Αφηρημένο

Παρά την αξιοσημείωτη βελτίωση της μετεγχειρητικής 5-FU με βάση επικουρική χημειοθεραπεία, το ποσοστό υποτροπής των ασθενών με γαστρικό καρκίνο που υποβάλλονται σε θεραπευτική εκτομή ακολουθούμενη από την επικουρική χημειοθεραπεία παραμένει σημαντική. Ως εκ τούτου, είναι σημαντικό να προσδιοριστούν δείκτες πρόβλεψη για το χημειοθεραπευτικό αποτελεσματικότητα της 5-FU. Πρόσφατα εντοπίστηκαν NF-κΒ ως υποψήφια υποτροπής πρόβλεψη βιοδείκτη σε καρκίνο του στομάχου. Για να αξιολογηθεί η βιολογική σημασία του ΝΡ-κΒ στο πλαίσιο της 5-FU χημειοθεραπεία με βάση, αναλύσαμε την ΝΡ-κΒ-εξαρτώμενο βιολογική απόκριση κατά την κατεργασία με 5-FU σε κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου. Επτά γονίδια επάγεται από την αγωγή με 5-FU σε ένα ΝΡ-κΒ-εξαρτώμενο τρόπο ταυτοποιήθηκαν, πέντε από τα οποία είναι γνωστά στόχοι ρ53. Knockdown του

RELA

, το οποίο κωδικοποιεί την ρ65 υπομονάδα του ΝΡ-κΒ, μειωμένα και τα δύο επίπεδα πρωτεΐνης στόχου ρ53 και ρ53. Σε αντίθεση, NF-κΒ δεν επηρεάστηκε από

TP53

νοκ ντάουν. Δείξαμε επίσης ότι κυτταρικές σειρές που φέρουν Pro /Pro ομοζυγωτία σε codon72 ρ53 exon4, η οποία είναι σημαντικά για τη σύνδεση NF-κΒ σε ρ53, είναι πιο ανθεκτικές σε 5-FU από εκείνους με Arg /Arg ομοζυγωτία. Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι το ΝΡ-κΒ παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην απόκριση σε θεραπεία 5-FU σε κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου, με πιθανή αντισταθμιστική λειτουργία του ρ53. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η NF-κΒ είναι ένας πιθανός 5-FU-χημειοευαισθησία πρόβλεψη δείκτη που μπορεί να αντανακλά οδούς 5-FU που προκαλείται στρες-απόκριση, συμπεριλαμβανομένης ρ53

Παράθεση:. Endo F, Nishizuka SS, Kume Κ, Ishida Κ, Katagiri Η, Ishida Κ, et al. (2014) αντισταθμιστικής ρόλος του NF-κΒ στο p53 σε απάντηση 5-FU-Based χημειοθεραπεία για καρκίνο του γαστρικού Γραμμές κυττάρων. PLoS ONE 9 (2): e90155. doi: 10.1371 /journal.pone.0090155

Επιμέλεια: Θωμάς Γ Hofmann, γερμανικής Cancer Research Center, Γερμανία

Ελήφθη: 17 Οκτ 2013? Αποδεκτές: 28 Ιαν 2014? Δημοσιεύθηκε: 27 Φεβρουαρίου 2014

Copyright: © 2014 Endo et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από MIAST (Ιατρική Εταιρεία της Καινοτομίας από την προηγμένη επιστήμη και τεχνολογία) του έργου της Grant-in-Aid Στρατηγικών Ιατρικής Επιστήμης Ερευνητικό Κέντρο από το Υπουργείο Παιδείας, Πολιτισμού, Επιστήμης και Τεχνολογίας της Ιαπωνίας, 2010-2014 (SSN, K.Ku. , GW)? και Grant-in-Ενισχύσεις για την Επιστημονική Έρευνα (C) (11.863.286) (S.S.N.), και (12.877.914) (K.Ko.). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η πλειοψηφία του καρκίνου του στομάχου στον κόσμο διαγιγνώσκονται στην Ανατολική Ασία [1], όπου η καθιερωμένη θεραπεία για προχωρημένο γαστρικό καρκίνους παραμένει χειρουργική επέμβαση και χημειοθεραπεία. Πρόσφατα αναπτύχθηκε επικουρική χημειοθεραπευτικών σχημάτων μετά από θεραπευτική γαστρεκτομή για προχωρημένο καρκίνο του στομάχου έχουν σημειώσει αξιοσημείωτη πρόοδο όσον αφορά τον έλεγχο των υποτροπών και την ελεύθερη νόσου επιβίωση, ιδιαίτερα στην ιαπωνική πληθυσμού [2], [3]. Ωστόσο, το 30-40% των ασθενών που εξακολουθούν να βιώνουν υποτροπή παρά λαμβάνουν χημειοθεραπεία μετά από θεραπευτική γαστρεκτομή [3], γεγονός που υποδηλώνει ότι η επιλογή των ασθενών που βασίζεται στη μοριακή πληροφορία θα μπορούσε δυνητικά να είναι πολύ αποτελεσματική για την αύξηση της χημειοθεραπείας με τη μεσολάβηση μη υποτροπής και της επιβίωσης ποσοστά.

για να επιλέξετε για τους ασθενείς με καρκίνο του στομάχου που θα μπορούσαν να ωφεληθούν από τη χημειοθεραπεία, είναι σημαντικό να κατανοήσουμε ατομικές ευαισθησίες πριν από τη χημειοθεραπεία [4]. Μετεγχειρητική επικουρική χημειοθεραπεία του καρκίνου του στομάχου παρέχει μια ευκαιρία να δοκιμάσει τους όγκους των ασθενών που προέρχονται από πριν που λαμβάνουν χημειοθεραπεία. Σε μία προσπάθεια για τον εντοπισμό πιθανών βιοδεικτών σε αυτή τη ρύθμιση στο επίπεδο πρωτεΐνης, έχουμε αναφερθεί στο παρελθόν ένα σύστημα κυτταρικής γραμμής ελέγχου πίνακα χρησιμοποιώντας ποσοτική έκφραση της πρωτεΐνης profiling με δέσμες πρωτεΐνης Reverse-Phase (RPPAs) [5], [6] σε συνδυασμό με ένα κύτταρο- με βάση το σύστημα δοκιμασίας ανάπτυξη βασίζεται στην έννοια του NCI-60 του πίνακα ελέγχου κυτταρική γραμμή [7], [8]. Υποψήφια βιοδείκτες απομονώθηκαν με βάση συντελεστές συσχετισμού από την πρωτεϊνική έκφραση και ευαισθησία φαρμάκου μήτρας και στη συνέχεια περαιτέρω επικυρωθεί με τη χρήση χειρουργικά αφαιρεθεί δείγματα [9]. Με βάση αυτή την προσέγγιση που εντόπισε δύο βιοδείκτες στο επίπεδο πρωτεΐνης, συμπεριλαμβανομένων των ΝΡ-κΒ και ΙΝΚ, των οποίων τα επίπεδα είχε καλή συσχέτιση με χημειοθεραπευτικούς απόκριση. Η υψηλότερη έκφραση του ΝΡ-κΒ φάνηκε να συσχετίζεται με μία χειρότερη πρόγνωση, ενώ JNK έδειξε μια αντίστροφη συσχέτιση. Οι δείκτες αυτοί επίσης επικυρωθεί στο μοριακό επίπεδο χρησιμοποιώντας γαστρεντερικό καρκινικές κυτταρικές σειρές. Έχει αποδειχθεί ότι η siRNA μεσολάβηση knockdown του p65 επηρεάζει σχεδόν αποκλειστικά ευαισθησία 5-FU μεταξύ σήμερα χρησιμοποιούμενα χημειοθεραπευτικά φάρμακα? αλλά αυτό δεν είναι η περίπτωση για JNK knockdown [9]. Ως εκ τούτου, κατέληξε στο συμπέρασμα ότι η NF-κΒ διαδραματίζει κυρίαρχο ρόλο στη θεραπεία 5-FU και JNK μπορεί να αποτελεί ένδειξη της χρόνιας φλεγμονής του γαστρικού βλεννογόνου φόντο [10]. Ως προέκταση αυτής της μελέτης επικύρωσης, επιδιώξαμε να διερευνήσει αυτές τις πρωτεΐνες λειτουργικά και αποσαφήνιση του ρόλου του NF-κΒ ως μεταγραφικός παράγοντας άγχους που επάγεται από τη διάρκεια της θεραπείας 5-FU. Αξιολογήσαμε επίσης το ρόλο της ρ53 μετά από 5-FU-διαμεσολαβούμενη μετενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ [10], [11], επειδή είναι γνωστό ότι η ρ53 ενεργοποιείται σε απάντηση αυτής της γονιδιοτοξική παράγοντα [12]. Σε αυτή τη μελέτη αναφέρει μια πιθανή αντισταθμιστικό ρόλο του ΝΡ-κΒ για ρ53 μέσω ανάλυσης μιας ρ53-NF-κΒ δέσμευσης πολυμορφική θέση, κωδικόνιο 72 του p53. Μαζί, τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η NF-κΒ /p53-codon72 θα μπορούσε να είναι μια ισχυρή βιοδείκτη για την ευαισθησία 5-FU.

Υλικά και Μέθοδοι

τηλέφωνα Γραμμές

Εννέα ανθρώπινο γαστρικό καρκινικές κυτταρικές σειρές, συμπεριλαμβανομένων Kato-ΙΙΙ, KE39, ΜΚΝ74, ΜΚΝ7, NUGC4, GSS, GCIY, και ΜΚΝ45 ελήφθησαν από την τράπεζα κυττάρων RIKEN Bioresource Center. ΕΝ-1 ήταν ένα

de novo

κυτταρική σειρά που ιδρύθηκε το εργαστήριο μας από μια ιαπωνική αρσενικό γαστρικό ασθενή με καρκίνο οι οποίοι είχαν υποτροπιάσει περιτονίτιδα carcinomatosa. Η χρήση της ΕΝ-1 κυτταρική γραμμή έχει εγκριθεί από το Διοικητικό Συμβούλιο Iwate Ιατρικού Πανεπιστημίου Institutional Review (H25-116, και HG H25-15) και την οικογένεια του ασθενούς δότη, που είχε πεθάνει κατά τη στιγμή της δημιουργίας της κυτταρικής σειράς με ένα έγγραφη συγκατάθεση σε σχέση με τη λήψη των δειγμάτων και για την κυτταρική γραμμή. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 70-80% συρροή σε RPMI-1640 συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) στους 37 ° C υπό την παρουσία 5% CO

2.

Παρασκευή κυτταρολύματος

τα κύτταρα συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση και τα κυτταρικά ιζήματα λύθηκαν χρησιμοποιώντας Ροζ Ρυθμιστικό που περιέχει 9 Μ ουρία (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΙ, USA), 4% 3 – [(3-χολαμιδοπροπυλο) διμεθυλαμμωνιο] -1 -propanesul-fonate (CHAPS? Calbiochem, Merck Millipore, Darmstadt, Γερμανία), 2% pH 8,0 έως 10,5 pharma-Lyte (GE Healthcare Ιαπωνίας, Τόκιο, Ιαπωνία), και 65 mM DTT (GE Healthcare Ιαπωνίας, Τόκιο, Ιαπωνία) όπως προηγουμένως περιγράφεται [5], [13].

Western Blot

SDS-PAGE εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας NuPAGE 4-12% Bis-TrisGel ηλεκτροφόρησης (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), XCell ότι το κλείδωμα Mini-κυττάρων (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), και Power PAC HC (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Τα διαχωρισμένα πρωτεΐνες πάνω στην πηκτή μεταφέρθηκαν σε μια μεμβράνη νιτροκυτταρίνης χρησιμοποιώντας iBlot Dry Blotting System (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Οι προκύπτουσες μεμβράνες αποκλείστηκαν με 5% iBlot (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) και 0.1% Tween-20 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) σε TBS (TBST) για 1 ώρα. Οι μεμβράνες στη συνέχεια επωάστηκαν με τα υποδεικνυόμενα πρώτα αντισώματα, συμπεριλαμβανομένων των παν-ακτίνης, ρ53 (Thermo Scientific, Kalamazoo, ΜΙ, USA)? p21, Tigar, και PUMAα /β (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA)? και ΝΡ-κΒ, α-τουμπουλίνης, και PCNA (Cell Signaling Technology Ιαπωνία, Tokyo, Japan). Στη συνέχεια, οι μεμβράνες πλύθηκαν δύο φορές για 5 λεπτά με TBST, επωάστηκαν με ένα συζευγμένο με HRP δευτερογενές αντίσωμα για 1 ώρα, και στη συνέχεια πλένονται δύο φορές για 5 λεπτά σε TBST. αντιδραστήρια ανίχνευσης Χημειοφωταύγεια επωάστηκαν με τις μεμβράνες για 1-5 λεπτά και στη συνέχεια εικόνες αποκτήθηκαν χρησιμοποιώντας Image Quant LAS500 (GE Healthcare Ιαπωνία, Tokyo, Japan). Για την αξιολόγηση της επαγωγής πρωτεΐνης με 5-FU, δυτική κηλίδες ποσοτικά με τη χρήση ImageJ (https://rsbweb.nih.gov/ij/).

Ανοσοκυτοχημεία

Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 70-80 % συρροή σε RPMI-1640 συμπληρωμένο με 10% FBS σε γυάλινες πλάκες καλλιέργειας επεξεργασμένου ιστού αιμοφόρων πολυστυρόλιο 4-θάλαμο και στη συνέχεια επεξεργάστηκε με 5-FU όπως υποδεικνύεται σε κάθε πείραμα. Αφού τα κύτταρα εκτέθηκαν σε 50 μΜ 5-FU επί 4 ώρες για να δούμε μια πρώιμη μεταγραφική απόκριση, αυτά σταθεροποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη, κατέστησαν διαπερατά χρησιμοποιώντας 0.2% Triton Χ-100 σε PBS, και χρωματίστηκαν με ϋΑΡΙ (0,6 μΜ ϋΑΡΙ, 50 μΙ RNase, και 5 ml PBS) σε θερμοκρασία δωματίου για 12 λεπτά. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με τα ακόλουθα πρωτογενή αντισώματα: αντι-ΝΡ-κΒ ρ65, φωσφο-NF-κΒ ρ65 (Ser536) και φωσφο-ρ53 (Ser15) (Cell Signaling Technology Ιαπωνία, Tokyo, Japan), και ρ53 (Thermo Scientific , Kalamazoo, ΜΙ, USA). Τέλος, τα κύτταρα επωάστηκαν είτε με Alexa Fluor488- ή 568 συζευγμένο με δευτερογενές αντίσωμα (Life Technologies Ιαπωνία, Tokyo, Japan). Μια BX43 μικροσκόπιο φθορισμού (Olympus, Tokyo, Japan) χρησιμοποιήθηκε για την απόκτηση της εικόνας.

Gene Expression Profiling

ΜΚΝ45 κύτταρα συλλέχθηκαν μετά από θεραπεία με ή χωρίς 50 μΜ 5-FU για 4 ώρες . RNA στη συνέχεια εξάγεται από το συγκομίζονται κύτταρα και γονιδιακή έκφραση προφίλ διεξήχθη σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Sure Εκτύπωση G3 Ανθρώπινα GE8 × 60 K, Agilent Technologies Ιαπωνία, Tokyo, Japan). Πρώτες δεδομένα πρώτα κανονικοποιήθηκαν διαιρώντας κάθε σήμα του αισθητήρα από το 75

εκατοστημόριο του συνόλου του σήματος. Κάθε πείραμα μικροσυστοιχιών εκτελέστηκε εις διπλούν με αποτέλεσμα δύο ελέγχου και δύο σύνολα δεδομένων μικροσυστοιχιών 5-FU κατεργασία. Για την ταυτοποίηση των γονιδίων που εκφράζονται διαφορικά σε απόκριση σε 5-FU, κάθε σύνολο δεδομένων ελέγχου συγκρίθηκε ξεχωριστά για κάθε θεραπεία 5-FU που (4 συγκρίσεις). Διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια ήταν αυτά που είχαν μια αλλαγή στην έκφραση & gt? 2 φορές σε κάθε σύγκριση. Έχουμε προσδιορίσει το τελικό σύνολο των 10 διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων με βάση τη συχνότητά τους στις 4 συγκρίσεις [14]. Για να επιβεβαιωθεί η αναπαραγωγιμότητα αυτών των αλλαγών έκφρασης, ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR του 5-FU επεξεργασμένα δείγματα σε 0, 4, 8, 12, και 24 ώρες πραγματοποιήθηκε για κάθε γονίδιο. Οι αλληλουχίες εκκινητών παρατίθενται στον Πίνακα S1. Για τα γονίδια που επάγεται από την 5-FU, η ανάλυση των θέσεων δέσμευσης προαγωγέα διεξήχθη χρησιμοποιώντας JASPAR αλγόριθμος (JASPAR, https://jaspar.genereg.net/). Μία αλληλουχία υποκινητή 1000 bp ειδικά για αντίστοιχα γονίδια ελήφθη από μεταγραφικό ρυθμιστικό στοιχείο Database (https://rulai.cshl.edu/cgi-bin/TRED/tred.cgi?process=home). θέσεις δέσμευσης προβλεφθεί σαρώνοντας αλληλουχίες υποκινητή με τις συναινετικές αλληλουχίες του ΝΡ-κΒ και ρ53 με το 70% του ορίου βαθμολογίας προφίλ.

RELA και ΤΡ53 Gene Knockdown

Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 70-80 % συρροή σε RPMI-1640 συμπληρωμένο με 10% FBS σε πλάκες κυτταρικής καλλιέργειας 6 φρεατίων και στη συνέχεια κατεργάζεται με ΝΡ-κΒ ρ65 ή ρ53 siRNA (Cell Signaling Technology Ιαπωνία, Tokyo, Japan) επί 48 ώρες. Εν συντομία, knockdown διεξήχθη χρησιμοποιώντας Trans IT-TKO (Mirus Bio Corporation, Madison, WI, USA) σε συγκέντρωση 3% για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Οι κατάλληλες συγκεντρώσεις του siRNAs για κάθε κυτταρική σειρά αναμίχθηκε με τα διαλύματα IT-TKO Trans ακολουθούμενη από 20 λεπτών επώαση σε θερμοκρασία δωματίου. Οι συγκεντρώσεις siRNA που χρησιμοποιήθηκαν ήταν ως εξής: 100 ηΜ siRNA p65 για ΜΚΝ45, και τα κύτταρα ΜΚΝ74, και 150 ηΜ για τα κύτταρα GSS και Kato III-? και 100 ηΜ siRNA ρ53 για ΜΚΝ45, και τα κύτταρα GSS, και 50 ηΜ για ΜΚΝ74 κύτταρα. Μετά από 48 ώρες, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και τα επίπεδα πρωτεΐνης εξετάστηκαν με κηλίδα Western. Δύο siRNA κατασκευάσματα που έχουν διαφορετικές αλληλουχίες στον ίδιο γονίδιο στόχο χρησιμοποιήθηκε για κάθε γονίδιο να επιβεβαιώσει knockdown ειδικότητα. Η κατανομή κυτταρικού κύκλου εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας την Tali εικόνας που βασίζεται Κυτταρόμετρο (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Για να δείτε το μέγιστο αποτέλεσμα του siRNA επί της απόκρισης 5-FU, το φάρμακο προστέθηκε 48 ώρες μετά siRNA διαμολύνθηκε, και το αντίστοιχο κυτταρικό κύκλο μετρήθηκε μετά από 24 ώρες επώασης με 5-FU. Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές.

ΤΡ53 Κατάσταση και Codon72 Variant

DNA εκχυλίσθηκε από κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου χρησιμοποιώντας QIAmp DNA Mini Kit (Qiagen Ιαπωνία, Tokyo, Japan). PCR ενίσχυση για την

p53

exon4 codon72 παραλλαγή (Πίνακας S1) και το

p53

exon5-9 μετάλλαξη διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15], [16]. Κάθε προϊόν PCR υποβλήθηκε σε καθορισμό αλληλουχίας χρησιμοποιώντας τον γενετικό αναλυτή ΑΒΙ PRISM 3030xl (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. αποτελέσματα Sequencing αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας FinchTV (PerkinElmer Ιαπωνία, Tokyo, Japan) και MEGA 5.1 Beta 3 [17].

Growth Καταστολή Δοκιμασία

Δέκα χιλιάδες κύτταρα ανά φρεάτιο εμβολιάστηκαν σε μια 96-φρεατίων μικροπλάκας. Εικοσιτέσσερις ώρες αργότερα τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5-FU για 24 ώρες. Μετά την επεξεργασία 5-FU, το κλάσμα των ζωντανών κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τον Καταμέτρηση κυττάρων Kit-8 (Dojindo Molecular Technologies, Kumamoto, Japan) και ένα TriStar LB 941 αναγνώστη μικροπλάκας (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Germany). Πενήντα τοις εκατό συγκέντρωση αναστολή της ανάπτυξης (GI

50) υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό Prism (Graph Pad Software, La Jolla, CA, USA). Η GI

50 τιμές χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό συσχετίσεων μεταξύ των επιπέδων αποτελεσματικότητας και της πρωτεΐνης 5-FU με βάση συντελεστή προϊόν στιγμή συσχέτιση του Pearson ‘s (

r

).

Αποτελέσματα

φθοριοουρακίλη Προκαλεί NF-κΒ

για να επιβεβαιώσετε τυπική συμπεριφορά NF-κΒ σε απόκριση στη θεραπεία 5-FU, παρακολουθήσαμε την υποκυτταρική εντόπιση του NF-κΒ στο ΜΚΝ45 (ρ53 άγριου τύπου), ΜΚΝ74 (μεταλλαγμένο p53 ), GSS (p53 μεταλλαγμένο), και κυτταρικές σειρές Κάτω-III (p53 ομοζυγικά διαγράφεται). Η ανάλυση στυπώματος Western με πυρηνικά και κυτταροπλασματικά κλάσματα έδειξαν ότι 5-FU προκαλούμενη ΝΡ-κΒ και στα δύο διαμερίσματα σε ΜΚΝ45, αλλά δεν παρατηρήθηκε σε ρ53 μεταλλαγμένες κυτταρικές σειρές (Σχ. 1Α-D). Εξετάσαμε επίσης την επίδραση της 5-FU επί ΝΡ-κΒ εντοπισμό στα κύτταρα με ανοσοκυτταροχημεία (Σχ. 1Ε-Η). ΝΡ-κΒ εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα σε μη επεξεργασμένα ΜΚΝ45, ενώ η 5-FU θεραπεία προκάλεσε μια αύξηση στο NF-κΒ πυρηνικού εντοπισμού (Σχήμα 1 Ε.)? Ωστόσο, καμία αύξηση παρατηρήθηκε στις κυτταρικές σειρές ρ53 μετάλλαγμα (Εικ. 1 F-Η). Παρατηρήσαμε επίσης μία δραστική αύξηση φωσφορυλιωμένο NF-κΒ (ρ65 Ser536) στον πυρήνα του ΜΚΝ45 επεξεργάστηκε με 5-FU, υποδεικνύοντας ΝΡ-κΒ μετενεργοποίησε από την 5-FU (Σχ. 1Ε). Συστατική πυρηνικό εντοπισμό και περιστασιακή φωσφορυλίωση του ρ53 παρατηρήθηκε σε ΜΚΝ74, αλλά δεν φαίνεται να επάγεται από την 5-FU (Σχ. 1G). Πυρηνικός εντοπισμός της ρ53 προκλήθηκε με 5-FU σε GSS, αλλά το ενεργοποιημένο σήμα ήταν αμυδρή (Εικ. 1).

Α-Δ, ανάλυση Western blot της επαγωγής του ΝΡ-κΒ στον πυρήνα και η κυτόπλασμα με 50 μΜ 5-FU για 4 h για τις υποδεικνυόμενες κυτταρικές σειρές. PCNA και α-τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκαν ως οι έλεγχοι πυρηνικά και κυτταροπλασματικά φόρτωση, αντίστοιχα. Ε-Η, Η ανοσοκυτταροχημεία της ρ65 και της επαγωγής ρ53 και εντοπισμό με επεξεργασία 5-FU για τις υποδεικνυόμενες κυτταρικές σειρές. ρ65 (κόκκινο), φωσφόρου ρ65 (Ser536? κόκκινο), ρ53 (πράσινο), φωσφο-ρ53 (Ser15? κόκκινο), και ϋΑΡΙ (μπλε) χρώση του πυρήνα χωρίς (μάρτυρας) και με θεραπεία 5-FU. Ι, Gene έκφρασης με ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR σε ένα χρόνο πορεία της θεραπείας 5-FU. Tigar, Puma, CDKN1A, και BTG2 ταυτοποιήθηκαν ως 5-FU που προκαλείται γονίδια. Οι ποσοτικές τιμές ήταν σε σχέση με την β-ακτίνη έκφραση.

Η

Οι στόχοι p53 Induced κατόπιν 5-FU Θεραπεία

Από ΝΡ-κΒ είναι ένας μεταγραφικός παράγοντας (TF), πυρηνικό εντοπισμό του αγωγή κατά 5-FU υποδηλώνει έντονα διενεργοποίηση. Έχουμε εντοπίσει τα κορυφαία 7 μεταγραφές μεταξύ πάνω από 60.000 που επάγονται μετά από 4 ώρες από θεραπεία 5-FU σε ΜΚΝ45 χρησιμοποιώντας γονιδιακή έκφραση προφίλ (Πίνακας 1). Είναι ενδιαφέρον ότι, πέντε από τις 7 μεταγραφές, δηλαδή

BBC3

(το οποίο κωδικοποιεί ρ53 επάνω ρυθμισμένη ρυθμιστής της απόπτωσης, PUMA),

BTG2, C12orf5

(το οποίο κωδικοποιεί πιθανή φρουκτόζη-2,6-διφωσφορικής Tigar),

CDKN1A, και GPR87

, είναι γνωστοί στόχοι p53 [18] – [22]. Η παρουσία των θέσεων σύνδεσης προαγωγού είχαν προβλεφθεί με σάρωση αλληλουχίες υποκινητή με τις συναινετικές αλληλουχίες του ΝΡ-κΒ και ρ53 χρησιμοποιώντας αλγόριθμο JASPAR (Πίνακας 1) [23].

Η

Βρήκαμε ότι τα επίπεδα ρ53 προκλήθηκαν σε ο πυρήνας παρόμοιες με εκείνες του ΝΡ-κΒ σε απόκριση σε 5-FU θεραπεία (Εικ. 1 Ε). Κατεργασία της 5-FU αύξησε επίσης τα επίπεδα της φωσφορυλίωσης ρ53 στο Ser15, υποδεικνύοντας μετενεργοποίηση του (Εικ. 1 Ε, ref. [24]). Στην πραγματικότητα, η πλειοψηφία των συνολικών ρ53 που επάγεται από 5-FU φαινόταν να φωσφορυλιωθούν. Παρατηρήσαμε επίσης μια εξαρτώμενη από το χρόνο επαγωγής των γονιδίων, συμπεριλαμβανομένων των

C12orf5 (Tigar)

,

BBC3 (PUMA)

,

CDKN1A (p21)

, και

BTG2 από

5-FU με χρήση RT-PCR (Σχ. 1θ). Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν ότι η κυτταρική απόκριση σε θεραπεία 5-FU μπορεί να περιλαμβάνει τόσο NF-κΒ και ρ53 για την μεταγραφική ενεργοποίηση σε αυτό το πλαίσιο, το ΜΚΝ45.

RELA Νοκ ντάουν έχει μεγαλύτερη επίδραση στις p53 στοχεύουν πρωτεΐνες από ό, τι ΤΡ53 Gene Knockdown

για να αξιολογηθεί η ρυθμιστική επίδραση του NF-κΒ και ρ53 σε απόκριση στην θεραπεία 5-FU, αναλύσαμε τα επίπεδα πρωτεΐνης του p65, p53, καθώς και γνωστών στόχων ρ53, ρ21, Tigar, και PUMA, με western αποτύπωση παρακάτω

RELA

και

TP53

νοκ ντάουν στον ΜΚΝ45, ΜΚΝ74, GSS, και Κάτω-III.

RELA

knockdown προκάλεσε αξιοσημείωτη μείωση στα επίπεδα ρ53 σε όλες τις κυτταρικές σειρές. Όπως αναμενόταν, τα επίπεδα του ρ21, Tigar, και PUMA μειώθηκαν επίσης (Σχ. 2Α). Αντίθετα, ενώ η

TP53

νοκ ντάουν μειώθηκε p53 επίπεδα, δεν επηρεάζει p65 επίπεδα. Όπως αναμενόταν, τα επίπεδα των πρωτεϊνών-στόχων ρ53 μειώθηκαν κατά

ΤΡ53

knockdown? Ωστόσο, η μείωση αυτή ήταν μικρότερη από τη μείωση που προκαλείται από

RELA

νοκ ντάουν (Εικ. 2Β). Στην ανάλυση του κυτταρικού κύκλου, ο ΜΚΝ74, GSS, και Kato-III κυτταρικές γραμμές έδειξαν μία ελαφρά αύξηση στο κλάσμα φάση S ή G2 ενώ ΜΚΝ45 εμφάνισαν μια αύξηση στο κλάσμα G1 μετά από έκθεση 24 h σε 5-FU στην ρ65 και ρ53 knockdown παρόμοιες με τις αντίστοιχες ανακατώνει (Σχ. 2C). Τα αποτελέσματα αυτά μπορεί να υποδηλώνουν την ευρωστία των μηχανημάτων απάντηση κυτταρικό στρες που διατηρεί την κατανομή του κυτταρικού κύκλου, παρά το νοκ ντάουν της p65 και p53.

Α, ανάλυση Western blot του

RELA

νοκ ντάουν σε τέσσερις καρκίνο του στομάχου κυτταρικές γραμμές. Εκτός από τις πρωτεΐνες ρ53 και ρ65, ρ53 στόχους, συμπεριλαμβανομένων των ρ21, Tigar, και Puma, αξιολογήθηκαν. Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Τα αποτελέσματα από τα κύτταρα που επωάστηκαν με RELA siRNA (siRNA) και χωρίς στόχο siRNA (έλεγχος) φαίνονται. Β, ανάλυση Western blot

ΤΡ53

knockdown σε τρεις κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου. ρ53 αλληλόμορφο του Κάτω-III διαγράφεται ομοζυγικά έτσι δεν πραγματοποιήθηκε TP53 νοκ ντάουν. C, ανάλυση κυτταρικού κύκλου ναρκωτικά που προκαλείται. Ο οριζόντιος άξονας, η δύναμη του προπιδίου ιώδιο (ΡΙ), και ο κάθετος άξονας σημειώνονται οι αριθμοί των κυττάρων από κάθε κυτταρική γραμμή.

Η

ΤΡ53 Codon72 Pro Variant εμφανίζει χαμηλή 5-FU Ευαισθησία και High ΝΡ-κΒ Επίπεδα

Gene knockdown πειραματικά αποτελέσματα έδειξαν ότι η αλληλεπίδραση μεταξύ NF-κΒ και ρ53 πρωτεΐνες μπορεί να είναι σημαντική στο πλαίσιο της θεραπείας 5-FU. Για να διερευνηθεί η πιθανότητα η

ΤΡ53

παραλλαγή codon72 μπορεί να επηρεάσουν την κυτταρική ανταπόκριση στη θεραπεία 5-FU, εμείς αλληλουχία

ΤΡ53

codon72 καθώς και μεταλλάξεις στο DNA που κωδικοποιούν τις περιοχές δέσμευσης τομέα (δηλαδή, εξώνια 5-8) 9 κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου (Πίνακας 2). Η κατάσταση της διακύμανσης codon72 και

TP53

μετάλλαξη δεν επιδεικνύουν σαφή ενώσεις.

Η

Είμαστε δίπλα διερευνηθεί η συσχέτιση μεταξύ της ευαισθησίας 5-FU και

TP53

κατάστασης ( Σχ. 3Α), καθώς και τα ενδογενή επίπεδα του ΝΡ-κΒ και ρ53 (Σχ. 3Β). GSS, GCIY, και ΜΚΝ45 γραμμές, οι οποίες κατέχουν το Pro ομόζυγο παραλλαγή, με χαμηλή ευαισθησία σε 5-FU, ενώ το KE39, ΜΚΝ74, ΜΚΝ7, NUGC4 και IWT1 γραμμές που έχουν Arg αλληλόμορφο παρουσίασαν σχετικά υψηλή ευαισθησία. Κάτω-ΙΙΙ, η οποία έχει ένα μεγάλο

ΤΡ53

διαγραφή [25], ήταν η πιο ευαίσθητη σε 5-FU. επίπεδα πρωτεΐνης ΝΡ-κΒ ήταν ιδιαίτερα συσχετίζεται με 5-FU ευαισθησία (

r

= 0,68?

σ

= 0,04? Εικ. 3C)? Ωστόσο, δεν υπήρξε σαφής συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων p53 και την ευαισθησία 5-FU (

r

= -0.04?

σ

= 0,95? Εικ. 3D). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι Pro ομοζυγωτία σχετίζεται με την αντίσταση 5-FU, ενώ ούτε το ρ53 μετάλλαξη ούτε ενδογενή επίπεδα ρ53 επηρεάζει άμεσα την ευαισθησία 5-FU.

Α, δοκιμασία καταστολής της ανάπτυξης σε θεραπεία 5-FU σε γαστρικό καρκίνο κύτταρο γραμμές. Οριζόντιους άξονες δείχνουν GI

50 αξία της 5-FU. Β, τα ενδογενή επίπεδα πρωτεΐνης του ΝΡ-κΒ, ρ53, και η ακτίνη με κηλίδα Western σε κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου. Ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. C, διάγραμμα διασποράς της κατανομής των επιπέδων της πρωτεΐνης του ΝΡ-κΒ σε σχέση με ακτίνη και GI

50 της 5-FU σε κάθε κυτταρική σειρά. D, διάγραμμα διασποράς της κατανομής των επιπέδων της πρωτεΐνης ρ53 και GI

50 της 5-FU σε κάθε κυτταρική σειρά. Συντελεστής προϊόν στιγμή συσχέτιση κατά Pearson (

r

), καθώς και το

σ

αξία ενδείκνυται σε κάθε διάγραμμα διασποράς.

Η

Συζήτηση

έχουν ταυτοποιήσει προηγουμένως ΝΡ-κΒ ως πιθανό δείκτη πρόβλεψης για μετεγχειρητική 5-FU με βάση χημειοευαισθησία για προχωρημένο καρκίνο του στομάχου [9]. NF-κΒ είναι ένας επαγώγιμος μεταγραφικός παράγοντας που αποτελείται από ρ65 (ΚεΙΑ), c-Rel, Rel-Β, p50 /NF-κB1, και ρ52 /NF-κΒ2 [26], και παίζει κεντρικό ρόλο στην ανοσοαποκρίσεων και φλεγμονωδών κυτοκινών κανονισμού [27] – [29]. Chang et al κατέδειξαν προηγουμένως ότι η NF-κΒ που προκαλείται από τα πάνω ή προς τα κάτω ρύθμιση των διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων σε 5-FU που προκαλείται εντερική βλεννογονίτιδα επάγοντας προφλεγμονώδεις κυτοκίνες, όπως IL-6, TNF-α και IL-1β [10]. Αυτές οι 5-FU που προκαλείται φλεγμονώδεις αποκρίσεις θεωρήθηκαν να είναι μέρος των διεργασιών στρες-αποφεύγοντας που μπορεί να οδηγήσει σε απευαισθητοποίηση της αποτελεσματικότητας της 5-FU σε γαστρικό βλεννογόνο [30]. Αν και έχει προταθεί ότι η ενεργοποίηση του NF-κΒ δεν συνδέεται άμεσα με την ανάπτυξη και την εξέλιξη [31] του όγκου, NF-κΒ έχει θεωρηθεί ότι είναι ένας σημαντικός βιοδείκτης και θεραπευτικός στόχος [32]. Η άμεση απόδειξη της μειωμένης χημειοαντίσταση με 5-FU με siRNA για

RELA

σε συνδυασμό με την υψηλή διακριτική δύναμη του NF-κΒ πυρηνική χρώση σε θεραπευτικά αποτελέσματα της αφαιρεθεί χειρουργικά ιστούς μας ώθησε να εκτελέσει περαιτέρω επικύρωση της NF-κΒ από ένα βιολογικό άποψη.

μεταγραφικού προφίλ αποτελέσματά μας αποκάλυψαν ότι αρκετές ρ53 κατάντη γονίδια ήταν προς τα πάνω ρυθμισμένα σε απόκριση προς 5-FU, στην οποία μετενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ εμφανίστηκε επίσης. Αυτοί οι δύο κύριοι παράγοντες μεταγραφής έχουν προηγουμένως δειχθεί ότι είναι συν-ρυθμίζονται σε απόκριση προς γονοτοξικούς παράγοντες [33] – [35] και του ΤΝΡ-α [36], [37]. Επιπλέον, έχει προταθεί ότι η ταυτόχρονη ενεργοποίηση της ρ53 και NF-κΒ σε όγκους που έλαβαν θεραπεία με γονοτοξικούς παράγοντες θα μπορούσε να οδηγήσει σε θεραπευτική αποτυχία λόγω της ΝΡ-κΒ-διαμεσολαβούμενη σηματοδότηση επιβίωσης [38].

Ατομική knockdown του αυτοί οι παράγοντες μεταγραφής αποκάλυψε γονιδίων κατάντη του p53 επλήγησαν από p65 νοκ ντάουν, ενώ η επίδραση ήταν περιορισμένη από p53 νοκ ντάουν. Προηγούμενες αναφορές έχουν υποδείξει μια σχέση συνεργασίας μεταξύ ρ53 και NF-κΒ στο πλαίσιο της αυτοφαγία, απόπτωση, και ενεργοποίηση σημείου ελέγχου S-φάσης [34], [39] – [41]. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν επίσης ότι ΝΡ-κΒ μπορεί να αντισταθμίσει την μεταγραφική δραστικότητα της ρ53 όταν η ανέπαφη λειτουργία χάνεται σε απόκριση προς θεραπεία 5-FU. Στην πραγματικότητα, η πλειονότητα των γαστρικών καρκίνων φέρουν μεταλλάξεις στο πεδίο σύνδεσης ρ53 DNA, καθιστώντας την έτσι μεταγραφικά ανενεργή [42]. Μια πρόσφατη μελέτη από τον Frank

et al

. ανέφεραν ότι codon72 πολυμορφισμός του

ΤΡ53

επηρεάζει ουσιαστικά την ικανότητα του ρ53 να συνεργάζεται με NF-κΒ για γονιδιακή τρανσενεργοποίηση, ιδιαίτερα στην επαγωγή της απόπτωσης μέσω κασπάσης 4/11 [40]. Μαζί με το παρόν εύρημα ότι ορισμένοι μεταγραφική δράση της ρ53 απαιτεί NF-κΒ σε απόκριση σε 5-FU, p53 κωδικόνιο 72 πολυμορφισμό για πρόσδεση μπορεί να είναι μεγαλύτερη επιρροή από κατάστασης μεταλλάξεων του

ΤΡ53

ή πρωτεΐνη έκφραση ΝΡ-κΒ του ιδιότητα του p53

Η επίδραση του πολυμορφισμού codon72 στην αυθόρμητη κίνδυνο καρκίνου έχει ήδη ερευνηθεί αλλά δεν διαπίστωσε, λόγω του περιορισμένου ανθρώπινου πληθυσμού και ζωικά μοντέλα [40], [43] – [45].. Ωστόσο, ο πολυμορφισμός codon72 μπορεί να παίζει ένα ρόλο στη διατήρηση εγκατεστημένος καρκινικά κύτταρα από την ενεργοποίηση κυτταρικών κακοήθη μετασχηματισμό. Στην πραγματικότητα, προηγούμενες μελέτες έχουν αναφέρει ότι η Pro /αλληλόμορφο Pro σχετίζεται με την αντίσταση στη χημειοθεραπεία και φτωχή πρόγνωση στη στοματική κοιλότητα [46], καθώς και του παχέος [47], του μαστού [48] και του γαστρικού [49] καρκίνους και νευροβλαστώματα [ ,,,0],43]. Μια σειρά από

in vitro

μελέτες υποστηρίζουν επίσης την υπόθεση αυτή δείχνει ότι το αλληλόμορφο Arg είναι ένας πιο ισχυρός διεγέρτης απόπτωσης από την Pro αλληλόμορφο [40], [50], [51]. Η απόπτωση είναι ένας από τους κύριους μηχανισμούς που προκαλούνται από 5-FU και κατά συνέπεια είναι λογικό να υποθέσει ότι η αποτελεσματικότητα της 5-FU χημειοθεραπεία με βάση συνδέεται με συγκεκριμένες πολυμορφισμούς p53 [49]. Μας

in vitro

ευρήματα υποστηρίζουν αυτά τα επιδημιολογικά και πειραματικά δεδομένα και προτείνουν ένα πιθανό μηχανισμό για την 5-FU με τη μεσολάβηση της αλληλεπίδρασης p53-NF-κΒ στη θέση δέσμευσης p53-codon72.

Όπως ήταν αναμενόμενο , η μελέτη μας έδειξε ότι κυτταρικές σειρές με την Pro αλληλόμορφο ήταν πιο ανθεκτικά στην 5-FU από αυτούς με το αλληλόμορφο Arg. Το προφίλ καταστολή της ανάπτυξης, της 9ης γαστρικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές έδειξαν μία καλή συσχέτιση με τα επίπεδα της πρωτεΐνης ΝΡ-κΒ. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι ο γονότυπος Arg /Arg έχει μια ισχυρότερη επαγωγή της απόπτωσης από το Pro /Pro γονότυπο παρουσία της 5-FU. Μεταξύ των κυτταρικών γραμμών (όλα προέρχονται από ασθενείς Ιαπωνικά γαστρικό καρκίνο), η αναλογία του Arg /Arg: Arg /Pro: Pro /Pro ήταν 4:01:03, ενώ ότι σε υγιείς Ιάπωνες ασθενείς ήταν 4.5:4.4:1 [52] . Αυτό μπορεί να αντανακλά μία διαδικασία επιλογής που εμφανίζεται κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του όγκου και τη δημιουργία ως μία κυτταρική γραμμή. Προηγούμενο μετα-αναλύσεις του κινδύνου του καρκίνου και πολυμορφισμών p53-codon72 δείχνουν ότι η Pro /Pro γονότυπο έχει υψηλότερο κίνδυνο καρκίνου (χαμηλότερη για το γονότυπο Arg /Arg) σε ασιατικούς πληθυσμούς [45], [53]. Ωστόσο, η σημασία του «κινδύνου καρκίνου» για κακοήθεια καρκίνο ή ανταπόκριση στη θεραπεία μένει να διευκρινιστεί, διότι είναι γενικά δύσκολο να διεξάγει μια κλινική μελέτη που κυριαρχείται από γενετικούς πολυμορφισμούς και να εκτιμήσει τις πραγματικές γενετικές επιδράσεις της θεραπείας. Μέχρι σήμερα, οι περισσότερες εκθέσεις που περιγράφουν τη σύνδεση μεταξύ του πολυμορφισμού ρ53 codon72 και χημειοθεραπευτικών αποκρίσεις έχουν αποδείξει ότι ο γονότυπος Arg /Arg έχει ευνοϊκή απόκριση σε ένα ευρύ φάσμα καρκίνων αντιμετωπίζεται με συμβατική γονιδιοτοξικά φάρμακα [49], [54], [55] . Προτείνουμε ένα υποθετικό μηχανισμό για απόκριση σε 5-FU μέσω NF-κΒ και ρ53 πρωτεΐνη σύνδεση που σχετίζεται με τον πολυμορφισμό ρ53, και έτσι μια συνδυαστική διάγνωση της έκφρασης πρωτεΐνης NF-κΒ και codon72 μπορεί να είναι ένας χρήσιμος δείκτης για μετεγχειρητική επικουρική χημειοθεραπεία. Πέρα από μερικά σύνολα δεδομένων μεγάλης κλίμακας [52], [56], η έκταση των δημογραφικών και των εθνοτικών κατανομή του πολυμορφισμού παραμένει ασαφής. Συσσωρευμένα δεδομένα σχετικά με εθνικές διαφορές ως προς τον πολυμορφισμό μπορεί να εξηγήσει τις διαφορές στον κίνδυνο καρκίνου ή χημειοθεραπευτικών ποσοστό ανταπόκρισης σε πληθυσμό ασθενών.

Εν ολίγοις, τα ευρήματά μας υποδεικνύουν ότι η NF-κΒ ρυθμίζει την δραστηριότητα της ρ53 μεταγραφικής σε απάντηση 5-FU, η οποία μπορεί να σχετίζεται με μια πολυμορφική θέση του ρ53 στο codon72. Περαιτέρω κλινικές και επιδημιολογικές μελέτες θα πρέπει να αξιολογήσει τη χρησιμότητα της ταυτόχρονης παθολογικών /γενετική αξιολόγηση του NF-κΒ /p53-codon72 σε χειρουργικά αφαιρεθεί γαστρικό δείγματα καρκίνου, προκειμένου να προβλέψουν την αποτελεσματικότητα της μετεγχειρητικής 5-FU-επικουρική χημειοθεραπεία βασιζόμενη.

Υποστήριξη Πληροφορίες

πίνακα S1.

Primer Ακολουθίες

doi:. 10.1371 /journal.pone.0090155.s001

(DOCX)