Abstract

σισπλατίνη, ένα ευρέως χρησιμοποιούμενο χημειοθεραπευτικό, συνδέεται με ωτοτοξικότητα, νεφρική τοξικότητα και νευροτοξικότητα, προσδιορίζοντας έτσι μέσο για την αύξηση του θεραπευτικού δείκτη της σισπλατίνης μπορεί να επιτρέψει για βελτιωμένα αποτελέσματα. Ένας SNP (rs4343077) στο

eps8

, ανακαλύφθηκε μέσα από μια μελέτη του γονιδιώματος μεγάλη ένωση σισπλατίνη που προκαλείται κυτταροτοξικότητα και την απόπτωση σε λεμφοβλαστοειδείς κυτταρικές σειρές (LCLs), έδωσε ώθηση για να μελετήσει περαιτέρω το γονίδιο αυτό. Ο σκοπός αυτής της εργασίας ήταν να αξιολογηθεί ο ρόλος του

eps8

στην κυτταρική ευαισθησία στη σισπλατίνη σε καρκινικούς και μη καρκινικά κύτταρα. Χρησιμοποιήσαμε

eps8

RNA παρεμβολής για να προσδιοριστεί η επίδραση της μειωμένης

eps8

έκφραση στο LCL και Α549 καρκίνου του πνεύμονα ευαισθησία των κυττάρων στην σισπλατίνη.

eps8

νοκ ντάουν στον LCLs οδήγησε σε αύξηση κατά 7,9% σε σισπλατίνη που προκαλείται από την επιβίωση (

P

= 1,98 × 10

-7) και μια μείωση 8,7% σε απόπτωση (

P

= 0,004) σε σύγκριση με τον έλεγχο. Αντίθετα, μειώνεται

eps8

έκφραση σε καρκινικά κύτταρα πνεύμονα οδήγησε σε μείωση 20,6% σισπλατίνη που προκαλείται από την επιβίωση (

P

= 5.08 × 10

-5). Στη συνέχεια διερευνήθηκε μια

eps8

αναστολέα, μιθραμυκίνη Α, ως ένα δυνητικό μέσο για την αύξηση του θεραπευτικού δείκτη της σισπλατίνης. Μιθραμυκίνη Μια μειωμένη

eps8

έκφραση σε LCLs με αποτέλεσμα την μειωμένη κυτταρική ευαισθησία στην σισπλατίνη, όπως αποδεικνύεται από τα χαμηλότερα κασπάσης 3/7 ενεργοποίηση μετά από θεραπεία με σισπλατίνη (42,7% ± 6,8% σε σχέση με τον έλεγχο

P

= 0.0002 ). Σε 5 μη μικροκυτταρικού καρκινώματος του πνεύμονα (NSCLC), κυτταρικές σειρές μιθραμυκίνη Α οδήγησε επίσης σε μειωμένη

eps8

έκφρασης. Προσθέτοντας μιθραμυκίνη έως 4 κυτταρικές σειρές NSCLC και μία κυτταρική γραμμή καρκίνου της ουροδόχου κύστης, είχε ως αποτέλεσμα την αυξημένη ευαισθησία στη σισπλατίνη που ήταν σημαντικά πιο έντονη σε καρκινικές κυτταρικές σειρές σε σύγκριση με τις γραμμές LCL (ρ & lt? 0,0001). Ένας EGFR μεταλλαγμένη κυτταρική σειρά NSCLC (H1975) δεν έδειξε σημαντική αλλαγή στην ευαισθησία στη σισπλατίνη με την προσθήκη μιθραμυκίνη θεραπείας. Ως εκ τούτου, ένας αναστολέας της

eps8

, όπως μιθραμυκίνη Α, θα μπορούσε να βελτιώσει τη θεραπεία με σισπλατίνη, αυξάνοντας την ευαισθησία του όγκου σε σχέση με τα φυσιολογικά κύτταρα

Παράθεση:. Gorsic LK, Stark AL, Wheeler HE, Wong SS, Im Χονγκ Κονγκ, Dolan ME (2013)

eps8

Αναστολή Αυξάνει Cisplatin Ευαισθησία σε κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα. PLoS ONE 8 (12): e82220. doi: 10.1371 /journal.pone.0082220

Συντάκτης: John D. Minna, Πολυτεχνείου της Texas Southwestern Medical Center στο Ντάλας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 13 Ιουνίου του 2013? Αποδεκτές: 24 Οκτ 2013? Δημοσιεύθηκε: 19 Δεκεμβρίου 2013

Copyright: © 2013 Gorsic et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς είναι ευγνώμονες στο Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας, Εθνικό Ινστιτούτο Γενικών Ιατρικών Επιστημών UO1GM61393 (MED), Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας Κλινική και Μεταγραφική Science Award ΤΕ1 RR25001 (ALS), Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου Υγείας Βιολογία Εκπαίδευση Grant T32CA009594 (HEW). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Cisplatin είναι ένας παράγων της πλατίνας που χρησιμοποιείται για τη θεραπεία της κεφαλής και του τραχήλου, των ωοθηκών, του τραχήλου της μήτρας, των όρχεων, και καρκίνων του πνεύμονα? Ωστόσο, σοβαρές τοξικότητες και εγγενή /επίκτητη αντίσταση παρεμβαίνει με την αποτελεσματικότητά του [1]. Κατανόηση γενετικούς και μοριακούς μηχανισμούς με τους οποίους αυτό χημειοθεραπευτικό παράγοντα προκαλεί τοξικές παρενέργειες θα είναι μεγάλο πλεονέκτημα για τους ασθενείς. Ειδικότερα, η ταυτοποίηση των γονιδίων των οποίων η έκφραση συνεισφέρει στην τοξικότητα θα επέτρεπε την ανάπτυξη της χημειοθεραπείας για την παράκαμψη τοξικές επιδράσεις.

εργαστήριο μας έχει αναπτύξει ένα προκλινικό μοντέλο φαρμακογονιδιωματικών χρησιμοποιώντας λεμφοβλαστοειδείς κυτταρικές γραμμές (LCLs) για την ταυτοποίηση γενετικών παραλλαγών που σχετίζονται με ευαισθησία σε χημειοθεραπευτικά για να συμπληρώσει και να ενισχύσει τις κλινικές μελέτες φαρμακογονιδιωματικών [2] – [5]. Είναι σημαντικό ότι, παραλλαγές εντοπίζονται στην προσέγγιση βασισμένη σε κύτταρα έχει αποδειχθεί ότι σχετίζονται με απόκριση σε καρκίνο των ωοθηκών [6], τον καρκίνο του πνεύμονα [7], καρκίνο κεφαλής και τραχήλου [8], και πακλιταξέλη επαγόμενη περιφερικής νευροπάθειας σε ασθενείς με καρκίνο του μαστού [ ,,,0],9], παρέχοντας εμπιστοσύνη στο μοντέλο που βασίζεται σε κύτταρα για την ταυτοποίηση κλινικά σχετική παραλλαγές.

για περισσότερες μελέτες LCL, προκαλούμενη από φάρμακα αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης μετρήθηκε η φαρμακολογική φαινότυπο, ωστόσο αυτό είναι μια ευρεία φαινότυπο που περιλαμβάνει κυτταρικές διεργασίες που οδηγεί σε νέκρωση, κυτταρικό θάνατο μέσω αποπτωτικών και μη-αποπτωτικών οδών, διακοπή του κυτταρικού κύκλου, και κατεστραμμένα κύτταρα που υφίστανται την επιδιόρθωση του DNA [10]. Η απόπτωση, μια πιο συγκεκριμένη φαινότυπο, μπορεί να ρίξει φως στις σχετικές πολυμορφισμών μονού νουκλεοτιδίου (SNPs) που συνδέεται με απόκριση σισπλατίνης σε ασθενείς, αφού σισπλατίνη είναι γνωστό ότι προκαλεί κυτταρικό θάνατο μέσω ενός αποπτωτικό μονοπάτι [11]. Ως εκ τούτου, σε μια προηγούμενη μελέτη σε επεξεργασία HapMap LCLs με σισπλατίνη και μετράται η ενεργοποίηση της κασπάσης 3/7 καθώς και αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης [12]. Ένα GWAS αποκάλυψε 2449 SNPs και 1629 SNPs Ενδεικτικές συνδέονται με σισπλατίνη απόπτωση και κυτταροτοξικότητα (

P

& lt? 0.001), αντίστοιχα, με 19 επικαλυπτόμενα SNPs [12]. Ένα από τα κοινά SNPs, rs4343077, στο οποίο ο ανήλικος αλληλόμορφο είχαν χαμηλότερα προκαλείται από τη σισπλατίνη απόπτωση (

P

= 0,0007) και μεγαλύτερο survivial (

P

= 0,0007) είναι επίσης μια έκφραση ποσοτική τόπο γνώρισμα (eQTL) που σχετίζονται με τα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου βασικής γραμμής των 28 γονιδίων σε

P

≤10

-4 [12]. Αυτό το SNP βρίσκεται σε ένα ιντρόνιο του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα υπόστρωμα οδού 8 (

eps8

).

Είναι ενδιαφέρον,

eps8

έχει συνδέονται ειδικά με σισπλατίνη και πακλιταξέλη που προκαλείται ανταπόκριση των ναρκωτικών, όπου τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα έγιναν πιο ευαίσθητα σε φαρμακευτική αγωγή μετά από

eps8

νοκ ντάουν [13]. Πρόσφατα,

eps8

επίσης βρέθηκε να υπερεκφράζεται σε ανθρώπινο κακοήθη γλοιώματα και προώθησε την κυτταρική ανάπτυξη τους [14]. Μελέτες έχουν αναφερθεί αυξημένη έκφραση του

eps8

σε άλλα διάφορα ανθρώπινων όγκων συμπεριλαμβανομένων των ωοθηκών, του παχέος εντέρου, του πνεύμονα, της υπόφυσης και του στόματος καρκίνων [15]. Ως αποτέλεσμα,

eps8

εξασθένησης έχει αποδειχθεί ότι επηρεάζουν την κυτταρική μετανάστευση και τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων [15].

Λόγω της σημασίας του

eps8

σε απόκριση σισπλατίνη σε καρκινικά κύτταρα [13] και την αναγνώριση μας για μια SNP στο

eps8

(rs4343077) που συνδέονται τόσο με σισπλατίνη κυτταροτοξικότητα και την απόπτωση [12], θα αξιολογηθεί περαιτέρω το ενδιαφέρον των

eps8

στην ευαισθησία να σισπλατίνη. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιείται siRNA εναντίον

eps8

και ένα γνωστό

eps8

αναστολέα, μιθραμυκίνη. Προς τα κάτω ρύθμιση χρησιμοποιώντας siRNA ή /και αναστολή

eps8 από

μιθραμυκίνη οδήγησε σε μειωμένη μεγαλύτερη αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης σε μη EGFR μεταλλαγμένο καρκινικά κύτταρα πνεύμονα και ένα κύτταρο κύστη γραμμή εξής σισπλατίνη θεραπεία. Η μελέτη μας προσδιορίζει τη σημασία του

eps8

στην σισπλατίνη που προκαλείται κυτταροτοξικότητα.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές

Εννέα LCLs (GM6991, GM7348, GM10838 , GM11994, GM12239, GM10859, GM11830, GM11840, GM12156) που προέρχεται από άτομα της Βόρειας και Δυτικής Ευρώπης καταγωγή (HapMap CEU) διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 που περιέχει 15% ορό εμβρύου μόσχου (Hyclone, Logan, Utah, USA) και 20 mM L-γλουταμίνη. Οι κυτταρικές σειρές αραιώθηκαν 3 φορές την εβδομάδα σε μια συγκέντρωση 350,000 κυττάρων /ml. Α549, ΝΟΙ-H1437, NCI-H1563 και ΝΟΙ-H1975 (κυτταρικές σειρές καρκινώματος ανθρώπινου μη-μικρού κυττάρου πνεύμονα) διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου. NCI-Καταλόγου Η2126 (ανθρώπινα μη-μικρού κυττάρου κυτταρική γραμμή καρκινώματος πνεύμονα) διατηρήθηκε σε DMEM: F12 που περιείχε 0,005 mg /ml ινσουλίνη, 0.01 mg /ml τρανσφερίνη, 30 ηΜ σεληνικό νάτριο, 10 ηΜ υδροκορτιζόνης, 10 ηΜ β-οιστραδιόλη, επιπλέον 2 mM Ε-γλουταμίνη και 5% ορό εμβρύου μόσχου (μέσο προτείνεται από ATCC). HTB9 (ουρική κυτταρική γραμμή καρκινώματος ουροδόχου κύστης βαθμού II) διατηρήθηκε σε RPMI 1640 και 10% εμβρυϊκό βόειο ορό. Όλες οι κυτταρικές γραμμές που αποθηκεύονται σε επωαστήρα 37 ° C με 5% CO

2. Τα καρκινικά κύτταρα, μεσαία και συστατικά αγοράστηκαν από την ATCC (Manassas, Virginia, USA), Cellgro (Herndon, Virginia, USA) ή την Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, Missouri, USA).

Drugs

η σισπλατίνη και η μιθραμυκίνη Α αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich Co. διμεθυλοσουλφοξείδιο χρησιμοποιήθηκε για την αραίωση σισπλατίνη σε ένα απόθεμα 20 mM, ενώ μιθραμυκίνη αραιώθηκε σε μία συγκέντρωση αποθέματος από 0,06 μm χρησιμοποιώντας αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό.

Συσχέτιση

eps8

και φαινοτύπων

Γονιδίωμα-ευρύ δεδομένα γονιδιακής έκφρασης δημιουργήθηκαν στο εργαστήριο μας με Affymetrix GeneChip Ανθρωπίνων εξόνιο array 1.0 ST array [16], καθώς και όλα τα δεδομένα πίνακα των πρώτων εξόνιο έχουν κατατίθενται σε γονιδιακής έκφρασης Omnibus (ένταξη όχι. GSE7761).

eps8

επίπεδα γονιδιακής έκφρασης συσχετίστηκαν με 5 μΜ σισπλατίνη που προκαλείται κυτταροτοξικότητα και την απόπτωση [12] στο CEU LCLs (n = 77). Αναλύσεις γραμμικής παλινδρόμησης μεταξύ

eps8

επίπεδα και κάθε φαινοτύπου διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας GraphPad Prism 4.

παρεμβολή RNA

Νοκ ντάουν πειράματα διεξήχθησαν για να αποδείξει τις επιπτώσεις των χαμηλότερων

eps8 επίπεδα

επί σισπλατίνη επαγόμενη κυτταροτοξικότητα και απόπτωση. Χρησιμοποιώντας Lonza Κυτταρικής Σειράς 96 φρεατίων Nucleofector Kit SF (Lonza Inc, Βασιλεία, Ελβετία), LCLs και Α549 nucleofected 24 ώρες μετά την σπάρθηκαν σε 5.5 × 10

5 κύτταρα /ml και 4,0 × 10

5 κύτταρα /ml, αντίστοιχα. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση σε 90 χ g για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και εναιωρούνται εκ νέου σε συγκέντρωση 1 × 10

6 κύτταρα /20 μΙ στο SF διάλυμα /συμπλήρωμα και 2 μΜ τελική συγκέντρωση Allstars αρνητικού ελέγχου siRNA επισημασμένο με AlexaFluor488 (Qiagen Inc., Valencia, CA, USA) ή στην πισίνα του Hs_EPS8 (SI00380737, SI03109302, SI00380751, SI00380744) FlexiTube siRNA (Qiagen). Πρόγραμμα DN-100 χρησιμοποιήθηκε για την LCL nucleofection και CM-130 για Α549. Τα κύτταρα 10 λεπτά την ανάπαυση πριν από την προσθήκη του μέσου RPMI, μετά καλλιεργήθηκαν για κυτταροτοξικότητα ή απόπτωση και επωάζονται όλη τη νύκτα.

Η κυτταροτοξικότητα εξής siRNA ή θεραπεία με μιθραμυκίνη

Μία δοκιμασία αναστολής της κυτταρικής ανάπτυξης alamarBlue είχε χρησιμοποιείται για να μετρήσει κυτταροτοξικά αποτελέσματα του cisplatin και μιθραμυκίνη [17]. Για

eps8

πειράματα siRNA, LCLs (GM6991, GM7348, GM10838, GM11994 και GM12239) υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 5 μΜ cisplatin 5 ώρες μετά nucleofection, ενώ Α549 υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 5 μΜ cisplatin 24 ώρες μετά nucleofection. Μετά τα κύτταρα φαρμακευτική θεραπεία επωάστηκαν για 24 ώρες. AlamarBlue συνέχεια προστέθηκε και οι πλάκες επωάστηκαν για επιπλέον 24 ώρες πριν την ανάγνωση σε μήκη κύματος 570 και 600 nm με τη χρήση του Synergy ΗΤ (Biotek, Winooski, VT) και το ποσοστό επιβίωσης υπολογίστηκε [12]. Για να παρατηρήσουμε κυτταροτοξική αντίδραση με το

eps8

νοκ ντάουν μέσω μιθραμυκίνη, κύτταρα (GM10859, GM11830, GM11840, GM12156, Α549, H1437, H1563, H1975, Καταλόγου Η2126 και HTB9) απλώθηκαν και έλαβαν θεραπεία είτε με Μιθραμυκίνη μόνο (0 και 0,01 μΜ), cisplatin μόνο (0, 1, 2,5, 5, 10 20, 25 και 50 μΜ) ή σισπλατίνη σε διάφορες συγκεντρώσεις σε συνδυασμό με 0.01 μΜ μιθραμυκίνη. επεξεργασία Μιθραμυκίνη συνέβη αμέσως μετά την τοποθέτηση. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με σισπλατίνη 6 ώρες μετά την προσθήκη μιθραμυκίνη και 10% του συνολικού όγκου του καλά alamarBlue προστέθηκαν 24 ώρες μετά τη θεραπεία cisplatin. Μετά από μία επιπλέον περίοδο επώασης 24 ωρών, οι πλάκες διαβάζονται όπως αναφέρεται ανωτέρω. Όλα τα πειράματα για μετρήσεις επιβίωση τοις εκατό απλώθηκαν σε τριπλή επανάληψη με δύο τουλάχιστον ξεχωριστά πειράματα.

Προσδιορισμός απόπτωσης

σισπλατίνη και μιθραμυκίνη επαγόμενη απόπτωση μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας κασπάση-Glo αντιδραστήριο 3/7 από Promega Corporation (Madison, WI) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [12]. Για

eps8

πειράματα siRNA, επιστρώθηκαν κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 μΜ cisplatin 5 ώρες μετά nucleofection και κασπάσης 3/7 μετρήθηκε 24 ώρες μετά τη θεραπεία cisplatin. Για να αξιολογηθεί

eps8

γονίδιο έκφρασης μετά μιθραμυκίνη έκθεση, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν και αμέσως υποβλήθηκε σε επεξεργασία με μιθραμυκίνη (0 ή 0,01 μΜ), στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 5 μΜ cisplatin 20 ώρες μετά την προσθήκη μιθραμυκίνη. Caspase 3/7 δραστικότητα μετρήθηκε 24 ώρες μετά την σισπλατίνη και υπολογίζεται ως σχέση με τον έλεγχο (χωρίς προσθήκη φαρμάκου). Τα αποτελέσματα για τις μετρήσεις της απόπτωσης αντιπροσωπεύουν πειράματα επιχρυσωμένο εις τριπλούν με τουλάχιστον δύο ανεξάρτητες επαναλήψεις.

Η ποσοτικοποίηση νοκ ντάουν του

eps8

Η

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση σε 5, 29, και 53 ώρες μετά nucleofection με

eps8

siRNA και κωδικοποιημένα ελέγχου, καθώς και 6 και 20 ώρες μετά μιθραμυκίνη θεραπεία. RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας το κιτ RNeasy Mini Plus και QIAcube (Qiagen) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. mRNA στη συνέχεια μεταγράφεται ανάστροφα σε cDNA αποδίδοντας τελικές συγκεντρώσεις 25 ή 50 ng /μΐ χρησιμοποιώντας το High Capacity Αντίστροφη Μεταγραφή kit (Applied Biosystems, Life Technologies, Grand Island, ΝΥ). Το cDNA χρησιμοποιήθηκε για να εκτελέσει qRT-PCR για την επιβεβαίωση της νοκ ντάουν του

eps8

[18]. Της Applied Biosystems TaqMan αστάρι χρησιμοποιείται για την ποσοτικοποίηση της έκφρασης του mRNA της

eps8

(Hs00610286_m1).

Μικτά αποτελέσματα μοντέλο

Η επίδραση του

eps8

νοκ ντάουν στην σισπλατίνη επαγόμενη απόπτωση και την ανάπτυξη αναστολή μοντελοποιήθηκε χρησιμοποιώντας την ακόλουθη μικτό μοντέλο επιδράσεις:

Πειραματιστείτε και κυτταρικές σειρές ήταν τυχαίες επιδράσεις επιτρέποντας πείραμα συγκεκριμένες και κυτταρική σειρά συγκεκριμένων παρακολουθήσεις και νοκ ντάουν κατάσταση θεωρήθηκε ένα σταθερό αποτέλεσμα. Υ αντιπροσωπεύει απόπτωση ή την ανάπτυξη αναστολής. τιμές P για νοκ ντάουν αποτέλεσμα υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας το τεστ λόγου πιθανοφανειών με τα μοντέλα ταιριάζουν με το σύνολο REML σε false. Καλής προσαρμογής των μοντέλων αξιολογήθηκε εξετάζοντας τις διανομές των υπολοίπων ». Ε Στατιστική λογισμικού (R Ανάπτυξης Βασικής Ομάδας https://www.R-project.org/) και το

lme4

πακέτο (έκδοση του πακέτου R 0,999375 έως 42 https://CRAN.R-project.org/πακέτο = lme4) χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση.

αλληλεπίδραση μιθραμυκίνη ± σισπλατίνη

για να ελέγξετε το αποτέλεσμα της αλληλεπίδρασης του κυτταρικού τύπου (όγκου vs LCL) και μιθραμυκίνη θεραπεία για την καμπύλη απόκρισης της δόσης της cisplatin που ταιριάζει μια μικτή αποτελέσματα. Το τελικό μοντέλο ήταν: όπου ο φυσικός λογάριθμος ποσοστό επιβίωσης ήταν το αποτέλεσμα και όγκου (κατάσταση vs καθεστώς LCL) και μιθραμυκίνη θεραπεία (TRT) μονιμοποιήθηκαν αποτελέσματα με τον όρο αλληλεπίδραση? exp ανέφερε ένας από τους δύο βιολογικούς επαναλήψεις και τοποθετούνται ως τυχαίο αποτέλεσμα? δόση σισπλατίνης και την πλατεία της χρησιμοποιήθηκαν για την μοντελοποίηση της καμπύλης δόσης-απόκρισης επιτρέπει να είναι διαφορετική για όγκο και τις γραμμές LCL? κυτταρική γραμμή id προστέθηκε ως τυχαίο αποτέλεσμα να αντιπροσωπεύουν εντός κυτταρικής γραμμής συσχέτισης. Κατά την τοποθέτηση της μοντέλο τα αποτελέσματα σε μηδενική συγκέντρωση αμφοτέρων των φαρμάκων (σειρές όπου υπολογίστηκε έκβαση επιβίωσης = 1, λόγω του τρόπου ποσοστό επιβίωσης) αποκλείστηκαν. Σύνδεση μετασχηματισμού χρησιμοποιήθηκε για να βελτιώσει το μοντέλο ταιριάζει. Ο συντελεστής του όρου αλληλεπίδρασης tumor:trt μπορεί να ερμηνευθεί ως η μέση μετατόπιση της καμπύλης δόσης-απόκρισης όταν mithrmycin προστέθηκε στις γραμμές των όγκων σε σχέση με τις γραμμές LCL.

Αποτελέσματα

Η επιτυχής νοκ ντάουν της

eps8

μέσω RNA παρεμβολής

Πέντε CEU LCLs και την κυτταρική σειρά καρκίνου του πνεύμονα Α549 χρησιμοποιήθηκαν για μελέτες που περιλαμβάνουν

eps8

νοκ ντάουν. Τα κύτταρα nucleofected είτε με ένα κωδικοποιημένο έλεγχο ή siRNA της

eps8

. Σε σύγκριση με το ανακατωμένο έλεγχο,

eps8

knockdown φάνηκε να είναι επιτυχής σε όλες τις κυτταρικές σειρές 6 (Εικ. 1Α). Οι μέσες ποσοστά

eps8

σε όλες LCLs στα 5, 29, και 53 ώρες χρονικά σημεία ήταν 17,2 (± 7,5), 19,0 (± 4,3) και 40,6% (± 7,3), αντίστοιχα. Α549 επιτευχθεί

eps8

νοκ ντάουν σε 7,4% και 10,5% σε σύγκριση με ανακατωμένο έλεγχο σε 29 και 53 ώρες αντίστοιχα.

Οι τιμές περιλαμβάνουν 2 ανεξάρτητα πειράματα με qRT-PCR εις διπλούν. αλλαγές γραμμής κυττάρων στο ποσοστό επιβίωσης (

P

= 1,98 × 10

-7) και τη δράση της κασπάσης 3/7 (

P

= 0.004) για όλες τις LCLs και Α549 (

P

= 5.08 × 10

-5) σε 5 μΜ σισπλατίνη οφείλεται σε

eps8

νοκ ντάουν παρουσιάζονται με τυπικό σφάλμα του μέσου όρου χρησιμοποιώντας 6 επαναλήψεις από 2 ανεξάρτητα πειράματα (Β).

φαινοτυπικές αλλαγές με το

eps8

siRNA

Μετά την επιβεβαίωση νοκ ντάουν του

eps8

, αξιολογήσαμε τις αλλαγές στην ευαισθησία στη σισπλατίνη όπως μετράται με ποσοστό επιβίωσης και της κασπάσης 3/7 ενεργοποίηση. Η συσχέτιση μεταξύ

eps8

έκφρασης και σισπλατίνη που προκαλείται κυτταροτοξικότητα έδειξε χαμηλότερα επίπεδα

eps8

έκφραση συσχετίζεται σημαντικά μεγαλύτερο ποσοστό επιβίωσης σε 5 μΜ σισπλατίνη (

P

= 0,047)? Ωστόσο σισπλατίνη απόπτωση που επάγεται δεν έφθασε σημασία (

P

= 0,499) (Εικ. S1). Χρησιμοποιώντας ένα μικτά αποτελέσματα μοντέλου που συνδυάζει όλες τις κυτταρικές σειρές,

eps8

παρεμβολή RNA έδειξαν αυξημένη επιβίωση του LCLs σισπλατίνη επεξεργασμένου κατά μέσο όρο 7,9% (

P

= 1.98 × 10

– 7) και μειωμένη απόπτωση κατά μέσο όρο 8,7% (

P

= 0,004) (Εικ. 1Β). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι τα χαμηλότερα επίπεδα του

eps8

στο LCLs μειώνουν την κυτταρική ευαισθησία στην σισπλατίνη, όπως αποδεικνύεται από την αυξημένη επιβίωση των κυττάρων και μειωμένη αποπτωτική δραστηριότητα όταν λαμβάνουν θεραπεία με σισπλατίνη. Έτσι, μειώθηκε

eps8

στο LCLs προσδίδει αντοχή στην τοξικότητα σισπλατίνη. Σε αντίθεση,

eps8

μειορρύθμιση σε Α549 προκάλεσε μεγαλύτερη ευαισθησία σε σισπλατίνη με μείωση 20,6% το ποσοστό επιβίωσης (

P

= 5.08 × 10

-5) (Σχ. 1Β).

μιθραμυκίνη μειώνει την έκφραση του

eps8

στις γραμμές του καρκίνου και LCLs

τα επίπεδα του

eps8

έκφρασης μετρήθηκαν 6 και 20 ώρες μετά από θεραπεία με μιθραμυκίνη (0,01 μΜ). Επίπεδα

eps8

έκφραση μειώθηκε απέναντι και τα 4 LCLs που ελέγχθηκαν, με μέσο όρο 74,4% (± 3,4) στις 6 ώρες και 29,8% (± 3,7) στους 20 ώρες σε σχέση με τον έλεγχο εξής μιθραμυκίνη έκθεσης (Σχ. 2Α ). Μιθραμυκίνη μειώθηκε επίσης

eps8

επίπεδα έκφρασης σε 5 NSCLC κυτταρικές σειρές καρκίνου της κύστεως και κυτταρικής γραμμής σε ένα μέσο όρο 95,7% (± 3,4) στις 6 ώρες και 59,9% (± 14,7) σε 20 ώρες από την έκθεση, σε σύγκριση με κανένας έλεγχος φαρμακευτική θεραπεία (Εικ. 2Β). Αυτές οι μετρήσεις επιβεβαιώνουν ότι η θεραπεία της μιθραμυκίνη (0,01 μΜ) οδηγεί σε χαμηλότερη έκφραση του

eps8

σε καρκινικούς πνεύμονα και της ουροδόχου κύστης κύτταρα καθώς και σε noncancerous LCLs.

Ποσοστό τιμές που παρουσιάζονται περιλαμβάνουν δύο ανεξάρτητα πειράματα με qRT-PCR εις διπλούν για κάθε πείραμα με το πρότυπο σφάλμα του μέσου.

η

μιθραμυκίνη μειώνει την ευαισθησία του LCLs με σισπλατίνη

στη συνέχεια, προσδιορίζεται η επίδραση των μιθραμυκίνη στην ευαισθησία των LCLs στη σισπλατίνη που προκαλείται από την ενεργοποίηση της κασπάσης 3/7. Τα μέσα επίπεδα απόπτωσης σε όλη την 4 LCLs εξής σισπλατίνη μόνη της ήταν 5,94 (± 0,9) σε σχέση με τον έλεγχο, σε σύγκριση με τη σισπλατίνη συν μιθραμυκίνη οποία μείωσε την μέση κασπάσης 3/7 επίπεδα σε 3,38 (± 0,5) (Εικ. 3). Caspase 3/7 δραστηριότητα μετά μιθραμυκίνη μόνο (0,01 μΜ) οδήγησε σε ένα μέσο όρο 3,41 (± 0,4) κατά μήκος των 4 LCLs. Ακόμα κι αν μιθραμυκίνη και σισπλατίνη επάγουν απόπτωση χωριστά, υπήρξε μια μέση μείωση 42,7% (± 6,8

P

= 0,0002) σε κασπάσης 3/7 ενεργοποίηση συνδυάζοντας μιθραμυκίνη με σισπλατίνη σε σύγκριση με τη σισπλατίνη μόνη της, γεγονός που υποδηλώνει μια προστατευτική επίδραση του μιθραμυκίνη άποψη της απόπτωσης. Πνεύμονα και καρκίνου της ουροδόχου κύστης κύτταρα ελέγχθηκαν επίσης για απόπτωση με σισπλατίνη (5 μΜ) παρουσία και απουσία μιθραμυκίνη? Ωστόσο κασπάσης 3/7 επίπεδα ενεργοποίησης για αυτά τα κύτταρα δεν ήταν πάνω από την αρχική τιμή.

Κάθε LCL βιώσει κατώτερο σισπλατίνη επαγόμενη αποπτωτική δραστικότητα με την προστιθέμενη μιθραμυκίνη σε σχέση με ένα μάρτυρα χωρίς φαρμακευτική αγωγή. Μιθραμυκίνη αντιμετωπίζονται 10859, 11830, 11840, 12156 και οδήγησε σε 47,1, 40,8, 48,9, και 34,0% μείωση από μόνη τη σισπλατίνη, αντίστοιχα. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν δύο ξεχωριστά πειράματα, έκαστο εις τριπλούν με τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής.

Η

Μιθραμυκίνη ενισχύει την ευαισθησία των καρκινικών κυττάρων στη σισπλατίνη

Εκτός από τον έλεγχο των επιπέδων της απόπτωσης με σισπλατίνη και μιθραμυκίνη σε LCLs και καρκινικά κύτταρα, μετρήσαμε επίσης την αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων. Πέντε κυτταρικές σειρές NSCLC με ποικίλες καταστάσεις μετάλλαξη επιλέχθηκαν για τη μελέτη? η επίδραση της μιθραμυκίνη και μόνο ποικίλλει για αυτές τις καρκινικές κυτταρικές γραμμές που κυμαίνονται από 59,7% να 92,9 αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης (Πίνακας 1). Ευαισθησία σε σισπλατίνη βρέθηκε να αυξάνει με μιθραμυκίνη θεραπεία σε 4 μοριακά διακριτές NSCLC κύτταρα (Εικ. 4). H1975 με μια μετάλλαξη του EGFR, δεν παρουσίασαν σημαντική μεταβολή. Δεδομένου ότι η σισπλατίνη χρησιμοποιείται επίσης για τη θεραπεία του καρκίνου της ουροδόχου κύστης, επιλέξαμε επίσης να μετρήσει σισπλατίνη και μιθραμυκίνη επιδράσεις σε μια γραμμή όγκου κύστης για να δούμε αν το αποτέλεσμα θα μιμηθούν αποτελέσματα NSCLC? παρατηρήσαμε 59,6% επιβίωση με μιθραμυκίνη θεραπεία μόνο (Εικ. 4).

τετράγωνο σχήμα αντιπροσωπεύει συγκεντρώσεις σισπλατίνης και μόνο, ενώ το τρίγωνο αντιπροσωπεύει σισπλατίνης με προσθήκη μιθραμυκίνη (0,01 μΜ). Καμπύλες αντιπροσωπεύουν δύο ανεξάρτητα πειράματα γίνονται εις τριπλούν με τυπικό σφάλμα του μέσου όρου.

Η

Ωστόσο, κατά την εξέταση της επίδρασης των μιθραμυκίνη στην ευαισθησία των LCLs με σισπλατίνη, εμείς δεν παρατηρούμε τον ίδιο βαθμό ενισχυμένη αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων. Μιθραμυκίνη μόνος απέναντι 4 LCLs προκάλεσε μία μέση αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης του 63,1% (± 12,8) σε 0,01 μΜ (Εικ. S2). Η καμπύλη απόκρισης δόσης για LCLs μετατοπίστηκε προς τα κάτω κατά μέσο όρο περίπου 17% όταν μιθραμυκίνη προστέθηκε. Για τις γραμμές όγκων η καμπύλη δόσης-απόκρισης μετατοπίστηκε προς τα κάτω κατά προσέγγιση 26% κατά μέσο όρο. Η τιμή p του όρου αλληλεπίδρασης ήταν

P

& lt? 0,0001. Αυτό, μαζί με τα αποτελέσματα της απόπτωσης, υποστηρίζει την ιδέα ότι μειωμένη έκφραση του

eps8

μέσω μιθραμυκίνη δεν είναι εξίσου επιβλαβής για LCL επιβίωση, όπως είναι για καρκινικές κυτταρικές σειρές. Μιθραμυκίνη προκαλεί μεγαλύτερη ευαισθησία στα κύτταρα NSCLC χωρίς μετάλλαξη του EGFR και ενδεχομένως άλλων τύπων καρκίνου ιστού, όπως φαίνεται από τα αποτελέσματά μας σε καρκινικών κυττάρων της ουροδόχου κύστης γραμμή, HTB9.

Συζήτηση

Στην παρούσα μελέτη, αξιολογήσαμε

eps8

ως πιθανός στόχος για θεραπεία συνδυασμού με σισπλατίνη.

eps8

επιλέχθηκε με βάση τα προηγούμενα προκλινικά αποτελέσματα χρησιμοποιώντας GWAS πολλαπλών κυτταρικών φαινοτύπων: σισπλατίνη επαγόμενη κυτταροτοξικότητα και σισπλατίνη απόπτωση που επάγεται όπως μετράται με κασπάσης 3/7 ενεργοποίησης. Το SNP (ιντρονική να

eps8

), rs4343077, σχετίστηκε με σισπλατίνη επαγόμενη κυτταροτοξικότητα και την απόπτωση όπως επίσης και την αρχική τιμή έκφραση των γονιδίων στόχων 28. Μετά knockdown του

eps8

έκφραση σε 5 LCLs, παρατηρήσαμε μια σημαντική μείωση στην κυτταρική ευαισθησία στη σισπλατίνη όπως μετράται με αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης και της κασπάσης 3/7 ενεργοποίησης (

P

= 1.98 × 10

-7 και

P

= 0,004, αντίστοιχα) σε όλη LCLs. Λογοτεχνία στοιχεία έδειχναν

eps8

νοκ ντάουν σε κυτταρικές σειρές όγκων αυξημένη κυτταρική ευαισθησία στην σισπλατίνη [13], [15]. Τα αποτελέσματά μας συμφωνούν με αυτά τα ευρήματα, που δείχνουν ότι

eps8

ρύθμιση προς τα κάτω ευαισθητοποιεί Α549 καρκίνου του πνεύμονα κυττάρων στη θεραπεία με σισπλατίνη. Εμείς επεκταθεί μελέτες μας σε άλλες μοριακά ορίζεται κυτταρικές σειρές πνεύμονα και μία κυτταρική γραμμή κύστη καθώς LCLs.

eps8

knockdown σε LCLs εξής μιθραμυκίνη αγωγή είχε ως αποτέλεσμα μια μείωση στην αποπτωτική δραστικότητα όταν μιθραμυκίνη συνδυάστηκε με σισπλατίνη, συγκριτικά με μόνη τη σισπλατίνη. Παρά το γεγονός ότι οι μετρήσεις των κυττάρων κυτταροτοξικότητα έδειξε μια μικρή αύξηση της ευαισθησίας του LCLs στη σισπλατίνη εξής μιθραμυκίνη έκθεση, την ευαισθησία των καρκινικών κυτταρικών σειρών ήταν σημαντικά μεγαλύτερη με μιθραμυκίνη προσθήκη σε σύγκριση με LCLs. Η εξαίρεση ήταν η NSCLC H1975 κυτταρική σειρά με μια μετάλλαξη του EGFR. Αυτό συνεπάγεται knockdown του

eps8

είτε μέσω siRNA ή της χρήσης ενός αναστολέα όπως μιθραμυκίνη μπορεί να είναι μια στρατηγική για την αύξηση της ευαισθησίας όγκου σε σισπλατίνη.

eps8 είναι μια ογκοπρωτεΐνη που συμβάλλουν στην κακοήθη μετασχηματισμό σε κύτταρα όγκου [12], [19]. Είναι ένα υπόστρωμα του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) και συμμετέχει σε EGFR σηματοδότηση μέσω Rac, και της διακίνησης μέσω Rab5 [20]. tri-πολύπλοκη σχέση της με την

SOS1

και

ABI1

έχει βρεθεί να είναι ένα ουσιαστικό συστατικό για lysophosphatidic κυτταρική μετανάστευση οξέος διεγείρεται και ενεργοποίηση Rac, η οποία έχει βρεθεί ότι παίζει σημαντικό ρόλο στην μετάσταση καρκίνου των ωοθηκών [21]. Επίπεδα

eps8

έχουν επίσης υλοποιηθεί ως προγνωστικό εργαλείο για τους ασθενείς κατά τα αρχικά στάδια του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας [13]. Οι ασθενείς που έχουν υψηλότερη έκφραση του

eps8

τείνουν να αντιμετωπίζουν parametrial εισβολή, λεμφικό μετάσταση στους λεμφαδένες και μείωση στο ποσοστό επιβίωσης.

Αρχικά, Yang et al. (2010), διερευνήθηκε μιθραμυκίνη, ένα αντιβιοτικό από τα

Streptomyces

ειδών, ως δυνητικός αναστολέας της

eps8

. Καθόρισαν ότι μιθραμυκίνη μειώνει τα επίπεδα του mRNA και της πρωτεΐνης του

eps8

σε μια ανθρώπινη κυτταρική σειρά ορθοκολικού αδενοκαρκινώματος επιθηλιακών και ένα ανθρώπινο καρκίνωμα πνεύμονα επιθηλιακή κυτταρική γραμμή. Επιπλέον,

eps8

ρύθμιση προς τα κάτω, μέσα από μιθραμυκίνη αγωγή, προκαλεί σημαντική μείωση στην ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων και την ικανότητά της μετανάστευσης [22].

Μιθραμυκίνη υπήρξε μια εγκεκριμένη κλινική αντικαρκινικό φάρμακο από το 1970 [23] και που χρησιμοποιούνται στις Ηνωμένες Πολιτείες για την κλινική θεραπεία της νόσου του Paget, καρκίνωμα των όρχεων, και υπερασβεστιαιμία σε ασθενείς που παρουσιάζουν κακοήθεια που σχετίζεται με βλάβες των οστών [24] – [28]. Ωστόσο, η χρήση της στη θεραπεία της θεραπείας έχει μειωθεί καθ ‘όλη τη διάρκεια των ετών, λόγω των αρνητικών συνεπειών του και στενό θεραπευτικό δείκτη [29]. Ασθενείς που λαμβάνουν θεραπεία με μιθραμυκίνη, για αυτές τις ασθένειες, έχουν παρατηρηθεί να βιώσουν γαστρεντερικό, ηπατική, νεφρική και του μυελού των οστών τοξικότητα, με αποτέλεσμα την ναυτία, εμετό, και αιμορραγία [30]. Παρά σοβαρές παρενέργειες του, υπήρξε ένα ανανεωμένο ενδιαφέρον για μιθραμυκίνη τώρα ότι η κατανόηση των αλληλεπιδράσεων του στο μοριακό επίπεδο εξελίσσεται [29].

Μιθραμυκίνη έχει βρεθεί να αλληλεπιδρά με τις περιοχές DNA πλούσιο σε GC που βρίσκεται στο η μικρή αύλακα του DNA [29], [31] – [33], η οποία επί του παρόντος πιστεύεται ότι για την πρόληψη της πρωτεΐνης ειδικότητα παράγοντα μεταγραφής 1 (SP1) από σύνδεση σε μια ποικιλία προαγωγέων του πρωτο-ογκογονίδια. Ωστόσο, η δέσμευση Sp1 περιοχές που δεν έχουν σχέση με ένα υποσύνολο των πρωτο-ογκογονιδίων φαίνεται να παραμείνει ανεπηρέαστη, όπως p21 υποκινητή

Cip1 /WAF1 [29]. Ως εκ τούτου, μιθραμυκίνη μπορεί να μην είναι ειδικά για αναστολή Sp1 και θα μπορούσαν ενδεχομένως να στοχεύσουν ένα ογκογονίδιο ανάντη του Sp1 αλληλεπίδρασης. Έχει προηγουμένως ανακαλύψει ότι μιθραμυκίνη μειώνει επίσης την έκφραση του

c-myc

,

c-myb

,

c-src

,

c-met

, και FOXM1 [22], [34]? Ωστόσο, μιθραμυκίνη αυξάνει τα επίπεδα της FOXO3a [34], έναν παράγοντα μεταγραφής που ρυθμίζει την απόκριση βλάβη του DNA. Μπορεί να υπάρχει μια πιθανότητα ότι αυτά τα γονίδια είναι αλληλένδετα σε ένα μονοπάτι προς τα κάτω του στόχου μιθραμυκίνη του.

Για παράδειγμα,

eps8

έχει επίσης αποδειχθεί ότι ρυθμίζει προς τα πάνω FOXM1 [35], ένα σημαντικό παράγοντα για την ανάπτυξη και εξέλιξη ορισμένων καρκίνων [36], η οποία είναι γνωστό ότι συνδέεται άμεσα με SP1 [37], [38]. SP1 και FOXM1 έχει αποδειχθεί ότι μετενεργοποιήσει υποστηρικτές του

c-myc

συνεργικά [38]. Επιπλέον,

eps8

εξασθένησης έχει βρεθεί ότι μειώνει τα επίπεδα της

Src

,

Shc

και

ΡΑΚ

(επίσης γνωστή ως

ΡΤΚ2

), μία ενδοκυτταρική κινάση τυροσίνης που συμμετέχουν στην κυτταρική προσκόλληση και την κινητικότητα [39]. FOXO3a μπορεί επίσης να ρυθμίζεται από την παρουσία ή απουσία του

eps8

μέσω διαφόρων οδών, είτε μέσω ΡΙ3Κ /ΑΚΤ /mTOR σηματοδότηση [40] ή μέσω του μονοπατιού Ras-Raf ΜΕΚ-ΕΚΚ-[41]. Shiota et al. (2010) ερεύνησαν αντίσταση σισπλατίνη και προσδιορίστηκε ότι η σισπλατίνη ανθεκτικά κύτταρα έγινε ευαισθητοποιημένα σε θεραπεία μέσω της επαγωγής FOXO3a από μιθραμυκίνη [34]. Μια μείωση στην σηματοδότηση ΑΚΤ ενεργοποιεί FOXO3a και επάγει την απόπτωση [36]? Ως εκ τούτου, είναι πιθανό ότι η μείωση του

επίπεδα eps8

μειώνεται ΑΚΤ, προκαλώντας φωσφορυλίωση FOXO3a και τα καρκινικά κύτταρα να υποστούν απόπτωση, αντί της συνεχούς πολλαπλασιασμού.

Λαμβάνοντας μια συλλογική ματιά στην βιβλιογραφία και μας Αποτελέσματα φαίνεται ενδιαφέρον το γεγονός ότι η κυτταρική σειρά καρκίνου του πνεύμονα τα οποία δεν παρουσίασαν αυξημένο κυτταρικό θάνατο με μιθραμυκίνη (H1975) έχει μετάλλαξη EGFR. Lung κυτταρική γραμμή όγκου H1975 έχει ένα σημείο μετάλλαξης στον βρόχο ενεργοποίησης προκαλώντας μια αλλαγή από λευκίνη σε αργινίνη (L858R) στο εξόνιο 21, καθώς και ένα δευτερεύον σημείο μετάλλαξης, Τ790Μ, μεταβάλλοντας τη φυσιολογική δραστηριότητα του EGFR [42]. Οι αναστολείς τυροσίνης EGFR χρησιμοποιείται συνήθως για να ευαισθητοποιήσει EGFR τύπους όγκων μεταλλαχθεί σε παράγοντες πλατίνας, ωστόσο EGFR όγκους φυσικού τύπου σπανίως απάντηση σε αυτούς τους αναστολείς [43]. Δυνητικά, η προσθήκη ενός σχήματος μιθραμυκίνη μπορεί να είναι ευεργετική για τους ασθενείς με EGFR φυσικού τύπου για να ευαισθητοποιηθεί σε θεραπεία πλατίνα μέσω αναστολής του

eps8

και κατάντη στόχοι, οι οποίοι παίζουν ένα μεγάλο ρόλο στον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων, την προσκόλληση και την κινητικότητα . Μια δόση μιθραμυκίνη αρκετά μεγάλο για να αναστείλει ορισμένα ογκογονίδια, αλλά αρκετά χαμηλή για να προκαλέσει όχι επιπλέον ανεπιθύμητες ενέργειες, θα επιτρέψει στον χημειοθεραπευτικό παράγοντα για να προκαλέσει πιο αποτελεσματικά κυτταρικό θάνατο των καρκινικών κυττάρων.

Συμπερασματικά, τα αποτελέσματά μας επικυρώνουν

eps8

συμμετοχή στο κελί ανταπόκριση στη σισπλατίνη θεραπεία. Αν και εξετάσαμε μιθραμυκίνη, μπορεί να υπάρχουν περισσότερες ειδικοί αναστολείς

eps8

αυτό το αποτέλεσμα σε μια μεγαλύτερη διαφορά μεταξύ καρκινικών κυττάρων και φυσιολογικών κυττάρων. ικανότητα Μιθραμυκίνη να μειώσει τα επίπεδα του

eps8

προκαλείται λιγότερο αποπτωτική δραστηριότητα LCLs από ό, τι με τη θεραπεία με μόνη τη σισπλατίνη. Μειωμένη έκφραση του

eps8

μέσω επεξεργασίας με μιθραμυκίνη είναι λιγότερο επιβλαβείς για τα φυσιολογικά κύτταρα (όπως μετράται σε LCLs) σε σύγκριση με τα καρκινικά κύτταρα. Συλλογικά, τα δεδομένα μας παρέχει περαιτέρω επιβεβαίωση του ρόλου και της σημασίας του

eps8

στην τοξικότητα σισπλατίνη που προκαλείται και ως μια πολλά υποσχόμενη στόχο για τη βελτίωση της θεραπείας με σισπλατίνη.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

Συσχέτιση

eps8

επίπεδα έκφρασης και CEU LCL μετατραπεί καταγραφής τοις εκατό επιβίωσης (

P

= 0,047, r

2 = 0,05, κορυφή) και η δράση της κασπάσης 3/7 (

P

= 0,499, r

2 = 0,006, κάτω)

doi: 10.1371 /journal.pone.0082220.s001

(TIFF)

Εικόνα S2.

LCLs παρουσιάζονται σε διάφορες συγκεντρώσεις σισπλατίνης με την παρουσία και απουσία του μιθραμυκίνη. Τετράγωνο σχήμα αντιπροσωπεύει συγκεντρώσεις σισπλατίνης και μόνο, ενώ το τρίγωνο αντιπροσωπεύει σισπλατίνης με προσθήκη μιθραμυκίνη (0,01 μΜ). Καμπύλες αντιπροσωπεύουν δύο ανεξάρτητα πειράματα γίνονται εις τριπλούν με τυπικό σφάλμα του μέσου όρου

doi:. 10.1371 /journal.pone.0082220.s002

(TIFF)

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς είναι ευγνώμων στους Φαρμακογενωμική αντικαρκινικών παραγόντων κυτταρικής γραμμής πυρήνα στο Πανεπιστήμιο του Σικάγο για βοήθεια στην παραγγελία και την παραλαβή αυτών των κυτταρικών σειρών.