Αφηρημένο

Ιστορικό

Έχουμε περιγράψει προηγουμένως μια RAF ογκογονίδιο οδηγείται διαγονιδιακό μοντέλο ποντικού για μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC). Εδώ εξετάζουμε κατά πόσο έναρξη και την ανάπτυξη του όγκου απαιτεί την βλαστικών κυττάρων παράγοντα αυτο-ανανέωση Bmi1.

Κύρια Ευρήματα

Για να αξιολογηθεί η λειτουργία Bmi1 σε NSCLC δύο γραμμές ιδρυτή που διαφέρουν στη συχνότητα εμφάνισης και λανθάνουσα κατάσταση του σχηματισμό όγκων συγκρίθηκαν. Κατάλυση της έκφρασης Bmi1 και στις δύο γραμμές είχαν μειωθεί δραματικά την ανάπτυξη του όγκου. Όπως η γραμμή με την μικρότερη λανθάνουσα κατάσταση συνδυάζεται η διάρκεια ζωής της Bmi1 knock out ποντίκια, τα ποντίκια επιλέχθηκαν για περαιτέρω μελέτη. Η απουσία Bmi1 δεν μείωσε τον αριθμό των όγκων έναρξης σε αυτούς τους ποντικούς καθώς μόνο το μέγεθος και όχι ο αριθμός των όγκων μειώθηκε. Μείωση στην αύξηση του όγκου προέκυψε από την αύξηση του κυτταρικού θανάτου και μείωση στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου που αντιστοιχεί με τη ρύθμιση του p16

ΙΝΚ4 & και p19

ΤΑΠ.

Σημασία

Τα δεδομένα προσδιορίζει Bmi1 ως σημαντικός παράγοντας για την επέκταση, αλλά όχι την έναρξη της RAF οδηγείται NSCLC

Παράθεση:. Becker M, Korn C, Sienerth AR, Voswinckel R, Luetkenhaus Κ, Ceteci F, et al. (2009) Protein Ομάδα Polycomb Bmi1 απαιτείται για την ανάπτυξη της RAF Driven μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 4 (1): E4230. doi: 10.1371 /journal.pone.0004230

Επιμέλεια: Mauricio Rojas, Πανεπιστήμιο Emory, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 5 του Αυγούστου 2008? Αποδεκτές: 5 του Δεκέμβρη, 2008? Δημοσιεύθηκε: 19 Ιανουαρίου, 2009

Copyright: © 2009 Becker et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. MB και CK υποστηρίχθηκαν από SFB TR 17 της DFG, ARS και KL υποστηρίχθηκαν από την απόφοιτος κολεγίου DFG 1141 Βίρτσμπουργκ-Νίκαια. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο στον δυτικό κόσμο. Με βάση ιστολογία δύο διαφορετικούς τύπους καρκίνου του πνεύμονα, μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) και μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα (SCLC) ορίζονται. Συνολικά το 50% του συνόλου των αδενοκαρκινώματα, η πιο διαδεδομένη μορφή NSCLC, λιμάνι μεταλλάξεις σε συστατικά του μιτογόνου σηματοδότησης καταρράκτη δηλαδή EGFR, K-Ras και B-RAF [1]. Οι μεταλλάξεις του C-RAF βρίσκονται επίσης σε NSCLC, ωστόσο, σε χαμηλότερη συχνότητα.

Πολλά συστήματα που καρκίνος του πνεύμονα μοντέλο στον ποντικό έχουν αναφερθεί. Οι στρατηγικές για τη δημιουργία αυτά τα μοντέλα έχουν ουσιαστικά ακολούθησαν δύο διαφορετικές διαδρομές. 1) Η επαγωγή της έκφρασης του ογκογονιδίου και τη διαγραφή των ογκοκατασταλτικών γονιδίων μέσω αδενοϊό κατευθύνεται έκφραση του Cre-ανασυνδυάσης [2] – [5]. Αυτό μιμείται προσέγγιση εμφάνιση σωματικών μεταλλάξεων σε ενήλικες ιστούς. 2) Συστατική έκφραση ογκογονιδίου σε κύτταρα-στόχους μέσω της χρήσης ειδικών προαγωγών κυτταρικού τύπου [6], [7]. Τα τελευταία μοντέλα μπορεί να είναι πιο κατάλληλο για gestationally απέκτησε μεταλλάξεις. Ενώ οι ιικώς επαγόμενη μοντέλα δείχνουν ένα κάπως απροσδιόριστο φάσμα κύτταρο στόχο το διαγονιδιακό προσέγγιση έχει το δυναμικό της στόχευσης όλες τις μεταμόρφωση ευαίσθητα κύτταρα που δείχνουν έκφραση από έναν εξειδικευμένο υποκινητή συγκεκριμένο τύπο κυττάρου.

περιγράφηκε προηγουμένως την δημιουργία διαγονιδιακών γραμμών που εκφράζουν ένα ενεργοποιημένο ογκογονικώς εκδοχή της κινάσης C-RAF (C-RAF BXB) υπό τον έλεγχο του ανθρώπινου κυψελιδικού τύπου δύο (ΑΤ2) κυττάρου ειδικού επιφανειοδραστική πρωτεΐνη C (SP-C) υποκινητή [7]. Δύο γραμμές ιδρυτής, περαιτέρω αναφέρεται ως BXB11 και BXB23, δείχνουν πνεύμονα στοχευμένη ανάπτυξη αδενώματος με υψηλή διεισδυτικότητα, μεγάλη συχνότητα και μικρή καθυστέρηση. Όγκοι είναι φαινοτυπικά μάλλον σταθερή και όχι πυρηνική ατυπία ή μετάσταση είχε δει σε ένα C57BL /6 υπόβαθρο. Ένα κυβοειδές τύπος κυττάρου αποτελεί κατά κύριο λόγο τα αδενώματα. Έχει παρατηρηθεί αριθ βρογχικά επιθηλιακά υπερπλασία συνεχής με κυβοειδές όγκους όπως περιγράφεται για ογκογόνο μοντέλα K-Ras [4]. Η γραμμή ιδρυτής BXB23 έχει χρησιμοποιηθεί εκτενώς σε γενετικές μελέτες για την ανάλυση της προόδου των όγκων παράγοντες επιρροής [7] – [12]. Αν και η έκφραση διαγονιδίου σε κύρια στόχων όλων των ΑΤ2 κύτταρα μόνο ένα υποσύνολο από αυτούς ανταποκρίθηκαν στην έκφραση του C-RAF BXB με το σχηματισμό όγκων [7]. Μια εξήγηση αυτού του ευρήματος είναι ότι ένα διαμέρισμα πνεύμονα προγονικών ανταποκρίνεται σε μιτογόνο καταρράκτη σηματοδότησης με την επέκταση. Εναλλακτικά κλείσει έκφρασης διαγονιδίου στην πλειονότητα των ΑΤ2 κυττάρων μπορεί να συμβεί. Εμείς ευνοούν την πρώτη δυνατότητα και να υποθέσουμε ότι αυτό διαμέρισμα προγονικών είναι Bmi1 θετική και εξαρτάται από μιτογόνο καταρράκτη σηματοδότησης για την αυτο-ανανέωση αφού θεραπεία με έναν αναστολέα ΜΕΚ οδήγησε σε προτιμησιακή μείωση στο κλάσμα των θετικών καρκινικών κυττάρων Bmi1 και μία δραματική μείωση σε όγκο μάζα [ ,,,0],12]. Συνεπής με αυτά τα ευρήματα κύτταρα του ενδοδέρματος πρωτόγονης οποία θα οδηγήσει σε πνευμονική προγονικά κύτταρα δείχνουν την εξάρτηση από μιτογόνο σηματοδότηση για την αυτο-ανανέωση και όχι διαφοροποίηση [13]. Έχει ήδη αποδειχθεί ότι η πρωτεΐνη ομάδα Polycomb Bmi1 είναι ένας κρίσιμος παράγοντας για την αυτο-ανανέωσης σε ενήλικα βλαστικά βλαστικά κύτταρα /καρκινικά κύτταρα μέσω της αναστολής της ΙΝΚ4 & /ΤΑΠ τόπο κωδικοποίηση p16

ΙΝΚ4 & /p19

ARF ([ ,,,0],14], αναθεωρούνται στο [15]). Bmi1 έχει επίσης πρόσφατα έχουν προσδιοριστεί ως προγνωστικός δείκτης για NSCLC [16], [17] και ανήκει σε μια ομάδα παραγόντων που έχουν προσδιοριστεί ως ο θάνατος-από-τον καρκίνο υπογραφή στο ανθρώπινο κακοήθειες [18].

στη μελέτη αυτή έχει σκοπό την αξιολόγηση της λειτουργίας Bmi1 σε σχηματισμό που προκαλείται από αδένωμα της RAF. Λόγω της περιορισμένης διάρκειας ζωής του γονιδίου αποκόπτεται ποντίκια Bmi1 [19] επωφεληθήκαμε από την υψηλότερη συχνότητα εμφάνισης και μικρότερη καθυστέρηση της γραμμής ιδρυτή BXB11 να εξετάσει την εξάρτηση Bmi1 της ανάπτυξης αδενώματος σε προχωρημένο στάδιο της νόσου.

Bmi1 κατάλυσης μέσω διασχίζουν το Bmi1 – /- υπόβαθρο στη γραμμή ιδρυτή BXB23 και BXB11 αποκάλυψε ότι Bmi1 δεν είναι απαραίτητη για την έναρξη του όγκου, αλλά για την επέκταση του ξεκίνησε κυττάρων

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική δήλωση

.

Όλες οι μελέτες σε ζώα έχουν εγκριθεί από τις αρχές της Βαυαρίας για τα πειράματα σε ζώα.

Ζώα

BXB23 και τα ποντίκια BXB11 ήταν συνήθως εκτρέφονται στο C57BL /6 υπόβαθρο. Για την παραγωγή του Bmi1 – /- BXB23 και Bmi1 – /- ποντίκια BXB11 SP-C, C-RAF BXB ποντίκια διασταυρώθηκαν με Bmi1 +/- ποντίκια που είχαν διαδοθεί σε FVB /N φόντο. Οι προκύπτουσες Bmi1 ετερόζυγη ένωση ποντίκια διασταυρώθηκαν με FVB /N /Bmi1 +/- ποντίκια για να παράγουν Bmi1 – /-. Ένωση ποντίκια SP-C C-RAF BXB

Αντιδραστήρια και αντισώματα

Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν για ανοσοϊστοχημεία /ανοσοφθορισμό: Pro αντίσωμα SP-C κουνελιού πολυκλωνικό (Chemicon International), αντίσωμα CC10 κατσίκα πολυκλωνικό (Santa Cruz Biotechnology), παν-Cytokeratin πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού (ϋΑΚΟ), Ki-67 μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού (Novocastra), C-RAF μονοκλωνικό αντίσωμα (Santa Cruz Biotechnology), Bmi1 μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού (Upstate), ρ19

ARF κουνελιού πολυκλωνικό αντίσωμα (Abcam), c-MYC πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού (Santa Cruz Biotechnology), ρ16

ΙΝΚ4 & κουνελιού πολυκλωνικό αντίσωμα ποντικού ( Santa Cruz Biotechnology), κουνέλι μονοκλωνικά φωσφο-ρ44 /ρ42 ΜΑΡΚ Thr 202 /Tyr204 (φωσφο-ΕΚΚ) αντίσωμα (Cell Signaling).

μικροσκοπία

μικροσκοπία φθορισμού πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα λογισμικό Openlab ( Improvision, Κόβεντρυ, Ηνωμένο Βασίλειο), που ελέγχεται DMIRBE μικροσκόπιο (Leica, Wetzlar, Γερμανία) με Leica καταδυτικό αντικειμενικό φακό 40 ×. Όλες οι εικόνες συλλήφθηκαν και αποθηκεύονται ως αρχεία Openlab ΕΙΡ. Εικόνες στη συνέχεια επεξεργασία χρησιμοποιώντας το σημείο τροφοδοσίας και το λογισμικό Adobe Illustrator.

ιστοπαθολογία και ανοσοϊστοχημεία /ανοσοφθορισμού χρώση

Τα ζώα θανατώθηκαν και οι πνεύμονες μονιμοποιήθηκαν υπό πίεση νερού 25 εκατοστών με 4% PBS ρυθμιστικό διάλυμα φορμόλης. Ιστολογία έγινε σε σταθεροποιημένο με φορμαλίνη, εγκλεισμένα σε παραφίνη δείγμα πνεύμονα. 6 τομές μm-cut αποπαραφινοποιήθηκαν, επανυδατώθηκαν σε διαβαθμισμένες αλκοόλες και αιματοξυλίνη-ηωσίνη (Η &? Ε) χρωματίζονται. Για τον ποσοτικό προσδιορισμό του εμφάνιση όγκου, ο αριθμός των όγκων εντός τουλάχιστον πέντε διαφορετικές περιοχές (310,390 μm

2) ανά Η &? Ε ή C-RAF τομές χρωματίστηκαν πνεύμονα μετρήθηκε. Τουλάχιστον τέσσερις ποντικοί αναλύθηκαν για κάθε γονότυπο. Ο όγκος του όγκου υπολογίσθηκε είτε από την Η & amp? Ε χρώση ή αντι-C-RAF χρωματίζονται όγκους από ολόκληρα τμήματα του πνεύμονα υποθέτοντας σφαιρικό όγκο. Οι διάμετροι των όγκων μετρήθηκαν με τη χρήση ενός μικροσκοπίου Leica. Για τον ποσοτικό προσδιορισμό των όγκων του όγκου εξετάστηκαν τουλάχιστον τέσσερα ζώα ανά γονότυπο και την ηλικία: 321 όγκους από BXB11, 266 όγκους από Bmi1 – /- BXB11, 92 όγκους από BXB23 και 54 όγκους από Bmi1 – /- BXB23 ζώα σε ηλικία δύο εβδομάδων αναλύθηκαν. 133 όγκους από Bmi1 – /- BXB11, 121 όγκους από BXB23 και 4 όγκους από Bmi1 – /- BXB23 ζώα σε ηλικία τριών μηνών αναλύθηκαν. Για την ποσοτικοποίηση του πολλαπλασιασμού Κί67 /pro SP-C θετικά κύτταρα σε τομές πνεύμονα από ποντίκια της ενδεικνυόμενης γονότυπο και την ηλικία αναλύθηκαν. Ένα σύνολο τουλάχιστον 1200 pro SP-C θετικά κύτταρα μετρήθηκαν από πέντε τυχαία επιλεγμένα όγκους και αναλύθηκαν για Ki67 συν-χρώση. Για ΤΟΥΝΕΛ χρώση αδιέξοδο φθορομετρικής ΤΟΥΝΕΛ-System (Promega) χρησιμοποιήθηκε. Ένα σύνολο 20 τυχαία επιλεγμένα όγκους από τέσσερα ποντίκια (Bmi1 – /- BXB11) και 25 τυχαία επιλεγμένα όγκους από πέντε ποντικούς (BXB11) αναλύθηκαν. 325 (+/- 100) DAPI θετικά κύτταρα ανά καρκίνωμα αναλύθηκαν για TUNEL θετικότητα. Για τον ποσοτικό προσδιορισμό των κυττάρων με πυρηνική χρώση φωσφο-ΕΚΚ αναλύθηκαν τουλάχιστον 14 όγκους από δύο ποντίκια της ενδεικνυόμενης γονότυπο και την ηλικία. Ημι αυτοματοποιημένη μορφολογική ανάλυση των τμημάτων του πνεύμονα από WT και Bmi1 – /- ζώα διεξήχθη όπως περιγράφεται στο [20]. Για τον ποσοτικό προσδιορισμό των προ SP-C /CC10 διπλά θετικά κύτταρα αναλύθηκαν πέντε τυχαία επιλεγμένα όγκων ανά τμήμα του πνεύμονα από συνολικά 5 ζώα στην ηλικία των 2 εβδομάδων έως 3 μηνών. Ρυθμίσεις για λήψη εικόνας επιλέχθηκαν που επέτρεψε την ανίχνευση των διπλών θετικών κυττάρων στο βρογχο-κυψελιδικού-αγωγός κόμβους (BADJs)

χρώσεις ανοσοφθορισμού διεξήχθησαν σύμφωνα με το ακόλουθο βασικό πρωτόκολλο:. Παραφίνη ενσωματωμένα τμήματα αποπαραφινοποιήθηκαν και επανυδατώθηκαν . Για αντιγόνο μικροκύματα ανάκτηση τομές επωάστηκαν σε 10 mM κιτρικού ρυθμιστικού διαλύματος επί 6-23 λεπτά. Τα πλακίδια μπλοκαρίστηκαν σε κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει είτε 4% κατσίκας ή ορό γαϊδάρου, ή 1% BSA (αποκλειστικά για χρώση Bmi1). Η επώαση με πρωτογενή αντισώματα διεξήχθη όλη τη νύχτα στους 4 ° C που ακολουθείται από μετέπειτα στάδια ως εξής: Για pro SP-C /Ki67 τμήματα συν-χρώση επωάστηκαν με βιοτινυλιωμένο αντίσωμα γαϊδάρου αντι-ποντικού (1:200) και Cy5 αντίσωμα αντι-κουνελιού γαϊδάρου (1:200) για 90 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου (RT) τομές στη συνέχεια επωάστηκαν με στρεπταβιδίνη συζευγμένη με Alexa 555 (1:200). Για Bmi1 τομές χρώση επωάστηκαν με ένα αντίσωμα αντι ποντικός βιοτινυλιωμένο κατσίκα σε ρυθμιστικό αποκλεισμού για 90 λεπτά σε RT. Μετά από τρεις πλύσεις με PBS οι τομές επωάστηκαν με αντιδραστήριο ABC (Vectastain Elite ABX Kit, Vector Labs) για 30 λεπτά σε RT. Ακολούθως οι τομές επωάστηκαν με Cy5 επισημασμένα αντι HRP (υπεροξειδάση Horseraddish) αντίσωμα (1:100) σε ρυθμιστικό δέσμευσης. Για ρ19

ARF τομές χρώση επωάστηκαν με αντίσωμα αντι κουνελιού βιοτινυλιωμένο γάιδαρος (1:200) 90 λεπτά σε RT. Μετά από τρεις πλύσεις με PBS τομές επωάστηκαν με στρεπταβιδίνη συζευγμένη Alexa 555 (1:200) σε PBS, 0,2% Triton Χ-100, 90 λεπτά σε RT. Για pro τμήματα SP-C /CC10 συν-χρώση επωάστηκαν με γαϊδάρου αντι-κατσίκας Alexa 555 (1:200) και γαϊδάρου αντι-κουνελιού Cy5 (1:200) αντισωμάτων σε ρυθμιστικό αποκλεισμού για 90 λεπτά. Όλες οι χρώσεις τελικά αντίθετα με DAPI πριν από την τοποθέτηση.

Για ανοσοϊστοχημικές χρώσεις αποπαραφινοποιήθηκαν και επανυδατώθηκαν τμήματα. Για αντιγόνο ανάκτηση τομές επωάστηκαν σε 10 mM κιτρικό ρυθμιστικό διάλυμα στους 90 ° C για 10-20 λεπτά. Η ενδογενής δραστικότητα υπεροξειδάσης αποσβέστηκε με μεθανόλη ή PBS που περιέχει 3% Η

2O

2. Για χρώση c-myc, τομές φράχθηκαν 60 λεπτά με PBS που περιέχει 0.2% Triton Χ-100 και 4% ορό κατσίκας. Μετά την αρχική επώαση αντίσωμα διάρκεια της νύχτας στους 4 ° C τομές επωάστηκαν με κατσικίσιο αντι-κουνελιού βιοτινυλιωμένο δευτερογενές αντίσωμα σε αραίωση 1:200 για 60 λεπτά σε RT. αντιδραστήριο ABC εφαρμόστηκε (Vectastain Elite ABX Kit, Vector Labs) και αναπτύχθηκε σε διαμινοβενζιδίνη (DAB). Οι τομές στη συνέχεια αντιχρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και συναρμολογείται μετά την αφυδάτωση. χρώση /ρ42 ΜΑΡΚ φωσφο ρ44 ήταν ουσιαστικά διεξήχθη όπως περιγράφεται για c-myc με τις ακόλουθες αλλαγές: TBS, 1% Tween 20 (TBST) χρησιμοποιήθηκε για πλύσεις. Οι τομές αποκλείσθηκαν με TBST που περιείχε 0,2% Triton Χ-100 και 5% ορό κατσίκας. Δευτερεύουσα επώαση αντισώματος διεξήχθη χρησιμοποιώντας αντίσωμα αντι-κουνελιού βιοτινυλιωμένο κατσίκα σε ρυθμιστικό αποκλεισμού για 60 λεπτά. Pan-Cytokeratin χρώσεις πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [8].

ανάλυση

Western blot του ολικού εκχυλισμάτων πνεύμονα

Για την παρασκευή των εκχυλισμάτων φρεσκοπαρασκευασμένο πνεύμονες μεταφέρθηκαν σε ένα σωλήνα που περιέχει 500 μΙ παγωμένου ρυθμιστικό RIPA (50 mM Tris-HCl, ρΗ 8.0, 150 mM NaCl, 0,1% SDS, 0,5% δεοξυχολικό (DOC), 1% Nonidet Ρ40 με κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης). Οι πνεύμονες ομογενοποιήθηκαν για 5 λεπτά χρησιμοποιώντας ένα ομογενοποιητή Ultraturax σε κρύο περιβάλλον. Σωλήνες που περιέχουν το ομογενοποίημα πνεύμονα φυγοκεντρήθηκαν σε ένα ψυχόμενο φυγόκεντρο στα 18.000 g για 30 λεπτά. Μετά υπερκείμενα φυγοκέντρηση μεταφέρθηκαν σε ένα νέο σωλήνα και δείγματα ελήφθησαν για τον προσδιορισμό της πρωτεΐνης. Τα υπόλοιπα εκχυλίσματα αναμίχθηκαν με 2 χ Laemmli ρυθμιστικού διαλύματος φόρτωσης θερμαίνεται στους 95 ° C για 5 λεπτά και είτε αποθηκεύεται στους -20 ° C ή επιλύονται με SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης. Μετά από μια περίοδο δέσμευσης μία ώρα εντός PBS (0,05% Tween, 5% κονιοποιημένο άπαχο γάλα) στυπώματα επωάστηκαν για μία νύχτα με το πρωτογενές αντίσωμα, πλύθηκαν τρεις φορές με PBS και στη συνέχεια επωάστηκαν με ένα δευτερεύον αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση. Μετά από τρεις φορές σε PBS πλύνετε κηλίδες αναπτύχθηκαν.

RTPCR

RNA παρασκευάστηκε από ολόκληρο πνεύμονες δύο εβδομάδων ποντικών ηλικίας χρησιμοποιώντας το κιτ παρασκεύασμα RNA peqGOLD Trifast (peqlab Biotechnologie GmbH) σύμφωνα με τον κατασκευαστή οδηγίες. Τα δείγματα υποβλήθηκαν σε κατεργασία με ϋΝΑση Ι πριν από την παρασκευή των cDNA χρησιμοποιώντας τυχαίους εκκινητές εξαμερών που παρέχεται από το First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas).

σε πραγματικό χρόνο PCR πραγματοποιήθηκε πράσινο ενσωμάτωση παρακολούθηση SYBR. Ως εσωτερικός έλεγχος παρακολουθήθηκαν τα επίπεδα RNA του γονιδίου HPRT. Real-time PCR ανάλυση διεξήχθη σε σύστημα ανίχνευσης Roto-Gene 2000 (Corbet Research). Αστάρι ακολουθίες: HPRT: CACAGGACTAGAACACCT? GCTGGTGAAAAGGACCTCT? p19

ARF: GCGCTCTGGCTTTCGTGAAC? CGTGTCCAGGAAGCCTTCCC? p16

ΙΝΚ4 &: CGTGAGGGCACTGCTGGAAG? ACCAGCGTGTCCAGGAAGCC? p15

INK4b: CCAGGAAGCCTTCCCGAGCT? GGGGGCAAGTGGAGACGGTG? Cbx7: CGGCCCATTGGTCAGGTCTG? GACCCTCGCCTTGTCATGGC.

Αποτελέσματα

Ανάπτυξη των NSCLC σε BXB23 και BXB11 ποντίκια

σχηματισμό αδενώματος του πνεύμονα συγκρίθηκε μεταξύ των γραμμών διαγονιδιακών ιδρυτής BXB23 και BXB11 RAF. Όπως κρίθηκε από το Η &? Ε χρώση δεν υπήρχε διαφορά στην ιστοπαθολογία όγκων και από τις δύο γραμμές. Ωστόσο, ο αριθμός των εστιών του όγκου ανά περιοχή ήταν πολύ διαφορετικά. Ποσοτικοποίηση των όγκων έδειξε 4-5 φορές υψηλότερη επίπτωση στους πνεύμονες του BXB11 σε σύγκριση με BXB23 ζώα (Σχήμα 1Α). Η βάση αυτής της διαφοράς μεταξύ των στελεχών μπορεί να προκύπτουν από την υψηλότερη κλάσμα των κυττάρων που δείχνουν πυρηνικών φωσφο-ΕΚΚ σε BXB 11 ποντικούς (Σχήμα S1A και Β). Με βάση τον αριθμό των όγκων ανά τομή υπολογίσαμε το συνολικό ποσό των όγκων ανά πνεύμονα στην περιοχή από 3000 σε ένα μέσο BXB23 πνεύμονα και 12000 έως 15000 όγκων σε ένα μέσο BXB11 πνεύμονα. Στο βάθος περίπου 1-2 × 10

6 κύτταρα ΑΤ2 μέσα στον πνεύμονα ποντικού [21] καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι και στις δύο γραμμές ιδρυτής μόνο ένας πολύ περιορισμένος αριθμός των ΑΤ2 κύτταρα χρησιμεύουν ως καρκινικά κύτταρα έναρξης. Αυτό το εύρημα είναι συνεπές με την έναρξη του όγκου σε ένα διαμέρισμα προγονικών και αντοχή του τελικά διαφοροποιημένα κύτταρα ΑΤ2 σε μετασχηματισμό αν και στοχαστικά κλείσιμο διαγονίδιο δεν μπορεί να αποκλειστεί. Σύγκριση του μεγέθους του όγκου μεταξύ των ιδρυτών δεν αποκάλυψε σημαντικές διαφορές (Σχήμα 1Β). Όγκων σε BXB11 είναι πιο συχνές και, ως εκ τούτου γεμίσει πιο γρήγορα τον πνεύμονα οδηγεί σε ασφυξία, όπως προκύπτει από τις καμπύλες επιβίωσης (Σχήμα 1C).

Α) Ποσοτικοποίηση της εμφάνισης όγκου σε BXB23 και BXB11 πνευμόνων στην ηλικία των 3 εβδομάδων (n = 5 ζώα, για λεπτομέρειες βλέπε πειραματικές υλικά). Β) Ποσοτικοποίηση του μεγέθους του όγκου μεταξύ BXB23 και BXB11. Η διαφορά μεταξύ των δύο ιδρυτών δεν ήταν σημαντική. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως Box-and-Whisker οικόπεδα. Κουτιά οριοθετηθούν πρώτο και τρίτο τεταρτημόριο, μουστάκια αντιπροσωπεύουν ελάχιστα και μέγιστα αντίστοιχα, οι διάμεσοι υποδεικνύεται από σταθερή γραμμή μέσα σε κουτιά, μικρά τετράγωνα αντιπροσωπεύουν πειραματική ακραίες τιμές. ρ-τιμές υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας t-test του Student, μόνο τιμές ρ δείχνουν σημαντικότητα (ρ & lt? 0,05) δείχνονται. Γ) Kaplan-Meier οικόπεδο για την επιβίωση των BXB11 και BXB23 ποντίκια. P-αξία υπολογίστηκε με τη χρήση της δοκιμής Logrank.

Η

Bmi1 προωθεί την ανάπτυξη του όγκου, αλλά όχι την έναρξη του όγκου, τόσο τα ποντίκια BXB11 και BXB23

Με βάση την παρατήρηση ότι Bmi1 εκφράζεται σε BXB11 που προκαλείται όγκων και η προηγουμένως περιγραφείσα ρόλος του Bmi1 σε όγκο βλαστικών κυττάρων αυτο-ανανέωση [14], [22], [23] αποφασίσαμε να μελετήσουμε περαιτέρω το ρόλο του Bmi1 για την ανάπτυξη των αδενωμάτων C-RAF BXB (Σχήμα 2Α). Εμείς παράγεται ένωση ποντίκια που εκφράζουν το διαγονίδιο SP-C C-RAF BXB στο φόντο Bmi1 νοκ-άουτ. Δεδομένου ότι η γονιδιωματική διαγραφή Bmi1 είχε καμία επίδραση στην ανάπτυξη των πνευμόνων και τη δομή του πνεύμονα ενήλικα (Σχήμα S2) οποιεσδήποτε μεταβολές στην ανάπτυξη του όγκου μπορεί να αποδοθεί σε Bmi1. Η ανάλυση της Bmi1 – /- SP-C, C-RAF BXB ποντικούς παρεμποδίζεται από την μικρή διάρκεια ζωής αυτών των ποντικών που προκαλείται από τη διαγραφή του Bmi1 [24] και σπάνια επιτρέπεται η παρακολούθηση της ανάπτυξης του όγκου για περισσότερο από τρεις μήνες.

Α) παραφίνης ενσωματωμένα τμήματα του πνεύμονα από BXB11 και Bmi1 – /- BXB11 πνεύμονες βάφτηκαν για Bmi1 (πράσινο) και DAPI (μπλε). Διακεκομμένες λευκές γραμμές οριοθετηθούν όγκους. μπαρ κλίμακας = 30 μm. Β) Η &? Ε χρώση τομών πνεύμονα από BXB11 και Bmi1 – /- ποντίκια BXB11 στην ηλικία δύο εβδομάδων και τρεις μήνες επιδεικνύει μειωμένη Burdon όγκου σε Bmi1 – /- BXB11 πνεύμονες. Κλίμακα bar = 200 μm. Γ και Δ) Ανάλυση εμφάνιση όγκου και της ανάπτυξης εντός των πνευμόνων του BXB11 και Bmi1 – /- ποντίκια BXB11. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως Box-and-μουστάκια οικόπεδα, για λεπτομέρειες σχετικά με την παρουσίαση των δεδομένων βλέπε σχήμα θρύλος του σχήματος 1 (n≥4 ζώων ανά γονότυπο και την ηλικία, για λεπτομέρειες βλέπε πειραματικές υλικά). Σημειώστε ότι συχνότητα εμφάνισης όγκου αυξάνεται κατά ένα συντελεστή δύο σε σύγκριση με το Σχήμα 1Α), λόγω της FVB /N γενετικό υπόβαθρο εισάγεται μέσω ζευγαρώματος με το Bmi1 – /- ποντίκια. Ν.Ο. = Δεν έχει προσδιοριστεί, επειδή οι όγκοι συρροή. ρ-τιμές υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας t-test του Student μόνο τιμές ρ δείχνουν σημασία απεικονίζονται.

Η

Ως εκ τούτου, αναλύθηκε πρώτα την επίδραση της Bmi1 εκτομή κατά την έναρξη όγκου πνεύμονα στο παρασκήνιο BXB11 ως χρόνος ζωής του αυτά τα ποντίκια ίση με εκείνη του Bmi1 knock out ποντίκια. Σε αντίθεση με BXB23, BXB11 πνεύμονες έδειξαν εξαιρετικά μεγάλες περιοχές του πνεύμονα που καταλαμβάνεται από ιστό του όγκου σε τρεις μήνες της ηλικίας. Η ανάπτυξη του όγκου μειώθηκε ισχυρά μέσα στους πνεύμονες του Bmi1 – /- BXB11 ποντίκια (Σχήμα 2Β) με δύο τρόπους, πρώτα υπήρξε φορές μείωση περίπου δύο αριθμών όγκου μεταξύ δύο εβδομάδων και τριών μηνών (Σχήμα 2C) και δεύτερο του όγκου του επιζών όγκων μειώθηκε (Σχήμα 2D). Παρόμοια δεδομένα ελήφθησαν για Bmi1 – /- ποντίκια BXB23 ένωση (Σχήμα S3). Αν και μειώνονται σε μέγεθος των όγκων σε Bmi1 – /- BXB11 πνεύμονες έδειξαν χαρακτηριστικά της SP-C, C-RAFBXB επαγόμενη αδενωμάτων όπως κρίνεται από ανάλυση της μορφολογίας των κυττάρων και χρώση με δύο δείκτες όγκου (παν-κυτοκερατίνης και pro SP-C? Σχήμα S4) . Επίσης, η διακοπή της λειτουργίας της έκφρασης διαγονιδίου ως συνέπεια της Bmi1 κατάλυσης μπορεί να αποκλειστεί ως αιτία για τη μειωμένη ανάπτυξη του όγκου αφού Bmi1 – /- BXB11 όγκων βάφτηκαν θετικά με ένα αντίσωμα C-RAF (Σχήμα S4). Με συνέπεια το επίπεδο της πυρηνικής φωσφο-ΕΚΚ διατηρήθηκε σε BXB11 και Bmi1 – /- BXB11 από δύο εβδομάδων έως τριών μηνών αποδεικνύοντας ότι η παύση της αύξησης δεν προκαλείται από μία μείωση στη σηματοδότηση μέσω του μιτογόνου καταρράκτη (Σχήμα S5)

Εν ολίγοις, η κατάλυση της Bmi1 σε BXB11 ποντίκια οδηγεί σε μειωμένη έντονα την ανάπτυξη του όγκου. Ο αρχικός αριθμός των όγκων σε BXB11 έναντι Bmi1 – /- BXB11 ωστόσο, δεν δείχνουν σημαντική μείωση στο Bmi1 – /-. BXB11 πνεύμονες, υποδεικνύοντας ότι ο προσδιορισμός των καρκινικών κυττάρων κίνηση δεν εξαρτάται από Bmi1

Αυξημένη κυτταρικό θάνατο και μειωμένο κλάσμα των κυττάρων σε κύκλο σε Bmi1 – /- BXB11 ζώα

το ισχυρά μειωμένη ανάπτυξη του όγκου και η απώλεια των όγκων με το χρόνο σε δύο γραμμές ιδρυτής με κατήργησε έκφραση Bmi1 είναι είτε μια συνέπεια ενός μπλοκ σε πρόοδο του κυτταρικού κύκλου ή αυξημένη κυτταρικού θανάτου ή ένας συνδυασμός και των δύο. Bmi1 έχει προηγουμένως εμπλακεί στην προαγωγή της επιβίωσης των κυττάρων του όγκου και την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου σε ένα σύστημα μοντέλου καλλιέργειας ιστών [25], [26]. χρώση TUNEL έδειξαν μια σημαντική αύξηση του δείκτη αποπτωτικών κυττάρων σε αδενώματα τριών μηνών Bmi1 – /- ποντίκια BXB11 (Σχήμα 3Α και 3C). Αυτό δείχνει ότι η απόπτωση είναι μια καθυστερημένη εκδήλωση στο Bmi1 – /- BXB11 αδενώματα. Στη συνέχεια θα εξεταστούν ρυθμό ανάπτυξης. Πραγματοποιήσαμε Ki-67 /pro SP-C συν-χρώση για τους πνεύμονες που παρασκευάζονται από δύο εβδομάδες και τριών μηνών Bmi1 – /- BXB11 και BXB11 ζώα. Το κλάσμα των κυττάρων σε κύκλο είναι έντονα μειωμένος κατά Bmi1 κατάλυσης. Επιπλέον, όπως προκύπτει από τον έλεγχο BXB11 σε ηλικία τριών μηνών ο ρυθμός ανάπτυξης αυτών των όγκων μειώθηκε επίσης υποδηλώνει είτε μια περιορισμένη αντιγραφική διάρκεια ζωής για BXB11 μετασχηματισμένα κύτταρα ΑΤ2 ή άλλα επίπεδα ελέγχου της ανάπτυξης (Σχήμα 3Β και 3D).

Α) ΤΟΥΝΕΛ χρώση τομές παραφίνης τμήματα του πνεύμονα από Bmi1 – /- BXB11 και BXB11 ποντίκια. Κατεργασμένο με ϋΝάση Ι τομές πνεύμονα χρησιμοποιήθηκαν ως θετικός έλεγχος. Τμήματα αντιμετωπίζονται χωρίς τερματικό δεοξυνουκλεοτιδυλοτρανσφεράσης χρησίμευσε ως αρνητικός έλεγχος. Διακεκομμένες λευκές γραμμές οριοθετηθούν όγκους. Γονότυπους και ηλικίες όπως υποδεικνύεται. Τα βέλη δείχνουν αποπτωτικά κύτταρα (πράσινο). μπαρ κλίμακας = 30 μm. Β) Ki67 (κόκκινο) /pro SP-C (πράσινο) συν χρώση ανοσοφθορισμού των τμημάτων του πνεύμονα από BXB11 και Bmi1 – /- BXB11 ποντίκια. Τα βέλη δείχνουν κύτταρα ποδηλασία όγκου. «*» Υποδηλώνει χρώση τεχνούργημα. μπαρ κλίμακας = 30 μm. Γ) Ποσοτικοποίηση των TUNEL θετικών κυττάρων σε όγκους του πνεύμονα των δύο εβδομάδων και τριών μηνών BXB11 και Bmi1 – /- BXB11 ποντίκια (η = 4 ζώα ανά γονότυπος), για λεπτομέρειες βλέπε Υλικά και Μέθοδοι. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως οικόπεδο Box-and-μουστάκια για τις λεπτομέρειες της παρουσίασης των δεδομένων βλέπε σχήμα θρύλος του Σχήματος 1. Δ) Ποσοτικοποίηση των Ki-67 /pro SP-C διπλά θετικά κύτταρα. Τουλάχιστον πέντε όγκους από πέντε διαφορετικά ζώα αναλύθηκαν. ρ-τιμές υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας t-test του Student, μόνο τιμές ρ δείχνει τη σημασία που φαίνεται.

Η

Συμπερασματικά τόσο την επιβίωση των κυττάρων του όγκου και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων επηρεάζονται σε BXB11 ποντίκια με απαλοιφή Bmi1 και μπορεί να ευθύνεται για η παρατηρούμενη μειωμένη ανάπτυξη του όγκου.

Bmi1 εξαρτώνται από την έκφραση της p16

ΙΝΚ4 & και p19

ΤΑΠ

Bmi1 εμπλέκεται στη ρύθμιση cdki. Με πιο γνωστή p16

ΙΝΚ4 &, p19

ΤΑΠ έχει αποδειχθεί ότι ρυθμίζεται αρνητικά από Bmi1 [27]. Ως εκ τούτου μεταβληθεί p16

ΙΝΚ4 & /p19

ΤΑΠ επίπεδα έκφρασης θα μπορούσαν να ευθύνονται για τη μείωση του αριθμού των επιζώντων και ποδηλασία κύτταρα στο Bmi1 – /- BXB11 όγκους. Αναλύσαμε πρώτη έκφραση επιπέδων mRNA του ρ16

ΙΝΚ4 & με ημι-ποσοτική RTPCR σε πνεύμονες δύο εβδομάδων παλιό BXB11 και Bmi1 – /- ποντίκια BXB11 (Σχήμα 4Α). τα επίπεδα έκφρασης της p16

ΙΝΚ4 & ήταν σημαντικά αυξημένη σε Bmi1 – /- BXB11 πνεύμονες. Η ανάλυση στυπώματος Western των προϊόντων λύσης ολόκληρο πνεύμονα επιβεβαίωσαν αυτό το αποτέλεσμα στο επίπεδο πρωτεΐνης (Εικόνα S6a).

Α-D) Ημι-ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR ανάλυση του συνολικού RNA από ολικό πνεύμονες δύο εβδομάδων ποντικών ηλικίας, γονότυπους ως υποδεικνύεται. επίπεδα BXB11 τέθηκαν σε ένα. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά δύο ανεξάρτητων συνόλων ανάλυσης. Τα δεδομένα δείχνουν τυπικές αποκλίσεις από τις τιμές εις τριπλούν. ρ-τιμές υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας t-test του Student, μόνο τιμές ρ δείχνουν σημασία απεικονίζεται. Α) Η ποσοτικοποίηση του ρ16

ΙΝΚ4 & επίπεδα έκφρασης Β) Ποσοτικοποίηση της ρ19

ΤΑΠ επίπεδα έκφρασης του RNA. Γ) Ποσοτικοποίηση των p15

INK4b επίπεδα έκφρασης. Δ) Ποσοτικοποίηση των επιπέδων έκφρασης Cbx7.

Η

Στη συνέχεια αναλύσαμε τα επίπεδα έκφρασης του mRNA της ρ19

ΤΑΠ. Όπως και στην περίπτωση της ρ16

ΙΝΚ4 &, ρ19

ARF και ρ15

INK4b επίπεδα έκφρασης πάνω ρυθμισμένα σε πνεύμονες του Bmi1 – /- BXB11 όταν συγκρίνεται με BXB11 (Σχήμα 4Β και 4C). Σε αντίθεση με ρ16

ΙΝΚ4 & που δεν είχε μεταβληθεί μεταξύ άγριου τύπου και ποντίκια BXB11, βρήκαμε αυξημένα επίπεδα ρ19

έκφραση ARF RNA και σε BXB11 πνεύμονες (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ένα άλλο επιγενετικές ρυθμιστής του τόπου ΙΝΚ4 &, Cbx7 δεν μεταβλήθηκε σημαντικά σε έκφραση κατά Bmi1 εκτομή σε BXB11 ποντίκια (Εικόνα 4D). χρώση ανοσοφθορισμού των Bmi1 – /- BXB11 και BXB11 πνεύμονες έδειξαν ότι η p19

ΤΑΠ εκφράζεται σε όγκους του πνεύμονα των ζώων και των δύο γονότυπων. Οι διαφορές στην subnuclear κατανομή της ρ19

ARF είναι, ωστόσο, εμφανές όταν Bmi1 – συγκρίνονται BXB11 και BXB11 όγκους – /. Ενώ η εκτομή του Bmi1 συνδέεται με ένα πολυ εστιακό πρότυπο πυρηνική χρώση των ρ19

ARF σε σχεδόν όλα τα καρκινικά κύτταρα είναι ως επί το πλείστον περιορίζεται σε ένα μόνο τόπο εντός των πυρήνων των όγκων παρουσία Bmi1 (Σχήμα S7).

Εν κατακλείδι βρίσκουμε μειωμένο πολλαπλασιασμό σε προχωρημένο στάδιο p19

ΤΑΠ θετικούς όγκους BXB11 που θα μπορούσε να ερμηνευθεί ως μέρος ενός φαινοτύπου γήρανσης. Μία πιθανή εξήγηση για αυτό το ήπιο αποτέλεσμα μπορεί να είναι C-MYC έκφρασης που βρίσκουμε στα καρκινικά κύτταρα BXB11 (Σχήμα S6B) και ότι έχει περιγραφεί πρόσφατα για να επανέλθει ένα φαινότυπο sensescence σε Β-RAF μετασχηματισμένα μελανωμάτων [28]. Σε περίπτωση απουσίας του Bmi1 ωστόσο, η έκφραση της ΙΝΚ4 & /ΤΑΠ ήταν εντονότερη παρόλο έκφραση c-MYC διατηρήθηκε (σχήμα S6B) οδηγώντας τελικά σε παύση του πολλαπλασιασμού. Έτσι, κάτω από αυτές τις συνθήκες, μια διάσωση c-myc δεν μπορεί πλέον να λειτουργήσει.

Δεν υπάρχουν ενδείξεις για βρογχο-κυψελιδικά-βλαστικά κύτταρα (BASCs) σε όγκους του πνεύμονα ανεξάρτητα από Bmi1

Εμείς απευθύνεται δίπλα τη συνεισφορά της κύτταρα BASC στο σχηματισμό όγκων SP-C C-RAF BXB. Για το σκοπό αυτό πραγματοποιήσαμε pro διπλή χρώση SP-C /CC10 και αναλύθηκαν BXB11 όγκων για την παρουσία διπλών θετικών κυττάρων. Για την ανάλυση της εικόνας ρυθμίσεις απόκτηση επιλέχθηκαν που επέτρεψε την αναγνώριση των BASCs σε BADJs. Όπως απεικονίζεται στο Σχήμα 5, δεν διπλών θετικών κυττάρων θα μπορούσε να παρατηρηθεί σε όγκους.

παραφίνη ενσωματωμένα τμήματα του πνεύμονα από ποντίκια BXB11 χρωματίστηκαν για pro SP-C (κόκκινο) και για CC10 (πράσινο) για την ανίχνευση διπλά θετικά βρογχο κυψελιδικά βλαστικά κύτταρα (BASCs). Ένας εκπρόσωπος BASC κελί που βρίσκεται σε μια βρογχο φατνιακή αγωγού σύνδεσης (BADJ) υποδεικνύεται από λευκό βέλος. μπαρ κλίμακας = 30 μm.

Η

Εν ολίγοις αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι το απόθεμα των κυττάρων ανεξάρτητη όγκου Bmi1 που αντιπροσωπεύει πιθανώς καρκινικά κύτταρα έναρξης δεν αντιπροσωπεύει BASCs.

Συζήτηση

στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήσαμε δύο διαγονιδιακές σειρές ιδρυτή με πνευμονική στοχευμένη έκφραση του C-RAF BXB για την εξάρτηση της έναρξης αδενώματος και ανάπτυξη επί του στελέχους κυττάρου παράγοντα αυτο-ανανέωση Bmi1. Δείχνουμε ότι BXB11 έχει τέσσερις φορές υψηλότερη επίπτωση και μικρότερο χρόνο των αδενωμάτων επιτρέποντας την εξέταση των προχωρημένη νόσο απουσία Bmi1. Η εξάντληση των Bmi1 τόσο στο παρασκήνιο BXB23 και BXB11 οδήγησε σε σημαντική ελάττωση του ρυθμού ανάπτυξης του όγκου και μία αύξηση σε κυτταρικό θάνατο μέσα στα αδενώματα. Αντίθετα δεν υπάρχει σημαντική μείωση στις εκδηλώσεις του όγκου κίνηση θα μπορούσε να παρατηρηθεί και στις δύο γραμμές ιδρυτής, υποστηρίζοντας για Bmi1 είναι ένας σημαντικός παράγοντας για την επέκταση του όγκου και όχι στη συνέχεια έναρξη.

Με βάση την παρατήρηση, ότι Bmi1 εκφράζεται στο C- RAF BXB ξεκίνησε αδενώματα των πνευμόνων και ότι Bmi1 είναι ένας στόχος της RAF σηματοδότησης [19] αποφασίσαμε να ερευνήσουμε το σχηματισμό αδενώματος απουσία Bmi1. Η κατάργηση της έκφρασης Bmi1 στο παρασκήνιο BXB23 και BXB11 δεν απέδωσε σημαντική μείωση σε εκδηλώσεις την έναρξη του όγκου, όπως ορίζεται από τον αριθμό των όγκων που σχηματίστηκαν στις διάφορες γενετικές συνδυασμούς από δύο εβδομάδες της ηλικίας. Ανάλυση των κυττάρων του πνεύμονα αδενώματος απουσία ή παρουσία Bmi1 δεν αποκάλυψαν διαφορές σε μορφολογικό και σε επίπεδο έκφρασης δείκτη κυττάρου. Ως εκ τούτου, η απουσία Bmi1 δεν επηρέασε τη διαδικασία της έναρξης του όγκου. Αυτά τα αποτελέσματα είναι σύμφωνα με μια προηγουμένως δημοσιευμένη έκθεση που δείχνει ανεξάρτητη έναρξη γλοιώματος Bmi1 αν και σε περίπτωση απουσίας του ΙΝΚ4 & [29]. Η απουσία Bmi1 δεν επηρέασε την ταυτότητα των προκυπτόντων κυττάρων όγκου σε σχέση με την μορφολογία και την έκφραση ενός περιορισμένου συνόλου δεικτών. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν επίσης ότι Bmi1 δεν απαιτείται για την προδιαγραφή ενός όγκου έναρξη κύτταρο μέσα στον πνεύμονα. επίπεδα φωσφο-ΕΚΚ μπορεί να αντισταθμίσει την απώλεια Bmi1 για βραχυπρόθεσμα, αλλά όχι μακροπρόθεσμα διαιρέσεις αυτο ανανέωση ξεκίνησε κυττάρων όπως παρατηρήσαμε σημαντική αύξηση του όγκου σε Bmi1 – /- BXB11 δείχνει υψηλότερη πυρηνική φωσφο-ΕΚΚ που ακολουθείται από διακοπή της κυτταρικής διαίρεσης σε αργά χρονικά σημεία ( ηλικία των τριών μηνών), όταν τα πυρηνικά φωσφόρου-ΕΚΚ ήταν ακόμα παρούσα. Κατά τη διάρκεια των σπουδών μας, επίσης, δεν τήρησε τις αλλαγές στη μορφολογία του πνεύμονα σε Bmi1 – /- ποντίκια δείχνει ότι Bmi1 δεν αποτελεί κρίσιμο παράγοντα για τη σωστή ανάπτυξη των πνευμόνων. Βρήκαμε μια ισχυρή ανοδική ρύθμιση του p19

ARF, p16

ΙΝΚ4 & και, p15

INK4b σε όλη την προετοιμασία του πνεύμονα RNA του Bmi1 – /- ζώα σε σύγκριση με τα αδερφάκια άγριου τύπου. Η έκφραση του ρ19

ARF δεν μπορεί αποκλειστικά να αποδοθεί σε πνεύμονα διηθητικά κύτταρα του αιμοποιητικού συστήματος δεδομένου ότι βλέπουμε έντονη ρ19

ARF έκφραση σε ΑΤ2 κύτταρα και τα επιθηλιακά κύτταρα του βρόγχους σε Bmi1 – /- ζώα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται ). Προφανώς, η έκφραση της cdkis δεν βλάπτει τη φυσιολογική λειτουργία του πνεύμονα. Αυτό το εύρημα είναι ενδιαφέρον σχετικά με off επιδράσεις στόχου σε πιθανές μελλοντικές θεραπευτικές στρατηγικές που στοχεύουν Bmi1 στον καρκίνο του πνεύμονα

Cdkis κωδικοποιούνται στο γενετικό τόπο ΙΝΚ4 & εμπλέκονται στην αναστολή της εξέλιξης του κυτταρικού κύκλου και τον έλεγχο της κυτταρικής επιβίωσης [30] -. [ ,,,0],32]. Σύμφωνα με αυτό το κάνουμε δούμε μειωμένη εξέλιξη του κυτταρικού όγκου κύκλου Bmi1 – /- BXB11 όγκους και την αύξηση των κυττάρων που υφίστανται απόπτωση αν και με κάποια καθυστέρηση. Τα ευρήματα αυτά συμφωνούν με τα προηγούμενα αποτελέσματα δημοσιεύονται από τον Liu και οι συνεργάτες του [25] δείχνει

in vitro

μια συγκεκριμένη επίδραση της Bmi1 για την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων.

Σε συμφωνία με προηγούμενες εκθέσεις δείχνουν p19

ARF up-ρύθμιση σε απάντηση σε ογκογόνους υπερπολλαπλασιαστικών σήματα [33] – [35], η έκφραση της ρ19

ΤΑΠ δεν περιορίστηκε στην Bmi1 – /- υπόβαθρο, αλλά θα μπορούσε επίσης να παρατηρηθεί σε μικρότερο βαθμό σε BXB11 αδενώματα. Σημειώσαμε ότι η p19

ARF εντοπίζεται σε ένα μόνο σε δύο διακριτές πυρηνική εστίες μέσα BXB11 αδενώματα.