Αφηρημένο

θειορεδοξίνη αναγωγάσης 1 (TR1) είναι ένα σημαντικό ρυθμιστή οξειδοαναγωγής στα κύτταρα των θηλαστικών. Ως ένα σημαντικό αντιοξειδωτικό σεληνοπρωτεϊνης, TR1 πιστεύεται ότι συμμετέχουν στην πρόληψη του καρκίνου, αλλά είναι επίσης γνωστό ότι υπερ-εκφράζεται σε πολλά καρκινικά κύτταρα. Πολυάριθμες αντικαρκινικά φάρμακα αναστέλλουν TR1, και αυτή η πρωτεΐνη έχει προταθεί ως στόχος για θεραπεία του καρκίνου. Αναφέραμε προηγουμένως ότι μείωση των επιπέδων TR1 σε καρκινικά κύτταρα αντιστραφεί πολλά κακοήθη χαρακτηριστικά που υποδηλώνει ότι η ανεπάρκεια σε λειτουργία TR1 είναι αντιογκογένεσης. Η μοριακή βάση για το ρόλο TR1 στην ανάπτυξη του καρκίνου, ωστόσο, δεν είναι κατανοητός. Εδώ, βρήκαμε ότι, μεταξύ selenoproteins, TR1 είναι μοναδικά υπερεκφράζεται σε καρκινικά κύτταρα και knockdown του σε μια κυτταρική γραμμή καρκίνου του ποντικού οδηγείται από ογκογόνους

k-ras

οδήγησε σε μορφολογικές αλλαγές χαρακτηριστικές της γονικής (φυσιολογικά) κύτταρα, χωρίς σημαντική επίδραση στην ανάπτυξη των κυττάρων υπό κανονικές συνθήκες ανάπτυξης. Όταν αναπτύσσονται σε μέσο ορού με ανεπάρκεια, TR1 καρκίνος ελλειμματικά κύτταρα χάνουν αυτάρκεια της ανάπτυξης, εκδηλώνουν ένα ελαττωματικό εξέλιξη στη φάση S τους και μειωμένη έκφραση της DNA πολυμεράσης α, ενός ενζύμου σημαντικού στην αντιγραφή του DNA. Οι παρατηρήσεις αυτές παρέχουν αποδείξεις ότι TR1 είναι κρίσιμη για την αυτάρκεια σε σήματα ανάπτυξης των κακοηθών κυττάρων, ότι TR1 δρα κυρίως ως μια πρωτεΐνη προ-καρκίνου και είναι πράγματι ο πρωταρχικός στόχος στη θεραπεία του καρκίνου

Παράθεση:. Yoo ΜΗ , Xu XM, Carlson ΒΑ, Patterson μ.Χ., Gladyshev VN, Hatfield DL (2007) Στόχευση αναγωγάση της θειορεδοξίνης 1 Μείωση στα καρκινικά κύτταρα Αναστέλλει Self-επαρκή ανάπτυξη και DNA Replication. PLoS ONE 2 (10): e1112. doi: 10.1371 /journal.pone.0001112

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Μιχαήλ Blagosklonny, Ordway Research Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 25 Σεπτεμβρίου 2007? Αποδεκτές: 12 Οκτωβρίου του 2007? Δημοσιεύθηκε: 31, Οκτωβρίου 2007

Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της δήλωσης Creative Commons Public Domain που ορίζει ότι, μόλις τοποθετηθεί στο δημόσιο τομέα, το έργο αυτό μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο σκοπό

Χρηματοδότηση:. η έρευνα υποστηρίχθηκε από το εσωτερικό ερευνητικό πρόγραμμα των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας, Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, Κέντρο έρευνας για τον Καρκίνο, και από ΝΙΗ επιχορηγήσεις CA080946 και GM065204 να VNG. ADP χρηματοδοτήθηκε από το PRAT Fellowship, NIGMS, ΝΙΗ

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Διαιτητικά σελήνιο έχει ισχυρή πρόληψη του καρκίνου αμφότερες οι πρωτεΐνες που περιέχουν σελήνιο (selenoproteins) [2,3 και παραπομπές εκεί] και χαμηλού μοριακού βάρους σελήνιο ενώσεις που περιέχουν (selenocompounds) δραστηριότητα [1] και [2 και εκεί παραπομπές] έχουν εμπλακεί σε αυτή τη δραστηριότητα. Ο κύριος ρόλος του σεληνίου στην παροχή οφέλη για την υγεία είναι πιθανό μέσω της δράσης της selenoproteins [1]. Αναγωγάση της θειορεδοξίνης 1 (TR1) είναι ένα από τα 24 γνωστά selenoproteins σε τρωκτικά [4], είναι ένα σημαντικό αντιοξειδωτικό και οξειδοαναγωγής ρυθμιστή σε κύτταρα θηλαστικών [5,6 και παραπομπές εκεί] και έχει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη των θηλαστικών [7]. Ωστόσο, αυτό το ένζυμο φαίνεται να έχει αντίθετα αποτελέσματα στην ανάπτυξη καρκίνου, όπως έχει ενοχοποιηθεί τόσο στην πρόληψη του καρκίνου [8] και την προαγωγή του καρκίνου [9] – [12]. Για παράδειγμα, TR1 υποστηρίζει τη λειτουργία ρ53 και έχει άλλες δραστηριότητες ογκοκατασταλτικό, και η στόχευση της από καρκινογόνες, ηλεκτρονιόφιλη ενώσεις υποστηρίζουν για το ρόλο της στην πρόληψη του καρκίνου [13]. Εναλλακτικά, TR1 υπερεκφράζεται σε πολλά καρκινικά κύτταρα [9] – [12] και η αναστολή της από μία ποικιλία ισχυρών φαρμάκων κατά του καρκίνου μεταβάλλεται σχετίζονται με τον καρκίνο ιδιότητες πολλών όγκων και κακοήθων κυττάρων υποδηλώνοντας ότι αυτό το ένζυμο είναι ένας στόχος για τη θεραπεία του καρκίνου [9] -. [12], [14], [15]

δεν είναι σαφές κατά πόσον TR1 καρκίνου-πρόληψη ή καρκίνο-προώθηση ιδιότητες ασκούν μεγαλύτερη επιρροή για τον καρκίνο, αν αυτές οι αντικρουόμενες επιδράσεις λειτουργούν ταυτόχρονα ή είναι ειδικοί για τις διάφορες στάδια της ανάπτυξης του καρκίνου, και πώς αυτές οι ιδιότητες θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν στην πρόληψη ή /και θεραπεία του καρκίνου. Για να αντιμετωπιστούν αυτά τα ζητήματα, εξετάσαμε αρχικά τον ρόλο του TR1 σε μια κυτταρική σειρά καρκίνου του πνεύμονα ποντικιού και ένα ζωικό μοντέλο ποντικού και παρατήρησε ότι η μείωση των επιπέδων TR1 αντιστραφεί πολλές κακοήθεις ιδιότητες συμπεριλαμβανομένων tumorigenecity [16]. Εδώ, εξετάσαμε λειτουργία TR1 και ρόλους στην ανάπτυξη καρκίνου σε έναν κακοήθη κυτταρική γραμμή ποντικού για τα οποία η αντίστοιχη γονική (κανονική) κυτταρική γραμμή ήταν διαθέσιμη, και περαιτέρω επαλήθευσε τα ευρήματα σε αρκετές κυτταρικές σειρές ανθρώπινου καρκίνου.

Αποτελέσματα

Δημιουργία των κακοήθων και γονικών κυτταρικών σειρών και την ανάλυση των επιπέδων τους TR1, μαζί με αρκετές καρκινικές κυτταρικές σειρές ανθρώπου

κύτταρα DT, τα οποία κωδικοποιούν ογκογόνο

k-ras

[17] [18], και τα κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 γονικού (έλεγχος) σημάνθηκαν με

75Se και τα προκύπτοντα εκχυλίσματα πρωτεΐνης σε ηλεκτροφόρηση για την εξέταση των επιπέδων του TR1 και άλλων selenoproteins (Εικ. 1Α, το άνω αριστερό πλαίσιο). Η 55 kDa TR1 είναι ένα από τα σημαντικότερα selenoproteins, μαζί με άλλα selenoproteins, επισημαίνονται σε αυτό το σχήμα. Σαφώς, τα κύτταρα DT έχουν υψηλότερες ποσότητες TR1 από κύτταρα ελέγχου. επίπεδα TR1 εξετάστηκαν επίσης στον έλεγχο και τα κύτταρα DT με κηλίδωση Western (Εικ. 1Α, κάτω αριστερά πάνελ), η οποία επιβεβαίωσε τα αυξημένα επίπεδα του TR1 στα κύτταρα DT. Είναι ενδιαφέρον ότι, η αυξημένη έκφραση TR1 ήταν σε βάρος άλλων selenoproteins, τα οποία ήταν σε μειωμένα επίπεδα σε κύτταρα DT σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου.

υποδεικνύεται κυτταρικές γραμμές σημάνθηκαν μεταβολικά με

75Se, τα προκύπτοντα πρωτεΐνη κυτταρικής εκχυλίσματα ηλεκτροφορήθηκαν και τα πηκτώματα εκτίθενται σε PhosphorImager (βλέπε Μέθοδοι). Οι selenoproteins προσδιορίζονται προηγουμένως σε εκχυλίσματα κυττάρων [25], [26] που υποδεικνύεται από ένα βέλος και το όνομα για το δικαίωμα του κάθε πίνακα. TR1 επίσης προσδιορίζονται από κηλίδωση Western σε εκχυλίσματα πρωτεΐνης από κάθε κυτταρική σειρά, όπως φαίνεται στα κάτω πάνελ. (Α, αριστερό πάνελ) ελέγχου (γονική? ΝΙΗ3Τ3) και κύτταρα DT. (Α, δεξιός πίνακας) ΝΙΗ3Τ3 (έλεγχος, γονικά κύτταρα που χρησιμοποιούνται στην παραγωγή κυττάρων DT), LLC1 (Lewis καρκίνωμα ποντικού πνεύμονα), ACHN (ανθρώπινο νεφρό καρκίνωμα νεφρικών κυττάρων), Α549 (ανθρώπινου πνεύμονα μη-μικροκυτταρικό καρκίνωμα), HCT116 ( αδενοκαρκινώματος κύτταρο ανθρώπινου κόλον) και SNB19 (γλοιοβλαστώματος ανθρώπινου κυττάρου). ΝΙΗ3Τ3 χρησιμοποιήθηκε σαν κυτταρική γραμμή δείκτης για τη σύγκριση των επιπέδων TR1 σε ένα φυσιολογικό κύτταρο γραμμή προς τις κακοήθεις κυτταρικές γραμμές. (Β) DT /pU6-m3 και DT /siTR1. DT (που λαμβάνεται με υπερέκφραση μεταλλακτικών

k-ras

σε ΝΙΗ3Τ3) κύτταρα διαμολύνθηκαν σταθερά με τον φορέα pU6-m3 (έλεγχος) ή φορέα knockdown siTR1, αντιστοίχως (βλέπε Μέθοδοι).

Η

Επιπλέον, το καρκίνωμα του ποντικιού Lewis πνεύμονα (LLC1) κύτταρα [16] μαζί με τέσσερις ανθρώπινες κυτταρικές σειρές, μαζί με, επισημάνθηκαν με

75Se και σεληνοπρωτεϊνης έκφρασης αναλύθηκαν (Εικ. 1Α, δεξιά άνω πάνελ). Αν και δεν αντίστοιχο κύτταρα ελέγχου ήταν διαθέσιμα για τις εν λόγω κακοήθεις κυτταρικές σειρές, συγκρίναμε τα πρότυπα επισήμανσης σεληνοπρωτεϊνης τους με εκείνη των φυσιολογικών κυττάρων ΝΙΗ3Τ3. Το μόνο σημασμένο σεληνοπρωτεϊνη που φάνηκε να υπερεκφράζεται σε κάθε μία από τις γραμμές καρκινικών κυττάρων ήταν TR1. Η ανάλυση στυπώματος Western έδειξε επίσης υψηλά επίπεδα TR1 στους κακοήθεις κυτταρικές σειρές ανθρώπου και ποντικού (Σχ. 1Α, κάτω δεξιά πλαίσιο).

Σταθερή διαμόλυνση DT και ελέγχου κυττάρων με ένα φορέα knockdown siRNA-TR1 και τον χαρακτηρισμό τους κύτταρα

DT επιμολύνθηκαν σταθερώς με το knockdown siRNA-TR1 (ονομαζόμενο DT /siRNA) ή φορέα ελέγχου (που ορίζεται DT /pU6-m3) (Εικ. 1 Β, άνω πίνακας). TR1 ήταν σχεδόν απούσα στην DT /siRNA επιμολυσμένα κύτταρα όπως καταδεικνύεται από μεταβολικές

επισήμανση 75Se και στύπωμα Western (Σχ. 1Β, κάτω πλαίσιο).

Εξετάστηκαν οι φαινότυποι των δύο διαμολυσμένες κυτταρικές σειρές DT και συγκρίθηκαν με εκείνες των μη επιμολυσμένα DT και ελέγχου κύτταρα (Εικ. 2). Τα κύτταρα ελέγχου αυξήθηκαν σε μονόστρωμα και σφιχτά επισυνάπτεται στο τρυβλίο καλλιέργειας που είναι χαρακτηριστικά των φυσιολογικών κυττάρων, ενώ DT /pU6-m3 και DT κύτταρα αναπτύχθηκαν σε πολυστρωματικές και χαλαρά επισυνάπτεται στο τρυβλίο καλλιέργειας που είναι χαρακτηριστικά των κακοήθων κυττάρων (Εικ. 2Α). Ωστόσο, τα κύτταρα DT /siRNA είχε σημαντικά μειωμένη ικανότητα να αυξάνεται σε πολυστρωματικές και ήταν πιο σφιχτά επισυνάπτεται στο δίσκο καλλιέργειας, είτε από DT /pU6-m3 ή DT κύτταρα.

(Α) ελέγχου (ΝΙΗ3Τ3, γονική) , η DT, η DT /pU6-m3 και DT /siTR1 κύτταρα. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε πλάκες καλλιέργειας και φωτογραφήθηκαν κατά τη διάρκεια της εκθετικής ανάπτυξης (βλέπε Μέθοδοι). (Β) Anchorage-ανεξάρτητη ανάπτυξη του ελέγχου, η DT, η DT /pU6-m3 και DT /siTR1 κύτταρα νοκ ντάουν. Χίλια κύτταρα εναιωρήθηκαν σε μαλακό άγαρ και αναπτύχθηκαν για δύο εβδομάδες. Οι πλάκες στη συνέχεια χρωματίστηκαν με ΙΝΤ τη διάρκεια της νύχτας και φωτογραφήθηκαν. Λεπτομέρειες δίνονται στο Μέθοδοι. (C) ρυθμοί αύξησης του ελέγχου, η DT /pU6-m3 και DT /siTR1 κύτταρα υπό κανονικές και ορό ανεπάρκεια συνθήκες. Έλεγχος, κύτταρα DT /pU6-m3 και DT /siTR1 σπάρθηκαν (2 × 10

5 κύτταρα /60 mm δίσκο) και αναπτύχθηκαν υπό κανονικές συνθήκες ανάπτυξης (αριστερό πάνελ), και τα κύτταρα DT /pU6-m3 και DT /siTR1 ήταν σπάρθηκαν (5 × 10

5 κύτταρα /60 mm δίσκο) και αναπτύχθηκαν σε μέσο (δεξί πάνελ) ορό με έλλειψη. Οι ρυθμοί ανάπτυξης σε μέσο άνευ ορού με ανεπάρκεια συγκρίθηκαν με εκείνα που ελήφθησαν υπό κανονικές συνθήκες ανάπτυξης.

Η

Δεδομένου ότι πολλά καρκινικά κύτταρα μπορούν να αναπτυχθούν τα μη αγκυροβολημένα σε μαλακό άγαρ, αλλά περισσότερα φυσιολογικά κύτταρα δεν μπορούν, η ικανότητα του ελέγχου, DT, κύτταρα DT /pU6-m3 και DT /siTR1 να αναπτύσσονται σε μαλακό άγαρ εξετάστηκε (Εικ. 2Β). DT και η DT /pU6-m3 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μαλακό άγαρ, ενώ τα κύτταρα ελέγχου και DT /siTR1 αυξήθηκε ελάχιστα κάτω από αυτές τις συνθήκες. Οι ιδιότητες ανάπτυξης σε μαλακό άγαρ από δύο ανθρώπινες κυτταρικές σειρές, Α549 και HCT116, μετά την επιμόλυνση με τον αντίστοιχο φορέα knockdown και τον έλεγχο των φορέων των ανθρωπίνων TR1 λείπει siTR1 εξετάστηκαν επίσης (βλέπε Εικ. S1 και σχήμα λεζάντα). Είναι ενδιαφέρον, οι δύο κυτταρικές σειρές που κωδικοποιούν siTR1 χάσει την ικανότητά τους να αναπτύσσονται σε μαλακό άγαρ.

Η αυτάρκεια σε σήματα ανάπτυξης

Η αυτάρκεια σε σήματα ανάπτυξης έχει προταθεί ως ένας από τους έξι αποκτήσει δυνατότητες του φαινοτύπων του καρκίνου και το καταρράκτη σηματοδότησης Ras-Raf-ΜΑΡΚ είναι γνωστό ότι εμπλέκεται σε αυτή απέκτησε την ικανότητα που μιμούνται τα σήματα ανάπτυξης [19]. Εξετάσαμε την επίδραση της μείωσης TR1 σε αυτό το φαινότυπο με αυξανόμενη ελέγχου, DT /pU6-m3 και TR1 κύτταρα knockdown σε τακτική και ορό μέσα ανεπαρκή (Σχ. 2C). Υπό κανονικές συνθήκες ανάπτυξης, τόσο DT και η DT /siTR1 κυττάρων αυξήθηκε περισσότερο από το διπλάσιο του ποσοστού των κυττάρων ΝΙΗ3Τ3, ενώ κύτταρα DT /siTR1 αυξήθηκαν μόνο περίπου 10% λιγότερο αποτελεσματικά από ό, τι DT /pU6-m3 κυττάρων (αριστερό πάνελ, Σχ. 2C). Έτσι, TR1 knockdown δεν μείωσε την ανάπτυξη των κυττάρων DT, εξαιρουμένων των επιδράσεων που συνδέονται με TR1 ουσιαστικότητα για την κυτταρική ανάπτυξη. Όπως πολλοί κακοήθη κύτταρα αναπτύσσονται πιο αποτελεσματικά από ό, τι τα φυσιολογικά κύτταρα όταν καλλιεργούνται σε μέσο άνευ ορού με ανεπάρκεια, εξετάσαμε τις ικανότητες των δύο επιμολυσμένες κυτταρικές γραμμές να αναπτύσσονται σε συνθήκες άνευ ορού με ανεπάρκεια (δεξί πάνελ). κύτταρα DT /siTR1 αυξήθηκε κατά περίπου το ήμισυ του ποσοστού ως DT /pU6-m3 κύτταρα, υποδηλώνοντας περαιτέρω ότι ο καρκίνος που σχετίζεται με τις ιδιότητες των κυττάρων που επηρεάζονται ειδικά από το νοκ ντάουν TR1.

κυτταρικού κύκλου analsis

η ανάλυση κυτταρικού κύκλου ελέγχου, DT /siTR1 και DT /κυττάρων pU6-m3, όταν καλλιεργούνται σε μέσο άνευ ορού με ανεπάρκεια, διεξήχθη για να αποσαφηνιστεί η φάση επηρεάζεται από την μείωση στην έκφραση TR1 με αποτέλεσμα καθυστέρηση της ανάπτυξης (Εικ. 3). Οι τρεις κυτταρικές γραμμές αναπτύχθηκαν σε πλήρες μέσο επί μία νύκτα και στη συνέχεια τοποθετούνται σε μέσο χωρίς ορό με έλλειψη για 0, 24 και 48 ώρες. Τα κύτταρα επωάστηκαν με 5-βρωμο-2-δεοξυουριδίνη (BrdU) και χρωματίστηκαν με αντισώματα BrdU για την αξιολόγηση της αντιγραφής του DNA και επωάστηκαν με 7-αμινο-ακτινομυκίνη (7-AAD) για την αξιολόγηση γονιδιωματικό DNA. Αυτά τα κύτταρα στη συνέχεια αναλύθηκαν με FACS (Σχ. 3Α) και οι κατάλληλες περιοχές ποσοτικοποιήθηκαν (Σχ. 3Β). Οι τρεις κυτταρικές σειρές είχαν μεγάλους αριθμούς κυττάρων τόσο στην G0-G1 και τις φάσεις S όταν αναλύονται αμέσως μετά την ενεργή ανάπτυξη σε πλήρες μέσο, ​​αν και DT /siTR1 είχε περισσότερα κύτταρα στην φάση S, ενώ οι δύο άλλες κυτταρικές σειρές είχαν περισσότερα κύτταρα στο G0-G1 φάση (βλ Ώρα μηδέν στα Σχ. 3Α και Β). Η κυτταρική γραμμή ελέγχου είχαν περίπου το 90% των κυττάρων του συγκρατείται στο G0-G1 φάση όλη ανάπτυξη σε μέσο άνευ ορού με ανεπάρκεια. Η παρατήρηση αυτή σίγουρα δείχνουν ότι τα περισσότερα από τα κύτταρα ελέγχου συγκρατούνται σε κατάσταση ηρεμίας (G0), η οποία συμφωνεί με την αδυναμία τους να αναπτύσσονται υπό αυτές τις συνθήκες ανάπτυξης. Μια σημαντική διαφορά σημειώθηκε στις ποσότητες των κυττάρων σε DT /pU6-m3 και DT /siTR1 γραμμές κυττάρων σε 24 ώρες της ανάπτυξης στην G0-G1 και τις φάσεις S από το ότι DT κύτταρα /pU6-m3 είχε ένα πολύ μεγαλύτερο ποσοστό των κυττάρων του στη φάση S και κατώτερο ποσοστό στη φάση G0-G1 από ό, τι DT /siTR1. Εντός της φάσης S, DT /pU6-m3 είχε περίπου 1,5 φορές περισσότερα κύτταρα στις αρχές από αργά S, ενώ DT /siTR1 είχε περίπου 3 φορές περισσότερα κύτταρα στις αρχές από αργά S. Αν και τα ποσά των κυττάρων σε αμφότερες τις επιμολυσμένες κυτταρικές σειρές στο G0-G1 και τις φάσεις S προσεγγίζονται στενότερα μεταξύ τους σε 48 ώρες ανάπτυξης, η μεγάλη απόκλιση ήταν ακόμα παρούσα μεταξύ των πρώιμων και όψιμων φάσεων S στις δύο αυτές κυτταρικές σειρές. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η αντιγραφή του DNA συνελήφθη στην πρώιμη φάση S σε κύτταρα DT /siTR1. Θα πρέπει επίσης να σημειωθεί ότι τα κύτταρα DT /siTR1 έχουν υψηλότερες ποσότητες κυτταρικού πληθυσμού τους διατηρούνται στην φάση G2-M, είτε από τον έλεγχο ή DT /pU6-m3 κύτταρα κατά την ανάλυση της ανάπτυξης που υποδηλώνει ότι περισσότερα κύτταρα εντός του πληθυσμού DT /siTR1 έχουν πρόβλημα μεταπίπτουν σε μίτωση. Η πιθανή βλάβη που προκαλεί μεγαλύτερη καθυστέρηση των κυττάρων DTsiTR1 στο G2-M φάση εντάλματα περαιτέρω έρευνα, αλλά δεν δόθηκε συνέχεια σε αυτή τη μελέτη, δεδομένου ότι δεν φαίνεται να επηρεάζει τη συνολική μείωση της DT /siTR1 ρυθμό ανάπτυξης σε σύγκριση με εκείνη της DT /pU6-m3 σε μέσο άνευ ορού με ανεπάρκεια (βλέπε Σχ. 2C).

Έλεγχος, κύτταρα DT /pU6-m3 και DT /siTR1 αναπτύχθηκαν σε μέσο χωρίς ορό με έλλειψη για 0, 24 και 48 ώρες και επωάζονται με BrdU για 6 ώρες. Τα συλλεγμένα κύτταρα βάφτηκαν με αντι-BrdU αντίσωμα για την παρακολούθηση πρόσφατα αναπαραχθεί γενωμικού DNA και 7-AAD να παρακολουθεί ολόκληρο γονιδιωματικό DNA. (Α) βαμμένα κύτταρα αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής και (Β) ποσοτικοποιούνται σε κάθε φάση του κύκλου ανάπτυξης με FlowJo. Φάσεις του κύκλου ανάπτυξης, G0-G1, S φάση (Early S και Late S) και G2-M έδειξαν και οι τιμές που δίδονται αντιπροσωπεύουν την επί τοις εκατό του συνολικού πληθυσμού των κυττάρων. Λεπτομέρειες των πειραμάτων παρουσιάζονται στο σχήμα δίδεται στις Μεθόδους.

Η

Ανάλυση των παραγόντων που πολυμεράσης DNA

Για να διαλευκανθεί οποία το συστατικό (α) μπορεί να εμπλέκεται στην αντιγραφή του DNA προκαλώντας μείωση της συνολικό ποσοστό αύξησης σε μέσο άνευ ορού με ανεπάρκεια σε κύτταρα DT /siTR1 σύγκριση με /pU6-m3 κύτταρα DT, εξετάσαμε τα επίπεδα του DNA Ροΐ α, β, γ και ε, Cdc45 και PCNA τα οποία όλα διαδραματίζουν κάποιο ρόλο σε αυτή τη διαδικασία [20 ]. Western αναλύσεις αυτών των συστατικών πραγματοποιήθηκαν με τις τρεις κυτταρικές σειρές σε κάθε χρονικό σημείο (Εικ. 4). DNA α Pol και Cdc45 έχουν πολύ εμπλουτισμένο σε αμφότερες τις επιμολυσμένες κυτταρικές σειρές σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου σε καθένα από τα χρονικά σημεία. Είναι ενδιαφέρον ότι, το DNA Ροΐ α φάνηκε να μειώνεται σε κύτταρα DT /siTR1 σύγκριση με DT κύτταρα /pU6-m3 στους 24 hrs και πλέον σημαντικά στις 48 ώρες. Επιπλέον, τα επίπεδα του DNA Ροΐ ε φάνηκε να μειώνεται στον έλεγχο και κύτταρα DT /siTR1 σύγκριση με DT /pU6-m3 κύτταρα σε 48 ώρες, ενώ το DNA Ροΐ β φάνηκε να μειώνεται σε όλα τα τρία χρονικά σημεία στην DT /siTR1 σύγκριση είτε έλεγχο ή DT /pU6-m3 κύτταρα. Φαίνεται ότι η πιο έντονη επίδραση της μείωσης TR1 σε κύτταρα DT /siTR1 είναι στο DNA Ροΐ α με αποτέλεσμα τη μειωμένη ανάπτυξη αυτών των κυττάρων σε μέσο άνευ ορού με ανεπάρκεια. Ωστόσο, η μείωση TR1 μπορεί επίσης να οδηγήσει στη μείωση των επιπέδων του DNA Ροΐ β, ενώ τα μειωμένα επίπεδα DNA Ροΐ ε σε 48 ώρες σε έλεγχο και κύτταρα DT /siTR1 μπορεί να προκύψει από το μέσο ανάπτυξης ορού με ανεπάρκεια.

τα επίπεδα έκφρασης των συστατικών DNA πολυμεράση, DNA Ροΐ α, β, δ και ε, Cdc45 και PCNA, τον έλεγχο, DT /pU6-m3 και DT /siTR1 κύτταρα αναλύθηκαν με κηλίδωση Western. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μέσο χωρίς ορό με έλλειψη για 0, 24 και 48 ώρες, συλλέχθηκαν, κυτταρικά εκχυλίσματα πρωτεΐνης παρασκευάζονται και ηλεκτροφορήθηκαν όπως περιγράφεται στις Μεθόδους.

Η

Συζήτηση

TR1 έχει πολλές κυτταρικές λειτουργίες και ευρέως εμπλέκονται σε κυτταρικές διαδικασίες που ρυθμίζονται από οξειδοαναγωγής [9] – [12]. Για παράδειγμα, TR1 έχει ρόλο στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, την αγγειογένεση, τη μεταγραφή, επιδιόρθωση του DNA και χρησιμεύει στην αντιοξειδωτική άμυνα και την οξειδοαναγωγική ρύθμιση της κυτταρικής σηματοδότησης (βλέπε σχόλια [9] – [12]). κύρια λειτουργία του είναι να διατηρεί πιστεύεται κυτοσολική θειορεδοξίνη (Trx1) σε ανηγμένη κατάσταση χρησιμοποιώντας NADPH ως δότης ηλεκτρονίων [21]. Με τη σειρά του, Trx1 δωρίζει αναγωγικά ισοδύναμα σε δισουλφίδια πυρηνικών και κυτταροπλασματικών πρωτεϊνών διατήρηση μειωμένη υπολείμματα κυστεΐνης σε αυτές τις πρωτεΐνες. Στο παρόν, έχουμε διευκρινιστεί ο ρόλος του TR1 σε αυτάρκεια της ανάπτυξης δείχνοντας ότι η αναστολή της αντιγραφής του DNA σε μία κακοήθη knockdown κυτταρική γραμμή TR1 συνδέεται με μια μείωση στην έκφραση α DNA Pol. Επιπλέον, άλλες μελέτες έχουν δείξει ότι η αντιγραφή του DNA μπορεί να επιβραδυνθεί με τον περιορισμό της σύνθεσης του DNA από το θειορεδοξίνης έχει ένα ρόλο στη διατήρηση της ενδοκυτταρικής πισίνα δεοξυνουκλεοτιδίων [11], [22], [23]. Ωστόσο, απέκλεισε αυτό το ενδεχόμενο με την εξέταση των πισίνες δεοξυνουκλεοτιδίων στον έλεγχο, η DT, η DT /pU6-m3 και DT /siTR1 κύτταρα και δείχνει ότι δεν μεταβάλλεται κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης σε μέσο ορό ανεπάρκεια (βλ. Σχήμα S2).

Πολλές λειτουργίες και ιδιότητες TR1 υποδηλώνουν ότι αυτή η σεληνοπρωτεϊνης διαθέτει λειτουργίες κατά του καρκίνου: 1) το οξειδωτικό στρες είναι ένα από τα σημαντικότερα χαρακτηριστικά των καρκινικών κυττάρων και TR1 είναι ένας βασικός παράγοντας στην αντιοξειδωτική άμυνα μειώνοντας Trx1 και άλλες ρυθμιστικές αρχές οξειδοαναγωγής στα κύτταρα [ ,,,0],9] – [12]? 2) TR1 είναι απαραίτητη για τη σωστή λειτουργία του καταστολέα όγκων ρ53 [13]? 3) TR1 αναστολή από καρκινογόνο, ηλεκτρονιόφιλες ενώσεις που εμπλέκονται στην πρόληψη του καρκίνου [1]? και 4) το σελήνιο που περιέχει αμινοξύ, Sec, καταλαμβάνει τη δραστική καταλυτική θέση TR1 [4] και το σελήνιο είναι γνωστό ότι έχει ισχυρές ιδιότητες πρόληψης του καρκίνου [1]. Ωστόσο, TR1 έχει επίσης εμπλακεί στην ανάπτυξη και τη συντήρηση των όγκων: 1), υπερεκφράζεται σε πολλούς όγκους και κυτταρικές γραμμές [9] – [12]? 2) διάφορα αντικαρκινικά φάρμακα είναι ισχυροί αναστολείς του TR1 που υποδηλώνει ότι αυτό το ένζυμο είναι ένας στόχος για τη θεραπεία του καρκίνου [9] – [14]? 3) η στοχευόμενη απομάκρυνση της TR1 αντιστρέφει μορφολογία και άλλα χαρακτηριστικά του καρκίνου των κακοηθών κυττάρων [16] (βλέπε επίσης σχήματα 2 και 3 και κειμένου S1).? και 4) έλλειψη σεληνίου έχει αναφερθεί να μειώνεται ο σχηματισμός όγκου σε ορισμένα μοντέλα καρκίνου σε ζώα [24].

Πώς μπορεί ο ρόλος του TR1 στην ανάπτυξη καρκίνου να συμβιβάζεται με το ρόλο της στην καταστολή των όγκων, καθώς και το γνωστό ιδιότητες του σεληνίου κατά του καρκίνου, το οποίο είναι ένα καταλυτικό συστατικό του TR1; Είναι δελεαστικό να υποθέσουμε ότι επαρκείς ποσότητες διαιτητικών σεληνίου σε γενικές γραμμές, και ένα επαρκές επίπεδο έκφρασης του TR1 ειδικότερα, διατήρηση της ομοιόστασης κυτταρικής οξειδοαναγωγής σε φυσιολογικά κύτταρα, προστατεύοντάς τα από το οξειδωτικό στρες, οι μεταλλάξεις στο DNA και βλάβη σε άλλα κυτταρικά συστατικά. Έτσι, TR1, μαζί με άλλα selenoproteins, μπορεί να λειτουργήσει στην πρόληψη του καρκίνου με αναστολή κακοήθη μετασχηματισμό. Ωστόσο, σε νέες αναδυόμενες όγκους, οι απαιτήσεις για TR1 αυξήσει σημαντικά καθώς αυτή η πρωτεΐνη φαίνεται να απαιτείται για να στηρίξει την ανάπτυξη του όγκου, πιθανόν λόγω της αυξημένης ζήτησης για τη μείωση των ισοδυνάμων του μέσω της οδού Trx1 και, όπως φαίνεται σε αυτό το έργο, την αντιγραφή του DNA. Η πρόταση αυτή εξηγεί και την ισχυρή δράση πρόληψης του καρκίνου του διατροφικού σεληνίου και τις αντιθέσεις τους ρόλους του TR1 στην πρόληψη και την προαγωγή του καρκίνου. Επιπλέον, η μελέτη αυτή παρέχει τη βάση για να εξηγήσει ανόμοια στοιχεία της βιβλιογραφίας σχετικά με το ρόλο της αινιγματικής πρωτεΐνης στον καρκίνο και εξυψώνει TR1 ακόμη περισσότερο ως [8] – [12], [14] – [16] θα έχουν αναμφίβολα σημαντικές επιπτώσεις στην πώς μπορούμε όραση της πρόσληψης σεληνίου στη διατροφή των ανθρώπων και άλλων θηλαστικών. Είναι γνωστό για λίγο χρόνο ότι οι δίαιτες που περιέχουν επαρκή ή συμπληρωματικές ποσότητες σεληνίου έχουν ευεργετικά αποτελέσματα στην πρόληψη ορισμένων μορφών καρκίνου, ενδεχομένως μέσω της δράσης του εμπλουτισμού του πληθυσμού σεληνοπρωτεϊνης [1]. Ωστόσο, προσοχή θα πρέπει να εκφράζονται σε ότι μόλις αρχίσει μια κακοήθεια, τότε επαρκείς ή εμπλουτισμένο ποσότητες σεληνίου στη διατροφή μπορεί να χρησιμεύσει για την οδήγηση ογκογένεση. Η μελέτη μας προσθέτει ένα σημαντικό στρώμα για την κατανόηση του ρόλου των διαδικασιών οξειδοαναγωγής στις εξελίξεις του καρκίνου και τη χρήση της διατροφής στην πρόληψη και τη θεραπεία του καρκίνου.

Υλικά και Μέθοδοι

Υλικά