Αφηρημένο

Ειδικές AT-πλούσια αλληλουχία δέσμευσης της πρωτεΐνης-1 (SATB1) έχει αναγνωριστεί ως διοργανωτής γονιδίωμα που επαναπρογραμματίζει την οργάνωση της χρωματίνης και μεταγραφή προφίλ. SATB1 προάγει την ανάπτυξη του όγκου και τη μετάσταση σε καρκίνο μαστού και συνδέεται με κακή πρόγνωση σε αρκετούς τύπους καρκίνου. Η συσχέτιση μεταξύ SATB1 και του παχέος εντέρου (CRC) δεν έχει μελετηθεί εντατικά. Επομένως, αυτή η μελέτη είχε ως σκοπό να διερευνηθεί η επίδραση της SATB1 στην ανάπτυξη CRC και μετάσταση in vitro και in vivo και συσχέτιση με τη συνολική επιβίωση και κλινικοπαθολογικών παραγόντων σε ασθενείς CRC. είχαν καθιερώσει σταθερές νοκ ντάουν SATB1 και SATB1 υπερεκφράζουν κυτταρικές σειρές. SATB1 knockdown μειωμένη ανάπτυξη των κυττάρων, σχηματισμό αποικιών, τη μετανάστευση, και η εισβολή και η αυξημένη απόπτωση σε κύτταρα CRC in vitro (ρ & lt? 0,05), ενώ η υπερέκφραση SATB1 είχε το αντίθετο αποτέλεσμα. SATB1 υπερέκφραση αυξημένη ανάπτυξη όγκου και μετάσταση στον πνεύμονα και το ήπαρ in vivo με τη χρήση ζωικών μοντέλων ξενομοσχεύματος (ρ & lt? 0,05). Έτσι, SATB1 προώθησε μια επιθετική φαινότυπο CRC in vitro και in vivo. Ανοσοϊστοχημική ανάλυση των 560 δειγμάτων CRC έδειξαν ότι η έκφραση SATB1 ήταν σημαντικά υψηλότερη σε ιστούς CRC σε σχέση με συμφωνημένα βλεννογόνο μη-όγκου (ρ & lt? 0.001). Επιπλέον, η έκφραση SATB1 ήταν σημαντικά υψηλότερη στους ασθενείς με χαμηλής διαφοροποίησης όγκους, υψηλότερη βάθος εισβολή, μακρινή μετάσταση, και προχωρημένο στάδιο ΤΝΜ. SATB1-θετικούς ασθενείς είχαν χειρότερη πρόγνωση από SATB1-αρνητικούς ασθενείς, και SATB1 ταυτοποιήθηκε ως ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας για CRC (p = 0,009). Εντυπωσιακά, αξιολογήσαμε επίσης την έκφραση SATB2 σε CRC και διαπίστωσε ότι SATB2 ήταν πιο άφθονα εκφράζεται σε μη-καρκινικές βλεννογόνο σε σύγκριση με ορθοκολικό καρκίνο ιστούς (ρ & lt? 0.001). Ωστόσο, η έκφραση SATB2 δεν είχε καμία επίδραση στην πρόγνωση των ασθενών CRC (p = 0.836). έκφραση SATB1 ήταν σημαντικά σχετίζεται με μικρότερο χρόνο επιβίωσης είτε SATB2-θετικούς ασθενείς ή σε SATB2-αρνητικούς ασθενείς (p & lt? 0.001). Εν κατακλείδι, τα ευρήματά μας έδειξε ένα σημαντικό ρόλο για την SATB1 στο CRC ογκογένεση και τη μετάσταση. Ως εκ τούτου, SATB1 μπορεί να αντιπροσωπεύει ένα σημαντικό προγνωστικό βιοδείκτη και θεραπευτικός στόχος για CRC

Παράθεση:. Zhang Υ, Tian X, Ji Η, Guan Χ, Xu W, Dong Β, et al. (2014) Έκφραση του SATB1 προωθεί την ανάπτυξη και μετάσταση του καρκίνου του παχέος εντέρου. PLoS ONE 9 (6): e100413. doi: 10.1371 /journal.pone.0100413

Επιμέλεια: Masaru Katoh, Εθνικό Κέντρο Καρκίνου, Ιαπωνία

Ελήφθη: 15 Σεπτέμβρη, 2013? Αποδεκτές: 28 του Μάη 2014? Δημοσιεύθηκε: 27 Ιουνίου 2014

Copyright: © 2014 Zhang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από τη χρηματοδότηση Εθνικό Φυσικών Επιστημών (No: 81272765), Capital Χαρακτηριστική Κλινική Εφαρμογή Έρευνας (No: Z121107001012083), το Έργο Κλειδί της Capital Fund Ιατρική Ανάπτυξης (No: 2009 – 2095), το Πεκίνο Ίδρυμα Δημοτική Φυσικών Επιστημών (No: 7122030) , εκκαθάριση ταλέντα Σχέδιο επιδότησης του Πεκίνου (215 Προγράμματος, No: 18.02.2009), Ειδικό Πρόγραμμα του Πεκίνου «Δεκάδες, εκατοντάδες και χιλιάδες« χρηματοδότηση Υγείας Talentsand από το Πεκίνο Αντικαρκινικού Νοσοκομείου (αριθ: 10-04). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο ορθοκολικός καρκίνος (CRC) είναι η τρίτη κύρια αιτία του καρκίνου που σχετίζεται θανάτου στις Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής [1] και ο δεύτερος συχνότερος καρκίνος στην Κίνα [2]. Περίπου το 15-25% των ασθενών με CRC βιώνουν σύγχρονη ηπατικές μεταστάσεις, και 80-90% αυτών των ασθενών έχουν ανεγχείρητο μεταστατική νόσο του ήπατος [3]. Μεταστατικό ηπατική νόσο είναι η κύρια αιτία θανάτου σε ασθενείς με CRC [4]. Ως εκ τούτου, υπάρχει επείγουσα ανάγκη να εντοπιστούν ευαίσθητες και ειδικές μοριακών δεικτών για την πρόβλεψη CRC μετάσταση. Περαιτέρω κατανόηση των υποκείμενων μηχανισμών του CRC μετάστασης είναι ουσιαστική για την ταυτοποίηση των βιολογικών δεικτών για τη μεταστατική εξέλιξη στον CRC.

Ειδικά πλούσια σε ΑΤ αλληλουχία δέσμευσης πρωτεΐνης-1 (SATB1) είναι ένας ιστο-ειδική πυρηνική πρωτεΐνη η οποία είναι εκφράζεται κυρίως σε θυμοκύτταρα [5] και αρχικά αναγνωρίστηκε για τον κρίσιμο ρόλο του στη σωστή ανάπτυξη των Τ-κυττάρων [6] – [8]. SATB1 δεσμεύει ειδικά πλούσια σε ΑΤ θέσεις άγκυρα οριοθετήσει ετεροχρωματίνη για να σχηματίσουν ένα «κλουβί-όπως το» λειτουργικό πυρηνικό αρχιτεκτονική που χρησιμεύει ως πλατφόρμα για προσγείωση παράγοντες χρωματίνη αναδιαμόρφωση. Επομένως, το δίκτυο SATB1 μπορεί να ρυθμίζει τη γονιδιακή έκφραση με μεταβολή της λειτουργικής οργάνωσης αλληλουχίας DNA [9], [10]. SATB1 έχει πρόσφατα αναφερθεί ότι είναι ένας διοργανωτής γονιδίωμα. έκφραση SATB1 μεταβληθεί σημαντικά την έκφραση του πάνω από 1000 γονίδια του καρκίνου του μαστού, συμπεριλαμβανομένων των γονιδίων που σχετίζονται με τη μετάσταση και ογκοκατασταλτικά γονίδια για την προώθηση της ανάπτυξης και της μετάστασης του καρκίνου του μαστού [11]. Επιπλέον, πολυπαραγοντική ανάλυση επιβίωσης έδειξε ότι SATB1 ήταν ένα ανεξάρτητο προγνωστικό παράγοντα για τον καρκίνο του μαστού [11]. SATB1 υπερέκφραση έχει επίσης συσχετιστεί με φτωχή πρόγνωση σε λαρυγγική καρκινώματος πλακωδών κυττάρων [12], γαστρικού καρκίνου [13], [14], και κακοήθη δερματικό μελάνωμα [15]. Η συσχέτιση μεταξύ SATB1 και του παχέος εντέρου (CRC) παραμένει ασαφής

Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε τη συμμετοχή των SATB1 σε ανάπτυξη και μετάσταση CRC με βάση τα ακόλουθα στοιχεία:. (Α) SATB1 υπερέκφραση ανιχνεύθηκε τόσο CRC κυτταρικές σειρές και όγκους CRC, (β) τα ποσοστά σχηματισμού της ανάπτυξης και της αποικίας κάτω ρυθμίζονται SATB1-νοκ ντάουν κύτταρα, αλλά μέχρι ρυθμίζονται SATB1-κύτταρα που υπερεκφράζουν, (γ) τη μετανάστευση και την εισβολή των δυνατοτήτων ήταν πολύ φτωχότερη σε SATB1-νοκ ντάουν κύτταρα, ενώ πιο επιθετική σε SATB1-κύτταρα που υπερεκφράζουν, (δ) SATB1 υπερέκφραση προωθείται καρκινογένεση και μετάσταση in vivo με τη χρήση ζωικών μοντέλων, (ε) η έκφραση της SATB1 πρωτεΐνης ήταν πιο άφθονο σε ιστούς CRC σε σχέση με συμφωνημένα μη καρκινικούς ιστούς, και (στ) έκφραση SATB1 βρέθηκε να είναι ένας ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας για τους ασθενείς CRC.

Υλικά και Μέθοδοι

Lines

2.1 κυττάρων και κυττάρων Πολιτισμού

SW480, SW620, ΗΤ-29, HCT116, RKO και κυτταρικές σειρές LoVo CRC αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC) και κινεζικής Ακαδημίας Ιατρικών Επιστημών & amp? Peking Ένωση Medical College, και όλες οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν σε μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco (ϋΜΕΜ? GibcoBRL, Life Technologies, Grand Island, ΝΥ, USA) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS), στρεπτομυκίνη (100 μg /ml) , και πενικιλλίνη (100 μg /ml). Όλες οι κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C υπό 5% CO

2.

2.2 Ίδρυση Σταθερό SATB1-νοκ ντάουν κυττάρων Lines

Τρεις σύντομες-φουρκέτα RNA (shRNA) ακολουθίες σχεδιάστηκαν με βάση την αλληλουχία SATB1 (NM_002971) που προσδιορίζονται από shRNA Target Finder (Ambion? Life Technologies, Carlsbad, California): shRNA1 (2566), 5′-GTCCACCTTGTCTTCTCTC-3 ‘? shRNA2 (2364), 5’-AAGGACAATTCCGGTTTAGAG-3 ‘? και shRNA3 (2797), 5’-AAAGTGTGTACCCCGTAAGCA-3 ‘. Οι oligoduplexes κλωνοποιήθηκαν εντός του φορέα pSilencer3.1 (Ambion? Ϋίβ Technologies, Carlsbad, California). Τα προκύπτοντα κατασκευάσματα επιμολύνθηκαν σε κύτταρα LoVo ή RKO κύτταρα χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, California) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Κύτταρα επιμολυσμένα με άδειο φορέα (pSilencer3.1) χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες. Σταθερά επιμολυσμένα shRNA επιλέχθηκαν με καλλιέργεια με 600 μg /mL του G418 (GibcoBRL) για 3 εβδομάδες. RT-PCR, Western Blot, και χρώση ανοσοφθορισμού χρησιμοποιήθηκαν για να επιβεβαιώσετε τη ρύθμιση προς τα κάτω της έκφρασης SATB1.

2.3 Ίδρυση Σταθερό SATB1 υπερεκφράζουν κυτταρικές γραμμές

πλήρους μήκους ανθρώπινο SATB1 cDNA κλωνοποιήθηκε εντός του φορέα έκφρασης pcDNA3.1 (Ambion? ϋίβ Technologies, Carlsbad, California). SW480 κύτταρα επιμολύνθηκαν με SATB1-pcDNA3.1 ή κενό φορέα (pcDNA3.1) ως έλεγχο. Οι επιμολύνσεις με σταθερή υπερέκφραση SATB1 επιλέχθηκαν με καλλιέργεια με 600 μg /mL του G418 για 3 εβδομάδες. RT-PCR, western blot, και χρώση ανοσοφθορισμού χρησιμοποιήθηκαν για να επιβεβαιώσουν την επάνω ρύθμιση της έκφρασης SATB1.

2.4 Ασθενείς και δείγματα

CRC ιστούς όγκων ελήφθησαν από 560 ασθενείς οι οποίοι είχαν διάγνωση και θεραπεία στο Τμήμα Χειρουργικής, Πανεπιστήμιο του Πεκίνου Σχολή Ογκολογίας μεταξύ 2005 και 2008. Κανένας από τους ασθενείς έλαβαν θεραπεία με χημειοθεραπεία ή ακτινοβολία πριν από τη χειρουργική επέμβαση. Πεντακόσια και σαράντα δύο από αυτούς τους ασθενείς παρακολουθήθηκαν μετεγχειρητικά, για μία περίοδο τουλάχιστον 3 χρόνια. Και αναλυτικές κλινικοπαθολογοανατομικές πληροφορίες ελήφθησαν από 520 ασθενείς. Φρέσκα ορθοκολικού όγκου και συμφωνημένα δείγματα φυσιολογικού βλεννογόνου του παχέος ελήφθησαν από 21 ασθενείς. Τα δείγματα καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C μέχρι την ανάλυση. Ιστοπαθολογικές αναλύσεις έγιναν ανεξάρτητα από δύο παθολόγους. Για τη χρήση των κλινικών υλικών για ερευνητικούς σκοπούς, την έγκριση από τις Περιφερειακές Επιτροπές Ηθικής, του Πεκίνου Αντικαρκινικό Νοσοκομείο, Κίνα ελήφθη. Γραπτές ενημέρωσε συναινέσεις έχουν ληφθεί από όλους τους συμμετέχοντες. Η κλινική έρευνα διεξήχθη σύμφωνα με τις αρχές που διατυπώνονται στη Διακήρυξη του Ελσίνκι.

2.5 Εκχύλιση του ολικού RNA και αντίστροφη μεταγραφή-πολυμεράσης

Αλυσιδωτή Αντίδραση

έκφραση SATB1 mRNA προσδιορίστηκε με αντίστροφη μεταγραφή-πολυμεράσης αλυσιδωτή αντίδραση (RT-PCR). Ολικό RNA εξήχθη χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, California) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. cDNA συντέθηκε από το εξαγόμενο RNA (4 μg) χρησιμοποιώντας το κιτ EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix (Invitrogen). PCR ενίσχυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τα ακόλουθα ειδικά για το γονίδιο εκκινητές SATB1 και βήτα-ακτίνη: SATB1, 5′-AGAGGAAGGCTTGGGAGTA-3 ‘(νοηματικό) και 5′-GGGCAGCAGAGCTATGTG-3′ (antisense)? και β-ακτίνη, 5’-TTAGTTGCGTTACACCCTTTC-3 ‘(νοηματικό) και 5′-ACCTTCACCGTTCCAGTTT-3’ (antisense). Βήτα-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε για να ομαλοποιήσει την έκφραση του γονιδίου SATB1. Είκοσι οκτώ κύκλοι PCR εκτελέστηκαν στην οποία κάθε κύκλος αποτελούνταν από προ-μετουσίωση στους 94 ° C για 3 λεπτά, μετουσίωση στους 94 ° C για 45 s, ανόπτηση στους 55 ° C για 45 s και επέκταση στους 72 ° C για 45 s , και μετά τις 28 κύκλων είναι μία τελική επιμήκυνση στους 72 ° C για 10 λεπτά. PCR προϊόντα διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση πηκτής επί πηκτής αγαρόζης 2% που βάφτηκε με βρωμιούχο αιθίδιο. ένταση Band μετρήθηκε απευθείας σε ένα Άλφα Imager 2200 σύστημα ανάλυσης (Άλφα Innotech, San Leandro, CA, USA).

2.6 Ανάλυση Western Blot

Κύτταρα και ιστοί φρέσκο ​​λύθηκαν σε 1 × νατρίου δωδεκυλοθειικό (SDS) ρυθμιστικού διαλύματος λύσης. Ίσες ποσότητες ολικής πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE, ηλεκτρομεταφέρθηκαν πάνω σε μεμβράνες διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (Pall Corporation, Πόλη του Μεξικού, Μεξικό), και επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C με ένα SATB1 πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού (1:500 αραίωσης, PRS4631? Sigma- Aldrich, St. Louis, ΜΟ, USA). Βήτα-ακτίνη (1:10000, Sigma-Aldrich) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Οι ζώνες πρωτεΐνης αξιολογήθηκαν με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA).

2.7 ανοσοφθορισμού χρώσης και σάρωσης λέιζερ συνεστιακό μικροσκόπιο

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε γυάλινες καλυπτρίδες, μονιμοποιήθηκαν με 4 % παραφορμαλδεΰδη, κατέστησαν διαπερατά χρησιμοποιώντας 0.1% Triton Χ-100, πλύθηκαν και δεσμεύτηκαν με 5% αλβουμίνη βόειου ορού. Τα κύτταρα επωάστηκαν με πρωτογενές αντίσωμα SATB1 (1:100, PRS4631, Sigma-Aldrich) που ακολουθείται από επώαση με ένα δευτερεύον αντίσωμα συζευγμένο με ροδαμίνη (1:50? Zhongshan Χρυσή Γέφυρα Biotechnology, Beijing, Κίνα). Οι καλυπτρίδες τοποθετήθηκαν με μέσο στερέωσης vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) που περιέχει διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (ϋΑΡΙ) πυρηνική χρώση και εξετάστηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού, τότε οι εικόνες κατασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας ένα λογισμικό (LAS AF 2.2.1 έκδοση , TCSSP5, Leica, Germany).

Growth

2.8 κυττάρων

η κυτταρική ανάπτυξη εκτιμήθηκε με 3- (4,5-methylthiozol-2-υλ) -2,5-διφαινυλτετραζόλιο βρωμίδιο (ΜΤΤ). Τα κύτταρα (3 χ 10

3 κύτταρα /φρεάτιο) σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων και καλλιεργήθηκαν για 24, 48, 72, και 96 ώρες. ΜΤΤ (10 μΙ) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο, και τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για επιπλέον 4 ώρες. Το μέσο καλλιέργειας απομακρύνθηκε και 200 ​​μλ DMSO (Amresco Inc., Solon, ΟΗ, USA) προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο. Η απορρόφηση στα 570 nm μετρήθηκε με αναγνώστη μικροπλάκας (iMark, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). καμπύλες ανάπτυξης των κυττάρων με τη γραφική αναπαράσταση της απορρόφησης (σβήνει με DMSO) έναντι του χρόνου.

2.9 κενά κύτταρα ελέγχου φορέα απόπτωση και ροής Ανάλυση Κυτταρομετρίας

Σταθερό SATB1 υπερεκφράζει, SATB1-knockdown, και (1 × 10

6 κύτταρα) καλλιεργήθηκαν σε πιάτα 60-mm για 48 ώρες και συλλέχθηκαν. Τα κύτταρα σημάνθηκαν με ιωδιούχο προπίδιο και Αηηβχίην. Οι αρνητικοί έλεγχοι αποτελούνταν από μη επισημασμένα κύτταρα και κατάλληλους ελέγχους ισοτύπου. Τουλάχιστον 10.000 συμβάντα από κάθε δείγμα συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής. (FACSAria? BD Biosciences, San Jose, CA, USA)

Κύκλος

2.10 τηλέφωνα Ανάλυση με κυτταρομετρία ροής

Σταθερό SATB1 υπερεκφράζει, SATB1-knockdown, και κενά κύτταρα ελέγχου φορέα καλλιεργήθηκαν σε πιάτα 60-mm και στερήθηκαν ορού για 24 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% FBS για 48 ώρες. Βιώσιμα κύτταρα συλλέχθηκαν, μονιμοποιήθηκαν σε 70% αιθανόλη και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής.

2.11 αποικίας μαλακού άγαρ Σχηματισμός

Σταθερή SATB1-υπερεκφράζουν, SATB1-νοκ ντάουν, και τα κενά κελιά φορέα ελέγχου (3 × 10

3) επαναιωρήθηκαν σε ϋΜΕΜ που περιείχε 3 mL 0.4% αγαρόζη, 20% FBS, 0,5 mM πυροσταφυλικό νάτριο, 10 m MHEPES, και 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη και επιστρώθηκε στην κορυφή του 4 mL 0,8% αγαρόζης σε DMEM επί πιάτα 60 mm. Μετά από 3 εβδομάδες, οι αποικίες μετρήθηκαν και φωτογραφήθηκαν.

2.12 Επούλωση Δοκιμασία

Σταθερή SATB1 υπερέκφραση, SATB1-νοκ ντάουν, και τα κενά κύτταρα ελέγχου φορέα καλλιεργήθηκαν σε πιάτα των 60 mm, μέχρι το κελί πυκνότητα έφτασε το 90% συρροή. Μια οριζόντια πληγή δημιουργήθηκε χρησιμοποιώντας ένα αποστειρωμένο μικροσκοπική αιχμή 10 μλ. Τα κύτταρα πλύθηκαν με ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο (PBS) για την απομάκρυνση των κυτταρικών υπολειμμάτων. επιλέχθηκαν τρεις διαφορετικές περιοχές σε κάθε πιάτο για να συγκρίνουν την απόσταση κύτταρα που μεταναστεύουν από την προέλευση της πληγής. Εικόνες συνελήφθησαν σε 0 και 24 ώρες για να αξιολογήσει το κλείσιμο των πληγών.

2.13 Transwell τη Μετανάστευση και την εισβολή Αναλύσεις

Σταθερή SATB1-υπερεκφράζουν, SATB1-νοκ ντάουν, και τα κενά κελιά φορέα ελέγχου (1 × 10

5) εναιωρήθηκαν σε 200 μλ μέσου χωρίς ορό και σπείρονται εντός του άνω θαλάμου ενός ενθέτου transwell με ένα 8-μm μεμβράνη μεγέθους πόρων (Corning Costar Corp, Cambridge, ΜΑ, USA). ΫΜΕΜ που περιέχει 10% FBS τοποθετήθηκε στον κάτω θάλαμο ως χημειοελκτικό. Μετά από επώαση για 24 ώρες, κύτταρα που δεν μετανάστευσαν στον άνω θάλαμο του ενθέτου transwell απομακρύνθηκαν με μια μπατονέτα, και τα κύτταρα τα οποία μετανάστευσαν στην κάτω πλευρά της μεμβράνης του φίλτρου μονιμοποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με 0.1% κρυσταλλικό ιώδες. Ο αριθμός των κυττάρων που μετανάστευσαν μετρήθηκε σε 5 τυχαία επιλεγμένα μικροσκοπικά πεδία και φωτογραφήθηκαν. Το πρωτόκολλο που χρησιμοποιείται για την δοκιμασία εισβολής ήταν η ίδια με αυτή που χρησιμοποιήθηκε για τη δοκιμασία της μετανάστευσης, εκτός από το ότι το ένθετο transwell επικαλύφθηκε με Matrigel (BD Biosciences, Heidelberg, Germany).

2,14 In Vivo Carcinogenesis

Σταθερό SATB1 υπερεκφράζουν και κενά κύτταρα ελέγχου φορέα (2 × 10

6) σε ισορροπημένο αλατούχο διάλυμα 100 μL του Hank (HBSS? GibcoBRL, Life Technologies) εγχύθηκαν σε 5 γυναίκες 4-εβδομάδων BALB /c αθυμικά ποντίκια . SATB1 υπερεκφράζουν και κενά κύτταρα ελέγχου φορέα εγχύθηκαν υποδορίως στην αριστερή και τη δεξιά πλευρά της ράχης του κάθε ποντικού, αντίστοιχα. Οι όγκοι των όγκων μετρήθηκαν δύο φορές την εβδομάδα, και οι ποντικοί θυσιάστηκαν μετά από 4 εβδομάδες. Οι όγκοι αποκόπηκαν, μετρήθηκαν, και ζυγίζεται. Οι όγκοι μονιμοποιήθηκαν σε 10% φορμαλίνη για ιστοπαθολογική ανάλυση ή αποθηκεύονται στους -80 ° C για RT-PCR και κηλίδος western. Όλα τα πειράματα σε ζώα έγινε σύμφωνα με τις σχετικές εθνικές και διεθνείς κατευθυντήριες οδηγίες. Το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας των πειραμάτων σε ζώα από το Πανεπιστήμιο του Πεκίνου Σχολή Ογκολογίας (Αριθμός Άδειας: 2012-07). Όλες οι χειρουργικές επεμβάσεις έγινε υπό αναισθησία πεντοβαρβιτάλης νατρίου, και όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία.

2.15 Ξενομοσχεύματος ζωικό μοντέλο πνεύμονα και μετάσταση στο ήπαρ

Εμείς καθοριστεί η επίδραση της έκφρασης SATB1 για CRC μετάσταση σε ξενομοσχεύματος μοντέλα ποντικών του πνεύμονα και μετάστασης ήπατος. Στο μοντέλο μετάστασης ήπατος, εναιωρήματα μονού κυττάρου των σταθερών SATB1 υπερεκφράζουν και κενά κύτταρα ελέγχου φορέα (2 × 10

6) σε 100 μL HBSS βραδέως εγχέεται στο σπλήνα ποντικών BALB /c αθυμικά υπό αναισθησία. Στο μοντέλο μετάστασης πνεύμονα, μονοκύτταρους εναιωρήματα SATB1 υπερεκφράζουν και κενά κύτταρα ελέγχου φορέα (2 × 10

6) σε 100 μL HBSS ενέθηκαν μέσα στην πλαγία ουραία φλέβα. Πέντε ποντικοί συμπεριελήφθησαν σε κάθε ομάδα θεραπείας. Οι ποντικοί θυσιάστηκαν 8 εβδομάδες μετά την ένεση, και οι σπλήνες, συκώτια, και οι πνεύμονες αποκόπηκαν χειρουργικά. Ο αριθμός και το μέγεθος των μεταστατικών εστιών στο ήπαρ και πνεύμονα τεκμηριώθηκαν. Δείγματα σταθεροποιήθηκαν σε 10% φορμαλίνη ή αποθηκεύονται στους -80 ° C για μελλοντική ανάλυση.

2.16 ανοσοϊστοχημική ανάλυση των μικροσυστοιχιών Tissue

φορμαλίνη σταθερό, εγκλεισμένα σε παραφίνη ορθοκολικό όγκου και παρακείμενο φυσιολογικό ορθοκολικό βλεννογόνου δείγματα κατασκευάστηκαν σε ιστικές μικροσυστοιχίες (TMAs). τμήματα συγκροτημάτων ΤΜΑ (4 μm) αποπαραφινοποιήθηκαν και επανυδατώθηκαν σε διαβαθμισμένη αλκοόλη. Το αντιγόνο ανάκτηση πραγματοποιήθηκε σε φούρνο μικροκυμάτων με ρυθμιστικό EDTA. Τα κύτταρα επωάστηκαν σε υπεροξείδιο του υδρογόνου 3% επί 15 λεπτά για να εμποδίσει την ενδογενή δραστηριότητα υπεροξειδάσης και στη συνέχεια σε 5% άπαχο γάλα για την πρόληψη της μη ειδικής σύνδεσης. τμήματα συγκροτημάτων TMA επωάστηκαν όλη τη νύχτα στους 4 ° C με ένα ειδικό μονοκλωνικό αντίσωμα κουνελιού SATB1 (1:50, ab92307? Abcam, Cambridge, CA, USA) ή ένα μονοκλωνικό αντίσωμα κουνελιού έναντι SATB2 (1:200, TA307098? ΟηΟεηε Technologies, Inc .). Για τους αρνητικούς μάρτυρες, πρωτογενή αντισώματα αντικαταστάθηκαν με PBS. Όλα τα τμήματα εξετάστηκαν μικροσκοπικά και βαθμολογήθηκε από δύο ανεξάρτητους παθολογοανατόμους που δεν γνώριζαν την κλινικών πληροφοριών των θεμάτων. Αντίθετα με τα συνηθισμένα τμήματα, SATB1 ή SATB2 ανοσοϊστοχημική χρώση για τα τσιπ μικροσυστοιχιών ιστού ήταν σχεδόν το 100% των πυρηνικών βαμμένα ή μη βαμμένα για τον ιστό του όγκου ή της κανονικής του παχέος βλεννογόνο, έτσι ώστε κατά την αξιολόγηση της χρώσης τους, λάβαμε υπόψη ένταση χρώσης μόνο θετικά χρωματισμένων πυρήνας. Πυρηνική ένταση ήταν συμβολίζεται ως αρνητική, ασθενώς θετικό, μέτρια θετικό ή ισχυρά θετικό. Και κατά τη διενέργεια στατιστικής ανάλυσης, συνδυάσαμε τους ασθενείς του ασθενώς θετικό, μέτρια θετικό και έντονα θετική χρώση ως μία ομάδα θετικής χρώσης.

2.17 Στατιστική Ανάλυση

SPSS 16.0 (SPSS Inc. , Chicago, IL, USA) χρησιμοποιήθηκε για την εκτέλεση των στατιστικές αναλύσεις. Όλα τα in vitro πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και επαναλήφθηκαν 3 φορές. Αταίριαστα 2-tailed

t

δοκιμές χρησιμοποιήθηκαν για τις συγκρίσεις του ομίλου μετά από επαλήθευση της ομαλότητας και της ομοιογένειας της διακύμανσης. Τα δεδομένα στις εικόνες και το κείμενο που παρουσιάζεται ως το μέσο ± τυπική απόκλιση. Δύο δοκιμαστικό chi-τετράγωνο (χ

2) ή την ακριβή δοκιμασία του Fisher χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογηθεί η σχέση μεταξύ της έκφρασης SATB1 και κλινικοπαθολογοανατομικές παράγοντες ή έκφραση SATB2. ανάλυση επιβίωσης Kaplan-Meier χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογήσει την πρόγνωση των ασθενών, και οι τιμές ρ υπολογίστηκαν με τεστ log rank. Η πολυπαραγοντική ανάλυση με μοντέλο Cox παλινδρόμησης αναλογικών κινδύνων χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η επίδραση της έκφρασης SATB1 και κλινικοπαθολογικών παραγόντων στην επιβίωση των ασθενών. Μία τιμή ρ & lt? 0,05 θεωρήθηκε σημαντική

Αποτελέσματα

3.1 Έκφραση του SATB1 στο CRC Γραμμές κυττάρων

Η έκφραση mRNA και πρωτεΐνης SATB1 σε 6 ανθρώπινο κύτταρο CRC. γραμμές, SW480, SW620, ΗΤ-29, HCT116, RKO, και LoVo φαίνονται στο Σχ. 1Α. SATB1 mRNA και η έκφραση πρωτεΐνης δεν ανιχνεύθηκαν σε SW480, SW620, ΗΤ-29, και τα κύτταρα HCT116. SATB1 mRNA ανιχνεύθηκε στα ιδιαίτερα μεταστατικές κυτταρικές γραμμές RKO και LoVo. Επιπλέον, SATB1 πρωτεΐνη εντόνως εκφρασμένο σε κύτταρα RKO και LoVo. Έτσι κυτταρικές σειρές LoVo και RKO επιλέχθηκαν για μια σειρά πειραμάτων knockdown SATB1, και κυτταρικές σειρές SW480 για τα πειράματα υπερέκφραση SATB1.

(Α) SATB1 mRNA και πρωτεΐνης εκφράσεις προσδιορίστηκαν σε 6 κυτταρικές σειρές CRC (Α) , SW480, SW620, ΗΤ-29, HCT116, RKO, και LoVo? (Β) εκπρόσωπο του παχέος όγκους και συμφωνημένα φυσιολογικό βλεννογόνο? (C) μέτρια και φτωχά διαφοροποιημένα καρκινώματα και φυσιολογικό βλεννογόνο? και (Δ) εκπρόσωπο των όγκων του παχέος εντέρου και συμφωνημένα σύγχρονη ηπατικών όγκων μετάσταση εστίες. SATB1 mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν με RT-PCR και κηλίδος western, αντίστοιχα, και ομαλοποιήθηκε ως προς β-ακτίνης. Τ, του παχέος όγκους? Ν, σε συνδυασμό φυσιολογικό βλεννογόνο? Μ, σύγχρονη ηπατικών όγκων μετάσταση εστίες.

Η

3.2 Έκφραση του SATB1 στην Πρωτοβάθμια CRC και ηπατική μετάσταση Εστίες

Το επίπεδο έκφρασης του SATB1 mRNA και πρωτεΐνης προσδιορίστηκε σε πρωτοπαθή όγκο CRC και συμφωνημένα δείγματα βλεννογόνου μη-όγκου. Μεταξύ των 21 συμφωνημένα περιπτώσεις, SATB1 mRNA και της πρωτεΐνης ανιχνεύθηκαν σε 17 δείγματα όγκου αλλά όχι σε οποιαδήποτε από τα δείγματα βλεννογόνου μη-όγκου (Σχ. 1Β). Επιπλέον, SATB1 mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης ήταν υψηλότερα στα φτωχά δείγματα διαφοροποιημένο όγκου παρά σε μετρίως διαφοροποιημένα δείγματα όγκου (Σχ. 1 C). SATB1 mRNA και η έκφραση της πρωτεΐνης στην πρωτοβάθμια CRC ήταν παρόμοια με εκείνη σε συμφωνημένα σύγχρονη ηπατική μετάσταση εστίες (Εικ. 1D).

3.3 Καταστολή της SATB1 Έκφραση Μειώνει κυτταρικού πολλαπλασιασμού, Colony Σχηματισμός, μετανάστευση, και εισβολή στην Vitro

Για να αξιολογηθεί ο ρόλος του SATB1 στην εξέλιξη CRC, τρεις σταθερές SATB1-νοκ ντάουν κυτταρικές σειρές LoVo καθιερώθηκαν με χρήση shRNA. SATB1-shRNA1, SATB1-shRNA2, και SATB1-shRNA3 κυτταρικές γραμμές ήταν αποτελεσματικά στην προς τα κάτω ρύθμιση SATB1 mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης (Εικ. 2Α). Πρωτεΐνη έκφραση SATB1 ήταν μόλις ανιχνεύσιμη σε κύτταρα SATB1-shRNA1 και SATB1-shRNA2. έκφραση SATB1 mRNA μειώθηκε κατά σχεδόν 90% σε κύτταρα SATB1-shRNA1, και κατά 70% και 60% σε κύτταρα SATB1-shRNA2 και SATB1-shRNA3, αντίστοιχα (Εικ. 2Α). Ο ρυθμός αύξησης των όλες τις κυτταρικές σειρές SATB1-shRNA ήταν βραδύτερη από εκείνη των κενών κυττάρων ελέγχου φορέα (ρ & lt? 0,05, Σχήμα 2Β.). Όπως φαίνεται στο Σχ. 2C, κύτταρα SATB1-shRNA1 είχαν σημαντικά υψηλότερο ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων από τα κύτταρα ελέγχου (45,1% V.S. 20,3%, ρ & lt? 0,01). Ωστόσο, το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων δεν ήταν σημαντικά διαφορετική μεταξύ του SATB1-shRNA2, SATB1-shRNA3, και κύτταρα ελέγχου (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). SATB1 knockdown επαγόμενη G1-φάση διακοπή του κυτταρικού κύκλου: το ποσοστό των κυττάρων σε Ο0 /Ο1 φάση ήταν υψηλότερη σε κύτταρα (45,6%) SATB1-shRNA1 (46,4%) και SATB1-shRNA2 σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου (36,8%) (ρ & lt? 0,01? Σχ. 2D). Αντίθετα, το ποσοστό των κυττάρων σε G2 /M φάσεις και S ήταν σημαντικά χαμηλότερη στα κύτταρα shRNA1 και shRNA2 από ότι στα κύτταρα ελέγχου (ρ & lt? 0,01? Σχ. 2D). μεταβολές κυτταρικού κύκλου δεν παρατηρήθηκαν σε κύτταρα SATB1-shRNA3 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτά τα ευρήματα έδειξαν ότι SATB1 μπορεί να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην προώθηση της ανάπτυξης και επιβίωσης των κυττάρων CRC.

(Α) Τρεις σταθερό SATB1-knockdown κυτταρικές γραμμές LoVo καθιερώθηκαν χρησιμοποιώντας shRNA. Κύτταρα επιμολυσμένα με άδειο φορέα χρησίμευσαν ως μάρτυρες. Η αποτελεσματικότητα του SATB1 knockdown επαληθεύτηκε με RT-PCR (άνω αριστερό πλαίσιο), στύπωμα Western (κάτω αριστερό πλαίσιο), και ανοσοφθορισμό (δεξί πάνελ). β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε για να εξασφαλιστεί η ίση φόρτωση. (Β) κυττάρων πολλαπλασιασμό των κενών έλεγχο φορέα, SATB1-shRNA1, SATB1-shRNA2, και SATB1-shRNA3 κυττάρων προσδιορίστηκε με δοκιμή ΜΤΤ. (Γ) Η απόπτωση των κενών κυττάρων ελέγχου φορέα SATB1-shRNA1 και προσδιορίστηκε με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής της χρώσης ΡΙ και αννεξίνης V. (Δ) Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής του κυτταρικού κύκλου σε κενό έλεγχο φορέα, SATB1-shRNA1, και SATB1-shRNA2 κύτταρα. (Ε) μαλακό άγαρ σχηματισμού αποικίας των κενών έλεγχο φορέα, SATB1-shRNA1, SATB1-shRNA2, και SATB1-shRNA3 κυττάρων μετά από 3 εβδομάδες. * P & lt? 0.001. (F) Μετανάστευση των κενών έλεγχο φορέα, SATB1-shRNA1, SATB1-shRNA2, και SATB1-shRNA3 κυττάρων προσδιορίστηκε με τη δοκιμασία επούλωσης πληγών (αριστερό πάνελ) και δοκιμασία μετανάστευσης φρεατίων (πάνω δεξιά πλευρά). Ο αριθμός των μετανάστευσαν κυττάρων στην δοκιμασία μετανάστευσης transwell ποσοτικοποιήθηκε μετρώντας τα κύτταρα στην κάτω πλευρά της μεμβράνης του φίλτρου σε 5 τυχαία επιλεγμένα μικροσκοπικά πεδία (κάτω δεξιό πλαίσιο). * Ρ & lt? 0.001, αριθμός μετανάστευσαν κυττάρων σε σύγκριση με τον έλεγχο. (G) κυττάρων εισβολή των κενών έλεγχο φορέα, SATB1-shRNA1, SATB1-shRNA2, και SATB1-shRNA3 κυττάρων προσδιορίστηκε με τη δοκιμασία εισβολή Matrigel φρεατίων. Ο αριθμός των κυττάρων που εισέβαλαν ποσοτικοποιήθηκε με μέτρηση των κυττάρων στην κάτω πλευρά της μεμβράνης του φίλτρου σε 5 τυχαία επιλεγμένα μικροσκοπικά πεδία. * P & lt? 0.001, αριθμός εισέβαλε κυττάρων σε σύγκριση με τον έλεγχο

Η

Νοκ ντάουν της έκφρασης SATB1 μείωσε το ρυθμό σχηματισμού αποικίας και αποικία μεγέθους (Σχήμα 2Ε.).. Στα κύτταρα ελέγχου, σχεδόν τους 100 έως 120 αποικίες θα μπορούσε να παρατηρηθεί σε τυχαία επιλεγμένα μικροσκοπικά πεδία. Σε αντίθεση, ο σχηματισμός αποικιών ήταν πολύ λιγότερες στα τρία κελιά SATB1-shRNA (shRNA1: 28,75 ± 8,5? ShRNA2: 34.5 ± 7.8? ShRNA3: 40.5 ± 4.5). Εξόντωση SATB1 μείωσε επίσης κυτταρική κινητικότητα, όπως αποδεικνύεται από τις ευρύτερες κλεισίματα τραύμα στις 3 κυτταρικές σειρές SATB1-shRNA σε σύγκριση με αυτές των κυττάρων ελέγχου (Σχ. 2F). Η επεμβατική ικανότητα ήταν σημαντικά χαμηλότερη στα κύτταρα SATB1-shRNA1, shRNA2, και shRNA3 από ότι στα κύτταρα ελέγχου (ρ & lt? 0,001? Σχ. 2G). Αυτά τα αποτελέσματα ήταν σύμφωνα με αυτά της δοκιμασίας μετανάστευσης transwell (Σχ. 2F).

Επιπλέον, ελέγξαμε το ρυθμό ανάπτυξης και την ικανότητα της μετανάστευσης /εισβολή σε κυτταρικές σειρές RKO. SATB1-νοκ ντάουν των κυτταρικών σειρών RKO ιδρύθηκε χρησιμοποιώντας shRNA1 (που ονομάζεται κυτταρικές σειρές SATB1-shRNA1 RKO). Τόσο τα επίπεδα του mRNA και της πρωτεΐνης του SATB1 ήταν ουσιαστικά ρυθμίζεται προς τα κάτω από shRNA1 (Σχ. 3Α). Συνεπής με πειράματα knockdown SATB1 σε κυτταρικές γραμμές LoVo, ο ρυθμός αύξησης των κυτταρικών γραμμών SATB1-shRNA1 RKO ήταν βραδύτερη από εκείνη των κενών κυττάρων ελέγχου φορέα (ρ & lt?. 0.05, Σχήμα 3Β), και SATB1-shRNA1 κυτταρικές σειρές RKO έδειξε επίσης η G1-φάση διακοπή του κυτταρικού κύκλου (σχ. 3C). δοκιμασία μετανάστευσης, που προβλέπεται η απόδειξη ότι νοκ ντάουν του γονιδίου SATB1 θα μπορούσε να μειώσει την κινητικότητα των κυττάρων (p & lt?. 0.001 Σχήμα 3D). Και σε κυτταρικές γραμμές RKO, η επεμβατική ικανότητα μειώθηκε σημαντικά από κάτω ρύθμιση της έκφρασης SATB1, όπως φαίνεται στο Σχ. 3Ε (p & lt? 0.001).

(Α) SATB1-νοκ ντάουν κυτταρικές σειρές RKO ιδρύθηκε χρησιμοποιώντας shRNA1. Κύτταρα επιμολυσμένα με άδειο φορέα χρησίμευσαν ως μάρτυρες. Η αποτελεσματικότητα του SATB1 knockdown επαληθεύτηκε με RT-PCR και κηλίδος western. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε για να εξασφαλιστεί η ίση φόρτωση. (Β) Cell πολλαπλασιασμός των κενών ελέγχου φορέα και κύτταρα SATB1-shRNA1 RKO προσδιορίστηκε με ανάλυση ΜΤΤ. (C) με κυτταρομετρία ροής του κυτταρικού κύκλου σε κενό έλεγχο φορέα, τα κύτταρα SATB1-shRNA1 RKO. (Δ) Η μετανάστευση των κενών έλεγχο φορέα, τα κύτταρα SATB1-shRNA1 RKO προσδιορίστηκε από φρεατίων δοκιμασία μετανάστευσης. * Ρ & lt? 0.001, αριθμός μετανάστευσαν κυττάρων σε σύγκριση με τον έλεγχο. (Ε) κυττάρων εισβολή των κενών έλεγχο φορέα, SATB1-shRNA1 RKO κυττάρων προσδιορίστηκε με Matrigel φρεατίων δοκιμασία εισβολής. * P & lt? 0.001, αριθμός εισέβαλε κυττάρων σε σύγκριση με τον έλεγχο

Η

3.4 Η υπερέκφραση του SATB1 προωθεί τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, Colony Σχηματισμός, μετανάστευση, και εισβολή στην Vitro

Για την περαιτέρω επαλήθευση της ρόλο. της SATB1 στην εξέλιξη CRC, ένα SATB1 υπερεκφράζουν κυτταρική σειρά ιδρύθηκε χρησιμοποιώντας ελάχιστα μεταστατικά κύτταρα SW480. SATB1 υπερέκφραση επιβεβαιώθηκε με κηλίδα western, RT-PCR, και χρώση ανοσοφθορισμού (Σχ. 4Α). Ο ρυθμός αύξησης ήταν υψηλότερο σε SATB1-κύτταρα που υπερεκφράζουν από ό, τι στα κενά κελιά φορέα ελέγχου (p & lt? 0,05? Εικ. 4Β). Το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων ήταν χαμηλότερη στα SATB1-κύτταρα που υπερεκφράζουν από ότι στα κύτταρα ελέγχου (28,7% V.S. 36,1%, ρ & lt? 0,01? Εικ. 4C). Η υπερέκφραση του SATB1 προωθείται εξέλιξης του κυτταρικού κύκλου από G0 /G1 φάση προς /φάσεων Μ και S G2 (56,3% G0 /G1 φάση SATB1-κυτταρικές σειρές που υπερεκφράζουν έναντι 63,6% G0 /G1 φάση στα κύτταρα ελέγχου) (Εικ. 4D). ρυθμός σχηματισμού αποικίας και μέγεθος των αποικιών ήταν υψηλότερα στα SATB1-κύτταρα που υπερεκφράζουν (67,5 ± 9,5) σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου (24,75 ± 2,75) (Σχ. 4Ε). SATB1 υπερέκφραση αυξημένη κυτταρική μετανάστευση, όπως αποδεικνύεται από το πλήρες κλείσιμο του τραύματος και πιο μετανάστευσαν κύτταρα σε SATB1 υπερεκφράζουν κύτταρα (Σχ. 4F). Επιπλέον, η ικανότητα εισβολής ήταν υψηλότερη στα SATB1-κύτταρα που υπερεκφράζουν (109 ± 8,7) σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου (12,75 ± 4,5) (Σχ. 4G).

(Α) κύτταρα SW480 διαμολύνθηκαν με το pcDNA3 0,1-SATB1 φορέα έκφρασης ή με κενό φορέα. Προς τα πάνω ρύθμιση του SATB1 mRNA και πρωτεΐνης έκφραση επιβεβαιώθηκε με RT-PCR (άνω αριστερό πλαίσιο), στύπωμα Western (κάτω αριστερό πλαίσιο), και ανοσοφθορισμό (δεξί πάνελ). β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε για να εξασφαλιστεί η ίση φόρτωση. (Β) Cell πολλαπλασιασμός των κενών ελέγχου φορέα και κύτταρα pcDNA3.1-SATB1 προσδιορίστηκε με ανάλυση ΜΤΤ. (Γ) Η απόπτωση των κενών ελέγχου φορέα και κύτταρα pcDNA3.1-SATB1 προσδιορίστηκε με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής της χρώσης ΡΙ και αννεξίνης V. (Δ) Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής του κυτταρικού κύκλου σε κενό φορέα ελέγχου και κυττάρων pcDNA3.1-SATB1. (Ε) μαλακό άγαρ σχηματισμού αποικίας των κενών κυττάρων ελέγχου φορέα και ροϋΝΑ3.1-SATB1 μετά από 3 εβδομάδες. (F) Μετανάστευση των κενών φορέα ελέγχου και pcDNA3.1-SATB1 κυττάρων προσδιορίστηκε με δοκιμασία επούλωσης πληγών (αριστερό πάνελ) και δοκιμασία μετανάστευσης transwell (δεξί πάνελ). * Ρ & lt? 0.001, ο αριθμός των κυττάρων που μετανάστευσαν σε σύγκριση με τους μάρτυρες. (G) κυττάρων εισβολή των κενών ελέγχου φορέα και κύτταρα pcDNA3.1-SATB1 προσδιορίστηκε με Matrigel transwell δοκιμασία εισβολής (* p & lt? 0.001).

Η

3.5 SATB1 προωθεί την ανάπτυξη και μετάσταση του CRC κύτταρα σε vivo

στη συνέχεια, αξιολογήσαμε την επίδραση της υπερέκφρασης SATB1 επί CRC καρκινογένεση in vivo, το mRNA και η πρωτεΐνη έκφρασης SATB1 ήταν υψηλότερα σε όγκους από τα SATB1 υπερεκφράζουν κύτταρα σε σχέση με όγκους από τα κενά κελιά φορέα (Σχ. 5Α). Οι όγκοι από τα SATB1-κύτταρα που υπερεκφράζουν είχε ένα ταχύτερο ρυθμό ανάπτυξης από τους όγκους από τα κύτταρα ελέγχου, η οποία ήταν σύμφωνη με in vitro ρυθμούς ανάπτυξης (ρ & lt?. 0.01, Σχήμα 5Α, άνω πλαίσιο). Τα βάρη των όγκων από τις SATB1-κύτταρα που υπερεκφράζουν ήταν περίπου 5-6 φορές βαρύτερα από εκείνα από τα κενά κελιά φορέα, υποδεικνύοντας ότι SATB1 θα μπορούσε να προωθήσει την ανάπτυξη των όγκων του παχέος in vivo (Εικ. 5Α, κάτω πάνελ).

(Α) mRNA και πρωτεΐνη εκφράσεις SATB1 inxenograft όγκους από κενό φορέα ελέγχου και κυττάρων pcDNA3.1-SATB1 προσδιορίστηκαν με RT-PCR και κηλίδος western, αντίστοιχα (επάνω αριστερό πάνελ). Στη συνέχεια, η ανάπτυξη του όγκου προσδιορίστηκε σε ένα ίη νίνο μοντέλο ξενομοσχεύματος. Σταθερό SATB1 υπερεκφράζουν και κενά κύτταρα ελέγχου φορέα (2 × 10

6) εγχύθηκαν υποδορίως στην αριστερή και τη δεξιά ραχιαία πλευρά, αντίστοιχα, σε 5 θηλυκά BALB /c αθυμικά ποντίκια. Τα μεγέθη των όγκων μετρήθηκαν δύο φορές την εβδομάδα, και οι ποντικοί θανατώθηκαν μετά από 4 εβδομάδες.