Αφηρημένο

Ιστορικό

Το σηματοδοτικό μονοπάτι του mTOR παίζει κρίσιμο ρόλο στην καρκινογένεση του καρκίνου των νεφρών (RCC). Επιδιώξαμε να διερευνήσει την επίδραση των γενετικών παραλλαγών στα γονίδια μονοπάτι που σχετίζονται με mTOR σχετικά με τον κίνδυνο της RCC.

Μέθοδοι

γονότυπος 8 δυνητικά λειτουργικών πολυμορφισμών στο

ΑΚΤ1

,

ΑΚΤ2

,

PTEN

και

mTOR

γονίδια χρησιμοποιώντας τη μέθοδο TaqMan σε μια μελέτη ασθενών-μαρτύρων των 710 ασθενών RCC και 760 χωρίς καρκίνο θέματα. Άνευ όρων λογιστικής παλινδρόμησης, προσαρμοσμένο για τους πιθανούς συγχυτικούς παράγοντες, χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογήσει τις ενώσεις του κινδύνου. Στη συνέχεια εξετάζεται η λειτουργικότητα των σημαντικών πολυμορφισμών.

Αποτελέσματα

Από τις 8 πολυμορφισμούς, μετά την προσαρμογή για πολλαπλές συγκρίσεις, βρήκαμε μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ ενός παραλλαγή (rs2295080) στον υποκινητή του

mTOR

και μειωμένη RCC κινδύνου (

P

= 0.005, OR = 0.74, 95% CI = 0,59 – 0,91, TG /GG

vs.

ΤΤ). Μια άλλη παραλλαγή (rs701848) στην περιοχή 3’UTR του

PTEN

συσχετίστηκε με αυξημένο κίνδυνο RCC (

P

= 0.014, OR = 1.45, 95% CI = 1,08 – 1,96, CC vs . TT)? Ωστόσο, η ένωση δεν ήταν σημαντική μετά την προσαρμογή για πολλαπλές συγκρίσεις. Επιπλέον, παρατηρήσαμε κατώτερο

mTOR

επιπέδων mRNA με την παρουσία του αλληλόμορφου rs2295080G σε φυσιολογική νεφρική ιστούς. Η δοκιμασία λουσιφεράσης έδειξε ότι το αλληλόμορφο rs2295080G μειώθηκε σημαντικά δραστικότητα λουσιφεράσης. Δεν παρατηρήθηκε καμία άλλη στατιστικά σημαντική συσχέτιση μεταξύ των επιλεγμένων πολυμορφισμών και τον κίνδυνο RCC.

Συμπεράσματα

Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η λειτουργική

mTOR

παραλλαγή rs2295080 υποκινητή επηρεάζει την ευαισθησία RCC με τη διαμόρφωση του ενδογενούς

mTOR

επίπεδο έκφρασης. Οι επιπτώσεις των κινδύνων και η λειτουργική επίδραση του

παραλλαγή mTOR

rs2295080 χρειάζεται περαιτέρω επικύρωση

Παράθεση:. Cao Q, Ju Χ, Li P, Meng Χ, Shao P, Cai H, et al . (2012) μία λειτουργική παραλλαγή στο

mTOR

Ανάδοχος Διαμορφώνει την έκφρασή του και σχετίζεται με νεφρική Κίνδυνος Cancer Cell. PLoS ONE 7 (11): e50302. doi: 10.1371 /journal.pone.0050302

Επιμέλεια: Balraj Mittal, Sanjay Gandhi Ιατρικό Ινστιτούτο, Ινδία

Ελήφθη: 26 Ιουλίου, 2012? Αποδεκτές: 18 του Οκτ του 2012? Δημοσιεύθηκε: 28 του Νοέμβρη 2012

Copyright: © 2012 Cao et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Πρόγραμμα για την Ανάπτυξη Καινοτόμων ερευνητικής ομάδας στην Πρώτη Ενταγμένο Νοσοκομείο Ιατρικό Πανεπιστήμιο Nanjing, Επαρχιακό Πρωτοβουλία του Προγράμματος για την εξοχότητά κλάδους της επαρχίας Jiangsu, από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας [αριθμός επιχορήγηση 81171963 και 81102089] και Φυσικών Επιστημών Ίδρυμα της επαρχίας Jiangsu [αριθμός επιχορήγηση BK2008473 και BK2011773]. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνο νεφρικών κυττάρων (RCC) είναι η πιο κοινή μορφή καρκίνου του νεφρού, που αντιπροσωπεύουν περισσότερο από το 80% όλων των κακοήθων όγκων του νεφρού [1], [2]. Αν και η ακριβής αιτία της RCC παραμένει σε μεγάλο βαθμό άγνωστος, ανώμαλη αγγειογένεση θεωρείται το σήμα κατατεθέν της νόσου [3], [4]. Στην πλειονότητα των σποραδικών και κληρονομικών υποθέσεων RCC, ο νοη Hippel-Lindau (VHL) ογκοκατασταλτικό γονίδιο είναι λειτουργικώς διασπασμένο και τα αποτελέσματα σε συστατική ενεργοποίηση της υποξίας-διεγέρσιμο παράγοντα (HIF) και επακόλουθη επαγωγή γονιδίων στόχων, όπως ο VEGF [4] . Οι γενετικές παραλλαγές σε γονίδια που σχετίζονται με την αγγειογένεση προτάθηκε για να επηρεάσει την ευαισθησία των ατόμων να RCC [5], [6], [7]. Πρόσφατα, μια μεγάλη μελέτη σύνδεσης του γονιδιώματος-ευρεία διεξήχθη στις Ηνωμένες Πολιτείες έχει εντοπίσει μια ενδιαφέρουσα παραλλαγή στο

EPAS1

(κωδικοποιεί HIF-2 άλφα) ως ένα τόπο ευαισθησίας για RCC σε έναν ευρωπαϊκό πληθυσμό [7]. Ωστόσο, στην κινεζική πληθυσμό που αξιολογούνται, δεν καταφέραμε να αναπαράγουν τα σημαντικά ευρήματα μεταξύ των πολυμορφισμών στο

HIF1A

[8], καθώς και

EPAS1

[9] και ο κίνδυνος της RCC, η οποία δείχνει ότι υπάρχουν διαφορές στη γενετική αρχιτεκτονική των εθνοτικών ομάδων, καθώς και τη διερεύνηση των γενετικών παραλλαγών και σε άλλα υποψήφια γονίδια εξακολουθεί να είναι αναγκαία. Εδώ, στην παρούσα μελέτη, επεκτείναμε την εξερεύνηση σε μια σημαντική οδό σηματοδότησης περιλαμβάνει φωσφατιδυλοϊνοσιτολικής-3-κινάση (PI3K), φωσφατάση και tensin ομόλογο (PTEN), v-ΑΚΤ ποντικού thymoma ογκογονίδιο ιού ομόλογο (ΑΚΤ), και στόχος θηλαστικών ραπαμυκίνη (mTOR).

Η mTOR μονοπάτι σηματοδότησης παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην κυτταρική ανάπτυξη, την επιβίωση, τον πολλαπλασιασμό και την αγγειογένεση [10]. Οι ΡΙ3Κ ενεργοποιούνται από κινάσες τυροσίνης υποδοχέα όπως ο υποδοχέας του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR), υποδοχέας του αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGFR) και μοιάζει με ινσουλίνη υποδοχέα του αυξητικού παράγοντα (IGFR)? η ενεργοποίηση στη συνέχεια καταλήγει σε ένα καταρράκτη κινάσης μέσω ΑΚΤ και mTOR [11]. Αυτή η οδός ρυθμίζεται αρνητικά από το ογκοκατασταλτικό γονίδιο

ΡΤΕΝ

μέσω της αποφωσφορυλίωσης της φωσφατιδυλινοσιτόλης τριςφωσφορικής (ΡΙΡ3) [12]. Γενετικές αλλοιώσεις των γονιδίων οδού που σχετίζονται με mTOR, συμπεριλαμβανομένων των μεταλλάξεων του

PI3K

,

ΑΚΤ

, και

PTEN

, τη διευκόλυνση της ογκογένεσης και είναι κοινά σε καρκίνους του ανθρώπου [13], [ ,,,0],14], [15]. Η σημασία του mTOR σηματοδότησης σε RCC τονίζεται από την επιτυχία με τη χρήση αναστολέων του mTOR (temsirolimus και everolimus) για τη θεραπεία ασθενών με προχωρημένη νόσο [16], [17].

πολυμορφισμοί ενός νουκλεοτιδίου (SNPs) σε υποψήφιες γονίδια έχουν αποδειχθεί ότι επηρεάζουν την ευαισθησία των ατόμων να RCC [7]. Υπό το φως της κρίσιμο ρόλο του μονοπατιού του mTOR RCC, είναι πιθανό ότι SNPs σε αυτό το μονοπάτι μπορεί να παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του RCC. Ωστόσο, δεν υπάρχει δημοσιευμένη μελέτη έχει αντιμετωπίσει ακόμη το θέμα αυτό. Ως εκ τούτου, στην παρούσα μελέτη, αξιολόγηση 5 βασικά γονίδια (

PI3KCA

,

ΑΚΤ1

,

ΑΚΤ2

,

PTEN

, και

mTOR

) σε αυτό το μονοπάτι και αναλύθηκαν 8 πιθανώς λειτουργική SNPs σε αυτά τα γονίδια και τις επιπτώσεις τους για την εμφάνιση του RCC σε ένα κινεζικό πληθυσμό.

ασθενείς και Μέθοδοι

δήλωση Ηθικής

Η μελέτη εγκρίθηκε από το Διοικητικό συμβούλιο Institutional Review της Nanjing Ιατρικό Πανεπιστήμιο, Nanjing, Κίνα. Κατά την πρόσληψη, γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους συμμετέχοντες που εμπλέκονται σε αυτή τη μελέτη.

πληθυσμός Μελέτη

Συνολικά, 710 ασθενείς περιστατικό με RCC και μια ομάδα 760 καρκίνου χωρίς ελέγχους που προσλαμβάνονται στο Πρώτο Ενταγμένο Νοσοκομείο Ιατρικό Πανεπιστήμιο Nanjing, Nanjing, Κίνα μεταξύ του Μαΐου 2004 και Σεπτεμβρίου 2011 είχαν εγγραφεί στη μελέτη ασθενών-μαρτύρων. Τα κριτήρια ένταξης των περιπτώσεων και ελέγχων έχουν περιγραφεί αλλού [8]. Εν συντομία, όλες οι νεοδιαγνωσθέντες ασθενείς με ιστοπαθολογικά επιβεβαίωσε το περιστατικό RCC και χωρίς προηγούμενο ιστορικό άλλων μορφών καρκίνου ή προηγούμενη χημειοθεραπεία ή ακτινοθεραπεία είχαν διαδοχικά προσληφθεί χωρίς τον περιορισμό της ηλικίας και του φύλου. Η ασθένεια είχε ταξινομηθεί σύμφωνα με τα κριτήρια της Παγκόσμιας Οργάνωσης Υγείας και οργάνωσε σύμφωνα με το 2002 αμερικανική μεικτής επιτροπής για τον Καρκίνο (AJCC) ταξινόμηση ΤΝΜ. Οι έλεγχοι είχαν προσληφθεί από άτομα που ζητούσαν φυσική εξέταση στα εξωτερικά ιατρεία του νοσοκομείου και αντιστοιχήθηκαν συχνότητα στις περιπτώσεις κατά ηλικία (± 5 έτη) και το φύλο. Τα καρκινικά χωρίς ελέγχους ήταν γενετικά άσχετη με τις περιπτώσεις και δεν είχε ατομικό ιστορικό καρκίνου. Πριν από την πρόσληψη, ένα τυποποιημένο ερωτηματολόγιο χορηγήθηκε μέσω πρόσωπο με πρόσωπο συνεντεύξεις από εκπαιδευμένους ερευνητές για τη συλλογή δημογραφικών δεδομένων και των σχετικών παραγόντων. Κάθε ασθενής δώρισε 5 ml φλεβικού αίματος μετά την παροχή της γραπτής ενημερωμένη συγκατάθεση. Το ποσοστό ανταπόκρισης για την περίπτωση και την ομάδα ελέγχου ήταν πάνω από 85%

επιλογή SNP

Εμείς αξιολόγηση 5 βασικά γονίδια που εμπλέκονται στην οδό σηματοδότησης mTOR:.

PI3KCA

,

ΑΚΤ1

,

ΑΚΤ2

,

PTEN

και

mTOR

. επιλέγεται SNPs σε αυτά τα γονίδια βασίστηκαν σε HapMap δεδομένων (https://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/) και τα δεδομένα dbSNP (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/). Τα δυνητικά λειτουργικά πολυμορφισμοί προσδιορίστηκαν σύμφωνα με τα ακόλουθα κριτήρια: (1) που βρίσκονται στις πλευρικές περιοχές 5 ‘, 5’ αμετάφραστη περιοχή (UTR), 3 ‘UTR, ή περιοχές κωδικοποίησης με αλλαγές αμινοξέων? (2) συχνότητα έλασσον αλληλόμορφο (MAF) & gt? 5% του κινεζικού πληθυσμού? ή (3) που σχετίζεται με τον κίνδυνο καρκίνου σε προηγούμενες μελέτες. Σύμφωνα με τα κριτήρια, 8 SNPs εντοπίστηκαν, συμπεριλαμβανομένων rs2494750 και rs2498786 στο

ΑΚΤ1

, rs33933140 και rs7254617 στο

ΑΚΤ2

, rs11202607 και rs701848 στο

PTEN

καθώς και rs2295080 και rs2536 στο

mTOR

.

εξαγωγή DNA και του γονότυπου

το γονιδιακό DNA εκχυλίζεται από το περιφερικό αίμα από πέψη με πρωτεϊνάση Κ και εκχύλιση με φαινόλη-χλωροφόρμιο. Η γονοτυπική αυτών των 8 SNPs πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας προσχεδιασμένα TaqMan SNP Γονοτυπικές αναλύσεις (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) στο Εργαστήριο του Τμήματος Μοριακής και Γενετικής Τοξικολογίας, Ιατρικό Πανεπιστήμιο Nanjing, Nanjing, Κίνα. Οι αλληλουχίες των εκκινητών και ανιχνευτών που παρατίθενται στον Πίνακα S1. Το μίγμα της αντίδρασης 10 μί περιείχε 20 ng γενωμικού DNA, 3.5 μι 2 χ TaqMan Γονοτυποποίηση Master Mix, 0,25 μι του εκκινητών και ανιχνευτών μίγματος και 6,25 μL διπλά αποσταγμένο νερό. Η ενίσχυση εκτελέστηκε υπό τις ακόλουθες συνθήκες: 50 ° C για 2 λεπτά, 95 ° C για 10 λεπτά που ακολουθείται από 45 κύκλους των 95 ° C για 15 sec, και 60 ° C για 1 λεπτό. Ενισχύσεις και ανάλυση διεξήχθησαν στα 384 φρεατίων ΑΒΙ 7900HT Real Time PCR System (Applied Biosystems) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. SDS 2.4 λογισμικό (Applied Biosystems) χρησιμοποιήθηκε για αλληλομόρφων των διακρίσεων. Τα ποσοστά του γονότυπου αυτών των SNPs ήταν όλες πάνω από 98%. Για τον έλεγχο της ποιότητας, 4 αρνητικοί έλεγχοι περιλήφθηκαν σε κάθε πλάκα και 5% των δειγμάτων επιλέχθηκαν τυχαία για επαναλαμβανόμενη γονοτυπική επιβεβαίωση? και τα αποτελέσματα ήταν 100% συγκλίνουσες.

Ανάλυση του

mTOR

έκφραση mRNA

Δεκαοκτώ αφαιρεθεί χειρουργικά νεφρικού καρκίνου ιστούς με ζευγαρωμένα paratumor νεφρικούς ιστούς και ένα επιπλέον 24 paratumor νεφρικούς ιστούς ήταν χρησιμοποιηθεί για την ανάλυση

mTOR

επίπεδα mRNA

in vivo

. Οι ιστοί που λαμβάνονται από τους αφαιρεθεί χειρουργικά δείγματα από τους ασθενείς και αμέσως αποθηκεύτηκαν σε υγρό άζωτο. Το RNA απομονώθηκε από περίπου 100 mg ιστού χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) και αντίστροφη μεταγραφή σε μονόκλωνο cDNA χρησιμοποιώντας ολίγο (dT) εκκινητή και Superscript II (Invitrogen). Η

mTOR

RNA επίπεδο μετρήθηκε με ποσοτική πραγματικού χρόνου αντίστροφης μεταγραφής (RT) -PCR σχετικά με το σύστημα ανίχνευσης 7900 ακολουθίας ΑΒΙ Prism (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Η

ACTB

χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικό γονίδιο αναφοράς. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για

mTOR

ήταν 5 ‘-TTGCTTGAGGTGCTACTG -3′ (νοηματικό) και 5’-CTGACTTGACTTGGATTCTG-3 ‘(antisense), και οι εκκινητές για

ACTB

ήταν 5′-TGGCACCCAGCACAATGAA -3 ‘(με νόημα) και 5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3’ (antisense). Το μίγμα της αντίδρασης περιείχε 0.1 Μ του κάθε εκκινητή, 2 χ SYBR Green PCR Master Mix (Takara, Berkeley, CA, USA), και 1 μL του cDNA (1:10 αραίωση). Η ενίσχυση εκτελέστηκε υπό τις ακόλουθες συνθήκες: 95 ° C για 30 s, και 40 κύκλους των 95 ° C για 15 s και 60 ° C για 30 s. Κάθε αντίδραση έγινε εις τριπλούν.

Κατασκευή των πλασμιδίων με προαγωγό ρεπόρτερ

Για την κατασκευή του στόχου

mTOR

πλασμίδια υποκινητή-αναφοράς, συνθέσαμε το θραύσμα DNA που περιέχει είτε το rs2295080G αλληλόμορφο ή το T αλληλόμορφου με ενίσχυση του 998-bp (από -617 έως 381 βάση σε σχέση με τη θέση έναρξης της μεταγραφής)

mTOR

περιοχή προαγωγού χρησιμοποιώντας εναρκτήρες με θέσεις περιορισμού. Οι εκκινητές ήταν 5′-ACTTAGAGCTCAAACAGGGATGGGGCTGGGGGAGAGGGA-3 ‘(προς τα εμπρός) και 5′-ACTTAAGATCTCGAAACGTCTTTTGATGCAGTAATTCCT-3’ (αντίστροφο), και περιελάμβαναν τις θέσεις περιορισμού SacI και NheI. Τα προκύπτοντα PCR προϊόντα στη συνέχεια σε πέψη με SacI και NheI και κλωνοποιήθηκε εντός του pGL3-Basic (Promega, Madison, WI, USA) που περιέχει το γονίδιο λουσιφεράσης πυγολαμπίδας ως ρεπόρτερ. Τα κατασκευάσματα όλα επιβεβαιώθηκαν με αλληλούχιση του DNA.

Οι κυτταρικές σειρές

Η νεφρική κυτταρική γραμμή αδενοκαρκινώματος κύτταρο (786-ο), κύτταρα ανθρώπινου εμβρυϊκού νεφρού 293 (ΗΕΚ-293) και κυτταρικές σειρές HeLa ήταν ευγενώς από το Δρ Ζ Zhang (Τμήμα Μοριακής και Γενετικής Τοξικολογίας, της Σχολής Δημόσιας Υγείας, Ιατρικό Πανεπιστήμιο Nanjing, Nanjing, Κίνα) και χρησιμοποιήθηκαν ως έχουν αναφερθεί στο παρελθόν [18], [19].

η επιμόλυνση και προσδιορισμούς αναφοράς λουσιφεράσης

786-o, τα κύτταρα ΗΕΚ-293 και HeLa σπάρθηκαν σε πλάκες καλλιέργειας των 24 φρεατίων. Μετά από 24 ώρες, κάθε φρεάτιο διαμολύνθηκε με 1 μα κάθε

mTOR

σε δημοσιογράφο πλασμίδιο χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Ως εσωτερικό πρότυπο, όλα τα πλασμίδια συνεπιμολύνθηκαν με 8 ng pRL-SV40, το οποίο περιείχε το γονίδιο της λουσιφεράσης της Renilla. Το pGL3-Basic φορέα χωρίς ένθετο χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. Σαράντα οκτώ ώρες μετά επιμολύνσεις, τα κύτταρα λύθηκαν με την παθητική ρυθμιστικού λύσης (Promega) και προσδιορίστηκαν για δραστικότητα λουσιφεράσης χρησιμοποιώντας το Dual-Luciferase Assay System Reporter (Promega). Ανεξάρτητα πειράματα έγιναν εις τριπλούν για κάθε πλασμίδιο κατασκεύασμα.

Στατιστικές αναλύσεις

Οι διαφορές στις κατανομές των δημογραφικών χαρακτηριστικών, επιλεγμένες μεταβλητές, και τις συχνότητες των γονοτύπων μεταξύ ασθενών και μαρτύρων ελέγχθηκαν με t του Student -test (για τις συνεχείς μεταβλητές) ή χ

2-test (για τις κατηγορικές μεταβλητές). SNP συχνότητες αλληλόμορφο στη συμμετέχοντες ελέγχου ελέγχθηκαν κατά την αναχώρηση από την ισορροπία Hardy-Weinberg με καλοσύνη-of-fit χ

2-δοκιμή πριν από την περαιτέρω ανάλυση. Οι συσχετίσεις μεταξύ των πολυμορφισμών και τον κίνδυνο της RCC εκτιμήθηκαν με υπολογισμό αναλογιών πιθανοτήτων (OR) και 95% διαστήματα εμπιστοσύνης (ΠΙ) από την άνευ όρων ανάλυση λογιστικής παλινδρόμησης με την προσαρμογή για πιθανούς συγχυτικούς παράγοντες. Χρησιμοποιήσαμε το ποσοστό εσφαλμένης ανακάλυψη (FDR) με βάση την μέθοδο Benjamini-Hochberg για να ρυθμίσετε το

P

τιμή για πολλαπλές συγκρίσεις. Οι ενώσεις θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές όταν FDR προσαρμοσμένο

P

τιμές ήταν μικρότερη από 0,05. Οι διαφορές στην έκφραση λουσιφεράσης του γονιδίου αναφοράς μεταξύ των διαφόρων κατασκευασμάτων υποκινητή, καθώς επίσης και mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης από νεφρική όγκου ή φυσιολογικούς ιστούς που φέρουν διαφορετικούς γονότυπους εκτιμήθηκαν με t δοκιμασία του Student ή μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA), και

P

& lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. Όλες οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με το λογισμικό SAS 9.1.3 (SAS Institute, Cary, NC, USA) με δύο όψεων

τιμές Ρ.

Αποτελέσματα

Χαρακτηριστικά του RCC ασθενών και μαρτύρων

Οι κατανομές συχνότητας των επιλεγμένων χαρακτηριστικών των 710 περιπτώσεις και 760 μάρτυρες φαίνονται στον πίνακα 1. Δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των υποθέσεων και ελέγχων σε σχέση με την ηλικία, το φύλο, ΒΜΙ και πόσιμο κατάστασης ( όλες τις φωτογραφίες

P

& gt? 0,05). Ωστόσο, υπήρχαν περισσότεροι καπνιστές, ασθενείς υπέρταση και διαβήτη μεταξύ των περιπτώσεων από ό, τι μεταξύ των μαρτύρων (

P

= 0.035, & lt? 0.001 και & lt? 0.001, αντίστοιχα). 710 ασθενείς, 62,8% των ασθενών ήταν σε φάση Ι, ενώ 19,6, 7,3 και 10,3% βρέθηκαν να έχουν σταδίου ΙΙ, ΙΙΙ και IV ασθένειες, αντίστοιχα. Το ποσοστό των πυρηνικών βαθμού από Ι έως IV ήταν 19,2, 48,0, 24,5 και 8,3 αντίστοιχα.

Η

γονότυπος και αλληλόμορφο συχνότητες

ΑΚΤ1

/

ΑΚΤ2

/

PTEN

/

πολυμορφισμούς mTOR

και RCC

κινδύνου

Οι συσχετίσεις μεταξύ αυτών των πολυμορφισμών και RCC κίνδυνο με τον καλύτερο γενετικό μοντέλο παρουσιάζονται στον πίνακα 2 και αναλυτικές κατανομές γονότυπου των πολυμορφισμών είναι που παρουσιάζονται στον πίνακα 3. συχνότητες γονότυπου αυτών των SNPs 8 στους ελέγχους όλα ήταν σύμφωνα με την ισορροπία Hardy-Weinberg. Η πιο σημαντική SNP που συνδέεται με RCC κίνδυνος ήταν rs2295080, το οποίο βρίσκεται στην περιοχή του υποκινητή του

mTOR

. Σε σύγκριση με τα άτομα που φέρουν το γονότυπο rs2295080TT, τα άτομα που μεταφέρουν το TG και TG γονότυπους /GG και οι δύο σχετίζονται με μειωμένο κίνδυνο του RCC (

P

= 0.021, OR = 0,81, 95% CI = 0,68 – 0,97 και

P

= 0.005, OR = 0.74, 95% CI = 0,59 – 0,91, αντίστοιχα). Η συσχέτιση μεταξύ rs2295080 και του κινδύνου RCC παρέμεινε σημαντική μετά την προσαρμογή για πολλαπλές συγκρίσεις (FDR = 0.040). Εκτός από αυτόν τον SNP, η παραλλαγή ομοζυγώτη (CC) του άλλου SNP (rs701848), η οποία βρίσκεται στην περιοχή 3’UTR του

ΡΤΕΝ

ήταν επίσης σημαντικά σχετίζονται με αυξημένο κίνδυνο RCC (

P

= 0.014, OR = 1.45, 95% CI = 1,08 – 1,96). Ωστόσο, η συσχέτιση αυτή παρέμεινε μόνο οριακά σημαντική μετά την προσαρμογή για πολλαπλές συγκρίσεις (FDR = 0,056). Από PTEN ρυθμίζει αρνητικά την mTOR μονοπάτι σηματοδότησης, μπορούμε στη συνέχεια διερευνήθηκε κατά πόσον υπήρχε αλληλεπίδραση μεταξύ των

mTOR

rs2295080 και

PTEN

rs701848 στον επηρεασμό των κινδύνων RCC, ωστόσο, όπως φαίνεται στον Πίνακα 4, χωρίς σημαντική παρατηρήθηκε αλληλεπίδραση (

P

αλληλεπίδρασης = 0,118), αν και τα άτομα με τα δύο γονότυπους κινδύνου (rs2295080 ΤΤ και rs701848 CC) είχαν σημαντικά αυξημένο κίνδυνο RCC 1,72. Καθώς το

mTOR

rs2295080 παράγεται το καλύτερο σήμα συσχέτιση μεταξύ της επιλεγμένης πολυμορφισμό, μπορούμε στη συνέχεια επικεντρώθηκε σε αυτό στα επόμενα λειτουργικά πειράματα.

Η

Η

Η έκφραση του

mTOR

στο RCC και οι συσχετίσεις μεταξύ των

mTOR

rs2295080 και

mTOR

έκφραση

στη συνέχεια διερευνηθεί η έκφραση του

mTOR

στο RCC και οι ενώσεις μεταξύ του πολυμορφισμού rs2295080 και

mTOR

έκφραση σε paratumor νεφρικούς ιστούς με τη χρήση πραγματικού χρόνου ποσοτική RT-PCR. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α, η

mTOR

επίπεδο έκφρασης σε ιστούς όγκων ήταν σημαντικά υψηλότερο από ότι στα γειτονικά φυσιολογικούς ιστούς (

P

= 0,018). Εκτός αυτού, σε σύγκριση με τα άτομα που φέρουν το γονότυπο ΤΤ, τα άτομα που φέρουν το αλληλόμορφο G (TG και GG γονότυπους) είχαν χαμηλότερα επίπεδα

mTOR

έκφραση (

P

= 0,003 και 0,011 για TG

εναντίον

ΤΤ και GG

vs.

TT, αντίστοιχα) (Εικ. 1Β). Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι η υπερέκφραση του

mTOR

μπορεί να συνεισφέρει σε νεφρική καρκινογένεση και ότι rs2295080, που βρίσκεται στο

mTOR

υποκινητή, μπορεί να εμπλέκεται στην νεφρική καρκινογένεση ρυθμίζοντας τις μεταγραφικές επίπεδα δραστηριότητας και έκφραση του

mTOR

.

(Α) Διανομή και σύγκριση των

mTOR

έκφρασης σε καρκινώματα και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών (

P

= 0,018). (Β) σύνδεσης μεταξύ της

mTOR

έκφραση σε νεφρικούς ιστούς και

mTOR

rs2295080 γονότυπους. Η

mTOR

rs2295080 ΤΤ γονότυπος σχετίζεται με σημαντικά υψηλότερη έκφραση του mTOR από το

mTOR

rs2295080 TG (

P

= 0,003) και GG (

P

= 0,011) γονότυπους.

η

Λειτουργικός χαρακτηρισμός του

mTOR

rs2295080

Για να εξεταστεί αν η μεταβολή είναι λειτουργικά σημαντική με την αλλαγή της

mTOR

υποστηρικτής δραστηριότητα, μπορούμε τότε δημιουργούνται κατασκευάσματα γονιδίου αναφοράς που περιέχουν είτε το rs2295080 G ή Τ αλληλόμορφο και επιμολυσμένα ΗΕΚ293, 786-o και HeLa κυτταρικές γραμμές με τα πλασμίδια αναφοράς. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2, το κατασκεύασμα που περιέχει το αλληλόμορφο rs2295080G οδήγησε ένα σημαντικά χαμηλότερο έκφρασης του γονιδίου αναφοράς σε σύγκριση με εκείνη που περιέχει το αλληλόμορφο rs2295080T σε αυτές τις κυτταρικές γραμμές. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το αλληλόμορφο rs2295080G στην περιοχή του υποκινητή είχε μια μειωμένη μεταγραφική δραστηριότητα του

mTOR

.

(Α) Σχηματική αναπαράσταση των πλασμιδίων ανταποκριτή που περιέχει τα

mTOR

rs2295080 Τ ή G αλληλόμορφο, το οποίο εισήχθη ανοδικά του γονιδίου αναφοράς λουσιφεράσης στο pGL3-Basic πλασμίδιο. (Β) Τα 2 κατασκευάσματα επιμολύνθηκαν παροδικά σε ΗΕΚ-293, 786-o και HeLa κύτταρα, αντίστοιχα. Όλα τα κατασκευάσματα συνεπιμολύνθηκαν με pRL-SV40 για να τυποποιηθεί η αποτελεσματικότητα μορφομετατροπής. Οι τιμές είναι μέσοι όροι ± SD από περισσότερες από 3 ξεχωριστά πειράματα που ήταν το καθένα εκτελούνται εις τριπλούν.

Η

Συζήτηση

Στην προκαθορισμένη μελέτη, ερευνήσαμε τις συσχετίσεις μεταξύ 8 δυνητικά λειτουργικών πολυμορφισμών στο mTOR σηματοδότησης γονίδια μονοπάτι που σχετίζονται και ευαισθησία RCC σε ένα κινεζικό πληθυσμό. Η μελέτη μας προτείνει ότι η παραλλαγή rs2295080 στην περιοχή προαγωγού του

mTOR

συσχετίστηκε με μειωμένο κίνδυνο RCC. Τα αποτελέσματα της μελέτης σύνδεσης του rs2295080 επιβεβαιώθηκαν στη συνέχεια από την περαιτέρω λειτουργική ανάλυση της παραλλαγής. Κατ ‘αρχάς, παρατηρήσαμε ότι το

mTOR

επίπεδο mRNA μειώθηκε σε άτομα που έφεραν το αλληλόμορφο rs2295080 G

in vivo

. Στη συνέχεια, στα

in vitro δοκιμασίες

, βρήκαμε ότι το αλληλόμορφο rs2295080 G μείωσε σημαντικά την μεταγραφική δραστικότητα του

mTOR

. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι οι

mTOR

rs2295080 είναι ένα λειτουργικό SNP. Για το καλύτερο της γνώσης μας, αυτή είναι η πρώτη μελέτη για την αξιολόγηση του ρόλου των πολυμορφισμών των γονιδίων mTOR σηματοδότηση μονοπατιού που σχετίζονται με την εμφάνιση του RCC.

Τα ευρήματα αυτά είναι βιολογικά αληθοφανής, ειδικά υπό το φως των κρίσιμων ρόλων του μονοπατιού mTOR σε κυτταρικό θάνατο και την επιβίωση. Πάνω από την ενεργοποίηση του mTOR έχει θεωρηθεί μια σφραγίδα στο RCC, αν και κατά πόσον η ενεργοποίηση πάνω του mTOR προκύπτει από αυξημένη έκφραση της πρωτεΐνης ή πάνω από φωσφορυλίωση της mTOR πρωτεΐνης φαίνεται ασαφής [20], [21]. Με δεδομένο το σημαντικό ρόλο του mTOR, θα περίμενε κανείς ότι ένα υψηλότερο επίπεδο έκφρασης της συνολικής πρωτεΐνης mTOR μπορεί να διευκολύνει την νεφρική καρκινογένεση, η οποία υποστηρίζεται από πολλές μελέτες που διερευνούν την έκφραση του

mTOR

σε κυτταρικές σειρές νεφρού [21] και δείγματα νεφρεκτομή RCC [22]. Στη μελέτη μας, παρατηρήσαμε επίσης ότι το επίπεδο του mRNA της

mTOR

ήταν σημαντικά υψηλότερη σε RCC ιστό από ό, τι στο paratumor νεφρικούς ιστούς, η οποία παρείχε περαιτέρω ενδείξεις για μια αιτιολογικό ρόλο του

mTOR

έκφρασης RCC. Υπερ-έκφραση του

mTOR

έχει επίσης προταθεί ότι είναι μια φτωχή προγνωστικός παράγοντας σε διάφορους ανθρώπινους καρκίνους, συμπεριλαμβανομένων των RCC [22], ο καρκίνος του πνεύμονα [23], του καρκίνου του μαστού [24], του λάρυγγα καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων [25 ] και των χοληφόρων οδών αδενοκαρκίνωμα [26]. Λαμβάνοντας υπόψη το ρόλο του mTOR στη διευκόλυνση της ανάπτυξης και εξέλιξης του καρκίνου, τα μειωμένα επίπεδα mTOR λόγω της παραλλαγής rs2295080 στον υποκινητή μπορεί να μειώσει την ευαισθησία του καρκίνου, η οποία μπορεί να εξηγήσει τα ευρήματα μας στις μελέτες σύνδεσης.

Επιπλέον, η

PTEN

rs701848 πολυμορφισμού ήταν οριακά σχετίζεται με αυξημένο κίνδυνο RCC μετά την προσαρμογή για πολλαπλές συγκρίσεις. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι αυτός ο πολυμορφισμός βρίσκεται στην περιοχή 3 ‘UTR του

ΡΤΕΝ

? Ως εκ τούτου, είναι βιολογικά εύλογο ότι αυτό το SNP μπορεί να μεταβάλει

PTEN

έκφραση επηρεάζοντας τη σταθερότητα του mRNA, και στη συνέχεια να επηρεάσει την ευαισθησία του καρκίνου. Ωστόσο, η υπόθεση λειτουργία αυτού του SNP χρειάζεται ακόμη να διερευνηθεί σε μελλοντικές μελέτες. Δεδομένου ότι η ενεργοποίηση της σηματοδότησης mTOR ρυθμίζεται αρνητικά από

PTEN

, θα ήταν ενδιαφέρον να δούμε αν υπάρχει ένα αποτέλεσμα της αλληλεπίδρασης μεταξύ των

mTOR

rs2295080 και τις

PTEN

rs701848 πολυμορφισμούς. Ωστόσο, δεν βρήκαμε μια σημαντική αλληλεπίδραση μεταξύ αυτών των 2 SNPs, αν και τα άτομα με τους γονότυπους κίνδυνο τόσο των δύο SNPs (rs2295080 ΤΤ και rs701848 CC) είχαν σημαντικά αυξημένο κίνδυνο RCC 1,57.

Μέχρι τώρα , αρκετές πράκτορες μοριακό στόχο, όπως ο αναστολέας της τυροσινικής κινάσης sunitinib, οι VEGFRs αναστολέα pazopanib, και η mTOR αναστολείς temsirolimus και everolimus, έχουν εγκριθεί για τη θεραπεία ασθενών με προχωρημένο RCC. Πιο πρόσφατα, Xu

et al.

Απέδειξε ότι γενετικών πολυμορφισμών στην αγγειογένεση και την έκθεση που σχετίζονται με τα γονίδια θα μπορούσαν να προβλέψουν την ανταπόκριση στη θεραπεία με μονοθεραπεία pazopanib σε ασθενείς με RCC [27]. Εκτός αυτού, υπάρχει επίσης στοιχεία που δείχνουν ότι οι γενετικών πολυμορφισμών σε γονίδια που εμπλέκονται στην φαρμακοκινητική του sunitinib που σχετίζονται με ελεύθερη προόδου επιβίωση (PFS) σε ασθενείς mRCC θεραπεία με sunitinib [28]. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι το

mTOR

rs2295080 πολυμορφισμός έχει προταθεί ότι σχετίζεται με κλινικές εκβάσεις σε ασθενείς καρκίνο του οισοφάγου που έλαβαν θεραπεία με χημειοραδιοθεραπεία [29]. Ωστόσο, εξακολουθεί να υπάρχει έλλειψη μελέτες που διερευνούν τη κληρονομική γενετική μεταβλητότητα στην απόκριση στη θεραπεία των αναστολέων mTOR. Λαμβάνοντας υπόψη το λειτουργικό ρόλο του πολυμορφισμού rs2295080 στη ρύθμιση της έκφρασης του

mTOR

, αυτός ο πολυμορφισμός μπορεί να είναι μια πολλά υποσχόμενη γενετικός δείκτης για τη διερεύνηση ως προς την πρόβλεψη της ανταπόκρισης στη θεραπεία για temsirolimus ή everolimus. Ωστόσο, η έλλειψη διαθέσιμων πληροφοριών σχετικά με αυτές τις θεραπείες φαρμάκων σε ασθενείς με RCC μας περιορίζει τη μελέτη μας για την αντιμετώπιση αυτού του θέματος? ως εκ τούτου, καλούμε την έρευνά της σε άλλες μελέτες που επικεντρώνονται στην αντιμετώπιση των ασθενών RCC.

Εν κατακλείδι, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι το

mTOR

rs2295080 επηρεάζει την ευαισθησία RCC στην κινεζική πληθυσμού μας. Η μελέτη μας υπογραμμίζει επίσης ότι η

mTOR

rs2295080 παραλλαγή μπορεί να επηρεάσουν την ευαισθησία RCC με τη διαμόρφωση του ενδογενούς

mTOR

επίπεδο έκφρασης. Επιπλέον, τα αποτελέσματα της μελέτης μας εγείρει ορισμένα σημαντικά ζητήματα σχετικά, για παράδειγμα, αν η διακριτή επίπεδο έκφρασης του

mTOR

που προκαλείται από τον πολυμορφισμό rs2295080 θα επηρεάσει το επίπεδο φωσφορυλίωσης του mTOR και στη συνέχεια να αλλάξει προς τα κάτω το σήμα του, και κατά πόσον αυτός ο πολυμορφισμός έχει επίδραση στην πρόγνωση RCC και την απόκριση των ασθενών RCC στη θεραπεία με temsirolimus και everolimus. Μελλοντικές μελέτες με περισσότερα ένα ολοκληρωμένο σχεδιασμό και επιπλέον διαθέσιμες πληροφορίες σχετικά με αυτές τις φαρμακευτικές αγωγές μπορούν να βοηθήσουν στην αντιμετώπιση αυτών των ζητημάτων.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Πίνακα S1.

Οι αλληλουχίες των εκκινητών και ανιχνευτών που χρησιμοποιούνται στην παρούσα μελέτη.

doi: 10.1371 /journal.pone.0050302.s001

(DOC)