Αφηρημένο

Η /οδός E2F CDK /Rb είναι συνήθως διαταράσσεται στον καρκίνο του πνεύμονα, και ως εκ τούτου, προβλέπεται ότι μπλοκάροντας το μονοπάτι E2F θα έχουν θεραπευτικές δυνατότητες. Για να ελεγχθεί αυτή η υπόθεση, έχουμε εξετάσει τη δραστικότητα της HLM006474 (ένα μικρό μόριο αναστολέα παν-E2F) στον καρκίνο του πνεύμονα κυτταρικές σειρές ως μονοθεραπεία και σε συνδυασμό με άλλες ενώσεις. HLM006474 μειώνει τη βιωσιμότητα και των δύο γραμμών SCLC και NSCLC με ένα βιολογικό IC

50 που ποικίλλει μεταξύ 15 και 75 μΜ, αλλά χωρίς σημαντική διαφορά μεταξύ των ομάδων. Συνδυασμός HLM006474 με σισπλατίνη και γεμσιταβίνη αποδεικνύει λίγο συνέργεια? Ωστόσο, HLM006474 συνεργεί με paclitaxel. Παραδόξως, ανακαλύψαμε ότι η σύντομη επεξεργασία των κυττάρων με HLM006474 οδήγησε σε αύξηση των επιπέδων της πρωτεΐνης E2F3 (λόγω της άρσης της καταστολής από αυτές τις περιοχές προαγωγού). Δεδομένου ότι η ευαισθησία paclitaxel έχει αποδειχθεί ότι συσχετίζεται με τα επίπεδα E2F3, υποθέσαμε ότι η συνέργεια HLM006474 με το paclitaxel μπορεί να διαμεσολαβείται από παροδική επαγωγή του E2F3. Για να ελεγχθεί αυτό, Η1299 κύτταρα εξαντλούνται από E2F3a και E2F3b με siRNA και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με πακλιταξέλη. Δοκιμασίες πολλαπλασιασμού έδειξαν ότι και οι δύο siRNAs μειώνεται σημαντικά η ευαισθησία paclitaxel, όπως αναμενόταν. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι μπορεί να έχει HLM006474 αποτελεσματικότητα στον καρκίνο του πνεύμονα και μπορεί να είναι χρήσιμη σε συνδυασμό με ταξάνες

Παράθεση:. Kurtyka CA, Chen L, Cress WD (2014) E2F Αναστολή συνεργεί με πακλιταξέλη στον καρκίνο του πνεύμονα Γραμμές κυττάρων. PLoS ONE 9 (5): e96357. doi: 10.1371 /journal.pone.0096357

Συντάκτης: John D. Minna, Πολυτεχνείου της Texas Southwestern Medical Center στο Ντάλας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 18 Δεκέμβρη 2013? Αποδεκτές: 4 του Απρίλη του 2014? Δημοσιεύθηκε: May 15, 2014

Copyright: © 2014 Kurtyka et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από μια επιχορήγηση από το Εθνικό Ίδρυμα Καρκίνου (CA119997), την Bankhead Coley Καρκίνο Ερευνητικό Πρόγραμμα του Τμήματος Φλόριντα Υγείας (FDH 08BB-05) και το Κέντρο Καρκίνου Moffitt. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. WDC είναι ένας εφευρέτης για δίπλωμα ευρεσιτεχνίας ΗΠΑ 8.202.886 Β2 που πραγματοποιήθηκε από το Πανεπιστήμιο της Νότιας Φλόριντα. Διαφορετικά, οι συγγραφείς δεν έχουν καμία σύγκρουση συμφερόντων. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων να PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Η πρωτεΐνη ρετινοβλάστωμα (κοινώς ονομάζεται Rb) αναγνωρίζεται ευρέως ως ένα από τα πιο σημαντικά καταστολείς των όγκων σε ανθρώπους. Μαζί με τα παρόμοια «τσέπη» πρωτεΐνες ρ107 και ρ130, είναι υπεύθυνη για τη ρύθμιση εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου [1]. Η οικογένεια Rb ρυθμίζει τον κυτταρικό κύκλο μέσω δεσμεύει και να αναστέλλει την μεταγραφική δραστικότητα της πρώιμης 2 παράγοντες (E2Fs) και ογκοκατασταλτικά δραστηριότητα της είναι στενά συνδεδεμένα σε αυτή τη λειτουργία. [2] Όταν φωσφορυλιωθεί (τυπικά με CDKs 2, 4, και 6 σε G1), το Rb καθίσταται αδρανοποιείται, απελευθερώνοντας έτσι E2Fs και επιτρέποντας την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου [3]. Προκειμένου να αποφευχθεί η παρεκκλίνουσα έναρξη του κυτταρικού κύκλου, αναστολείς CDK όπως CDKN2A (κοινώς γνωστό ως p16) εμποδίζουν CDKs από φωσφορυλίωσης κύτταρα Rb και δύναμη για να παραμείνουν στην G1 [4].

Ανάλογα με το πλαίσιο, E2F μέλη της οικογένειας μπορεί να χρησιμεύσει ως μεταγραφικοί ενεργοποιητές που οδηγούν την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου ή μεταγραφικοί καταστολείς που περιορίζουν τον κυτταρικό κύκλο εξέλιξης [5]. Ως ενεργοποιητές, οι E2Fs αναγνωρίζονται ως σημαντική για τον πολλαπλασιασμό μέσω της ενεργοποίησης τους μεταγραφική των γονιδίων S φάση. E2Fs ενεργοποιούν τη μεταγραφή μέσω σύνδεσης με ακετυλοτρανσφεράσης ιστόνης (ΗΑΤ) δραστηριότητα [6], [7]. Ως καταστολείς, E2Fs αναστέλλουν τη μεταγραφή των γονιδίων που χρησιμοποιούνται στην καταχώρηση φάση S με σύνδεση προς προαγωγούς τους και την καταστολή της μεταγραφής μέσω της ικανότητάς τους να συνδέονται σε Rb και άλλες πρωτεΐνες τσέπη, η οποία με τη σειρά της την πρόσληψη τροποποιητές χρωματίνη όπως αποακετυλασών ιστόνης (HDACs) [6] – [8]. Από όλες τις E2F μέλη της οικογένειας, E2F3 είναι το μόνο που απαιτείται ατομικά για τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό να συμβεί [9] – [13]. E2F3 είναι σημαντική για την μεταγραφή διαφόρων γονιδίων για την είσοδο S φάση και έχει αποδειχθεί ότι έχουν ρόλους στην μεταγραφή γονιδίων που απαιτούνται για την G2 /φάσεις Μ (όπως κινάσης Aurora Α [14], CDC2 [15], και η κυκλίνη Β1 [15], [16]). Υπάρχουν δύο ισομορφές E2F3, E2F3a και E2F3b, κάθε που προκύπτει από τη μεταγραφή σε δύο διαφορετικούς υποκινητές. επίπεδα E2F3b παραμένουν σταθερά σε όλη του κυτταρικού κύκλου, ενώ τα επίπεδα E2F3a διακυμάνσεις και φθάνουν τα μέγιστα επίπεδα έκφρασης γύρω από τη μετάβαση G1 /S [17] – [19]. μελέτες knockout Mouse αποκαλύπτουν ότι E2F3a και E2F3b γενικά αντισταθμιστική ένα για το άλλο [20], [21], αλλά διαγραφή και των δύο ισομορφών είναι θανατηφόρα [9], [20]. Τέλος, E2F3 περισσότερο εντόνως εκφρασμένο σε πολλές καρκίνους (βλέπε [5] για ανασκόπηση), συμπεριλαμβανομένου του πνεύμονα [22] και η δραστικότητά της έχει συσχετιστεί με αυξημένη ευαισθησία σε θεραπεία ταξάνης σε καρκίνους των ωοθηκών [23] και του καρκίνου του ER-αρνητικών μαστού [ ,,,0],24].

Η /Rb /οδός E2F CDK διαταράσσεται σχεδόν σε κάθε εμφάνιση του ανθρώπινου καρκίνου του πνεύμονα, την κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο σχετίζονται με όλο τον κόσμο [25]. Σε μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (SCLC), η οποία αντιπροσωπεύει περίπου το 15% των καρκίνων του πνεύμονα, το πιο κοινό μηχανισμό Rb αναστάτωση οδός είναι η μετάλλαξη της ίδιας της πρωτεΐνης Rb. Στην πραγματικότητα, περίπου το 90% των μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα έχει έλλειψη λειτουργικού Rb πρωτεΐνη [26], [27]. Αντίθετα, σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC), τους λογαριασμούς μετάλλαξη Rb για 15-30% αυτών των καρκίνων [26], [28], και η απορρύθμιση του /Rb /E2F μονοπάτι CDK συμβαίνει πιο συχνά μέσω αποσιώπηση του αναστολέα CDK ρ16 [29] – [32]. Στις περισσότερες περιπτώσεις NSCLC όπου το

RB1 ​​

γονίδιο είναι άθικτο, οι αναστολείς των CDK4 και 6 θα αντιπροσωπεύουν ένα δυναμικό τρόπο να στοχεύσουν αυτό το μονοπάτι. Αυτή η υπόθεση έχει εξετασθεί σε αρκετές κλινικές δοκιμές και τα προκαταρκτικά αποτελέσματα στον καρκίνο του μαστού είναι πολύ ελπιδοφόρα [33] – [35]., Υποδηλώνοντας ότι /E2F αναστολείς οδού CDK /Rb μπορούν να διαδραματίσουν στη θεραπεία διαφόρων καρκίνων σημαντικό ρόλο

το όφελος των αναστολέων CDK μπορεί να περιορίζεται σε όγκους κατά την οποία η Rb πρωτεΐνη παραμένει WT και λειτουργική, και ως εκ τούτου, τα αντιδραστήρια που θα μπορούσαν να στοχεύουν αυτή την οδό προς τα κάτω του Rb μπορεί να είναι χρήσιμη σε καρκίνους όπου Rb είναι κοινώς μεταλλαγμένο (όπως καρκίνος του πνεύμονα). Για να ελεγχθεί αυτή η υπόθεση, έχουμε εξετάσει τη δραστικότητα της HLM006474 έναντι μιας ομάδας κυτταρικών σειρών καρκίνου του πνεύμονα. HLM006474 (επίσης συζητείται εδώ ως 6474) είναι ένα μικρό μόριο παν-αναστολέα της E2F-DNA δέσμευσης [36]. Αν και το IC

50 HLM006474 είναι σχετικά υψηλή (30 μΜ), έχει βρεθεί χρήση ως ένωση εργαλείο [37] – [40].

In vivo

μελέτες δείχνουν ότι τα αποτελέσματα της θεραπείας 6474 σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές περιλάμβαναν μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και μία αύξηση στην απόπτωση και μειωμένη εισβολή σε ένα τρισδιάστατο σύστημα μοντέλο καλλιέργειας ιστών [36]. HLM006474 μπορεί να είναι χρήσιμη στην πρόληψη του καρκίνου με οδηγεί σε μια αύξηση στην απόπτωση και μείωση του πολλαπλασιασμού σε ογκογόνα ανθρώπινων εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων [39], καθώς και οδηγούν σε μείωση του σχηματισμού όγκων σε έμβρυα ποντικού επιρρεπείς σε ρετινοβλάστωμα [40]. Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η παρέμβαση με την E2F δραστικότητα χρησιμοποιώντας μικρά μόρια μπορούν να έχουν κλινική εφαρμογή στη θεραπεία του καρκίνου. Στην παρούσα εργασία, παρέχουμε μια πιο λεπτομερή χαρακτηρισμό 6474 στο πλαίσιο του καρκίνου του πνεύμονα. HLM006474 μειώνει την βιωσιμότητα του ένα ευρύ φάσμα κυτταρικών γραμμών με ένα βιολογικό IC

50 που ποικίλλει μεταξύ 15 και 75 μΜ. Συνδυασμός HLM006474 με κοινή χημειοθεραπευτικών παραγόντων σισπλατίνη και γεμσιταβίνη αποδεικνύει λίγο συνέργεια? Ωστόσο, HLM006474 συνεργεί με paclitaxel. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι μπορεί να έχει HLM006474 αποτελεσματικότητα έναντι καρκίνων στο οποίο είναι απορυθμισμένη E2F και μπορεί να είναι χρήσιμη σε συνδυασμό με άλλα φάρμακα που στοχεύουν συστατικά του κυτταρικού κύκλου.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρικές γραμμές και χημικές ενώσεις

πνεύμονα κυτταρικές σειρές καρκίνου ελήφθησαν από την ATCC ή δημιουργούς και δόθηκαν από το SPORE Moffitt στον καρκίνο του πνεύμονα εγκατάσταση κυττάρων Core. Όλες οι γραμμές επικυρώνονται από γονότυπου και διατηρείται απαλλαγμένο από

Mycoplasma

. κυτταρικές γραμμές SCLC αναπτύχθηκαν σε RPMI 1640 με 10% FBS και 1% pen /strep. κυτταρικές γραμμές NSCLC καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 με 10% FBS χωρίς αντιβιοτικά. HLM006474 συντέθηκε και επικυρωμένη από την Moffitt Χημείας πυρήνα όπως περιγράφηκε προηγουμένως [36]. Γεμσιταβίνη (Gemzar, Eli Lilly) αγοράστηκε μέσω της Moffitt Φαρμακείο και διαλύεται σε νερό. Η σισπλατίνη και πακλιταξέλη αγοράστηκαν από τη Sigma και συμπυκνωμένα διαλύματα παρακαταθήκης παρασκευάστηκαν σε διμεθυλοσουλφοξείδιο.

siRNA knockdown

κύτταρα τοποθετούνται σε -50% συρροή σε πλάκες 6-φρεατίων μορφομετατράπηκαν χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Life Technologies) σύμφωνα με τις οδηγίες του προμηθευτή με 200 pmol του είτε siGENOME μη στόχευση siRNA # 2 (Dharmacon) ή siRNA που στοχεύει E2F3a ή E2F3b όπως περιγράφεται σε ένα έγγραφο από Hurst

κ.ά.

[41]. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν τέσσερις ώρες μετά την επιμόλυνση για δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας (όπως περιγράφεται παρακάτω). Τα υπόλοιπα κύτταρα επανα-επιστρώθηκαν και συλλέχθηκαν για ανάλυση Western blot 24 ώρες μετά την επιμόλυνση.

δοκιμασίες Βιωσιμότητας

Η αντιπολλαπλασιαστική δραστικότητα των ενώσεων και των συνδυασμών τους αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας μία υψηλής απόδοσης CellTiter-Μπλε δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας (Promega), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [42]. Για τις αναλύσεις, 1000 κύτταρα σε 24 μί τοποθετήθηκαν σε πλάκες 384-φρεατίων και επωάζονται όλη τη νύκτα στους 37 ° C, 5% CO

2. Την επόμενη μέρα, τα φάρμακα αραιώθηκαν σε μέσο και 6 μL από αυτές τις αραιώσεις προστίθενται σε κατάλληλα φρεάτια χρησιμοποιώντας ένα αυτοματοποιημένο σταθμό σιφωνισμού. Τέσσερα πανομοιότυπα φρεάτια χρησιμοποιήθηκαν για κάθε συγκέντρωση φαρμάκου. Τα κύτταρα επωάστηκαν με το φάρμακο για 120 ώρες, κατά τον οποίο χρόνο, προστέθηκε 5 μλ CellTiter-Μπλε αντιδραστήριο (Promega Corp., Madison, WI). Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε από την ικανότητα των υπόλοιπων κυττάρων επεξεργασία για να βιοανάγουν ρεζαζουρίνης να ρεζορουφίνη (579 nm Εχ /584 nm Em). Ο φθορισμός αναγνώστηκε με έναν αναγνώστη μικροπλάκας Synergy ΗΤ (Bio-Tek Instruments, Inc., Winooski, VT). IC

’50 προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας μία σιγμοειδή μοντέλο ισορροπίας παλινδρόμησης χρησιμοποιώντας XLfit έκδοση 4.3.2 (ID Business Solutions Ltd.) και ορίζεται ως η συγκέντρωση του φαρμάκου που απαιτείται για τη μείωση κατά 50% της αύξησης /βιωσιμότητα. Για 3- (-2-υλ 4,5-διμεθυλθειαζολ) -5- (3-καρβοξυμεθοξυφαινυλ) -2- (4-σουλφοφαινυλ) -2Η-τετραζόλιο (MTS) προσδιορισμούς κυτταρικής βιωσιμότητας, προστέθηκε CellTiter 96 Υδατικό One Solution από την Promega σύμφωνα με τις οδηγίες του πωλητή σε κύτταρα για 2 ώρες μετά την αγωγή με το φάρμακο στο σημειώνεται δόση για 72 ώρες. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές.

δείκτες Συνδυασμός

Το IC

50 τιμές που λαμβάνονται από προσδιορισμούς μόνο κύτταρο φάρμακο βιωσιμότητα χρησιμοποιήθηκαν για να σχεδιάσουν πειράματα συνδυασμού. Για 6474 συνδυασμούς με σισπλατίνη, γεμσιταβίνη και πακλιταξέλη, οι αναλογίες αυτές ήταν 1:01, 500:1 και 4000:1, αντίστοιχα. Για τα πειράματα συνδυασμού φαρμάκου, οι δοκιμασίες κυτταρικής βιωσιμότητας διεξήχθησαν και τα αποτελέσματα αναλύθηκαν για συνεργιστική, πρόσθετο, ή ανταγωνιστικές δράσεις χρησιμοποιώντας τον δείκτη συνδυασμού (CI) μέθοδος που αναπτύχθηκε από τους Chou και Talalay [43]. Συνδυασμός δείκτες CI & lt? 1, CI = 1, και CI & gt? 1 δείχνουν συνέργεια, αθροιστικών επιδράσεων, και ο ανταγωνισμός, αντίστοιχα

Αντισώματα και western αποτύπωση

κηλίδες Western έγιναν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [36. ], [44], [45]. Εν συντομία, προϊόντα λύσεως πλήρων κυττάρων υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη PVDF. Η ανίχνευση των πρωτεϊνών επιτεύχθηκε με τη χρήση ραφανιδική-υπεροξειδάση-συζευγμένο δευτερεύον αντισώματα και ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (ECL) που αγοράστηκε από την Amersham ή Thermo Scientific. Διάφορα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν περιλάμβαναν E2F1 (C-20, SC-193, Santa Cruz), E2F3 (C-18, SC-878, Santa Cruz), PARP (# 9542L, Cell Signaling Technology), και μονοκλωνικά β-ακτίνης (κλώνος AC -15, cat Νο: A5441, Sigma). Adobe Photoshop CS χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση της Δυτικής αναγνώσεις έντασης μπάντα κηλίδα απ ‘ευθείας από το εκτεθειμένο φιλμ χρησιμοποιώντας το ορθογώνιο εργαλείο μαρκαρίσματος /ιστόγραμμα και την ανεστραμμένη σαρωθεί ταινία εικόνα. Αυτό το ίδιο τετράγωνο χρησιμοποιήθηκε για όλες τις περαιτέρω αναγνώσεις ζώνη έτσι ώστε να διασφαλιστεί ότι η ίδια περιοχή αναλύθηκε για κάθε ζώνη. Οι αναγνώσεις έγιναν στη συνέχεια ρυθμίστηκε στο λογαριασμό για ακτίνη και το φόντο και αυθαίρετα ομαλοποιούνται στη κυτταρική γραμμή Η23 (εκχωρηθεί μία τιμή 1).

σε πραγματικό χρόνο

αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης

RNA συλλέχθηκε από τα κύτταρα χρησιμοποιώντας το κιτ RNeasy μίνι από Qiagen. Αντίστροφη αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης μεταγραφής (PCR) πραγματοποιήθηκε στη συνέχεια χρησιμοποιώντας το κιτ σύνθεσης cDNA iScript (Bio-Rad). Αυτό το cDNA στην συνέχεια χρησιμοποιείται σε πραγματικό χρόνο PCR χρησιμοποιώντας είτε iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) ή Perfecta SYBR Green SuperMix (Quanta Biosciences, VWR). E2F1, E2F3, E2F4, τουμπουλίνης, MCM2, MCM10, CCNE2, και GAPDH εκκινητές παραγγέλθηκαν από Ολοκληρωμένου DNA Technologies. Primer αλληλουχίες είναι οι εξής: E2F1 F (5′-GCTGGACCACCTGATGAATATC-3 ‘), E2F1 R (5′-TCTGCAATGCTACGAAGGTCCTG-3′), E2F3a /b F (5’-CGTCTCTTGGTCTGCTCAC-3 ‘), E2F3a /b R (5 «-CACTTCTGCTGCCTTGTTC-3 ‘), E2F4 F (5′-CTGAAGAGTGTGAGTGGTC -3′), E2F4 R (5’- GCAGAGGTGGAGGTGTAG -3 ‘), τουμπουλίνη F (5′-GGGGCTGGGTAAATGGCAAA-3′), τουμπουλίνη R (5’- TGGCACTGGCTCTGGGTTCG-3 ‘), MCM2 F (5′-CTGTGTGTGGTGAGGGACAC-3′), MCM2 R (5’-CTTGTCCTGGTCCATCTGGT-3 ‘), MCM10 F (5′-CGTCAGTGAGCAGCATGAAT-3′), MCM10 R (5’-TCCCGTTCCCATTTGTAGAG- 3 ‘), CCNE2 F (5′-CAGGTTTGGAGTGGGACAGT-3′), CCNE2 R (5’-ACTTCCTCCAGCATAGCCAA-3 ‘), GAPDH F (5′-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3′), και GAPDH R (5’-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3 ‘).

η στατιστική ανάλυση

για την PCR ανάλυση σε πραγματικό χρόνο για το πείραμα χρονικό σημείο, η διαφορά μεταξύ της έκφρασης του κάθε πειραματικού γονιδίου (E2F1, E2F3, E2F4, CCNE2, MCM2, και MCM10) και την έκφραση του γονιδίου ελέγχου (τουμπουλίνης) υπολογίστηκε για κάθε κυτταρική σειρά σε κάθε χρονικό σημείο. Η διαφορά μεταξύ καθενός από τους μη-0 χρόνος ώρες σημεία και τις αναγνώσεις 0 ώρες χρονικό σημείο για κάθε γονίδιο σε κάθε κυτταρική σειρά υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας T-Δοκιμές με διόρθωση του Welch. Οι πακλιταξέλη IC

’50 ήταν log-μετασχηματιστεί για τη βελτίωση της ομαλότητας. Η συσχέτιση του E2F3 mRNA και η έκφραση της πρωτεΐνης με log πακλιταξέλη IC

’50 υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας Pearson συντελεστής συσχέτισης. Wilcoxon τεστ rank-sum χρησιμοποιήθηκαν για να εξερευνήσετε την διαφορά της βιωσιμότητας των κυττάρων στη θεραπεία siRNA ελέγχου είτε με E2F3a ή θεραπεία E2F3b siRNA.

Αποτελέσματα

HLM006474 έχει ευρεία αντινεοπλασματική δραστηριότητα

Για να εξεταστεί το δυναμικό του 6474 για τη θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα, προσδιορίσαμε την 6474 IC

50 σε δεκαεπτά καρκίνου του πνεύμονα κυτταρικών γραμμών (Πίνακας 1). Αυτή η ανάλυση περιελάμβανε οκτώ μη μικροκυτταρικό γραμμές καρκίνου του πνεύμονα (NSCLC) και εννέα μικρές σειρές καρκίνου του πνεύμονα (SCLC). Σε αυτή τη δοκιμασία βιωσιμότητας, τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε χαμηλή πυκνότητα την ημέρα μηδέν και αναπτύχθηκαν σε παρουσία διαφόρων συγκεντρώσεων 6474 για πέντε ημέρες. Μετά από πέντε ημέρες, η σχετική βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με χρώση με CT-Blue (Promega). Τα αποτελέσματα αποκαλύπτουν ότι οι 6474 IC

50 κυμαίνεται από -15 έως -75 μΜ σε όλες τις κυτταρικές σειρές δεκαεπτά. Ο μέσος όρος βιολογικός IC

50 όλων των γραμμών κυττάρων 31,4 (6,1) μm, το οποίο είναι ουσιαστικά ταυτόσημο με το βιοχημικό IC

50 29,8 (± 7,6 μΜ, έχουν αναφερθεί στο παρελθόν [36]. Δεν υπήρξε καμία στατιστικώς σημαντική διαφορά μεταξύ SCLC και NSCLC.

η

Σύντομη θεραπείες με HLM006474 οδηγούν σε αυξημένη έκφραση πολλών γνωστών E2F-ρυθμιζόμενων γονιδίων

Ως μέρος της ανάλυσης μας HLM006474, εξετάσαμε την έκφραση των μελών της E2F οικογένειας μετά από θεραπεία με κηλίδωση Western. NSCLC κυτταρικές σειρές Η292 και Η1299 υπέστησαν αγωγή με 60 μΜ HLM006474 για 0, 3, 6, 9, 12, και 24 ώρες και αναλύθηκαν μέσω στυπώματος Western (Εικόνα 1 Α). Παραδόξως, πρωτεΐνη επίπεδα τόσο E2F3a και β ισομορφές αυξήθηκαν σε πρώιμα χρονικά σημεία (τυπικά γύρω 6-9 ώρες). Τα επίπεδα της πρωτεΐνης E2F1 αυξήθηκε περισσότερο συγκρατημένα μετά τη θεραπεία, με κορύφωση μεταξύ 6 και 12 ωρών και επιστρέφουν στα βασικά επίπεδα μετά από 24 ώρες. στο πραγματικό ανάλυση time PCR με τουμπουλίνης ως μάρτυρας, τα επίπεδα E2F3 mRNA αυξήθηκαν σημαντικά μετά από 3 ώρες επεξεργασίας και στη συνέχεια μειώθηκε σε κάθε επακόλουθο χρονικό σημείο (Σχήμα 1Β), ενώ τα επίπεδα έκφρασης E2F1 mRNA αυξήθηκαν σημαντικά μετά σύντομους χρόνους θεραπείας σε Η292 μόνο του (Σχήμα 1C ) και τα επίπεδα E2F4 παρέμεινε σταθερή ή μειώθηκε σε κάθε χρονικό σημείο (Σχήμα 1 D). Ήταν, επίσης, σημειωθεί ότι ορισμένα γονίδια που συνήθως ρυθμίζονται από E2Fs? MCM10 (Σχήμα 1Ε), MCM2 (Σχήμα 1 F), και CCNE2 (Σχήμα 1G)? ήταν περισσότερο εντόνως εκφρασμένο σε πρώιμα χρονικά σημεία κατά τρόπο συγκρίσιμο με τις αλλαγές που παρατηρούνται στην έκφραση E2F3 mRNA. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στο Σχήμα 1 δείχνουν ότι η θεραπεία με έναν αναστολέα της πρόσδεσης μπορεί να οδηγήσει στην ενεργοποίηση του E2F-ρυθμιζόμενων στόχων, συμπεριλαμβανομένων των μελών της E2F οικογένειας αυτορυθμιζόμενης E2F-DNA. Η οικογένεια E2F είναι γνωστό ότι καταστέλλει ενεργά μεταγραφή [46] – [49], και ως εκ τούτου, προτείνουμε ότι η θεραπεία με HLM006474 μπορεί να εκτοπίσει E2F-κατασταλτικά σύμπλοκα και έτσι να ενεργοποιούν τη μεταγραφή της E2F-ρυθμίζουν γονίδια που είναι κατά κύριο λόγο καταστέλλεται από E2F συγκροτήματα. Για να διερευνήσουν τη δυνατότητα αυτή, χρησιμοποιήσαμε siRNA ειδικά κατά E2F1, E2F3a, E2F3b, E2F4 και Rb να καταστρέφουν δύο NSCLC κυτταρικές σειρές διαφόρων E2F συγκροτήματα. Μικροσυστοιχιών εκτελέστηκε για να εξεταστεί η επίδραση αυτών των siRNAs για την έκφραση μιας υπογραφής E2F ορίζεται προηγουμένως με βάση E2F3 υπερέκφραση [50]. Τα αποτελέσματα, τα οποία θα πρέπει να δημοσιευθεί και αλλού, δείχνουν ότι η εξάντληση των μεμονωμένων E2Fs αποτελέσματα σε πολλά γονίδια E2F υπογραφή ενεργοποιείται, όπως θα ήταν αναμενόμενο από ένα μοντέλο de-καταστολή.

Μια

. Οι κυτταρικές γραμμές NSCLC Η1299 και Η292 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 60 μΜ HLM006474 για 0, 3, 6, 9, 12, και 24 ώρες, μετά συλλέχθηκαν και εξετάστηκαν μέσω Western blots. Μέτριες αυξήσεις E2F1 και περισσότερο δραματικές αυξήσεις στην E2F3a και b επίπεδα πρωτεΐνης παρατηρήθηκαν σε πρώιμο χρονικό σημείο στις δύο κυτταρικές σειρές.

Β-D

. mRNA συλλέχθηκε από κύτταρα που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως περιγράφεται στο 1Α, μετατράπηκε σε cDNA χρησιμοποιώντας RT-PCR, και αναλύθηκαν για τα επίπεδα έκφρασης του E3F3 (

B

), E2F1 (

C

), και E2F4 (

D

) χρησιμοποιώντας PCR πραγματικού χρόνου και τουμπουλίνης ως μάρτυρας. Σύντομη θεραπείες με 6474 επίπεδα έκφρασης του mRNA αλλαγμένη του E2F3 και E2F1, αλλά όχι E2F4.

E-G.

MRNA έκφραση των γνωστών γονιδίων που συνήθως ρυθμίζονται από E2Fs αναλύθηκαν με έναν τρόπο παρόμοιο με την προηγούμενη περιγραφή σε 1Β-D. Τα επίπεδα έκφρασης του MCM10 (

E

), MCM2 (

F

), και CCNE2 (

G

) mRNA αναλύθηκαν με τουμπουλίνης ως μάρτυρας και ήταν όλοι σημειωθεί ότι είναι πιο ιδιαίτερα εξέφρασε ακόλουθες βραχυπρόθεσμες θεραπείες με 6474. Σημειώσεις: ns δεν αντιπροσωπεύει σημαντικό, * αντιπροσωπεύει p & lt? 0,05, ** αντιπροσωπεύει p & lt?. 0.01

Η

HLM006474 συνεργεί με πακλιταξέλη

Αφού διαπιστώθηκε ότι 6474 έχει αντι-πολλαπλασιαστικές επιδράσεις σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα , αλλά μπορεί να επηρεάσει E2F-ρυθμιζόμενων γονιδίων σε ένα πολύπλοκο τρόπο, επιδιώξαμε να προσδιοριστεί εάν 6474 θα συνεργούν με χημειοθεραπευτικά φάρμακα που χρησιμοποιούνται συνήθως στη θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα. κύτταρα Η1299 υπέστησαν αγωγή με 6474 μόνο και σε συνδυασμό με σισπλατίνη, γεμσιταβίνη και πακλιταξέλη. Συνδυασμοί επιλέχθηκαν με βάση την IC

50 των κυττάρων στις μεμονωμένες ενώσεις και ο συνδυασμός των δεικτών υπολογίστηκαν [43]. Σχήμα 2 αποκαλύπτει ότι υπάρχει ανταγωνισμός μεταξύ 6474 και σισπλατίνη (πίνακας 2Α, CI μέσο όρο 1,40) και γεμσιταβίνη (πίνακας 2Β, CI μέσο όρο 1,39). Σε αντίθεση, 6474 συνεργεί ασθενώς με πακλιταξέλη (2C πάνελ, CI μέσο όρο 0,98). Για την περαιτέρω διερεύνηση της φύσης της συνέργειας μεταξύ 6474 και πακλιταξέλη, Η1299 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με μέτρια δόσεις του κάθε φαρμάκου μόνου ή σε συνδυασμό και να χρησιμοποιηθούν σε ανάλυση κηλίδος Western. Η εμφάνιση των διασπασμένη PARP σε κύτταρα που έλαβαν το συνδυασμό φαρμάκων επιβεβαιώνει ότι ο συνδυασμός του 6474 και πακλιταξέλη επάγει απόπτωση περισσότερο από κάθε φάρμακο μόνο του (Σχήμα 2D). Να διερευνήσει κατά πόσον αυτή η συνέργεια, θα πρέπει να τηρούνται σε πρόσθετες κυτταρικές σειρές, εξετάσαμε επίσης την κυτταρική σειρά NSCLC Η292. Όπως και στην περίπτωση των Η1299 κυττάρων, 6474 synergized με πακλιταξέλη (πάνελ 2G, CI μέσο όρο 0,96), αλλά δεν έδειξε συνέργεια με σισπλατίνη (2Ε πάνελ, CI μέσο όρο 1,51) ή γεμσιταβίνη (πάνελ 2F, CI μέσο όρο 1,46).

A-C.

Η1299 κύτταρα υποβλήθηκαν σε δοκιμασίες βιωσιμότητας με την παρουσία 6.474 (HLM) σε συνδυασμό με σισπλατίνη (

A

, CisPt), γεμσιταβίνη (

B

, Gem) και πακλιταξέλη (

C

, Pac), όπως αναφέρεται (βλέπε μεθόδους). Αποτελέσματα αποκαλύπτουν συνέργεια με πακλιταξέλη (CI μέσος 0,98) και τον ανταγωνισμό με σισπλατίνη και γεμσιταβίνη (CI μέσος 1,40 και 1,39, αντίστοιχα).

D

. Κηλίδωση Western αποκαλύπτει ότι σε Η1299 κύτταρα σε αγωγή για 72 ώρες με 20 μΜ 6474 μόνο, μόνος 5 ηΜ paclitaxel, ή του συνδυασμού των δύο, 6474 και πακλιταξέλη synergize στην επαγωγή της διάσπασης PARP.

E

–

G

. κύτταρα Η292 ελέγχθηκαν σε παρόμοιες δοκιμασίες βιωσιμότητας για να προσδιοριστεί η αποτελεσματικότητα του 6474 (HLM) σε συνδυασμό με σισπλατίνη (

E

, CisPt), γεμσιταβίνη (

F

, Gem) και paclitaxel (

G

, Pac). Όπως φαίνεται στο Η1299 κύτταρα, 6474 συνεργεί με πακλιταξέλη (CI μέσος 0,96), αλλά είναι ανταγωνιστική με σισπλατίνη (CI μέσος 1,51) και γεμσιταβίνη (CI μέσος 1,46).

Η

επίπεδα E2F3 ευαισθησίας αντίκτυπο στην πακλιταξέλη

Οι παρατηρήσεις ότι ένας αναστολέας E2F μπορούσε συνεργούν με πακλιταξέλη και το συζητήθηκε προηγουμένως αύξηση στα επίπεδα E2F3 μετά την πρόωρη θεραπείες χρονικό σημείο με HLM006474 πρότεινε ότι δραστικότητα E2F3 μπορεί να παίζει ένα ρόλο στην ευαισθησία paclitaxel. Real-time PCR χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση της έκφρασης ενδογενούς του E2F3 (με GAPDH χρησιμεύει ως ένας εσωτερικός έλεγχος), και στη συνέχεια αυτές οι τιμές συσχετίστηκαν με τη λογική paclitaxel

50 από κάθε κυτταρική γραμμή (Σχήμα 3Α). Κυτταρολύματα από δέκα κυτταρικές γραμμές NSCLC έτρεξαν σε κηλίδες Western (Σχήμα 3Β) και πυκνομετρικά αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας β-ακτίνης ως ένας έλεγχος. Αυτές οι E2F επίπεδα στη συνέχεια παρίσταται γραφικώς έναντι της αντίστοιχης λογική paclitaxel

50 τιμές (Σχήμα 3C). Τόσο στη πραγματικού χρόνου PCR και κηλίδας Western αναλύσεις, ένας ισχυρός αντίστροφος συσχετισμός μεταξύ E2F3 και πακλιταξέλη IC

50 σημειώθηκε. Για να ελέγξετε πιο επίσημα αυτή η υπόθεση, χρησιμοποιήσαμε siRNA να καταστρέφουν Η1299 κύτταρα του E2F3a και E2F3b και στη συνέχεια προσδιορίζεται η ευαισθησία τους στην πακλιταξέλη όπως μετρήθηκε σε δοκιμασίες MTS. Κηλίδωση Western αποκαλύπτει μια σχεδόν πλήρη εξουδετέρωση των στοχοθετημένων E2Fs στα κύτταρα Η1299 (Σχήμα 4Α). Ελέγχου siRNAs δεν επηρέασε E2F έκφρασης. Όπως ήταν αναμενόμενο, Σχήμα 4Β αποκαλύπτει ότι τα κύτταρα με μειωμένα επίπεδα E2F3 ήταν λιγότερο ευαίσθητη στην πακλιταξέλη.

Μια

. cDNA από δέκα κυτταρικές γραμμές NSCLC χρησιμοποιήθηκαν σε PCR πραγματικού χρόνου για να ανιχνεύσει επίπεδα ενδογενούς έκφρασης E2F3 (σε σύγκριση με GAPDH ως μάρτυρας). Τα επίπεδα έκφρασης κατόπιν συγκρίθηκαν με τη λογική paclitaxel

50 κάθε γραμμής και γράφημα όπως φαίνεται.

Β

. Κυτταρολύματα από δέκα κυτταρικές γραμμές NSCLC παρασκευάστηκαν και έτρεξε σε μία κηλίδα Western για την ανίχνευση ενδογενή επίπεδα E2F3.

C

. Πυκνομετρικώς αναλύθηκαν τιμές των επιπέδων έκφρασης πρωτεΐνης (σε σύγκριση με την β-ακτίνη ως μάρτυρας) στη συνέχεια γραφική παράσταση ως προς τη λογική paclitaxel

50 για κάθε γραμμή, όπως φαίνεται.

Η

A

. κύτταρα Η1299 επιμολύνθηκαν παροδικά με 200 pmol ελέγχου, E2F3a, ή E2F3b siRNA και συλλέχθηκαν μετά από 24 ώρες. Western blots των εν λόγω προϊόντων λύσης αποδεικνύουν την έκταση της E2F knockdown.

Β

. δοκιμασίες MTS χρησιμοποιήθηκαν για να προσδιοριστεί η ευαισθησία της κάθε κυτταρικής σειράς για 50 ηΜ paclitaxel. Τα κύτταρα με μειωμένη επίπεδα E2F3 ήταν πιο βιώσιμη παρουσία πακλιταξέλης από κύτταρα ελέγχου. Σημειώσεις: * αντιπροσωπεύει p & lt? 0,05, ** αντιπροσωπεύει p & lt? 0,01

Η

Συμπεράσματα

Η /Rb /E2F μονοπάτι CDK αντιπροσωπεύει έναν καλό στόχο για την θεραπεία διαφόρων συμπαγών όγκων.. Αν και η ανάπτυξη υπήρξε αργή λόγω τοξικότητας της πρόωρης ενώσεων, οι αναστολείς CDK αρχίζουν να κερδίζουν έδαφος σε κλινικές δοκιμές [33], [51], [52]. Προτείνουμε ότι η στόχευση ο /Rb /E2F οδού CDK ακόμη περισσότερο προς τα κάτω, στο E2F επίπεδο, μπορεί επίσης να είναι χρήσιμος. Έτσι, έχουμε εξετάσει το ενδεχόμενο ενός αναστολέα παν-E2F, HLM006474, στη θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα.

Προτείνουμε το μοντέλο στο Σχήμα 5 για να εξηγήσει τα αποτελέσματά μας. Πρώτον, παρατηρούμε ότι η θεραπεία με 6474 οδηγεί σε μία παροδική αύξηση της όχι μόνο πρωτεΐνη E2F3 και τα επίπεδα έκφρασης του mRNA, αλλά επίσης και μια αύξηση σε πολλές άλλες E2F-ρυθμιζόμενη μεταγραφές. Αυτές οι παρατηρήσεις αντι-διαισθητική λογική βασίζεται στη μακροχρόνια γνωστή παρατήρηση ότι E2Fs δραστηριοποιούνται καταστολείς της μεταγραφής [46] – [49]? Ωστόσο, αυτές δεν προκαλούν ανησυχίες ότι η Pan-E2F συγκρότημα αναστολή μπορεί να έχει ανεπιθύμητες συνέπειες. Έτσι, το μέλλον E2F στοχευμένες ενώσεις θα πρέπει να δεσμεύσουν επιλεκτικά τη μεταγραφή ενεργοποίηση E2F συγκροτήματα και ανταλλακτικά μεταγραφική καταστολή E2F συγκροτήματα. Δεύτερον, πιστεύουμε ότι τα αυξημένα επίπεδα του E2F3 (και πιθανόν άλλων E2F-ρυθμιζόμενα γονίδια) αυξάνουν την ευαισθησία των κυττάρων σε πακλιταξέλη. Έχουμε στηρίξει αυτό το συμπέρασμα σχετικά με τη συσχέτιση που παρατηρήθηκε μεταξύ των κανονικών επιπέδων E2F3 και την ευαισθησία πακλιταξέλη, καθώς και τα αποτελέσματα των πειραμάτων E2F3 siRNA. Αυτό τεκμηριώνει την πρώτη σύνδεση μεταξύ των επιπέδων του E2F3 και πακλιταξέλη σε NSCLC, αν και η σχέση μεταξύ των υψηλών επιπέδων δραστηριότητας E2F3 και αυξημένη ευαισθησία σε πακλιταξέλη έχει παρατηρηθεί προηγουμένως σε ωοθήκης [23] και ER αρνητικά τον καρκίνο του μαστού [24]. Ο μηχανισμός με τον οποίο E2F3 παράγει ευαισθησία προς πακλιταξέλη είναι άγνωστη. Μια πιθανότητα είναι ότι σχετίζεται άμεσα με το ρόλο E2F3 στον κυτταρικό κύκλο. Για παράδειγμα, σε κύτταρα με υψηλά επίπεδα E2F3, θα πρέπει να αναμένεται ότι τα κύτταρα θα πολλαπλασιάζονται περισσότερο, δίνοντας έτσι τα κύτταρα μια μεγαλύτερη ευκαιρία να εισέλθουν φάση Μ (όπου το paclitaxel θα ήταν περισσότερο αποτελεσματική). Ωστόσο, αυτή η εξήγηση και μόνο θα προτείνουν ότι αυτά τα κύτταρα θα πρέπει να είναι πιο ευαίσθητα σε gemcitabine, καθώς λόγω εισέρχονται στην S φάση πιο συχνά. Θα μπορούσε να είναι πιο πιθανό ότι η μεγαλύτερη ευαισθησία σε πακλιταξέλη οφείλεται σε γονίδια που ρυθμίζουν απόπτωση γίνεται εξαιρετικά εκφράζεται λόγω της αύξησης στην E2F3. Επίσης, έχει προηγουμένως αναφερθεί ότι η υπερέκφραση του E2F3 οδηγεί σε εμπλουτισμό των γονιδίων που είναι μικροσωληνίσκων που σχετίζονται με [23], έτσι αυτό θα μπορούσε ίσως να εξηγήσει τις συσχετίσεις που βλέπουμε μεταξύ των επιπέδων E2F3 και την ευαισθησία πακλιταξέλη. Ομοίως, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, E2F3 έχει σημειωθεί για να έχουν ένα ρόλο στο G2 /M σημείο ελέγχου μέσω της ρύθμισης της έκφρασης της κινάσης Aurora A [14], CDC2 [15], και η κυκλίνη Β1 [15], [16], η οποία μπορεί επίσης να επισημάνω σε υψηλότερα επίπεδα E2F3 οδηγεί σε αύξηση κύτταρα εισέρχονται στην εν λόγω φάση του κυτταρικού κύκλου και ίσως τότε η αύξηση της ευαισθησίας πακλιταξέλη.

σε μη επεξεργασμένα κύτταρα, E2F /διμερισμό συνεργάτη (DP) /Rb συγκροτήματα κυριαρχούν, και ως εκ τούτου, τα επίπεδα E2F3 είναι σχετικά χαμηλή (όπως και πολλές άλλες E2F-ρυθμιζόμενων γονιδίων). Η θεραπεία με HLM006474 διαταράσσει τις E2F /DP /Rb κατασταλτικά σύμπλοκα από δέσμευσης DNA, με αποτέλεσμα την αυξημένη μεταγραφή του E2F3 (καθώς και πολλές άλλες E2F-ρυθμιζόμενων γονιδίων). Σε αυτό το μοντέλο, τα αυξημένα επίπεδα του E2F3 ευαισθητοποιήσει κύτταρα σε θεραπεία ταξάνης, όπως καταδεικνύεται προηγουμένως, μέσω ενός άγνωστου μηχανισμού.

Η

Έχουμε αποδείξει ότι HLM006474 είναι αποτελεσματικό σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα. Επιπλέον, έχουμε δείξει ότι 6474 συνεργεί καλά με πακλιταξέλη, πιθανώς οφείλεται σε επιδράσεις 6474 σχετικά με τα επίπεδα E2F3. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι ισχυρός, ειδικός ενεργοποιητής E2F αναστολή μπορεί να είναι χρήσιμη στη θεραπεία της NSCLC στο μέλλον (ειδικά σε συνδυασμό με άλλους παράγοντες), και ότι τα επίπεδα E2F3 μπορεί να είναι μια καλή ένδειξη της ευαισθησίας πακλιταξέλης σε NSCLC.

Ευχαριστίες

τα πολλά πλούσια δώρα αντιδραστηρίων αναγνωρίζονται στα Υλικά και Μέθοδοι.

Ο Δρ. Fumi Kinose του SPORE Moffitt σε καρκίνο του πνεύμονα εγκατάσταση κυττάρων Πυρήνας προϋπόθεση επικυρωθεί κυτταρικές σειρές, συμπεριλαμβανομένων εκείνων που ευγενώς δώρισε από το εργαστήριο του Ιωάννη Δ Minna στο Πανεπιστήμιο του Texas Southwestern στο Ντάλας. Ο Δρ Dung-Tsa Chen και ο Jimmy Fulp της Moffitt της Βιοστατιστικής πυρήνα πραγματοποιείται στατιστική ανάλυση. Δρχ. Christopher L. Cubitt και Shumin Zhang της Moffitt του Experimental Therapeutics πυρήνα εκτελούνται αναλύσεις βιωσιμότητας και ανάλυση των δεδομένων.