Αφηρημένο

Τα υπάρχοντα στοιχεία υποδηλώνουν ότι η NF-κΒ σηματοδότηση είναι ένας βασικός ρυθμιστής του καρκίνου που προκαλείται από σκελετικών μυών. Ωστόσο, ο προσδιορισμός των συστατικών αυτού του μονοπατιού σηματοδότησης και των παραγόντων μεταγραφής ΝΡ-κΒ που ρυθμίζουν εξασθενητική απέχει πολύ από την ολοκλήρωσή της. Σε μύες C26 ποντικών που φέρουν όγκο, η υπερέκφραση των κυρίαρχων αρνητικών (D.N.) ΙΚΚβ μπλοκαριστεί απώλεια μυϊκής μάζας κατά 69% και ο ΙκΒα-super καταστολέα μπλοκαριστεί σπατάλη κατά 41%. Σε αντίθεση, η υπερέκφραση του D.N. ΙΚΚα ή D.N. ΝΙΚ δεν εμποδίζουν C26 που προκαλείται σπατάλη. Απροσδόκητα, υπερέκφραση της D.N. p65 ή D.N. γ-συνδεδεμένη δεν επηρέασε σημαντικά την απώλεια μυϊκής μάζας. συστοιχίες mRNA έκφραση του γονιδιώματος σε επίπεδο έδειξε αυξητική ρύθμιση πολλών γονιδίων προηγουμένως εμπλακεί σε μυϊκή ατροφία. Για να δοκιμαστεί εάν αυτά τα γονίδια ήταν προς τα πάνω ρυθμισμένη άμεσοι στόχοι των παραγόντων μεταγραφής ΝΡ-κΒ, συγκρίναμε γονιδιώματος σε επίπεδο δέσμευσης στο DNA σε έλεγχο και καχεκτικά μυών χρησιμοποιώντας τσιπ προσδιορισμού αλληλουχίας ρ65. Βιοπληροφορική ανάλυση των τσιπ δεδομένα αλληλουχίας από τον έλεγχο και οι μύες C26 έδειξε πολύ μικρή σύνδεση προς γονιδίων σε καχεξία και λίγο ρ65 που να δείχνουν ότι οι επιρροές πρόσδεσης ρυθμίζεται αυξητικά ρ65 η έκφραση του γονιδίου που συνδέεται με μυϊκό βασίζεται καχεξία. Τα δεδομένα τσιπ seq p65 είναι συνεπείς με το εύρημα μας καμία σημαντική αλλαγή στην πρωτεϊνική σύνδεση προς ένα ολιγονουκλεοτίδιο NF-κΒ σε μια δοκιμασία μετατόπισης γέλης, η μη ενεργοποίηση ενός ΝΡ-κΒ-εξαρτώμενο ρεπόρτερ, και καμία επίδραση της υπερέκφρασης dnp65 στους μυς του ποντικών που φέρουν όγκο. Λαμβανόμενα μαζί, τα δεδομένα αυτά υποστηρίζουν την ιδέα ότι, αν και η αναστολή της ΙκΒα, και ιδιαίτερα ΙΚΚβ, μπλοκ καρκίνος που προκαλείται σπατάλη, η εναλλακτική οδός σηματοδότησης ΝΡ-κΒ δεν απαιτείται. Επιπλέον, οι μεταγενέστεροι παράγοντες μεταγραφής ΝΡ-κΒ, ρ65 και c-Rel δεν φαίνεται να ρυθμίζουν τις μεταγραφικές μεταβολές που προκαλούνται από τον όγκο C26. Αυτά τα στοιχεία είναι συνεπή με το αυξανόμενο σώμα της βιβλιογραφίας δείχνει ότι υπάρχουν NF-κΒ-ανεξάρτητο υποστρώματα της ΙΚΚβ και ΙκΒα που ρυθμίζουν φυσιολογικές διεργασίες

Παράθεση:. Cornwell EW, Mirbod Α, Wu CL, Kandarian SC, Jackman RW (2014) C26 Καρκίνος-Induced απώλεια μυϊκής μάζας Είναι ΙΚΚβ-εξαρτώμενη και NF-κΒ-Independent. PLoS ONE 9 (1): e87776. doi: 10.1371 /journal.pone.0087776

Επιμέλεια: Imed Eddine Gallouzi, το Πανεπιστήμιο McGill, Καναδάς

Ελήφθη: 9 Ιουλίου, 2013? Αποδεκτές: 30 Δεκέμβρη του 2013? Δημοσιεύθηκε: 29 του Γενάρη του 2014

Copyright: © 2014 Cornwell et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας (NIH) βραβείο AR060217. (https://grants.nih.gov/grants/oer.htm.) Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου.

Ανταγωνιστικά συμφέροντα :. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η καχεξία είναι μια μεταβολική κατάσταση που σχετίζεται με πολλές χρόνιες παθήσεις και χαρακτηρίζεται από τη σοβαρή σπατάλη των σκελετικών μυών και του λιπώδους ιστού η οποία δεν μπορεί να να αντιστραφεί με την αύξηση της θερμιδικής πρόσληψης [1]. καχεξία του καρκίνου παρατηρείται στην πλειονότητα των προχωρημένων καρκίνων, αλλά είναι πιο συχνά παρατηρείται σε καρκίνους του πνεύμονα και του ανώτερου ΓΕ σωλήνα [1]. Οι ασθενείς με καρκίνο με καχεξία έχουν μια χαμηλότερη ποιότητα ζωής λόγω συμβιβασμένη ανοσοποιητική λειτουργία, την αντίσταση στην ινσουλίνη, αδυναμία και κόπωση. [2] Οι ασθενείς με ήπια ακόμα και καχεξία δεν μπορεί να ανεχθεί χημειοθεραπεία, γεγονός που επιδεινώνει περαιτέρω την ασθένειά τους [3]. Η καχεξία εκτιμάται να συμβάλει στο θάνατο περίπου 30% των ασθενών με καρκίνο [4]. Για το σύνολο της σοβαρότητας αυτής της θλίψη, θεραπείες παραμένουν παρηγορητική. Δεδομένου ότι οι πιο σοβαρές συνέπειες της καχεξίας φαίνεται να διαμένουν με σκελετική μυϊκή απώλεια [1], αναπτύσσοντας μια καλύτερη κατανόηση της κυτταρικής σηματοδότησης των μηχανισμών και της γονιδιακής ρύθμισης στο μυ θα μπορούσε να αποφέρει νέες θεραπευτικές στρατηγικές για την αντιμετώπιση αυτής της κατάστασης.

Έρευνα σε διαφορετικούς τύπους καρκίνου έχει προτείνει έναν ρόλο για ΝΡ-κΒ σηματοδότηση και ρύθμιση της μεταγραφής ΝΡ-κΒ σε μυϊκής ατροφίας [5], [6], [7]. Η αναστολή της κλασσικής πορείας ΝΡ-κΒ, από υπερέκφραση του IkappaBalpha σούπερ καταστολέα (IκBαSR), μπλοκάρει απώλεια μυϊκής μάζας σε καρκίνωμα πνεύμονα Lewis (LLC) ποντικοί που φέρουν όγκο κατά 50% [5]. Ο πρωτότυπος παράγοντας ΝΡ-κΒ μεταγραφής, ρ65 (Rel Α), έδειξε αυξημένη πρόσδεση σε ένα ολιγονουκλεοτίδιο προσδιορισμό βασισμένο σε ELISA ΝΡ-κΒ σε μυς ποντικών με LLC. Το ένα παράγοντα μεταγραφής ΝΡ-κΒ που εμπλέκονται στην μυϊκής απώλειας λόγω καρκίνου αυξημένη πρόσδεση αντιστράφηκε όταν IκBαSR υπερεκφράστηκε σε μυς, γεγονός που υποδηλώνει ότι ρ65 είναι, τουλάχιστον σε ποντίκια με LLC [5]. Η φωσφορυλίωση του ρ65 σε σερίνη 536, πιστεύεται ότι αυξάνουν την μεταγραφική δραστικότητα, αυξάνεται σε μυς από C26 ποντικών που φέρουν όγκο [6], και των μυών από ανθρώπους με καρκίνο του παγκρέατος [8]. Από την άλλη πλευρά, ορισμένα αποτελέσματα σχετικά με το ρόλο των παραγόντων μεταγραφής ΝΡ-κΒ σε καχεξία έχουν διφορούμενα. Για παράδειγμα, δοκιμασίες μετατόπισης σε πήκτωμα έδειξαν μικρές αυξήσεις στην πρόσδεση των παραγόντων μεταγραφής σε ένα ολιγονουκλεοτίδιο NF-κΒ σε μυς από C26 ποντίκια που φέρουν όγκο [6], [9], και σε μια άλλη μελέτη δεν υπήρχε αύξηση στην πρωτεΐνη δέσμευσης σε ένα ΝΡ κΒ ολιγονουκλεοτιδίου σε καχεκτικούς αρουραίους με Yoshida ηπάτωμα ασκίτη [10]. Είναι πιθανό ότι οι διαφορετικοί τύποι καρκίνου επάγουν μυϊκής ατροφίας μέσω διαφορετικών κυτταρικών μηχανισμών. Παρ ‘όλα αυτά, μόνο μία πρωτεΐνη NF-κΒ σηματοδότηση (ΙκΒα) και του μεταγραφικού παράγοντα ενός NF-κΒ (p65) έχουν μελετηθεί σε καρκίνο που προκαλείται απώλεια μυϊκής μάζας, και, εμείς δεν γνωρίζουμε την ατροφία που προκαλεί γονίδια που στοχεύονται από NF-κΒ μεταγραφή παράγοντες.

Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να προσδιορίσει τις γνωστές πρωτεΐνες θηλαστικών NF-κΒ σηματοδότηση και μεταγραφικών παραγόντων NF-κΒ που ρυθμίζουν την μυϊκή σπατάλη οφείλεται σε καρκίνο. Ένας δεύτερος στόχος ήταν να προσδιοριστούν τα γονίδια-στόχους του ΝΡ-κΒ σε ένα επίπεδο γονιδιώματος σε επίπεδο προκειμένου να προσδιοριστεί εάν μια μεταγραφική δίκτυο NF-κΒ ρυθμίζει τον καρκίνο που προκαλείται από απώλεια μυϊκής μάζας. Δοκιμάσαμε το αν οι πρωτεΐνες σηματοδότησης ΝΡ-κΒ που απαιτείται για την απώλεια μυϊκής μάζας με υπερέκφραση κυρίαρχο αρνητικό (D.N.) μορφές της ανάντη κινάσες NF-κΒ. Αυτά είναι ο αναστολέας της κΒ άλφα κινάσης (ΙΚΚα), ΙΚΚβ, και η κινάση επαγωγής ΝΡ-κΒ (ΝΙΚ). Ο ρόλος της ΙκΒα ελέγχθηκε από υπερέκφραση μιας τρανς-κυρίαρχη σούπερ μορφή καταστολέα της ΙκΒα (IκBαSR). Αν η μεταγραφή NF-κΒ παράγοντες Σχετ Α (p65) ή γ-συνδεδεμένη απαιτούνται για μυϊκή εξασθένηση ελέγχθηκε από την υπερέκφραση της D.N. p65 ή D.N. c-Rel, αντίστοιχα. παράγοντα μεταγραφής ΝΡ-κΒ πρόσδεση σε ένα ολιγονουκλεοτίδιο NF-κΒ και μεταγραφική δραστικότητα ΝΡ-κΒ ενός ρεπόρτερ μετρήθηκαν σε καχεκτικούς μυς. Για να καθοριστεί εάν τα κανονικά παράγοντα μεταγραφής ΝΡ-κΒ, ρ65, δεσμευμένη γονιδίων στόχων που θα μπορούσαν να σχετίζονται με τη ρύθμιση ατροφία, εκτελέσαμε τσιπς αλληλούχιση στον μυ από ποντικούς ελέγχου και που φέρουν όγκο σε συνδυασμό με τη μέτρηση της παγκόσμιας γονιδιακής έκφρασης ως λειτουργικό μέτρο καχεξία με μεσολάβηση γονιδιακής έκφρασης.

Αυτή είναι η πρώτη σε βάθος μελέτη σχετικά με το ρόλο του ΝΡ-κΒ σηματοδότηση και των παραγόντων μεταγραφής ΝΡ-κΒ στη ρύθμιση της μυϊκής ατροφίας που οφείλονται στον καρκίνο. Αν και η αναστολή του ΙκΒα, και ειδικότερα ΙΚΚβ δραστηριότητα, ανέστρεψε σημαντικά απώλεια μυϊκής μάζας, δεν υπήρξε καμία επίδραση στην εξασθένηση των ινών λόγω της αναστολής της ΙΚΚα ή ΝΙΚ. Απροσδόκητα, υπερέκφραση κυρίαρχων αρνητικών p65 ή c-Rel έδειξαν μικρή ή καμία επίδραση στην εξασθένηση των μυϊκών ινών. Επιπλέον, δεν υπήρξε καμία αλλαγή στην παράγοντα μεταγραφής ΝΡ-κΒ δέσμευσης σε μια δοκιμασία μετατόπισης γέλης ή σε δραστηριότητα ανταποκριτή ΝΡ-κΒ. Είναι σημαντικό ότι η προς τα πάνω ρύθμιση της ατροφίας ή κυτοκίνης γονίδια που βρέθηκαν από μικροσυστοιχίες γονιδιακή έκφραση δεν διαμεσολαβείται από παράγοντες μεταγραφής ρ65 που περιέχουν όπως αξιολογείται με τσιπ seq. Τα ευρήματά μας είναι συνεπείς με αυτές των Cai et al. [5] που δείχνει ένα ρόλο για ΙκΒα σε σπατάλη του καρκίνου, και για πρώτη φορά δείχνουμε ότι ΙΚΚβ απαιτείται για την ανάπτυξη της καχεξίας καρκίνου, αλλά ΙΚΚα και ΝΙΚ δεν είναι. Μας σε βάθος ανάλυση του NF-κΒ σηματοδότηση και μεταγραφή κατά την διάρκεια καχεξία του καρκίνου δείχνει ότι η ΙΚΚβ ρυθμίζει γονιδιακή έκφραση από παράγοντες μεταγραφής εκτός από ΝΡ-κΒ, τουλάχιστον σε σκελετικό μυ κατά την διάρκεια C26 καρκινική καχεξία. Τα αποτελέσματα αυτά αποκαλύπτουν μια αναπάντεχη αλλά σημαντική πτυχή του κανονισμού του καρκίνου που προκαλείται απώλεια μυϊκής μάζας.

Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Αυτή η μελέτη πραγματοποιήθηκε σε αυστηρά σύμφωνα με τις συστάσεις στον οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση των ζώων Εργαστηρίου των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας. Το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από το Πανεπιστήμιο Θεσμικών Animal Care and Use Επιτροπή Charles River Campus Βοστώνη (αριθμός πρωτοκόλλου: 12-016). Όλες οι χειρουργικές επεμβάσεις πραγματοποιήθηκε υπό κεταμίνη /ξυλαζίνη αναισθησία, και όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία. Όλο το προσωπικό που εργάζεται με τα ζώα έχουν υποβληθεί σε υποχρεωτική εκπαίδευση IACUC και ετήσια αναθεώρηση: https://www.bu.edu/orctraining/animal/lacf/

Cells

C26 κύτταρα αδενοκαρκινώματος (National Cancer. Institute, Frederick, MD) απλώθηκαν και διατηρήθηκαν στους 37 ° C, 5% CO

2 σε κατά Dulbecco Modified Eagle Medium, υψηλή γλυκόζη (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (Invitrogen), 1% πενικιλίνη-στρεπτομυκίνη (Invitrogen), και 1% Ε-γλουταμίνη (Invitrogen). Πριν από τον εμβολιασμό σε ποντίκια, τα κύτταρα C26 θρυψινοποιήθηκαν και πλύθηκαν δύο φορές με αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό και στη συνέχεια επαναιωρήθηκαν σε ένα 1:01 διάλυμα 1X PBS και matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA, USA).

τα ζώα

Οκτώ εβδομάδων, αρσενικά ποντίκια CDF1 αγοράστηκαν από την Charles River Laboratories (Wilmington, ΜΑ, USA) χρησιμοποιήθηκαν για όλα τα πειράματα. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε θεραπεία σε αυστηρά σύμφωνα με τις συστάσεις στον Οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση των Ζώων Εργαστηρίου των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας. Τα ζώα διατηρήθηκαν σε ένα κύκλο /Δ 12:12 L, στεγάστηκαν ξεχωριστά, και τους δόθηκε πρόσβαση σε τροφή και νερό

κατά βούληση

. Μετά από τρεις ημέρες εγκλιματισμού, τα ζώα χωρίστηκαν τυχαία σε μια ομάδα ελέγχου μη-όγκου ή μια ομάδα που φέρει όγκο C26. Τα ζώα ελέγχου έλαβαν ένα εμβόλιο 150 μL 1 × PBS /matrigel (1:01) υποδορίως στην δεξιά και αριστερά στα πλευρά. ζώα που φέρουν όγκο έλαβαν ένα εμβόλιο των 5,0 × 10

5 C26 κύτταρα αιωρούνται σε 150 μL PBS /matrigel (1:01) ενίεται υποδορίως στα δεξιά και αριστερά λαγόνες? Αυτό πραγματοποιήθηκε σε ελαφρά αναισθησία ποντίκια (40 mg /kg κεταμίνη 5 mg /kg ξυλαζίνη).

ένεση πλασμιδικό DNA σε μυϊκά

Το πλασμιδιακό DNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το QIAGEN ελεύθερο ενδοτοξίνης Mega Kit σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το πλασμίδιο DNA εγχύθηκε σε μυ 10 ημέρες μετά τις εμβολιασμούς όγκου, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [11]. Εν συντομία, το πλασμίδιο DNA καταβυθίζεται με αιθανόλη και επανα-εναιωρήθηκε σε 0,45% στείρο φυσιολογικό ορό /DDH

2O. Όλοι οι ποντικοί που έλαβαν χειρουργική δόθηκαν προφυλακτική αγωγή με 0,1 mg έγχυση /kg βουπρενορφίνη πριν από το χειρουργείο. Οι ποντικοί αναισθητοποιήθηκαν με κεταμίνη (80 mg /kg) και ξυλαζίνης (10 mg /kg). Τα πρόσθιο κνημιαίο (ΤΑ) των μυών από κάθε ζώο εγχύθηκαν με 35 μg του πλασμιδίου έκφρασης σε 25 μί 0,45% στείρου αλατούχου διαλύματος χρησιμοποιώντας μία σύριγγα ινσουλίνης 29-gauge. Μετά την έγχυση πλασμιδίου, οι μύες διεγείρονται με ένα ηλεκτρικό ρεύμα χαμηλής τάσης με χρήση ηλεκτροδίων δύο κουπί [12], η οποία διατυπώθηκε 6 παλμούς σε 86 V /cm για 20 ms με ένα διάστημα μεταξύ των 200 ms (Electro Square Porator ECM 830, ΒΤΧ) . Αυτό είναι ένα πρωτόκολλο ηλεκτροδιάτρησης χαμηλή δόση που δεν προκαλεί βλάβη [13], [14], [15]. Την ημέρα 25 μετά τον εμβολιασμό, TA μύες απομακρύνθηκαν από αμφότερα C26 ποντικούς που φέρουν όγκο ελέγχου και, ζυγίστηκαν και είτε καταψύχθηκαν ταχέως σε υγρό άζωτο για βιοχημική ανάλυση ή να τοποθετηθεί επί γλωσσοπίεστρα, ενσωματωμένο σε μέσο ιστού-κατάψυξης, και καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο ισοπεντανίου ψυχόμενο για ιστοχημική ανάλυση. Ένεση του πλασμιδίου αναφοράς NF-κΒ έγινε την ίδια ημέρα ως ενοφθαλμισμό των νεοπλασματικών κυττάρων. Ένεση d.n.p65-EGFP έγινε την 6η ημέρα μετά τον εμβολιασμό του όγκου

πλασμίδια

Τα πλασμίδια έκφρασης που χρησιμοποιήθηκαν ήταν οι εξής:. D.N. ΙΚΚα-EGFP, D.N. ΙΚΚβ-EGFP, IκBαSR-EGFP, D.N. ΝΙΚ-GFP, D.N. p65-EGFP, και D.N. c-rel-EGFP. Η D.N. ΙΚΚα-EGFP (K44M) και D.N. ΙΚΚβ-EGFP (K44M) πλασμίδια έκφρασης κωδικοποιούν πρωτεΐνες σύντηξης ΕΟΡΡ μορφών κινάσης-νεκρό του ΙΚΚα και ΙΚΚβ που έχουμε περιγράψει λεπτομερώς [11]. Κατασκευάσαμε επίσης το πλασμίδιο σύντηξης IκBαSR-ΕΟΡΡ που έχουμε περιγράψει λεπτομερώς [16]. Η D.N. ρ65 (313) είναι μια κολοβωμένη μορφή ρ65 λείπουν τα C-τελικές περιοχές διενεργοποίησης και ήταν ένα δώρο από D. Guttridge [17]. Δημιουργήσαμε ένα D.N. πλασμίδιο σύντηξης p65-EGFP με κλωνοποίηση του Ν-τερματική αλληλουχία DNA οξύ κωδικοποίησης 313 αμινοξέων του ρ65 εντός των HindIII-SalI θέσεις του ρΕΟΡΡ-Ν1 (313 + 238 = 551 α.α.). Επαληθεύσαμε τη κλωνοποίηση με αλληλούχιση του πλασμιδίου και δοκιμάστηκε το κυρίαρχο αρνητικό λειτουργία σε C2C12 μυοσωληνάρια, στην οποία η D.N. p65-EGFP ήταν σε θέση να εμποδίσει την ενεργοποίηση του ΤΝΡα ενός ανταποκριτή ΝΡ-κΒ με acc = GSE48363). Διαφορική έκφραση του γονιδίου υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τη μονάδα επιλογής Συγκριτικό Marker σε GenePattern οποίο συγκρίνει μέσες διαφορές μεταξύ των ομάδων ελέγχου και C26 με αμφίδρομη παραμετρικές t-tests. Παράμετροι που χρησιμοποιούνται για την ταυτοποίηση γονιδίων που εκφράζονται διαφορικά σε μυς από ποντίκια που φέρουν όγκο ήταν:

P

-value≤0.05,

q

-value≤0.05, και πολλαπλή μεταβολή είναι μεγαλύτερη από 1,5 φορές . Οι ανάντη ή προς τα κάτω-ρυθμίζονται λίστες γονίδιο που αποστέλλονται στη βάση δεδομένων DAVID Βιοπληροφορικής για τη λειτουργική σχολιασμό και για την ανάθεση οντολογία γονιδίων βασίζεται στη βιολογική διαδικασία των γονιδίων σε σύγκριση με εκείνη του

Mus musculus

γονιδίωμα, όπου το όριο της ΕΑΣΕ βαθμολογία (ένα τροποποιημένο Fisher Ακριβής P-value) καθορίστηκε στα 0,01 και ελάχιστη μέτρηση γονίδιο 2.

τσιπ αλληλουχίας

γαστροκνημίου και plantaris μυς απομονώθηκαν από τον έλεγχο (δηλαδή μη-όγκου οποία φέρουν το) και C26 ποντίκια που φέρουν όγκους κατά την ημέρα 25 μετά τον εμβολιασμό του όγκου. Προσφάτως αποσυντίθενται μυς τεμαχίστηκε και σταυροειδείς δεσμούς σε 1% φορμαλδεΰδη για 15 λεπτά, σβήστηκε με γλυκίνη και έπειτα καταψύχεται σε υγρό άζωτο. Για κάθε συνθήκη (δηλαδή, έλεγχο ή C26) plantarflexor μυών από συνενώθηκαν τέσσερα πόδια, ομογενοποιείται, και χρωματίνη απομονώθηκε όπως περιγράφεται λεπτομερώς προηγουμένως [21]. Αυτό το υλικό υποβλήθηκε σε υπερήχους για να δώσει θραύσματα χρωματίνης που ήταν κατά μέσο όρο 250 bp. Ένα κλάσμα σε υπερήχους χρωματίνη τέθηκε κατά μέρος για να χρησιμοποιηθεί ως το κλάσμα εισόδου για ChIP-PCR. Το υπόλοιπο της χρωματίνης αραιώθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα ΙΡ και χωρίστηκε σε μια ομάδα για επώαση με το ρ65 αντίσωμα (Santa Cruz SC-372X) και μία ομάδα χωρίς πρωτογενές αντίσωμα? Αυτό έγινε για χρωματίνης και από τις δύο ομάδες ελέγχου και C26. Δείγματα με και χωρίς πρωτογενές αντίσωμα επωάστηκαν για 16 ώρες στους 4 ° C με σταθερή ανάμιξη χαμηλής ταχύτητας και, στη συνέχεια, τα σύμπλοκα αντισώματος-χρωματίνης συλλήφθηκαν με πρωτεΐνη G μαγνητικά σφαιρίδια. Η χρωματίνη εκλούσθηκε από τα σφαιρίδια και διασταυρωμένες συνδέσεις αντιστραφεί, ακολουθούμενη από προνάση /αγωγή RNase και καταβύθιση του DNA. Ένα δέκατο του υλικού που χρησιμοποιείται για PCR για ένα γονίδιο ήδη δειχθεί ότι έχουν ισχυρή δεσμευτική προκειμένου να δοκιμαστεί το τσιπ p65 p65. Τρεις διαφορετικές βιβλιοθήκες DNA έγιναν: έλεγχος p65 ChIP, C26 p65 ChIP, και το chip χωρίς πρωτογενές αντίσωμα. Οι βιβλιοθήκες παρασκευάστηκαν για προσδιορισμό αλληλουχίας υψηλής διεκπεραίωσης χρησιμοποιώντας το κιτ Βιβλιοθήκη Illumina τσιπ seq. Ένα κλάσμα του κάθε βιβλιοθήκη εξετάστηκε με ηλεκτροφόρηση ακρυλαμιδίου και χρώση με SYBR-χρυσού για να εκτιμηθεί η ποιότητα από το μέγεθος και την ένταση του προϊόντος το οποίο εμφανίζεται ως επίχρισμα με μέσο μέγεθος 350 bp. Η όλη διαδικασία για την κατασκευή των τριών βιβλιοθηκών επαναλήφθηκε μία δεύτερη φορά με νέα δείγματα μυός, ώστε να έχουν δύο τσιπ seq βιβλιοθήκες για κάθε μία από τις τρεις ομάδες. Οι βιβλιοθήκες εστάλησαν στο Whitehead Institute (Cambridge, ΜΑ) όπου είχαν καθαριστεί διμερών προσαρμογέα με χάντρες Ampure XL. Τα καθαρισμένα βιβλιοθήκες ελέγχθηκαν με Bioanalyzer και qPCR ποιοτικός έλεγχος πραγματοποιήθηκε προκειμένου να καθοριστεί πόσο κάθε βιβλιοθήκης στη χρήση. Οι βιβλιοθήκες αλληλουχία τους χρησιμοποιώντας αλληλούχιση Illumina Solexa σε ένα sequencer GA II. Οι προκύπτουσες αλληλουχίες από τον έλεγχο και τα δείγματα C26 ευθυγραμμίστηκαν με το γονιδίωμα του ποντικού (έκδοση mm9) χρησιμοποιώντας είδος αντιλόπης. Οι αλληλουχίες εστάλησαν στο εργαστήριο μας σε μορφή ταυρότραγος.

Οι ευθυγραμμίσεις για τα δύο ανεξάρτητα δείγματα ελέγχου συνενώθηκαν και το ίδιο έγινε για τα δύο C26 δείγματα. Σε κάθε περίπτωση, αυτό έγινε με το συνδυασμό των μορφών .bam των ευθυγραμμίσεις στην ιστοσελίδα Galaxy. Οι αλληλουχίες στη συνέχεια αξιολογήθηκαν με το πακέτο FastQC των δοκιμών ελέγχου της ποιότητας, το οποίο ελήφθη ως αυτόνομο πρόγραμμα από την Brabaham Institute (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/). Μετά την αρχική ανάλυση FastQ δύο πράξεις έγιναν σχετικά με τα δεδομένα τσιπ επόμενα: 1. έχουμε απομακρυνθεί PCR εις διπλούν χρησιμοποιώντας samtools rmdup μέσω Galaxy, και 2. χρησιμοποιώντας και πάλι samtools, πήραμε πλεονέκτημα των ετικετών χαρτογράφηση των δεδομένων ταυρότραγος να απομονώσει διαβάζει μόνο χαρτογραφήθηκε σε μοναδικές θέσεις στο γονιδίωμα ποντικού. Ακολουθία διαβάζει ήταν 35 ή 36 ζεύγη βάσεων. Τα τρία αρχεία δεδομένων τσιπ επόμενα ήταν: τσιπ ελέγχουν p65 (10,7 εκατ διαβάζει), C26 p65 ChIP (11,1 εκατ διαβάζει), και ένα αρχείο που εκπροσωπούν ακολουθία φόντο διαβάζει (8,5 εκατομμύρια) που λαμβάνεται με το συνδυασμό του ελέγχου και C26 σε υπερήχους χρωματίνης που τρέχουν μέσω του τσιπ χωρίς ένα πρωτεύον αντίσωμα (καμία ομάδα αντίσωμα). Αυτά τα τρία ακολουθία μετα-QC .bam αρχεία είναι διαθέσιμα στην ηλεκτρονική διεύθυνση: (https://drive.google.com/folderview?id=0B0Ph0YwXvamQektEaTFkcElSLTQ usp=sharing) Οι ευθυγραμμισμένες σειρές μετατράπηκαν σε .sam μορφή και στη συνέχεια να ανεβάσει στην κορυφή πρόγραμμα εύρεσης σε ChIPseeqer [24] με τις ακόλουθες παραμέτρους: 1. κατώφλι = 5, 2. αλλαγή φορές = 2 ή μεγαλύτερο (σε σύγκριση με το υπόβαθρο), 3. θραύσμα μήκους 250 bp =, 4. κορυφή μήκους τουλάχιστον 100 bp και 5 . κορυφή διαχωρισμό τουλάχιστον 100 ζεύγη βάσεων. Εκτός από την αναγνώριση του ελέγχου και C26 ρ65 κορυφών σε σχέση με το φόντο (χωρίς αντίσωμα), ChIPseeqer προσδιόρισε την περιοχή του γονιδίου της ρ65 κορυφών δέσμευσης (δηλαδή, γονιδιωματική θέση των κορυφών).

Τα σύνολα ελέγχου και C26 κορυφές p65 έτρεξαν σε PeakAnalyzer [25] (https://www.ebi.ac.uk/research/bertone/software#peakanalyzer) προκειμένου να βρεθεί το γονίδιο με τον πλησιέστερο TSS για κάθε κορυφή. Αυτό δημιουργεί μια λίστα των γονιδίων με αιχμές λιγότερο από 100 kb από το TSS. Οι κατάλογοι στη συνέχεια σε σχέση με τους καταλόγους των αυξημένη και μειωμένη έκφραση του mRNA από τον έλεγχο εναντίον των δεδομένων μικροσυστοιχιών C26 με τη χρήση ενός αλγόριθμου perl βρίσκεται σε μια ιστοσελίδα που αναπτύχθηκε από τον Jim Lund στο Πανεπιστήμιο του Κεντάκι (https://nemates.org/MA /PROGS /Compare.html).

Θετικός μάρτυρας για ChIP

για να επιβεβαιώσετε τη σωστή σύνδεση του αντισώματος p65 μελετήσαμε τσιπ με PCR για δύο συνεχόμενες ιδιαίτερα μελετηθεί και επαλήθευσε υποστηρικτής NF-κΒ θέσεις πρόσδεσης στον ποντικό ΙΡ-10 (CXCL10) γονίδιο [26]. Αυτό το πείραμα ChIP χρησιμοποιείται επίσης ένα αντίσωμα για Ρ50 (Santa Cruz SC-1190X). Ένας θετικός μάρτυρας για ChIP έγινε με χρωματίνη από C2C12 μυοσωληνάρια που είχαν υποβληθεί σε θεραπεία για 4 ώρες με 10 ng /ml ΤΝΡα ποντικού. Έχουμε προηγουμένως έδειξαν ότι η θεραπεία αυτή επάγεται έντονα μια ανταποκριτή λουσιφεράσης ΝΡ-κΒ και την αύξηση της ΙΡ-10 mRNA επίπεδα, οι οποίες εξαρτώνται από την ρ65 [27]. Για το πείραμα δοκιμής χρησιμοποιήσαμε μεθόδους που περιγράφονται στα προηγούμενα εργασία μας [21]. Εν συντομία, η φορμαλδεΰδη σταθερό χρωματίνη από μη επεξεργασμένο και TNFa επεξεργασμένο μυοσωληνάρια C2C12 ανοσοκαταβυθίστηκε με αντίσωμα p65, αντίσωμα ρ50, ή κανένα αντίσωμα και η πρωτεΐνη G-σταματούν ιζήματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για την παραγωγή DNA το οποίο δοκιμάστηκε με PCR χρησιμοποιώντας εναρκτήρες που πλευρίζουν την δύο διαδοχικά NF -κB περιοχές κατά την ΠΕ-10 γονίδιο. Επιπλέον, αξιολογήσαμε επίσης ρ65 και ρ50 σύνδεση με το ΙΡ-10 υποκινητή με τη χρήση της χρωματίνης από τον έλεγχο και C26 μυών.

ChIP-PCR για Fbxo6

ChIP-PCR από μυϊκό ιστό σταθερό, ομογενοποιούνται και επεξεργάζονται με υπερήχους και για τσιπ επόμενα, με την εξαίρεση ότι το αντίσωμα p65 συνδέθηκε με την πρωτεΐνη G μαγνητικά σφαιρίδια με προ-επώαση (όλη τη νύχτα σε 4 ° C) πριν από την επώαση με την χρωματίνη, και τα προϊόντα DNA χρησιμοποιήθηκαν ως εκμαγείο για PCR με εκκινητές που πλευρίζουν θέση δέσμευσης στόχου του γονιδίου Fbxo6, όπως προσδιορίζεται από τσιπ seq. Η θέση στόχος από το τσιπ-seq ήταν στο πρώτο ιντρόνιο του γονιδίου Fbxo6, 2 kb καθοδικά της θέσης έναρξης μεταγραφής. Οι αλληλουχίες των εκκινητών που χρησιμοποιούνται για την PCR ήταν agctcgttgatgtggaccat (αριστερά εκκινητής) και cctcctgctttaggctcctt (δεξιά εκκινητής) και παρήγαγε ένα προϊόν PCR 302 bp.

Στατιστικά

Ένα ANOVA ή ένα

t-test

χρησιμοποιήθηκε για ανάλυση, ανάλογα με τον αριθμό των ομάδων που συγκρίνονται. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσοι ± SE, και η σημασία καθορίστηκε σε

P

& lt? 0.05. Οι στατιστικές για τα δεδομένα μικροσυστοιχιών περιγράφεται στην ενότητα μικροσυστοιχιών.

Αποτελέσματα

Χαρακτηρισμός C26 που φέρουν όγκο ποντικών

Χαρακτηρισμός

αυτού του μοντέλου όγκου στο εργαστήριο μας αφορούσε την ενοφθαλμισμό CDF1 ποντίκια με κύτταρα C26 όγκου σε PBS /matrigel (n = 164) ή με μόνο PBS /matrigel (n = 142). Οι ποντικοί θυσιάστηκαν στις 12, 13, 14, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 24, 25, και 26 ημέρες μετά τον ενοφθαλμισμό των νεοπλασματικών κυττάρων. Σε σοβαρές καχεξία (ημέρες 23-26 μετά τον εμβολιασμό) ποντικοί που φέρουν όγκο έχασε 22,1% ± 0,8% του αρχικού βάρους σώματος, ενώ οι έλεγχοι μη-όγκου που αποκτήθηκε 12,3% ± 0,7% του αρχικού μάζας σώματος (Σχήμα S2A). Ως μάζα του όγκου αυξήθηκε πρόσθιου κνημιαίου (TA) της μυϊκής μάζας μειώθηκε (στοιχεία S2B). Η μυϊκή μάζα TA σοβαρά καχεκτικών ποντικών ήταν 40.4 ± 0.3 mg σε σύγκριση με 51,1 ± 0,3 mg για τους ποντικούς ελέγχου αντίστοιχης ηλικίας. Ποντίκια που έφεραν όγκο σε σοβαρή καχεξία είχε 214 ± 8.7 mg του επιδιδυμικού λιπώδους μάζας pad, ενώ τα ποντίκια ελέγχου είχαν 465 ± 10 mg (Σχήμα S2C). Η μάζα σπλήνα ποντικών που φέρουν όγκο ήταν 205 ± 4,6 mg σε σύγκριση με 75,5 ± 0,7 mg σε μη φέροντες όγκο ποντικούς (Σχήμα S2D). Η μάζα του όγκου αυξήθηκε ως συνάρτηση του χρόνου μετά τον εμβολιασμό (Σχήμα S2E).

Επίδραση των κυρίαρχων αρνητικών ΝΡ-κΒ πρωτεϊνών επί ατροφία των μυϊκών ινών σηματοδότησης σε C26 που φέρουν όγκο ποντικών

Η μέση ίνα n.