεξαγωγή ποιοτικής ανάλυσης όπως η χαρτογράφηση έναρξης μεταγραφής θέση, η ανίχνευση των μεταγραφημάτων σύντηξης γονιδίου και εναλλακτικό μάτισμα, και χαρτογράφηση του γονιδιωματικού δομικές παραλλαγές, όπως διαγραφές, παρεμβολές και αναδιατάξεις [20]. Με βάση αυτά τα αποτελέσματα της έρευνας, μετά την ακτινοβόληση 4 ώρες, το ολικό RNA απομονώθηκε από ακτινοβολημένα και μη-ακτινοβολημένα κύτταρα ραδιοανθεκτικά Α549, χρησιμοποιείται για τη δημιουργία Illumina RNA-seq βιβλιοθήκη, και στη συνέχεια υποβάλλεται σε 100 bp αντιστοιχισμένο-άκρο αλληλουχίας με τη χρήση της πλατφόρμας Illumina GAIIx. Ένα σχηματικό διάγραμμα για το σχεδιασμό και τους στόχους της μελέτης μας παρουσιάζεται στο Σχ. 1Β

Αναγνώριση Radioresponsive γονίδια σε ακτινοανθεκτικά NSCLC κύτταρα μέσω μεταγραφικό Ανάλυση

Συνολικός αριθμός των RNA-επόμενα διαβάζει (format αποτέλεσμα: FASTQ). Αποκτηθεί από ακτινοβολημένα και μη ακτινοβολημένα ακτινοανθεκτικά κύτταρα NSCLC Α549, ήταν 32.315.026 (6527635252 bp) και 31084922 (6279154244 bp), αντίστοιχα. Εμείς ευθυγραμμιστεί η ακολουθία διαβάζει σε μια αναφορά του ανθρώπινου γονιδιώματος (hg19) χρησιμοποιώντας ΤΟΡΗΑΤ C έκδοση 1.2.0. διασταυρώσεις ματίσματος εξήχθησαν από REFSEQ ευθυγράμμισης (κατεβάσει από το Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνιας στη Σάντα Κρουζ (UCSC) Γονιδίωμα Browser). Συνολικά, τουλάχιστον ένα από τα άκρα 28372827 (87,8%) και 27514052 (88,5%) διαβάζει τα ακτινοβολημένα και μη-ακτινοβολημένα κύτταρα Α549, αντίστοιχα, χαρτογραφήθηκαν με επιτυχία κατά hg19. Στη συνέχεια, οι προκύπτουσες ανάγνωσης ευθυγραμμίσεις (μορφή αρχείου: BAM) συγκεντρώθηκαν μέσω μανικετόκουμπα έκδοση 1.0.3, και δημιούργησε μια νέα μεταγραφή χρησιμοποιώντας μεταγραφή (RABT) αλγόριθμο αναφοράς Μανικετόκουμπα σχολιασμός που βασίζεται. Οι μεταγραφές σε συνδυασμό με Cuffcompare χρησιμοποιήθηκαν για τον υπολογισμό σχετική αφθονία του κάθε μεταγραφή μέσω Cuffdiff. επίπεδα έκφρασης γονιδίων προσδιορίστηκαν με μέτρηση του αθροίσματος των θραυσμάτων ανά kilobase μοντέλου εξονίου ανά εκατομμύριο χαρτογραφηθεί διαβάζει τιμές (FPKM) του εξώνια της. Για να αποκτήσει πιο ακριβή αποτελέσματα, θα φιλτράρονται τα καθένα δεδομένα, αν εκτιμώμενες τιμές FPKM τόσο ακτινοβολημένα και μη ακτινοβολημένα δείγματος ήταν μικρότερη από 1,0 (βλ αξία FPKM 0,05 ως το κατώτερο όριο του επιπέδου έκφρασης συνήθως οριστεί). Τελικά, εντοπίσαμε ότι 727 γονίδια σημαντικά διαφορικά εκφρασμένες σε ραδιοανθεκτικά κύτταρα Α549 μετά την ακτινοβόληση. Μεταξύ αυτών των γονιδίων, 367 γονίδια ρυθμισμένα προς τα πάνω, και 360 γονίδια ρυθμισμένα προς τα κάτω. Σύμφωνα με την κυτταρική λειτουργική κατηγοριοποίηση, σημαντικά πάνω ρυθμισμένα γονίδια ταξινομούνται ως εξής: κυτταρικού κύκλου (

CDKN1A, MLL5, NEK11, TP53INP1

), επισκευή (

DDB2, REV3L, SESN1, SESN2, XPC

), ο θάνατος των κυττάρων (

ACER2, BTG2, MDM2, MEF2A, OPA1, PLTP, TRIAP1

), του μεταβολισμού των λιπιδίων (

COL4A3, COX-2

), η κυτταρική ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό (

DOK1, EIF2AK2, FDXR, DFRK, GDF15, GSTM1, ΡϋΚ1, ΤΕΣ, PIK3IP1, PPM1D, RHOBTB2, SH3BP2, SHBG, SLC22A1

) και ανοσολογικές αποκρίσεις του συστήματος (

FoxP3, TNFSF9

). Επίσης, σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται γονίδια ταξινομούνται ως εξής: κυτταρικού κύκλου (

CDC42, MT2A, SPC25, STAT5A

), επισκευή (

H2AFX, PDE11A, XRCC3

), την κυτταρική ανάπτυξη (

GPER, ICAM2, OPHN1

), κυτταρικό θάνατο (

CARD8, λειτουργίας του CEACAM1, PTPRG, ST6GAL1

), κυτταρική ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό (

BAI1, F3, KLF11, MNT, MORF4L1, MYC, ROMO1 , SMAD1, ST7L, TBXA2R

) και ανοσολογικές αποκρίσεις του συστήματος (

IL12A

). Τα λεπτομερή αποτελέσματα παρουσιάζονται στο Σύνολο δεδομένων S1, Πίνακας S1 και S2 πίνακα.

Επιπλέον, για να επαληθεύσει τις χαρακτηριστικές χρωμοσωμικές θέσεις των γονιδίων που ελέγχουν απαντήσεις ακτινοβολία, εξετάσαμε το τοπίο έκφραση σε όλη ολόκληρα χρωμοσώματα από τη διερεύνηση αλλοίωση της γονιδιακής έκφρασης σε ακτινοβολημένα ακτινοανθεκτικά κύτταρα Α549. Το 400 kb συρόμενο παράθυρο, ο αριθμός των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων των κυττάρων Α549 σε απόκριση IR, χαράσσεται μαζί με τα ολόκληρα χρωμοσώματα χρησιμοποιώντας προσαρμοσμένες-track του UCSC Genome Browser (Εικ. 2). Βρήκαμε ότι τα πρότυπα κατανομής χρωμόσωμα ποικίλουν σε μεγάλο βαθμό σε σχέση με την πυκνότητα του γονιδίου, και ειδικότερα χρωμόσωμα 19 έδειξαν την υψηλότερη πυκνότητα γονίδιο χαρτογραφείται γονιδίων. Σε ραδιοανθεκτικά κύτταρα Α549 NSCLC, ένας μεγάλος αριθμός γονιδίων που δείχνουν έκφραση IR-μεταβληθεί βρίσκονταν στο χρωμόσωμα 1, 2, 3 και 19. Ωστόσο, δεν θα μπορούσαμε να αποκτήσουμε σημαντικές πληροφορίες της άμεσης σχέσης μεταξύ αποκρίσεων ακτινοβολίας και αυτά τα πρότυπα κατανομής χρωμόσωμα.

(χ-άξονας: χρωμόσωμα συντεταγμένων, άξονας-γ: ο αριθμός των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων των κυττάρων Α549 υπό ακτινοβολία σε 400 kb συρόμενο παράθυρο).

η

Διερεύνηση Ακτινοβολίας επαγόμενης μεταγραφικό αλλοίωση σε κύτταρα ανθεκτικά στην ακτινοβολία NSCLC μέσω GO ανάλυση

μέσα οποιοδήποτε δεδομένο σετ γονιδίων (μικροσυστοιχιών ή NGS σύνολα πειραματικών δεδομένων), GO-με βάση τη λειτουργική ανάλυση παρέχει στατιστικά εμπλουτισμένο όρους GO, που περιγράφουν τα προϊόντα των γονιδίων και αποδεικνύουν τις σχέσεις τους σύμφωνα με τρεις οντολογία κατηγορίες: βιολογική διεργασία, μοριακή λειτουργία και κυτταρικού συστατικού [12]. Για να αναλύσουμε τα δεδομένα μας RNA-επόμενα βασίζονται σε ομάδες συνδέονται λειτουργικά με τα γονίδια αντί των μεμονωμένων γονιδίων, χρησιμοποιήσαμε GOEAST ως web-based υψηλής απόδοσης λειτουργικό εργαλείο γονιδιωματικής ανάλυσης. Στη συνέχεια εντοπίστηκαν σημαντικά εμπλουτισμένη όρους GO και χαρακτηρίζεται απαντήσεις ακτινοβολίας ανθεκτικά στην ακτινοβολία κύτταρα Α549 NSCLC. Συνολικά, εμπλουτισμένο όρους GO βρέθηκαν σε 77 υποκατηγορίες στα πλαίσια της βιολογικής διαδικασίας, 17 υποκατηγορίες σύμφωνα με κυτταρικό συστατικό, και 50 υποκατηγορίες στα πλαίσια της μοριακής λειτουργίας. Στη βιολογική οντολογία διεργασία, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι πυρηνικό εντοπισμό, τον υποδοχέα ΤΟΡ-β οδού, διακοπή του κυτταρικού κύκλου, κυτταρική μετανάστευση, σερίνη /κινάση θρεονίνης σηματοδότησης μονοπάτι σηματοδότησης, αγγειογένεση, BMP μονοπάτι σηματοδότησης, και ρύθμιση του κυτταρικού μορφογένεσης συνδέονται κυρίως με radioresponses σε ακτινοανθεκτικά κύτταρα Α549. Focal προσκόλληση ήταν ένα από τα κύρια κυτταρικά συστατικά τροποποιηθεί με IR. Τα προφίλ σημαντικό εμπλουτισμό GO στη βιολογική διαδικασία και την κυτταρική κατηγορίες συστατικό (μόνο π-τιμή μικρότερη από 0.01) συνοψίζονται στον Πίνακα 2. Θα καθοριστεί επίσης τα υπερεκπροσωπούνται όρους GO σε γραφική μορφή, σύμφωνα με τις σχέσεις τους στην ιεραρχική δέντρο της οντολογίας μοριακής λειτουργίας (Εικ. 3). Εμπλουτισμένο GO όροι μοριακών λειτουργία σε ραδιοανθεκτικά κύτταρα Α549, υπό ακτινοβολία ήταν β-γαλακτοσίδη α-2,6-σιαλυλτρανσφεράση δραστηριότητα, πυροσταφυλικής αφυδρογονάσης δραστικότητα κινάσης, ΤΟΡ-β δραστικότητα υποδοχέα, δέσμευσης GTP, δραστικότητα μεταφορέα διαμεμβρανική πρωτεΐνη, η δραστικότητα σύνδεσης υποδοχέα filamin και ακτιβίνης. Μέσα από την ανάλυση GO, βρήκαμε ότι υπερεκπροσωπούνται όρους GO στην radioresponsive σύνολα γονιδίων μας, συνδέονται στενά με EMT, τη μετανάστευση και την περαιτέρω αγγειογένεση. Με τη συμμετοχή του εστιακού συστατικών προσκόλλησης, σηματοδότηση ΤΟΡβ /ΒΜΡ, δεσμευτική filamin και δραστικότητα υποδοχέα ακτιβίνης έχουν αναφερθεί για τη ρύθμιση αλλοίωση της μορφολογίας των κυττάρων κατά τη διάρκεια της ΕΜΤ ή της μετανάστευσης των κυττάρων. Στο σύνολό τους, προτείνουμε ότι η EMT και EMT που σχετίζονται με τα γεγονότα μπορεί να είναι κρίσιμη στη ρύθμιση αποκρίσεων ακτινοβολίας σε ακτινοανθεκτικά κύτταρα Α549 υπό ακτινοβολία.

Κάθε κουτί έχει GO όρους επισημαίνονται με GO ID, όρο ενός ορισμού και λεπτομερείς πληροφορίες που εκπροσωπούν » q /m