Αφηρημένο

Ιστορικό

Το μονοπάτι Hippo ρυθμίζει το μέγεθος του οργάνου, αναστέλλοντας τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την προώθηση της κυτταρικής απόπτωσης κατά την ενεργοποίηση της. Το Ναι Associated Protein 1 (YAP1) είναι μια πυρηνική τελεστή του μονοπατιού Hippo που προωθεί την ανάπτυξη των κυττάρων ως μεταγραφή συν-ενεργοποιητή. Στον καρκίνο του ανθρώπου, το γονίδιο YAP1 αναφέρθηκε ως ενισχύεται και υπερεκφράζεται σε διάφορους τύπους καρκίνου.

Μέθοδοι

Ανοσοϊστοχημική χρώση YAP1 πρωτεΐνη χρησιμοποιήθηκε για να εκτιμηθεί η έκφραση του YAP1 σε παγκρεατικά καρκινικούς ιστούς . siRNA ολιγονουκλεοτίδια χρησιμοποιήθηκαν για να knockdown την έκφραση YAP1 και τα αποτελέσματά τους επί παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα διερευνήθηκαν χρησιμοποιώντας τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, την απόπτωση, και δοκιμασίες ανάπτυξης αγκύρωση-ανεξάρτητη. Η Wilcoxon signed-rank, Pearson συντελεστής συσχέτισης, Kendall της Ταού, Rho Spearman, καθώς και μια ανεξάρτητη δύο δειγμάτων

t

(two-tailed) τεστ χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό της στατιστικής σημαντικότητας των δεδομένων.

Αποτελέσματα

μελέτες ανοσοϊστοχημείας σε παγκρεατικά ιστούς όγκων αποκάλυψε YAP1 εντάσεις χρώσης ήταν μέτρια έως ισχυρή στον πυρήνα και στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων του όγκου, ενώ το παρακείμενο φυσιολογικό επιθηλιακό έδειξε αρνητικό για ασθενή χρώση. Σε καλλιεργημένα κύτταρα, η έκφραση και ο εντοπισμός YAP1 διαμορφωνόταν με πυκνότητα κυττάρων. YAP1 συνολική έκφραση της πρωτεΐνης αυξήθηκε στους πυρηνικούς κλάσματα σε BxPC-3 και PANC-1, ενώ μειώθηκε το HPDE6 η αυξημένη πυκνότητα των κυττάρων. Επιπλέον, η θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος κυτταρικές σειρές, BxPC-3 και PANC-1, με YAP1-στόχευση siRNA ολιγονουκλεοτίδια μείωσε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό τους

in vitro

. Επιπλέον, η θεραπεία με YAP1 siRNA ολιγονουκλεοτίδια μείωσε την ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη σε μαλακό άγαρ των παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων, υποδηλώνοντας ένα ρόλο YAP1 σε παγκρεατικά ογκογένεση του καρκίνου.

Συμπεράσματα

YAP1 υπερεκφράζεται στον καρκίνο του παγκρέατος ιστούς και ενδεχομένως διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην κλωνογενοποιήσεως και την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος

Παράθεση:. Diep CH, Zucker KM, Hostetter G, Watanabe Α, Χου C, Munoz RM, et al. (2012) κάτω ρύθμιση Ναι Associated Protein 1 Έκφραση Μειώνει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και ικανότητας κλωνισμού του καρκίνου του παγκρέατος κύτταρα. PLoS ONE 7 (3): e32783. doi: 10.1371 /journal.pone.0032783

Συντάκτης: Robert Oshima, Sanford Burnham Medical Research Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 1, Ιουνίου, 2011? Αποδεκτές: 2 Φεβ 2012? Δημοσιεύθηκε: 1 Μαρτίου, 2012

Copyright: © 2012 Diep et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα για την Έρευνα του Καρκίνου, την οικογένεια Katz, και το Πρόγραμμα Ήλιος Scholars. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ως μία από τις πιο θανατηφόρες μορφές της ανθρώπινης νόσου, του καρκίνου του παγκρέατος έχει ένα ποσοστό επιβίωσης ενός έτους και πέντε χρόνια από 26% και 6%, αντίστοιχα. [1] Υπάρχει μια κρίσιμη ανάγκη για νέες στρατηγικές θεραπείας για να παρέχει μια σκόπιμη επίδραση στην επιβίωση των ασθενών με καρκίνο του παγκρέατος.

Η οδός Hippo ρυθμίζει το μέγεθος του οργάνου με την παρεμπόδιση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και προάγει την κυτταρική απόπτωση [2], [3] . Συνιστώσες του Hippo οδού εντοπίστηκαν σε οθόνες γενετικό μωσαϊκό στο

Drosophila

, η οποία αποτελείται από το Hippo (Ηρο) κινάση, η πρωτεΐνη Σαλβαδόρ (Sav) προσαρμογέα, η πρωτεϊνική κινάση WTS, η πρωτεΐνη προσαρμογέα Mats, και το Yorkie (YKI) πυρηνική μεταγραφικού συν-ενεργοποιητή. Με την ενεργοποίηση της οδού, Ηρο και Sav φωσφορυλιώνει και ενεργοποιεί ΣΜΑ σε συνδυασμό με Mats. WTS φωσφορυλιώνει YKI να αδρανοποιήσει και φυλάξτε το στο κυτταρόπλασμα. Στα θηλαστικά, τα συστατικά της οδού Hippo είναι πολύ συντηρημένες ομόλογα, τα οποία περιλαμβάνουν MST1 /2 (Ηρο), WW45 (Sav), LATS1 /2 (WTS), MOB1 (Mats), και YAP1 (YKI) [4] – [ ,,,0],8].

Παρόμοια με το

Drosophila

μοντέλο, τα βασικά στοιχεία Hippo θηλαστικών σχηματίζουν συμπλέγματα πρωτεϊνικής κινάσης δρουν σε έναν καταρράκτη να φωσφορυλιώνει YAP1 (επίσης γνωστή ως YAP ή YAP65) και να το μεταφέρει στην κυτταρόπλασμα [6], [7], [9], [10]. Καθώς το μεγαλύτερο κατάντη στόχου της οδού Hippo, YAP1 είναι ένα παράδοξο. Ως ένα ογκογονίδιο, η ενίσχυση της θέσεως του γονιδίου YAP1 στο 11q22 βρίσκεται σε αρκετούς τύπους καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα, τον καρκίνο του μαστού, του στόματος καρκινώματα πλακωδών κυττάρων, μυελοβλαστώματα, και του οισοφάγου καρκινώματα πλακωδών κυττάρων [11] – [15]. Επιπλέον, η υπερέκφραση πρωτεΐνης YAP1 και πυρηνική εντόπιση της έχουν σημειωθεί στο παχύ έντερο, ήπαρ, πνεύμονα, των ωοθηκών, του προστάτη και του καρκίνου [6], [12], [16]. Overholtzer και συνεργάτες ανέφεραν ότι η υπερέκφραση του YAP1 σε μια αθανατοποιημένη κυτταρική σειρά επιθηλιακών κυττάρων ΜΟΡ10Α οδήγησε στην ογκογόνο μετασχηματισμό του [11]. Σε αντίθεση, YAP1 βρέθηκε επίσης για να σταθεροποιήσει και να ενισχύσει ρ73-εξαρτώμενη αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο κατά τη διάρκεια της βλάβης του DNA που προκαλείται από τη σισπλατίνη [17]. ΑΚΤ, ένας παίκτης-κλειδί σε πολλαπλά μονοπάτια κυτταρικής επιβίωσης, έχει αποδειχθεί ότι φωσφορυλιώνει YAP1 προκειμένου να καταστείλει την έκφραση προ-αποπτωτικών γονιδίων [18]. Σε ένα υποσύνολο των καρκίνων του μαστού, η έκφραση της πρωτεΐνης YAP1 μειώθηκε σημαντικά λόγω της απώλειας της ετεροζυγωτίας, και shRNA knockdown του YAP1 αυξημένη μετανάστευση, διεισδυτικότητα, και ενισχυμένη ανάπτυξη του όγκου [19]. Συνολικά, τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η έκφραση και ο ρόλος YAP1 σε καρκίνο θα μπορούσε να είναι ο τύπος των κυττάρων και /ή κυτταρική έννοια εξαρτώμενη.

Σε αυτή τη μελέτη, επιδιώξαμε να διαλευκανθεί ο ρόλος του YAP1 στον καρκίνο του παγκρέατος. Εξετάσαμε την έκφραση της πρωτεΐνης YAP1 και εντοπισμό σε παγκρεατικά ιστούς όγκων που ελήφθησαν από ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος και διερευνήθηκαν τα φαινοτυπικά αποτελέσματα του YAP1 μειορύθμιση σε καλλιεργημένα παγκρεατικά κυτταρικές σειρές. Έχουμε διαπιστώσει ότι YAP1 υπερεκφράζεται σε παγκρεατικά ιστούς όγκων, και η ρύθμιση προς τα κάτω των YAP1 υποχωρήσουν πολλαπλασιασμού και της ικανότητας κλωνισμού των καλλιεργημένων καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture

Οι παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές AsPC-1, BxPC-3, Capan-1, CFPAC-1, ΗΡΑΡ-ΙΙ, Hs 766T, ΜΙΑ PaCa-2 και PANC-1 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA). Οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) (Gemini Bio-Products, Woodland, CA), πενικιλλίνη (100 U /ml), και στρεπτομυκίνη (100 mg /ml) (Invitrogen). Η αθανατοποιημένη ανθρώπινη παγκρεατικού πόρου επιθηλιακή κυτταρική γραμμή, HPDE6, παρασχέθηκε από τον Dr. MS Tsao (University of Toronto, Canada) και καλλιεργήθηκαν σε μέσο ελεύθερο από κερατινοκύτταρα στον ορό συμπληρωμένο με εκχύλισμα βόειας υποφύσεως (30 μg /ml) και επιδερμικό αυξητικό παράγοντα (0,2 ng /ml) (Invitrogen) [20], [21]. Η αθανατοποιημένη ανθρώπινη παγκρεατικού πόρου επιθηλιακά κυτταρική γραμμή, hTERT-HPNE, ελήφθη από την ATCC και καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ μέσο συμπληρωμένο με 20% FBS [22]. Όλα τα κύτταρα καλλιεργούνται σαν ρουτίνα σε υγροποιημένο επωαστή στους 37 ° C και 5% CO

2. ταυτότητες γραμμή κυττάρων ελέγχθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23].

μικροσυστοιχιών ιστών και ανοσοϊστοχημεία (IHC)

Μια μικροσυστοιχία ιστού (TMA) κατασκευάστηκε από παραφίνη-ενσωματωμένες μπλοκ των 66 μοναδικές περιπτώσεις παγκρέατος πορογενές αδενοκαρκινώματα, 5 περιπτώσεις χρόνιας παγκρεατίτιδας, και 6 δείγματα φυσιολογικού παγκρέατος, όπως περιγράφεται προηγουμένως [24]. Για κάθε περίπτωση καρκίνου, δύο πυρήνες των όγκων και ένα παρακείμενο φυσιολογικό πυρήνα κτυπήθηκαν για την TMA. Τα μπλοκ TMA κόπηκαν σε 5 μm πάχους, που μεταφέρονται από επίπλευση νερό και ξηραίνεται όλη τη νύχτα σε θερμοκρασία δωματίου. Οι διαφάνειες αποκηρώθηκαν, ενυδατωμένο και αντιγόνο ανακτηθεί on-line στο Autostainer BondMax ™ (Leica Microsystems, Inc Bannockburn, IL). Όλα τα πλακίδια υποβάλλονται σε θερμική επαγόμενη ανάκτηση επιτόπου χρησιμοποιώντας ένα διάλυμα EDTA που βασίζεται ανάκτησης (Leica Microsystems) για 20 λεπτά. Ενδογενούς υπεροξειδάσης και βιοτίνη είχαν μπλοκαριστεί. Οι τομές ΤΜΑ επωάστηκαν για 30 λεπτά στους 1:125 με YAP1 (H-125) αντίσωμα από την Santa Cruz Biotechnology, Inc (Santa Cruz, CA). Τα τμήματα οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ Bond ™ Polymer Detection Περιορισμού (Leica Microsystems) χρησιμοποιώντας διαμινοβενζιδίνη χρωμογόνο ως υπόστρωμα και βαθμολογήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24]. Η δοκιμή που υπογράφηκε-rank Wilcoxon χρησιμοποιήθηκε για τη σύγκριση επίπεδο έκφρασης YAP1 μεταξύ του όγκου και των παρακείμενων φυσιολογικά δείγματα της. Η δοκιμή rank-sum του Wilcoxon χρησιμοποιήθηκε για να συγκριθεί η έκφραση YAP1 μεταξύ όγκου και παγκρεατίτιδας, καθώς και φυσιολογικά δείγματα πάγκρεας από μια ξεχωριστή ομάδα ατόμων. συντελεστή συσχέτισης του Pearson χρησιμοποιήθηκε για να εκτιμηθεί και να ελεγχθεί η συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης των πυρηνικών YAP1 και ιστοπαθολογικές παραμέτρους (βαθμός όγκου, το στάδιο, και η νόσος των περιφερειακών λεμφαδένες), και η ανάλυση ευαισθησίας πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας tau Kendall και rho του Spearman.

Ανάλυση ανοσοαποτύπωσης YAP1

Για να επιτευχθεί η απαραίτητη πυκνότητα κυττάρων μετά από 48 ώρες ανάπτυξης, BxPC-3, PANC-1, και τα κύτταρα HPDE6 σπάρθηκαν με τον ακόλουθο τρόπο σε Τ175 cm

2 φιάλες σε πλήρες μέσα αύξησης: δύο εκατομμύρια κύτταρα για 20-30%, τέσσερα εκατομμύρια κύτταρα για 50-70%, και επτά εκατομμύρια κύτταρα για το 100%. Τα κύτταρα πλύθηκαν με DPBS, σε επεξεργασία με θρυψίνη, και κατόπιν μετρήθηκαν για την Cellometer Auto Τ4 (Nexcelcom Biosciences, Lawrence, ΜΑ). Τέσσερα εκατομμύρια κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για υπο-κυτταρική κλασμάτωση χρησιμοποιώντας το BioVision Nuclear /κυτοσολίου Κλασμάτωση Kit (Mountain View, CA) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Για να παραχθούν προϊόντα λύσης ολικού κυττάρου από ένα εκατομμύριο κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό RIPA (Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ) με κοκτέιλ πρωτεάσης και φωσφατάσης αναστολέα 1Χ (Roche) και επωάστηκαν σε πάγο για 30 λεπτά. Τα εκχυλίσματα υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση σε 14,000 χ g για 10 λεπτά στους 4 ° C. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία πρωτείνης δικιγχονινικού οξέος (BCA) (Pierce Biotechnology, Rockford, IL). Ένα σύνολο 20 μg πρωτεΐνης ανά λωρίδα διαχωρίστηκε με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα NuPAGE Bis-Tris 4-12% (Invitrogen). Τα στυπώματα επωάστηκαν είτε με Phospho-YAP1 (Ser127) αντίσωμα (Cell Signaling) σε 1:2000 αραίωση ή ένα σύνολο YAP1 (Η-125) αντίσωμα (Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA) σε αραίωση 1:2000 διάρκεια της νύχτας σε 4 ° C και στη συνέχεια εκτέθηκαν σε αντι-κουνελιού IgG HRP-συνδεδεμένη αντίσωμα (Cell Signaling) σε 1:3000 αραίωση σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα. PARP (Cell Signaling) σε αραίωση 1:2000 χρησίμευσε ως έλεγχος φόρτωσης για το πυρηνικό κλάσμα, ενώ α-τουμπουλίνης (Cell Signaling) σε αραίωση 1:2000 χρησίμευσε ως έλεγχος για το σύνολο κυτταρολύματα και κυτοσολικό κλάσμα.

επεξεργασία siRNA και κυττάρων Δοκιμασίες Πολλαπλασιασμού

έκφραση YAP1 φίμωση επιτεύχθηκε με δύο YAP1 siRNA διπλά ολιγονουκλεοτίδια που στοχεύουν δύο διαφορετικές περιοχές της YAP1 μεταγραφή (Qiagen, Valencia, CA) σε τελική συγκέντρωση 20 nm χρησιμοποιώντας τον επιμόλυνση siLentfect αντιδραστήριο (Bio-Rad) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Τα siRNAs ανάστροφα-επιμολύνθηκαν με επώαση των siRNAs σε 10 μΐ RPMI 1640 μέσο κυτταρικής καλλιέργειας χωρίς ορό (Invitrogen) που περιέχει 50 μΙ του μίγματος siLentfect λιπιδικό αντιδραστήριο (Bio-Rad) ανά φρεάτιο και διατάσσονται σε πλάκες 96 φρεατίων. Το αντιδραστήριο siRNAs και διαμόλυνσης αφέθηκαν να επωαστούν σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά. Στη συνέχεια, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν στο μίγμα αντιδραστηρίου siRNA επιμόλυνση στα 4800 κύτταρα /φρεάτιο και συμπληρωμένο με ορό σε τελική συγκέντρωση 5% για BxPC-3 και 2% για PANC-1. Για την κυτταρική σειρά HPDE6, 6000 κύτταρα /φρεάτιο απλώθηκαν σε siRNA επιμόλυνση μίγμα αντιδραστηρίων στο μέσο των κερατινοκυττάρων. Οι πλάκες αποθηκεύθηκαν σε υγροποιημένο επωαστή στους 37 ° C και 5% CO

2. Μετά από 24 ώρες, το μέσο διαμόλυνσης αφαιρέθηκε από κάθε φρεάτιο και αντικαθίσταται με φρέσκο ​​μέσο ανάπτυξης συμπληρωμένο με ορό. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με την προσθήκη 100 μΙ του CellTiter-Glo Luminescent Δοκιμασία (Promega, Madison, WI) σε κάθε φρεάτιο. Οι πλάκες επωάστηκαν στους 37 ° C για μία ώρα, και η φωταύγεια καταγράφηκε με αναγνώστη μικροπλάκας Synergy ΗΤ (BioTek, Winooski, VT).

Η απόπτωση και κυτταρικό κύκλο ανάλυση

Η διαμόλυνση του YAP1 siRNAs στα παγκρεατικά γραμμές κυττάρων ήταν όπως περιγράφεται στις μελέτες του πολλαπλασιασμού των κυττάρων παραπάνω. Ενενήντα έξι ώρες μετά την αρχική επιμόλυνση, κασπάση-3 και -7 δραστηριότητες προσδιορίστηκαν με την προσθήκη 100 μΙ του κασπάση-Glo 3/7 Δοκιμασία (Promega) σε κάθε φρεάτιο. Οι πλάκες επωάστηκαν στους 37 ° C για μία ώρα, και η φωταύγεια καταγράφηκε με αναγνώστη μικροπλακός HT Synergy (BioTek). Η δραστικότητα της κασπάσης σε κύτταρα κατεργασμένα με siRNA κανονικοποιήθηκε προς εκείνη των κυττάρων Μόνο ελέγχου.

Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου του YAP1 siRNA αγωγή παγκρεατικού κυτταρικές σειρές όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23].

Anchorage- ανεξάρτητες δοκιμασίες

σε πλάκες 6 φρεατίων, 250.000 κύτταρα (BxPC-3 και PANC-1) αντίστροφη επιμολύνθηκαν με 20 ηΜ του YAP1 siRNAs (Qiagen) για 48 ώρες (72 ώρες για την εκχύλιση των πρωτεϊνών και ανοσοκηλίδος ανάλυση). Τα κύτταρα πλύθηκαν με DPBS, επεξεργασία με θρυψίνη, και μετρήθηκαν με αποκλεισμό trypan blue. Έξι χιλιάδες βιώσιμα κύτταρα BxPC-3 και 3000 βιώσιμων κυττάρων PANC-1 αναμίχθηκαν με 1 ml μέσου ανάπτυξης και 0.3% άγαρ και στη συνέχεια επιστρώνεται επάνω σε κρεβάτια άγαρ 0,5% σε πιάτα πλέγμα 35 mm. Τα κύτταρα αφέθηκαν να αναπτυχθούν για 21 ημέρες και ολόκληρη η περιοχή του πιάτου μετρήθηκε. Οι αποικίες μεγαλύτερες από 50 κύτταρα μετρήθηκαν ως θετικές για μετασχηματισμό. Οι δοκιμασίες διεξήχθησαν εις τριπλούν.

Κύτταρα που απομένουν από την επιμόλυνση διατηρήθηκαν για RNA και πρωτεϊνική εκχύλιση. Για εκχύλιση RNA, η RNeasy Mini Kit (Qiagen) χρησιμοποιήθηκε παρακάτω συνιστώμενο πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Ένα μικρογραμμάριο ολικού RNA χρησιμοποιήθηκε σε μία 20 μΙ αντίδραση σύνθεσης cDNA (Quantas Biosciences, Gaithersburg, MD). Οι αντιδράσεις διεξήχθησαν σε 1 μΐ του μίγματος αντίδρασης cDNA, 10 μΐ SYBR Green /Taq πολυμεράσης κύριο μείγμα (Roche, Indianapolis, ΙΝ), 4 μλ εκκινητές (YAP1, 5′-GCCATTAAAGGCAGCTGTTC-3 ‘και 5’-AGCACTGTGCCAGGTATCAC- 3 ‘? GAPDH, 5′-ATTGCCCTCAACGACCACTT-3′ και 5’-GGTCCACCACCCTGTTGC-3 ‘, σε μια τελική συγκέντρωση 400 nm), και 5 μΐ νερό σε ένα τελικό όγκο 20 μΙ. Το ενιαίο χρώμα σε πραγματικό χρόνο σύστημα ανίχνευσης PCR Bio-Rad MyIQ (Hercules, CA) χρησιμοποιήθηκε για την εκτέλεση της RT-PCR. ενίσχυση δύο βημάτων (95 ° C για 30 δευτερόλεπτα και 58 ° C για 30 sec) επαναλήφθηκε για 40 κύκλους. Μετά την αντίδραση PCR, μια ανάλυση καμπύλης τήξης διεξήχθη (60 ° C για 5 sec) για 35 κύκλους. Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας τη συγκριτική C

μέθοδος T [25]. Ανάλυση του προϊόντος λύσης ολικού κυττάρου επίπεδο πρωτεΐνης έκφρασης YAP1 ήταν όπως περιγράφηκε προηγουμένως, με την εξαίρεση ότι το siRNA-θεραπεία ήταν επί 72 ώρες.

Αποτελέσματα

YAP1 υπερεκφράζεται σε παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκινώματα (PDA )

Για να αξιολογηθεί το επίπεδο έκφρασης της YAP1 πρωτεΐνης σε ιστούς PDA, πραγματοποιήσαμε ανοσοχρώση χρησιμοποιώντας μικροσυστοιχίες ιστό (TMA). Μεταξύ των 66 περιπτώσεων PDA που περιέχονται στο ΤΜΑ, 64 αξιολογήθηκαν ως προς την χρώση των όγκων, εκ των οποίων 33 είχαν ταιριάζουν φυσιολογικό επιθήλιο. Το αντίσωμα έδειξε YAP1 τόσο πυρηνικά και κυτταροπλασματική χρώση, η οποία είναι συνεπής με τη γνωστή κυτταρική λειτουργία του YAP1 πρωτεΐνης – YAP1 εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα, όταν απενεργοποιείται και μετατοπίζεται σε πυρήνα όταν ενεργοποιείται. Εκτιμήσαμε την ένταση χρώσης τόσο για την πυρηνική και κυτταροπλασματική YAP1 και συνόψισε τα αποτελέσματα στον Πίνακα 1. Περίπου το 77% (49/64) των περιπτώσεων PDA είχε θετική (σκόραρε 1+ ή υψηλότερη) χρώση των πυρηνικών YAP1 στα καρκινικά κύτταρα, το 63% ( 31/49) από τα οποία είχαν μέτρια (2+) ή ισχυρή (χρώση 3+). Σε αντίθεση, μόνο το 48% (16/33) από τις περιπτώσεις είχαν θετική χρώση στο διπλανό φυσιολογικό επιθήλιο, με μόνο το 18% (6/33) είχαν μέτρια ή έντονη χρώση. Από την άλλη πλευρά, οι εντάσεις χρώσης στο κυτταρόπλασμα είναι συγκρίσιμα μεταξύ του όγκου και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών, όπου το 56% (36/64) των περιπτώσεων είχαν 2+ ή υψηλότερη χρώση στον όγκο και 43% (14/33) είχαν 2+ ή υψηλότερη χρώση σε γειτονικό φυσιολογικό επιθήλιο. Ανάλυση των περιπτώσεων όγκων που ταιριάζουν με γειτονικά φυσιολογικούς ιστούς χρησιμοποιώντας Wilcoxon signed-rank test έδειξε επίσης σημαντικά υψηλότερη έκφραση στα κύτταρα όγκου σε σύγκριση με παρακείμενες κανονικές πορογενές κυττάρων με μία τιμή ρ 0,0002. Αλλά το πιο σημαντικό, η διαφορά στο επίπεδο πρωτεΐνης YAP1 μεταξύ όγκου και γειτονικό φυσιολογικό επιθήλιο είναι πολύ πιο σημαντική στον πυρήνα (p-value = 0,0007) από ό, τι στο κυτταρόπλασμα (p-value = 0,027), υποδεικνύοντας ότι YAP1 όχι μόνο υπερεκφράζεται σε PDA αλλά είναι επίσης εξαιρετικά ενεργοποιηθεί.

η

το Σχήμα 1 απεικονίζει παραδείγματα διαφορική χρώση YAP1 σε PDA, δίπλα φυσιολογικούς ιστούς, και φυσιολογικό πάγκρεας. Σε μερικές κανονικές παγκρέατος και παγκρεατίτιδα ιστούς παρατηρήσαμε μέτρια έως ισχυρή χρώση YAP1 στα κυψελοειδή κύτταρα και μικρούς αγωγούς (Σχήμα 1 C). Παρ ‘όλα αυτά, η συνολική έκφραση της YAP1 στον όγκο είναι σημαντικά υψηλότερο σε σχέση με τις κανονικές πάγκρεας και περιπτώσεις παγκρεατίτιδα (p-value = 0,011).

α) αρνητική σε ασθενή κυτταροπλασματική χρώση σε φυσιολογικό επιθήλιο πόρου (λευκά βέλη) . Β) μέτρια χρώση (κυρίως κυτταροπλασματική) σε κανονική αγωγούς πλησίον του όγκου (λευκά βέλη). C) Μέτρια έως έντονη χρώση σε φυσιολογικό centroacinar και μικρά κύτταρα των πόρων (λευκά βέλη)? Δ) Ασθενής χρώση σε αδενοκαρκίνωμα του πόρου (μαύρα βέλη)? Ε) Ισχυρή χρώση σε ένα καλά διαφοροποιημένο πορογενές adenocarcinom (μαύρα βέλη)? και F) έντονη χρώση (κυρίως πυρηνική) σε μια κακώς διαφοροποιημένο αδενοκαρκίνωμα πόρου (μαύρα βέλη).

Η

Στη συνέχεια, συσχετίστηκε το ενεργοποιημένο επίπεδο έκφρασης πυρηνικών YAP1 με ιστοπαθολογικές παραμέτρους σε ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 2, δεν υπάρχει καμία συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης πυρηνικών YAP1 και βαθμού όγκου ή υπολειμματικής νόσου σε τοπικούς λεμφαδένες, αλλά υπάρχει μια οριακά σημαντική συσχέτιση (r = ρ-τιμή 0,33 και = 0.068 στην ανάλυση Pearson συντελεστής συσχέτισης) μεταξύ ραδιενέργειας YAP1 και το στάδιο του όγκου.

η

Εξετάζουμε επίσης το επίπεδο έκφρασης YAP1 σε ένα πάνελ οκτώ ανθρώπινου παγκρεατικού καρκίνου και δύο αθανατοποιημένα φυσιολογική ανθρώπινη παγκρεατική κυτταρικές γραμμές επιθηλιακών χρησιμοποιώντας κηλίδωση Western (Σχήμα 2Α). Έξι παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές (BxPC-3, CFPAC-1, ΗΡΑΡ-ΙΙ, Hs 766T, ΜΙΑ PaCa-2 και PANC-1) έδειξε υψηλή έως μέτρια επίπεδα πρωτεΐνης του YAP1. Δύο παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές (AsPC-1 και Capan-1) είχαν μη ανιχνεύσιμα σε χαμηλά επίπεδα πρωτεΐνης YAP1, αντίστοιχα. Οι δύο αθάνατες κυτταρικές γραμμές παγκρέατος (HPDE6 και hTERT-HPNE) είχαν χαμηλή έως μέτρια έκφραση της πρωτεΐνης YAP1. Αυτό το προφίλ έκφρασης του YAP1 σε παγκρεατικά κυτταρικές γραμμές είναι συνεπής με αυτό που παρατηρήθηκε στα δείγματα παγκρεατικό ιστό του όγκου (Πίνακας 1).

Α) Κηλίδωση Western ανάλυση της έκφρασης πρωτεΐνης YAP1 σε ένα πάνελ οκτώ καρκίνου του παγκρέατος και δύο αθανατοποιημένη (μη-μετασχηματισμένα) παγκρεατικών κυτταρικών σειρών. Β-Ε) Ανοσοϊστοχημική χρώση για YAP1 σε παγκρεατικά ξενομοσχεύματα καρκίνου: Β) AsPC-1? Γ) BxPC-3? Δ) ΜΙΑ PaCa-2? και Ε) PANC-1.

Η

Η περαιτέρω διερεύνηση της έκφρασης YAP1 σε ξενομοσχεύματος όγκοι που σχηματίζονται από τις παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές σειρές έδειξαν επίσης παρόμοια αποτελέσματα. Το Σχήμα 2 απεικονίζει την διαφορική χρώση και εντοπισμό YAP1 σε ξενομοσχεύματος όγκους των τεσσάρων παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημεία. Ο όγκος AsPC-1 είχε πολύ χαμηλή χρώση YAP1 και περιορίστηκε στο κυτταρόπλασμα (Σχήμα 2Β), η οποία είναι σύμφωνη με τα αποτελέσματα κηλίδωση Western (Σχήμα 2Α). BxPC-3 και ΜΙΑ PaCa-2, η οποία είχε μέτρια έως υψηλή περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη έκφραση YAP1 με κηλίδωση Western (Σχήμα 2Α), έδειξε μέτρια έως ισχυρή ανοσοχρώση στο κυτταρόπλασμα και μέτρια (ενίοτε ισχυρή) χρώση στους πυρήνες (2C και 2D, αντίστοιχα ). PANC-1 είχε παρόμοια έκφραση της πρωτεΐνης YAP1 με έντονη χρώση του κυτταροπλάσματος με χαμηλή έως μέτρια χρώση των πυρήνων (Σχήμα 2Ε).

Η έκφραση και ο εντοπισμός των YAP1 ρυθμίζεται από την κυτταρική πυκνότητα

έχει αναφερθεί ότι η αυξημένη κυτταρική πυκνότητα μπορεί να οδηγήσει στην ενεργοποίηση του μονοπατιού Hippo και ακολούθως την απομόνωση του YAP1 στο κυτταρόπλασμα [6]. Υποθέσαμε ότι σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα όπως ρύθμιση του YAP1 εντοπισμού με κυτταρική πυκνότητα μειώνεται. Για να διερευνηθεί αυτή η υπόθεση, αξιολογήσαμε το επίπεδο έκφρασης και ο εντοπισμός των YAP1 σε διάφορες κυτταρικές πυκνότητες από υποκυτταρικής κλασμάτωσης πρωτεϊνών και ανοσοκηλίδωση.

Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3, σε χαμηλότερες πυκνότητες κυττάρων (20-70%), το YAP1 πρωτεΐνη ήταν παρούσα τόσο στο κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα των δύο παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές, BxPC-3, και PANC-1, ενώ στην αθανατοποιημένη κανονική παγκρεατικού πόρου επιθηλιακή κυτταρική γραμμή, HPDE6, YAP1 δεν ήταν ανιχνεύσιμη στο κυτοσολικό κλάσμα. Όταν τα κύτταρα έγινε 100% συρροή, το σχετικό επίπεδο πρωτεΐνης πυρηνικής YAP1 (αναλογία των πυρηνικών YAP1 έναντι της συνολικής YAP1) αυξήθηκε σε BxPC-3 και PANC-1, αλλά όχι σε HPDE6 (Σχήμα S1). Αν και οι κυτοσολική επίπεδο πρωτεΐνης YAP1 αυξάνεται καθώς τα κύτταρα γίνονται συρρέουσες και στις τρεις κυτταρικές γραμμές, η αύξηση στην HPDE6 είναι η πιο σημαντική. Αυτό δείχνει ότι σχετικά πιο YAP1 παραμένει ενεργοποιημένο (μη φωσφορυλιωμένη) στις κυτταρικές σειρές καρκίνου απ ‘ότι στην αθανατοποιημένη φυσιολογική κυτταρική σειρά HPDE6 όταν τα κύτταρα καθίστανται συρρέοντα. Το επίπεδο της φωσφο-YAP1 (ρ-YAP1) πρωτεΐνη, η οποία ανιχνεύεται μόνο σε ολόκληρο προϊόν λύσης κυττάρου και το κυτοσολικό κλάσμα στις κυτταρικές γραμμές, επιβεβαιώνει επίσης τις διαφορές στην YAP1 κυτταρικό εντοπισμό μεταξύ των καρκινικών κυτταρικών γραμμών και HPDE6. ρ-YAP1 δεν ανιχνεύθηκε στο κυτοσολικό κλάσμα των χαμηλών συρρεόντων κυττάρων HPDE6 και υπήρξε μια δραματική αύξηση όταν τα κύτταρα έγιναν 100% συρροή. Στα καρκινικά κύτταρα, από την άλλη πλευρά, το ρ-YAP1 είναι παρόν σε χαμηλές πυκνότητες κυττάρων και αυξάνεται καθώς τα κύτταρα γίνονται περισσότερο συρροή. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η έκφραση YAP1 και εντοπισμός δεν είναι όπως σφικτά ρυθμίζεται από κυτταρική πυκνότητα σε καρκινικά κύτταρα όπως και στα φυσιολογικά κύτταρα, γεγονός που υποδηλώνει ότι η λειτουργία YAP1 μπορεί να απορυθμίζεται σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα.

Καθώς αυξάνεται η κυτταρική πυκνότητα, ο παγκρεατικός κυτταρικές σειρές καρκίνου, BxPC-3 και PANC-1, απάντηση στην απενεργοποίηση του YAP1 ως συμπαράγοντας μεταγραφής από κυτοσολικής παγίδευση είναι λιγότερο σημαντική από ό, τι HPDE6. Τα κύτταρα εκχυλίζονται στην αύξηση κυτταρικές πυκνότητες μετά από 48 ώρες από την αρχική σπορά. PARP χρησιμεύει ως έλεγχος φόρτωσης για το πυρηνικό κλάσμα. α-τουμπουλίνης χρησιμεύει ως έλεγχος φόρτωσης για το σύνολο κυτταρολύματα και κυτοσολικό κλάσμα.

Η

siRNA knockdown του YAP1 μειώνει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, επάγει την απόπτωση, και υποχωρεί από αγκύρωση ανάπτυξη ανεξάρτητη σε παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές

για να αναλυθεί περαιτέρω ο ρόλος της YAP1 στην ογκογένεση, εξετάσαμε την επίδραση της YAP1 αποσιώπηση από siRNA ολιγονουκλεοτίδια επί του πολλαπλασιασμού των παγκρεατικών κυττάρων, την απόπτωση, και αγκύρωση-ανεξάρτητη ανάπτυξη. BxPC-3 και PANC-1 κύτταρα αντίστροφης-επιμολύνθηκαν με δύο siRNA ολιγονουκλεοτίδια που στοχεύουν διαφορετικές περιοχές της αλληλουχίας YAP1 mRNA. Οι Allstars Αρνητικός siRNA ελέγχου (Neg siRNA) και Allstars Θάνατος ελέγχου siRNA (Qiagen) χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχοι για σύγκριση siRNA επιδράσεις διαμόλυνση σε κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης.

Πάνω από ένα χρόνο πορεία 96 ωρών, τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με YAP1 siRNA είχε σημαντική μείωση των ρυθμών ανάπτυξης σε σύγκριση με τα κύτταρα μόνο και αρνητικού ελέγχου siRNA (Neg siRNA). Στο Σχήμα 4, ο Αρν siRNA είχε ελάχιστη επίδραση επί του πολλαπλασιασμού των BxPC-3 και PANC-1 σε σύγκριση με το μη επεξεργασμένο Cells Μόνο ελέγχου. Ωστόσο, αμφότερες οι αλληλουχίες YAP1 siRNA είχε σημαντικά κατέστειλε τον πολλαπλασιασμό τόσο BxPC-3 και PANC-1. Ενενήντα έξι ώρες μετά την αγωγή siRNA, siRNA αλληλουχία YAP1_1 ανέστειλε την ανάπτυξη του BxPC-3 και PANC-1 κύτταρα κατά 69% και 53%, αντίστοιχα (ρ & lt? 0,01) και την αλληλουχία siRNA YAP1_2 ανέστειλε την ανάπτυξη κατά 34% και 33% , αντίστοιχα (ρ & lt? 0,05). YAP1 siRNA αλληλουχίες δεν μειώνουν σημαντικά τον πολλαπλασιασμό σε HPDE6 (Σχήμα S2A).

Η ανάπτυξη των κυττάρων καμπύλες Α) BxPC-3 και Β) PANC-1 επιμολυσμένα με YAP1 siRNA ολιγονουκλεοτίδια. Η ανεξάρτητη δύο δειγμάτων

t

test (two-tailed) χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό της στατιστικής σημασίας στο χρονικό σημείο των 96 ωρών σε σύγκριση με Neg siRNA. * Υποδηλώνει p & lt? 0,05 και ** σημαίνει ρ & lt? 0,01. Γ) Η κασπάση-Glo 3/7 Δοκιμασία (Promega) χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί το επίπεδο της απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος επιμολυσμένα με YAP1 siRNA ολιγονουκλεοτίδια μετά από 72 ώρες. ** Υποδηλώνει μια ανεξάρτητη δύο δειγμάτων

t

test (two-tailed) p-τιμή του & lt?. 0.01, σε σύγκριση με τον αρνητικό μάρτυρα siRNA (Neg siRNA)

Η

Για να αξιολογηθεί η επίδραση της αναστολής YAP1 στην απόπτωση, μετρήσαμε την ενεργοποίηση της κασπάσης-3 και κασπάσης-7 σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα σε επεξεργασία με siRNA. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 4C, 72 ώρες μετά την επιμόλυνση, αμφότερες οι αλληλουχίες YAP1 siRNA που επάγεται κασπάσης 3/7 δραστηριότητας κατά περισσότερο από 2 φορές (ρ & lt? 0,05) σε σύγκριση με τον αρνητικό μάρτυρα siRNA σε BxPC-3, ενώ μία αλληλουχία (YAP1_1) σημαντικά επαγόμενη δραστικότητα κασπάσης (ρ & lt? 0,05) σε PANC-1. Ωστόσο, ούτε YAP1 siRNA αλληλουχία που προκαλούνται σημαντικά τη δραστικότητα της κασπάσης 3/7 στα κύτταρα HPDE6 (Σχήμα S2B). Αυτό το εύρημα υποδεικνύει ότι knockdown έκφρασης YAP1 επάγει κασπάσης-εξαρτώμενη απόπτωση στα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος.

Στη συνέχεια, εξετάστηκαν οι επιδράσεις της αναστολής YAP1 στη διανομή του κυτταρικού κύκλου (Πίνακας S1). Αμφότερες οι αλληλουχίες YAP1 siRNA προκάλεσε σημαντική αύξηση στον πληθυσμό των κυττάρων G0 /G1 τόσο BxPC-3 και PANC-1, σε σύγκριση με τον αρνητικό μάρτυρα siRNA. Σε HPDE6, οι δύο αλληλουχίες siRNA δεν προκάλεσε συνεπής επιδράσεις στην κατανομή του κυτταρικού κύκλου, σε σύγκριση με τον μάρτυρα Αρν siRNA (Πίνακας S1).

Από τη στιγμή που παρατηρείται μια σημαντική επίδραση στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, θελήσαμε να εξετάσουμε αν YAP1 knockdown με siRNA θα καταργούσε ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη των παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων. BxPC-3 και PANC-1 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις αλληλουχίες siRNA για 48 ώρες και συλλέχθηκαν με τρυψινοποίηση. Ίδιος αριθμός των βιώσιμων κυττάρων για κάθε αγωγή στη συνέχεια εμβολιάζονται σε μαλακό άγαρ. Μετά από 21 ημέρες, μετρήθηκαν οι αποικίες από κάθε ομάδα και στη συνέχεια κανονικοποιούνται προς τα κύτταρα ελέγχουν και παριστάνεται ως ένα ποσοστό των αποικιών. Τόσο YAP1_1 και YAP1_2 siRNAs κατέστειλε κλωνογονικότητας σε μαλακό άγαρ σε BxPC-3 (95%, ρ & lt? 0,01) και σε PANC-1 (60%, ρ & lt? 0,05) (Σχήμα 5Α). Σε αντίθεση με την παρόμοια ανασταλτική δράση στη δοκιμασία πολλαπλασιασμού των κυττάρων (Σχήμα 4Α και 4Β), η μείωση σε σχηματισμό αποικίας ήταν πολύ μεγαλύτερη σε BxPC-3 κύτταρα (-95%) από ότι σε κύτταρα PANC-1 (~ 60%). Αυτή η διαφορά είναι συνεπής με το επίπεδο του mRNA YAP1 και μείωση της πρωτεΐνης από τα ολιγονουκλεοτίδια siRNA στις κυτταρικές σειρές (Σχήμα 5Β και 5Γ). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5C, η μειωμένη έκφραση πρωτεΐνης με YAP1 siRNAs είναι περισσότερο δραματική σε BxPC-3 κύτταρα από ό, τι σε κύτταρα PANC-1.

α) ποσοστό των αποικιών σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου Μόνο σε μαλακό άγαρ μετά από 21 ημέρες ανάπτυξης από την αρχική σπορά. p-τιμές υπολογίστηκαν με σύγκριση της YAP1 siRNA (YAP1_1 και YAP1_2) στην Αρν siRNA (ανεξάρτητη δύο ουρά

t

δοκιμή, δύο-tailed). Β) Ανάλυση της έκφρασης qPCR YAP1 mRNA μετά από 48 ώρες siRNA την επιμόλυνση. Γ) Western στύπωμα ανάλυση της έκφρασης YAP1 μετά siRNA-θεραπεία για 72 ώρες. Τα δείγματα για κάθε κυτταρική γραμμή διαχωρίζονται και αναλύονται στην ίδια κηλίδα * υποδηλώνει p & lt?. 0,05 και ** σημαίνει ρ & lt?. 0.01

Η

Συζήτηση

Αρχικά ανακαλύφθηκε στη Drosophila όπως ένας ισχυρός οδός για την καταστολή του όγκου, η οδός Hippo ρυθμίζει αρνητικά την ανάπτυξη των κυττάρων μέσω ενός καταρράκτη κινάσης και έχει ως αποτέλεσμα την αδρανοποίηση του YKI (YAP1 στα θηλαστικά) [6], [7], [9], [10]. Η οδός και τα συστατικά του είναι πολύ συντηρημένες σε θηλαστικά, και πολλαπλές μελέτες έχουν δείξει αναγκάζοντας τους ρόλους του μονοπατιού της ρύθμισης της κυτταρικής ανάπτυξης, πολλαπλασιασμού, επιβίωσης, και σύνδεσης σε κακοήθειες [26] – [33]. Δεδομένου ότι η πυρηνική τελεστή της μεταγραφής, YAP1 έχει γίνει ένας ελκυστικός στόχος της έρευνας σε κακοήθειες των θηλαστικών. Στη μελέτη μας, έχουμε παρατηρήσει ότι YAP1 υπερεκφράζεται σε όγκους του παγκρέατος και σε καρκινικές κυτταρικές σειρές. Η προς τα κάτω ρύθμιση των YAP1 μειωμένη βιωσιμότητα των κυττάρων, τον πολλαπλασιασμό, και ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη σε καλλιεργημένα κύτταρα.

Ο υποκυτταρικός εντοπισμός των YAP1 των παγκρεατικών όγκων και στις καλλιεργημένες κυτταρικές σειρές υπογράμμισε την απορύθμιση του μονοπατιού Hippo. Κατά την ενεργοποίηση της οδού, YAP1 απενεργοποιείται μέσω φωσφορυλίωσης από LATS1 /2 και κατά συνέπεια κατακρατείται στο κυτταρόπλασμα [6], [7]. Στις μελέτες μας ανοσοχρώση, χρώση YAP1 είναι γενικά πιο έντονη στο κυτταρόπλασμα σε σύγκριση με τον πυρήνα, και ο όγκος έχει ένα σημαντικά υψηλότερο ποσοστό των κυττάρων με θετική χρώση YAP1 στον πυρήνα από το γειτονικό φυσιολογικό (77% έναντι 48%). Παρά το γεγονός ότι ένα σημαντικό ποσοστό των παρακείμενων κανονικές περιπτώσεις χρωματίστηκαν θετικά για YAP1, το συνολικό επίπεδο έκφρασης είναι σημαντικά υψηλότερη στον όγκο (Πίνακας 1). Η χρώση του YAP1 σε φυσιολογικούς ιστούς παγκρέατος περιορίζεται σε κυψελοειδή κύτταρα και μικρούς αγωγούς, το οποίο είναι συνεπές με μία προηγούμενη μελέτη [34] και πιθανόν αντιπροσωπεύει την κανονική λειτουργία του YAP1 στη διατήρηση της ομοιόστασης των ιστών.

Ως προηγούμενη μελέτη [6] και η δική μας έχουν παρατηρήσει, η έκφραση πρωτεΐνης YAP1 διαμορφώνεται με την αύξηση της πυκνότητας. Σε χαμηλή πυκνότητα, η έκφραση της πρωτεΐνης YAP1 είναι ελάχιστη, αλλά όπως η κυτταρική πυκνότητα αυξάνει την έκφραση YAP1 αυξάνει αναλόγως. Στο Σχήμα 3, μια βραδύτερη μεταναστευτική ζώνη παρατηρήθηκε στα παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές ανοσοστυπώθηκαν για συνολικό YAP1 όταν η κυτταρική πυκνότητα έφθασε το 100% σε όλη την λύμα κυττάρου και πυρηνική κλάσματα. Εμείς υποθέσουμε ότι η βραδύτερη μεταναστευτική ζώνη που παρατηρείται στο πυρηνικό κλάσμα δεν οφείλεται στην φωσφορυλίωση γνωστό ότι ρυθμίζει YAP1 εντοπισμού, αλλά μάλλον μια μετα-μεταφραστική τροποποίηση άγνωστο αυτή τη στιγμή [35] – [38]. Για τις μελλοντικές μελέτες, η πυκνότητα των κυττάρων πρέπει να σημειωθεί σε σχέση με την έκφραση της πρωτεΐνης YAP1. Σε παγκρεατικό κυτταρικές γραμμές, η έκφραση πρωτεΐνης YAP1 και εντοπισμός ρυθμίζεται από την κυτταρική πυκνότητα, αλλά τέτοια ρύθμιση φάνηκε να μειωθεί σημαντικά σε καρκινικά κύτταρα σε σύγκριση με εκείνη σε φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα του πόρου (Σχήμα 3). Είναι ενδιαφέρον ότι, αν και βλέπουμε υψηλά επίπεδα χρώσης YAP1 τόσο πυρήνα και του κυτταροπλάσματος σε ιστούς PDA, το επίπεδο της πρωτεΐνης πυρηνικής YAP1 είχε περισσότερο σημαντική αύξηση από την κυτταροπλασματική YAP1 όταν συγκρίνεται προς γειτονικούς κανονικούς ιστούς (Πίνακας 1). Αυτό ίσως δείχνει ότι, εκτός από την προς τα πάνω ρύθμιση της έκφρασης YAP1 πρωτεΐνης, συστατικά της οδού Hippo που ρυθμίζουν εντοπισμό YAP1 (φωσφορυλίωση) θα μπορούσε επίσης να απορυθμίζεται σε καρκίνο του παγκρέατος. Στην πραγματικότητα, οι LATS1 /2 κινάσες ανοδικά YAP1 δειχθεί ότι ρυθμίζεται προς τα κάτω σε αρκετούς τύπους καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του σαρκώματος των μαλακών ιστών [39], αστροκύτωμα [40], και του καρκίνου του μαστού [41], [42]. Πιο πρόσφατα, Zhou et al. ανέφεραν την απώλεια δραστικού MST1, μια άλλη κινάση ανάντη του YAP1, σε ανθρώπινα ηπατοκυτταρικά καρκινώματα (HCC) και είναι κατασταλτικές όγκου σε διαγονιδιακά μοντέλα ποντικού [43] – [45].