Αφηρημένο

Οι μεταλλάξεις του αδενωματώδη πολυποδίαση coli (

APC

) γονιδίου είναι κοινά και έντονα που συνδέονται με την ανάπτυξη του παχέος αδενωμάτων και καρκινωμάτων. Ενώ εκτενώς στη σύγχρονη πληθυσμούς, εκθέσεις σχετικά με σπλαχνικό όγκους στην αρχαία πληθυσμοί είναι λιγοστές. Στο καλύτερο της γνώσης μας, γενετικός χαρακτηρισμός των μεταλλάξεων που σχετίζονται με καρκίνο του παχέος εντέρου στην αρχαία δείγματα δεν έχει ακόμη περιγραφεί. Σε αυτή τη μελέτη έχουμε αλληλουχία hotspots για μεταλλάξεις στο γονίδιο APC που απομονώθηκε από 18

ου αιώνα φυσικά διατηρημένα ανθρώπινα ουγγρική μούμιες. Ενώ οι αλληλουχίες άγριου τύπου APC βρέθηκαν σε δύο μούμιες, ανακαλύψαμε τη μετάλλαξη E1317Q παρερμηνεύσιμη, είναι γνωστό ότι είναι ένα ορθοκολικό καρκίνο προδιαθέσεως μετάλλαξη, σε ένα μεγάλο έντερο ιστό ενός 18

ου μούμια αιώνα. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι η γενετική προδιάθεση για καρκίνο υπήρχε ήδη στην εποχή προ-εκβιομηχάνιση. Αυτή η μελέτη καλεί για παρόμοιες έρευνες των αρχαίων δειγμάτων από διαφορετικές περιόδους και γεωγραφικές περιοχές που πρόκειται να διεξαχθεί και από κοινού για το σκοπό της απόκτησης ενός ανάλυσης μεγαλύτερης κλίμακας που θα ρίξει φως σχετικά με το παρελθόν επιδημιολογία του καρκίνου και για την εξέλιξη του καρκίνου

Αιτιολογική αναφορά.: Feldman Μ, Hershkovitz Ι, Sklan EH, Kahila Bar-Gal G, Παπανικολάου Ι, Szikossy Ι, et al. (2016) Ανίχνευση ενός γονιδίου καταστολής όγκου Παραλλαγή προδιαθέτουν για τον καρκίνο του παχέος εντέρου σε ένα 18ου αιώνα ουγγρική μούμια. PLoS ONE 11 (2): e0147217. doi: 10.1371 /journal.pone.0147217

Επιμέλεια: David Caramelli, Πανεπιστήμιο της Φλωρεντίας, Ιταλία

Ελήφθη: 30η Σεπτεμβρίου, 2015? Αποδεκτές: 30ης Δεκεμβρίου 2015? Δημοσιεύθηκε: 10 Φεβρουαρίου 2016

Copyright: © 2016 Feldman et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση: το έργο υποστηρίχθηκε από:. Dan David Ιδρύματος? Η Τασία και ο Δρ Joseph Meychan πρόεδρος της Ιστορίας και Φιλοσοφίας της Ιατρικής. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ορθοκολικός καρκίνος είναι μία κύρια αιτία νοσηρότητας και θνησιμότητας στις δυτικές χώρες [1,2]. Βελτιώσεις στην έγκαιρη διάγνωση και θεραπεία έχουν οδηγήσει σε μείωση των ποσοστών θνησιμότητας, ενώ τα ποσοστά εμφάνισης αυξάνεται [3]. Τυπικά, οι πρόδρομοι για τον ορθοκολικό καρκίνο είναι αδενωματώδεις πολύποδες, που είναι καλοήθεις νεοπλαστικές συσσωματώματα κυττάρων [4]. Οι περισσότεροι σποραδικές αδενωματώδεις πολύποδες, καθώς και οι περισσότεροι καρκίνοι του παχέος περιέχουν τυπικά γενετικές αλλοιώσεις [5].

αδενωματώδη πολυποδίαση coli (APC)

είναι ένα σημαντικό ογκοκατασταλτικό γονίδιο που βρίσκεται στο ανθρώπινο χρωμόσωμα 5q21. Μεταλλάξεις σε APC συνδέονται στενά με την ανάπτυξη του ορθοκολικού αδενωμάτων και καρκινωμάτων [6]. Περίπου το 50% του πληθυσμού θα αναπτύξει πολύποδες παχέος ξεκίνησε από τέτοιες μεταλλάξεις κατά τη διάρκεια μιας κανονικής διάρκειας ζωής [7]. Σωματικές μεταλλάξεις του γονιδίου APC ανιχνεύθηκαν όχι μόνο σε ασθενείς με ορθοκολικό καρκίνωμα, αλλά επίσης και σε ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος [8], γαστρικού καρκίνου [9], στοματικό καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων [10], ηπατοβλάστωμα, ο καρκίνος του μαστού, καρκίνος του εγκεφάλου και συνδεσμοειδούς όγκου [11]. Περίπου το 80% των σωματικών μεταλλάξεων του γονιδίου APC εμφανίζονται σε συγκεκριμένες «hot spot» και είναι συγκεντρωμένα σε μια περιοχή από το κωδικόνιο 764 έως κωδικόνιο 1596 ονομάζεται Cluster Περιφέρεια Μετάλλαξη (MCR). Περισσότερο από το 95% είναι μεταλλάξεις τερματισμού αλύσου που θα είχε ως αποτέλεσμα την έκφραση της κομμένης πρωτεΐνης. Η αδρανοποίηση του δύο αλληλόμορφα του APC είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη των περισσότερων όγκων του παχέος εντέρου και του ορθού [12].

καρκίνος έχει νωρίς τεκμηριώσεις. Αιγυπτιακή ιατρική παπύρους που χρονολογούνται ήδη από το 1500 π.Χ. έχουν βρεθεί για να περιγράψει όγκους. Ο Ηρόδοτος και ο Ιπποκράτης τόσο αναφέρουμε τον καρκίνο [13-15]. Οι περισσότεροι παλαιοπαθολογικά εκθέσεις σχετικά με τους όγκους στο παρελθόν πληθυσμών βασίζεται σε σκελετικό ιστό που είναι πιο πλούσια σε αρχαιολογικούς χώρους. Ωστόσο, ορισμένοι όγκοι σε μαλακό ιστό αναφερθεί [16-26]. Ενώ υπάρχουν πολλές θεωρίες σχετικά με τον επιπολασμό του καρκίνου στις μέρες μας, η οποία είναι απαραίτητη συνεργάτης του καρκίνου με στυλ ζωής, η διατροφή, η έλλειψη σωματικής άσκησης και την αναπαραγωγική μοτίβα, περισσότερες πληροφορίες από διαφορετικές χρονικές στιγμές στην ιστορία για να κατανοήσουν καλύτερα το ρόλο των παραγόντων αυτών στην ιστορική πληθυσμούς .

Φυσικό μουμιοποίηση επιτρέπει τη διατήρηση των μαλακών ιστών. Δείγματα από το μουμιοποιημένο ιστούς μπορούν να παρέχουν πολύτιμες πληροφορίες από ανθρωπολογική, ιστορική και ιατρική άποψη. Μπορούν να μας διδάξει σημαντικά μαθήματα σχετικά με την εξέλιξη των ασθενειών που θα μπορούσαν να είναι χρήσιμες για την πρόβλεψη μελλοντικών εξελικτικές αλλαγές. Το 1994 και το 1995, πάνω από 265 μούμιες είχαν ανασκαφεί από σφραγισμένες κρύπτες στην εκκλησία Δομινικανή στην Vác, Ουγγαρία. Οι κρύπτες χρησιμοποιήθηκαν συνεχώς για ταφές πολλών οικογενειών της μεσαίας τάξης και οι κληρικοί, 1731-1838. Η θερμοκρασία στις κρύπτες κυμάνθηκε μεταξύ οκτώ έως έντεκα βαθμούς Κελσίου, οι κρύπτες ήταν κακή, αλλά συνεχώς αεριζόμενο και τα υπολείμματα που προστατεύεται από την υγρασία από ροκανίδια πεύκου που γεμίζουν πολλά από τα φέρετρα. Αυτά ήταν ιδανικές συνθήκες για τη φυσική διατήρηση προκαλούν περίπου το 70% των οργανισμών που είναι πλήρως ή εν μέρει μουμιοποιημένα. Το επίπεδο διατήρηση των μουμιοποιημένο δείγματα ιστού και άφθονες σύγχρονες αρχειακές πληροφορίες σχετικά με τα άτομα της ουγγρικής μούμια συλλογή κίνητρο μια μορφολογική και γενετική μελέτη των ανθρώπινων λειψάνων [27]. Προηγούμενες μελέτες που βρέθηκαν γενετικά στοιχεία του

Mycobacterium tuberculosis

(

Μ

.

φυματίωση

) παρουσία σε αυτές τις μούμιες [28-34], υποδεικνύοντας ότι αυτή η ομάδα μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη γενετική σπουδές. Επιπλέον, αυτή η ομάδα αποτελείται από άτομα που σχηματίζουν μια ευρεία κατανομή ηλικιών. Έτσι, είναι συμβατή με την μελέτη του καρκίνου που συνδέεται μεταλλάξεων, καθώς ο κίνδυνος για τέτοιες μεταλλάξεις αυξάνει με την ηλικία [3]. Εδώ χρησιμοποιήσαμε τις μούμιες Vác να εκτιμήσει την ύπαρξη γενετικής προδιάθεσης για καρκίνο του παχέος εντέρου στην εποχή προ-εκβιομηχάνιση με αλληλούχιση των «καυτά σημεία» στο γονίδιο APC. Τρεις τέτοιες αλληλουχίες ενισχύθηκαν και αλληλουχήθηκαν από 3 διαφορετικές μούμιες. Η παραλλαγή E1317Q APC, είναι γνωστό ότι προδιαθέτουν για καρκίνο του παχέος εντέρου ανιχνεύθηκε σε ένα δείγμα κόλον από έναν μούμια. Ενώ μόνο λίγες σειρές APC λήφθηκαν την παρουσία της παραλλαγής E1317Q στο DNA του 18

ου αιώνα ατομική δείχνει ότι η γενετική προδιάθεση για καρκίνο υπήρχε ήδη στην εποχή προ-εκβιομηχάνιση. Η μελέτη αυτή όμως απαιτεί μια ανάλυση μεγαλύτερη κλίμακα για σκοπούς επιδημιολογικής σύγκρισης.

Υλικά και Μέθοδοι

Δείγματα και προφυλάξεις κατά τη μόλυνση

Ο 18ος αιώνας «Vác μούμια Collection» στεγάζεται και επιμέλεια στο Τμήμα Ανθρωπολογίας του Μουσείου Φυσικής Ιστορίας της Ουγγαρίας, της στη Βουδαπέστη, Ουγγαρία. Η συλλογή περιλαμβάνει 265 φυσικά μουμιοποιηθεί, εν μέρει μουμιοποιημένο και σκελετικών δειγμάτων (με αριθμούς Απογραφή: 2009.19.1-2009.19.264). Συνολικά 51 δείγματα λήφθηκαν από 20 μούμιες Vác (Πίνακας 1). Τα δείγματα συλλέχθηκαν στο Τμήμα Ανθρωπολογίας του Μουσείου Φυσικής Ιστορίας ουγγρική σύμφωνα με τους κανονισμούς σχετικά με την επεξεργασία των αρχαιολογικών ανθρώπινα υπολείμματα στην Ουγγαρία [35]. Δεν αρχαίο έργο DNA ενίσχυση των ανθρώπινων γονιδίων έγινε ποτέ στις εγκαταστάσεις. Η δειγματοληψία διεξήχθη χρησιμοποιώντας μέτρα για την πρόληψη σύγχρονη μόλυνση των δειγμάτων. Τα δείγματα ελήφθησαν χρησιμοποιώντας μια τεχνική χωρίς επαφή με αναλώσιμα νυστέρια, από τα εσωτερικά όργανα. Αυτές οι ανατομικές περιοχές δεν είχαν προηγουμένως εκτεθεί στο εξωτερικό περιβάλλον και ως εκ τούτου προστατεύονται από την επαφή με εκσκαφείς ή άλλους που χειρίστηκαν τις μούμιες. Τα δείγματα τοποθετήθηκαν σε αποστειρωμένους σωλήνες ελεύθερο DNA και αποθηκεύονται σε θερμοκρασία δωματίου.

Η

DNA εκχυλίζεται σε καθορισμένο αρχαία DNA (Adna) εργαστήριο. Για να αποφευχθεί η μόλυνση από τη σύγχρονη DNA οι σωλήνες άνοιξαν μόνο σε ένα καθορισμένο UV eradiated κουκούλα όπου εξαγωγή του DNA πραγματοποιήθηκε. Το εργαστήριο Adna ήταν φυσικά απομονωμένο από το εργαστήριο όπου χρησιμοποιήθηκε σύγχρονη DNA. Η διαδικασία διεξήχθη σε αποστειρωμένες θαλάμους UV καθένα εξοπλισμένο με ξεχωριστό σύνολο σιφώνια, αποστειρωμένους σωλήνες μιας χρήσης, συμβουλές φίλτρο, αντιδραστήρια βαθμού μοριακής βιολογίας και λύσεις. Μίας προστατευτική ενδυμασία χρησιμοποιήθηκε και αλλάζουν συχνά. Ξεχωριστή κουκούλες UV-ακτινοβολημένα χρησιμοποιήθηκαν για την παρασκευή DNA, εκχυλίσεις DNA και την προετοιμασία της PCR. Για την περαιτέρω ελαχιστοποίηση σύγχρονη μόλυνση του DNA όλα τα αντιδραστήρια, σωλήνες και μέσα, όπως λεπίδες νυστέρι μιας χρήσης είχαν ακτινοβοληθεί με UV πριν από τη χρήση. Πολλαπλές αρνητικοί έλεγχοι για την εξαγωγή και την ενίσχυση συμπεριλήφθηκαν να διασφαλιστεί η γνησιότητα των ευρημάτων Adna. πρωτόκολλα Adna ακολούθησε τις τυπικές απαιτήσεις για το πεδίο [36].

DNA εξόρυξη

Το DNA που εξάγεται από μουμιοποιημένο ιστό χρησιμοποιώντας μια τροποποίηση της θειοκυανικής γουανιδίνης (GuSCN) μέθοδος που αναπτύχθηκε από Boom R et al . [37] και η μέθοδος καθαρισμού με βάση σίλικα που αναπτύχθηκε από Höss M & amp? Pääbo S [38]. Περίπου 500 mg ιστού κόπηκε σε μικρά κομμάτια περίπου 5 mm, που τοποθετούνται σε έναν αποστειρωμένο σωλήνα που περιέχει UV ακτινοβοληθεί διπλά αποσταγμένο νερό (ddH2O) και επωάστηκαν στους 56 ° C όλη τη νύκτα. Η ddH2O απομακρύνθηκαν και 500 μL ρυθμιστικού διαλύματος εκχύλισης, που αποτελείται από 4 Μ θειοκυανικού γουανιδινίου (GuSCN) (Sigma), 0,1 Μ Tris-HCl ρΗ 6.4 (Sigma), 0,02 Μ EDTA ρΗ 8 (Biological Industries) και 1.3% Triton Χ- 100 (Sigma), μαζί με 10 μL των 25 mg /ml πρωτεϊνάση Κ προστέθηκαν στον ιστό. Ο ιστός επωάστηκε περαιτέρω στους 56 ° C για 48 ώρες. Τα δείγματα έβρασαν στους 94 ° C για 10 λεπτά και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν στις 13.000 rpm για 3 λεπτά. Το υπερκείμενο (που φέρει το DNA εκχυλίζεται) μεταφέρθηκε σε ένα νέο αποστειρωμένο σωλήνα. Για την εξαγωγή του DNA από το υπερκείμενο 1 ιωδιούχο mL νάτριο (ΝαΙ) (6Μ, Merck), 10 μL γραμμικού ακρυλαμιδίου (5 mg /ml, Ambion) και διοξείδιο του πυριτίου 8 μL (/ml, Sigma 1g) προστέθηκαν. Τα δείγματα επωάστηκαν στους 4 ° C για 1 ώρα για να καταστεί δυνατή η σύνδεση του DNA στα σφαιρίδια διοξειδίου του πυριτίου. Τα σφαιρίδια διοξειδίου του πυριτίου σβωλοποιήθηκαν με φυγοκέντρηση και το σφαιρίδιο πλύθηκε δύο φορές. Η πρώτη πλύση διεξήχθη με τη χρήση ρυθμιστικού διαλύματος πλύσεως που περιέχει 0,01 Μ Tris-HCl ρΗ 7,5, 0,05 Μ χλωριούχο νάτριο (NaCl) (Frutarum), 0,1 Μ EDTA ρΗ 8 και 250 μί απόλυτη αιθανόλη (Biolabs) και ddH2O μέχρι έναν όγκο 500 μL . Η δεύτερη πλύση ήταν με απόλυτη αιθανόλη. Το ληφθέν σφαιρίδια διοξειδίου του πυριτίου σβώλος ξηραίνεται στον αέρα και το Adna εκλούστηκε στους 56 ° C με ρυθμιστικό διάλυμα Tris-EDTA (ΤΕ, 1 Μ Tris ρΗ 8 και 0,5 Μ EDTA ρΗ 8). Το εκχύλισμα Adna φυλάχθηκε στους -20 ° C

ενίσχυση

DNA

Ενίσχυση του γονιδίου APC διεξήχθη σε ένα μίγμα αντίδρασης 25μL συμπεριλαμβανομένων 7 μΙ του εκχυλίσματος Adna με:. 10Χ ρυθμιστικό διάλυμα, 25 mM MgCl

2, 2,5 mM dNTP, η 10mM BSA (Biolabs), 12 pmol από κάθε σετ εκκινητή και 1,25 μονάδες AmpliTaq Gold® 360 πολυμεράση DNA (Applied Biosystems). Η Adna ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας ένα θερμοκυκλωτή με μια αρχική φάση θερμής εκκίνησης στους 95 ° C για 10 λεπτά που ακολουθείται από 45 κύκλους των 15 δευτερολέπτων στους 95 ° C μετουσίωση 45 περίπου δευτερόλεπτα ανόπτηση στους 60-48 ° C (touch-down) και 45 -60 δευτερόλεπτα για επιμήκυνση στους 72 ° C. Ένα τελικό στάδιο επέκτασης στους 72 ° C για 10 λεπτά διεξήχθη ακολουθώντας τις 45 κύκλους.

Τα εκχυλίσματα Adna ενισχύθηκαν χρησιμοποιώντας δύο σύνολα μορίων θεμελίωσης μορίων του γονιδίου APC που έχουν σχεδιαστεί από τους συγγραφείς αυτής της μελέτης χρησιμοποιώντας Primer 3,0 λογισμικού και με τη χρήση δύο δημοσιευθεί σύνολα μορίων θεμελίωσης μορίων της υπερ μεταβλητή περιοχή στην περιοχή ανθρώπινο μιτοχονδριακό ελέγχου (d-loop) [39]. Τα σύνολα εκκινητών APC σχεδιάστηκαν για να ενισχύσουν τις γνωστές μεταλλακτικές θερμές κηλίδες στην περιοχή MCR. Η ενίσχυση του μιτοχονδριακού d-βρόχος χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος για τα εκχυλίσματα οθόνη-out που μπορεί να έχουν μολυνθεί με σύγχρονες DNA των ερευνητών και ως περαιτέρω ένδειξη της αυθεντικότητας Adna. Τα σετ εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν για ενισχύσεις που περιγράφονται στον Πίνακα 2.

Η

Ανάλυση λαμβάνονται αλληλουχιών

Οι θετικές ενισχύσεις η αλληλουχία στο αλληλουχίας DNA Μονάδα του Σοφού Σχολή Επιστημών Ζωής, Πανεπιστήμιο Αβίβ Τελ χρησιμοποιώντας το ΑΒΙ PRISM® 3100 Genetic Analyzer. Οι ακολουθίες που ελήφθησαν αρχικά πιστοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το National Center for Biotechnology Information BLAST αλγόριθμο [40]. Τα χρωματογραφήματα που εξετάστηκαν χωριστά για να επιβεβαιωθεί η ποιότητα των αλληλουχιών, χρησιμοποιώντας Sequencher 4.9 [41]. αλληλουχίες και αντιπληροφοριακοί παρήχθησαν από κάθε σετ εκκινητών ως επιπρόσθετος έλεγχος για να αποκλειστεί σφάλματα προσδιορισμού αλληλουχίας. Οι αλληλουχίες και αντιπληροφοριακοί συναρμολογήθηκαν σε ένα contig σε Sequencher 4.9. Κάθε άτομο contig επιθεωρήθηκε οπτικά και επαλήθευσε? οποιεσδήποτε ασάφειες οπτικά επιλυθεί. Ακολουθίες με κακής ποιότητας χρωματογραφήματα αποκλείστηκαν από τη μελέτη. Ένα τελικό contig όλων των ακολουθιών δημιουργήθηκε χρησιμοποιώντας μια δημοσιευμένη αναφορά. Μερική μιτοχονδριακή προφίλ προσδιορίστηκαν για τις μούμιες, για όλο το προσωπικό που εργάζεται στο εργαστήριο Adna και για όλους τους συλλέκτες του δείγματος. Για τον έλεγχο για μόλυνση κατά τη διάρκεια ή μετά τη δειγματοληψία, μερική μιτοχονδριακή προφίλ και μερικές αλληλουχίες APC λαμβάνεται από μούμια δείγματα συγκρίθηκαν με τις αλληλουχίες αναφοράς και στα προφίλ του προσωπικού του εργαστηρίου (Πίνακες 3 και 4). Οι αλληλουχίες που λαμβάνονται από μούμια δείγματα συγκρίθηκαν επίσης με το άλλο για τον έλεγχο για διασταυρούμενη μόλυνση. Σημειώνουμε ότι οι αρχαίοι μερική μιτοχονδριακό προφίλ και οι αρχαίοι χρωμοσωμικές ακολουθίες θα μπορούσε να επηρεαστεί από μεταθανάτια διαδικασίες απαμίνωση [42]. Έτσι, ορισμένοι παρατηρούνται μεταβάσεις θα μπορούσε να αποδοθεί σε βλάβη του DNA και όχι για τη μητέρα κληρονομική ή χρωμοσωμικές αντικαταστάσεις αντίστοιχα. Μεταθανάτια βλάβη του DNA δεν επηρεάζει την ανάλυσή μας με στόχο να ελέγξει για μόλυνση από τον έλεγχο αν μούμιες μοιράζονται την ίδια SNP μοτίβο όπως ερευνητές και δεν επηρεάζει τυχόν παρατηρηθεί transvertions. Ωστόσο, οι συνέπειες της βλάβης του DNA θα πρέπει να εξεταστεί σε περίπτωση που οι ακολουθίες που χρησιμοποιούνται για άλλους σκοπούς.

Η

Αποτελέσματα

Η APC είναι ένα σημαντικό ογκοκατασταλτικό γονίδιο. Μεταλλάξεις σε APC συνδέονται στενά με την ανάπτυξη του ορθοκολικού αδενωμάτων και καρκινωμάτων [6]. Για να εκτιμηθεί η παρουσία της γενετικής προδιάθεσης για καρκίνο του παχέος εντέρου στην εποχή προ-βιομηχανοποίηση προσπαθήσαμε να ενισχύσει την περιοχή MCR του γονιδίου APC από DNA που λαμβάνεται από τα εσωτερικά όργανα των μούμιες VAC. Τμηματικές αλληλουχίες του γονιδίου APC περιοχή MCR ελήφθησαν επιτυχώς από τρεις μούμιες. Δύο αλληλουχίες άγριου τύπου APC λήφθηκαν δύο μούμιες αριθμούς 51 και 63 (Πίνακας 3, Σχήματα 1 και 2). Οι αλληλουχίες του γονιδίου APC MCR (θέση 4.377-4484 και η θέση 3956-4068) που αποκτήθηκαν από ένα δείγμα ιστού κόλον μούμια 88 (Πίνακας 3, Σχήματα 1 και 2) έδειξε ότι αυτό το άτομο ήταν ομόζυγο σε παρερμηνεύσιμη μετάλλαξη στο κωδικόνιο 1317 ( GAA να CAA) (Σχήματα 1 και 3). Αυτό είναι ένα γνωστό APC γενετική παραλλαγή που υποκαθιστά γλουταμίνη ένα αφόρτιστο υδρόφιλο αμινοξύ με ένα όξινο γλουταμινικό υδρόφιλο αμινοξύ (E1317Q). Αυτή η μετάλλαξη έχει συνδεθεί με μια προδιάθεση για την ανάπτυξη πολλαπλών παχέος αδενωμάτων και του παχέος εντέρου [43]. Το υπόλοιπο της μερικής ακολουθίας APC MCR για αυτό το μούμια ήταν πανομοιότυπη με την αναφορά (NM_000038.5) που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη άγριου τύπου. Οι αλληλουχίες όλων των ερευνητών που χειρίζεται το δείγμα ή τον εξοπλισμό βρέθηκαν να είναι ταυτόσημη με την αναφορά.

Μερική αλληλουχίες APC ενισχύθηκε με εκκινητές APC1309 σε σύγκριση με την αλληλουχία αναφοράς NM_000038.5 NCBI. Τα μέλη του προσωπικού εργαστήριο που αναφέρεται με τα αρχικά. Τα αρχαιότερα δείγματα επισημαίνονται με μια μούμια αριθμό. Το αρχικό τεμάχιο προσδιορισμού σειράς υπογραμμίζεται στην αλληλουχία αναφοράς. Μούμια αριθμός 88 είναι ο μοναδικός φορέας της μετάλλαξης E1317Q.

Η

Οι μερικές αλληλουχίες APC που ενισχύθηκαν με εκκινητές APC1450 σε σύγκριση με την NM_000038.5 αλληλουχία αναφοράς NCBI. Το αρχικό τεμάχιο προσδιορισμού σειράς υπογραμμίζεται στην αλληλουχία αναφοράς. Αυτές οι μερικές αλληλουχίες APC των δύο μούμιες ήταν ταυτόσημη με την αλληλουχία αναφοράς που κωδικοποιεί για την πρωτεΐνη άγριου τύπου.

Η

επισημάνθηκε είναι η ομόζυγη μετάλλαξη παρερμηνεύσιμη G → C E1317Q.

Η

μιτοχονδριακή Adna διατηρήθηκε σε 50% από τις μούμιες που δοκιμάστηκαν (Πίνακας 1). Μερική μιτοχονδριακή προφίλ (θέσεις 16004-16442) προσδιορίστηκαν για τις 3 μούμιες για τους οποίους ελήφθησαν οι αλληλουχίες APC MCR (Πίνακας 4). Μούμια 51 και 63 έδειξε ένα μοναδικό προφίλ διαφορετικό από την αλληλουχία αναφοράς Cambridge (NC_012920.1), διαφορετικά μεταξύ τους και διαφορετικά από τα προφίλ που λαμβάνονται από όλους τους χειριστές. PCR ενίσχυση ανιχνεύει μιτοχονδριακό DNA με μεγαλύτερη ευαισθησία σε σύγκριση με την ανίχνευση του χρωμοσωμικού DNA. Αυτή η διαφορά στην ευαισθησία εξηγείται κυρίως από υψηλότερο αριθμό αντιγράφων ανά κύτταρο του μιτοχονδριακού DNA [44,45]. Έτσι, εάν το δείγμα είχε μολυνθεί με τις σύγχρονες DNA είναι πιθανόν σύγχρονη μιτοχονδριακό DNA θα είχαν ανιχνευθεί. Τα μοναδικά χαρακτηριστικά των μούμιες δείχνουν ότι οι ακολουθίες που λαμβάνονται για τις δύο μούμιες είναι γνήσια και ότι δεν υπάρχει διασταυρούμενη μόλυνση μεταξύ των δειγμάτων μούμια.

Η μερική μιτοχονδριακή ακολουθία της μούμιας 88 ήταν ταυτόσημη με την αλληλουχία αναφοράς του Cambridge . Μεταξύ των ερευνητών, μόνο οι επιμέρους μιτοχονδριακών αλληλουχιών του Δρ κολοφώνιο-Arbesfeld (R.R.A) και Καθ Hershkovitz (I.H), οι οποίοι συμμετείχαν στη συλλογή των δειγμάτων, ήταν ταυτόσημη με την αλληλουχία αναφοράς του Cambridge όπως ήταν αναμενόμενο λόγω της ευρωπαϊκής καταγωγής τους. Ωστόσο, η παρατήρηση της μετάλλαξης E1317Q δεν θα μπορούσε να οφείλεται σε μόλυνση του μούμια 88 με DNA από τον Dr. Rosin-Arbesfeld ή Καθ Hershkovitz αφού ούτε αυτοί ή οποιοσδήποτε άλλος από τους ερευνητές, έχουν τη μετάλλαξη APC E1317Q (Σχήμα 1).

Συζήτηση

Έχουμε βρει την APC E1317Q μετάλλαξη ανοησίες σε ένα δείγμα από το παχύ έντερο ιστού ανακτήθηκαν από 18

ου μούμια αιώνα. Τα άγρια ​​ακολουθίες τύπου APC, στην ίδια θέση, ελήφθησαν από δύο άλλες μούμιες από την ίδια συλλογή.

Η ικανότητα να ανακτήσει το γενετικό υλικό από την αρχαία ιστού ήταν ένα τεράστιο βήμα προς τα εμπρός στην κατανόηση της εξελικτικής ιστορίας των ασθενειών. Ενώ οι περισσότεροι ασθένεια μελέτες Adna επικεντρώθηκε στο αρχαίο DNA του παθογόνου [46-48], η γενετική έρευνα του καρκίνου στο ιστορικό πληθυσμούς έχει κάπως παραμεληθεί. Υπάρχουν αναφορές για όγκους ή καλοήθη νεοπλάσματα στην αρχαία δείγματα? μερικές ακόμη και να πάει πίσω στην εποχή των δεινοσαύρων [49]. Αλλά, αυτά βασίζονται κυρίως στην παρουσία ειδικών αλλοιώσεων των οστών ή ιστολογικές μελέτες και όχι γενετική πληροφορία. Στην Ουγγαρία περιπτώσεις οστεοσαρκώματος? μυέλωμα? και μεταστατικό καρκίνωμα αναφέρθηκαν σε ιστορικά δείγματα [50-53]. Για το καλύτερο της γνώσης, καρκίνο ή μεταλλάξεις που σχετίζονται με τον καρκίνο μας δεν έχουν ακόμα αναφερθεί στην αρχαία μελέτες του DNA.

Η σπανιότητα των εκθέσεων σχετικά με τους όγκους στην αρχαία μαλακών ιστών παραμένει σε σύγκριση με τον μεγάλο αριθμό των αυτοψιών που πραγματοποιούνται σε μούμιες έχουν οδηγήσει ορισμένους μελετητές να υποθέσει ότι κακοήθειες ήταν σπάνια στο παρελθόν πληθυσμούς σε σύγκριση με τη σύγχρονη εποχή, λόγω της μικρής διάρκειας ζωής των ατόμων που δεν επέτρεψε την ανάπτυξη του καρκίνου [15,24]. Αντίθετα, παλαιοπαθολογικά εκθέσεις με βάση την έρευνα της σκελετικά υπολείμματα προτείνουν ποσοστά όγκου ήταν παρόμοια ανάμεσα στο παρελθόν και το σύγχρονο πληθυσμούς που εξετάστηκαν [20,23]. Ιστορικές μαρτυρίες δείχνουν ότι το προσδόκιμο ζωής ήταν στατιστικά μειωθεί κατά βρεφικής και μητρικής θνησιμότητας και όμως πολλά άτομα είχαν ζήσει σε αρκετά προχωρημένη ηλικία να αναπτύξουν άλλες ασθένειες ηλικία μέσα παλιά, όπως εκφυλιστικές ασθένειες [15]. Μια άλλη υπόθεση που προσπαθεί να εξηγήσει τη σπανιότητα των όγκων στα αρχαία μαλακών ιστών είναι ότι οι όγκοι μπορεί να μην είναι καλά διατηρημένα σε μουμιοποιηθεί μεταθανάτια ιστού. Ωστόσο, πειραματικές μελέτες δείχνουν ότι η μουμιοποίηση διατηρεί τα χαρακτηριστικά της κακοήθειας [54]. Ως εκ τούτου, σε μια αρχαία κοινωνία που στερείται χειρουργική επέμβαση, ένδειξη καρκίνου, αν υπήρχε στον ιστό, θα πρέπει να παραμείνουν σε όλες τις κονσέρβες μουμιοποιημένο δείγματα. Το γεγονός αρχαιολογικά δείγματα μαλακών ιστών είναι σπάνιες σε σύγκριση με σκελετικά υπολείμματα [55] παρουσιάζουν μια πρόκληση για την ανάλυση των αρχαίων καρκίνου που σχετίζονται με γενετικά δεδομένα, λόγω του μικρού μεγέθους του δείγματος. Το γεγονός αυτό υπογραμμίζει τη σημασία της συσσώρευσης των δεδομένων από μελέτες όπως αυτή, δημιουργώντας τελικά μια επαρκή βάση δεδομένων για τις επόμενες μελέτες. Τα τελευταία χρόνια, η χρήση της αλληλουχίας επόμενης γενιάς (NGS) έχει γίνει κοινή στον αρχαίο DNA της έρευνας [56]. αλληλουχίας καραμπίνα υλοποιήθηκε με επιτυχία από Kay et al. 2015 για να δημιουργήσει

Μ

.

φυματίωση

αλληλουχίες γονιδιώματος από σκελετικούς και των μαλακών ιστών από τις μούμιες Vác, αποδεικνύοντας ότι οι βακτηριακές σύνολό δεδομένων γονιδιώματος μπορεί να ληφθεί από μουμιοποιημένο ιστό γενικά και από τη μούμια συλλογή Vác ιδίως [33]. Ωστόσο, με βάση τα στοιχεία που αναφέρθηκαν από Kay et al. [33], η μέση κάλυψη φορές για τα ανθρώπινα γονιδιώματα είναι πολύ χαμηλή (όχι περισσότερο από 0,09 φορές κατά μέσο όρο κάλυψης), υποδεικνύοντας στοχευμένες εμπλουτισμό του DNA θα πρέπει να αναλυθούν συγκεκριμένες χρωμοσωμικές περιοχές όπως η περιοχή APC MCR. Επιπλέον, τα ανθρώπινα σύνολό δεδομένων γονιδιώματος μέχρι στιγμής δεν έχουν ληφθεί από μουμιοποιηθεί ιστό. Έτσι, επιλέξαμε να χρησιμοποιηθεί η κλασσική προσέγγιση της ενίσχυσης PCR και άμεση αλληλούχιση για να χαρακτηρίσει γονιδιακών μεταλλάξεων APC από τις μούμιες VAC. Δεδομένου ότι η κλασική προσέγγιση είναι πιο περιορισμένη στην ικανότητα να αντιμετωπίσει μόλυνση, χρησιμοποιήθηκαν αυστηρά μέτρα για την πρόληψη της μόλυνσης του DNA κατά τη διάρκεια της επεξεργασίας του δείγματος, όπως περιγράφεται στο τμήμα των μεθόδων? συμπεριλαμβανομένης της σύγκρισης των αλληλουχιών APC από τις μούμιες με εκείνες όλων των χειριστών δείγματος. Τα ευρήματά μας επιβεβαιώνουν ότι η απομόνωση συγκεκριμένων σχετίζονται με τον καρκίνο χρωμοσωμικές περιοχές από μουμιοποιημένο ιστού είναι εφικτή και μπορεί να παρακινήσει τη μελλοντική ανάπτυξη των συστοιχιών εμπλουτισμού με στόχο να συλλάβει τις περιοχές του DNA που σχετίζονται με κακοήθεια. Τέτοιες προσεγγίσεις θα μπορούσαν να αυξήσουν τις αποδόσεις DNA για αυτές τις περιοχές ενδιαφέροντος και θα μπορούσε να συνδυαστεί με τεχνικές NGS για να παράσχει πρόσθετη βοήθεια της ταυτότητας και μια ευρύτερη προοπτική για την εξέλιξη του καρκίνου.

καρκίνο του παχέος εντέρου προκύπτει ως το σωρευτικό αποτέλεσμα των πολλαπλών μεταλλάξεων σε πολλές γονίδια που επιτρέπει στο κύτταρο να ξεφύγουν από ρυθμιστικούς ελέγχους που οδηγεί σε ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό. Αυτές οι μεταλλάξεις μπορεί να είναι κληρονομική ή σωματικά και το τελευταίο μπορεί να επηρεαστεί σε μεγάλο βαθμό από περιβαλλοντικούς παράγοντες (π.χ. κάπνισμα, η ρύπανση του αέρα και της διατροφής) [57].

μελέτες που εξετάζουν τη σχέση μεταξύ της μετάλλαξης APC E1317Q και του παχέος εντέρου έχουν δείξει διαφορετικά αποτελέσματα. Ενώ μερικές μελέτες δείχνουν ότι η μετάλλαξη συμβάλλει σε μια προδιάθεση για παχέος αδενωμάτων και καρκινωμάτων με χαμηλή και μεταβλητή διεισδυτικότητα [58,59], άλλοι υποστηρίζουν ότι η παραλλαγή σχετίζεται μόνο με μια μέτρια αύξηση του κινδύνου καρκίνου του παχέος εντέρου [60-62]. Η επιλογή της ομάδας ελέγχου σε ορισμένες από τις μελέτες που δεν κατάφερε να βρει τον σημαντικά υψηλότερο κίνδυνο καρκίνου του παχέος εντέρου λόγω E1317Q έχει επικριθεί και προτάθηκε να είναι η αιτία της αντίφασης σχετικά επίδραση E1317Q για καρκίνο του παχέος εντέρου [43]. Έτσι, ένας πιθανός ρόλος για E1317Q στην παχέος γένεση του όγκου μπορεί να υπάρχουν και θα πρέπει να μελετηθεί περαιτέρω. Έχει προταθεί E1317Q έχει ανεπαίσθητες επιπτώσεις στην β-κατενίνης μεσεγγύηση ή υποβάθμιση, αλλά ο ακριβής μοριακός μηχανισμός που προκαλεί την προδιάθεση για καρκίνο του παχέος εντέρου είναι άγνωστη [59].

Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι η ατομική 88 μπορεί να είχε μια προδιάθεση για ανάπτυξη του παχέος αδενωμάτων και καρκινωμάτων, αλλά δεν μπορούμε να πούμε αν οι προϋποθέσεις αυτές στην πραγματικότητα εκδηλώνεται με το άτομο αυτό. Η μορφολογική διατήρηση της μουμιοποιημένο ιστού του παχέος εντέρου δεν ήταν επαρκής για την οπτική διαφοροποιούν αδενώματα ή καρκινώματα από φυσιολογικό ιστό. Το γεγονός ότι η μούμια 88 ήταν ομόζυγο για την αλληλουχία APC E1317Q αυξάνει κάπως την πιθανότητα εκδήλωσης καθώς είναι εφικτό να υποθέσουμε ότι homozygousity προκλήθηκε από την απώλεια του συμβάντος heterozygousity που είναι κοινό σε νεοπλασία και βρίσκεται συνήθως σε ασθενείς με ορθοκολικό καρκίνο που δείχνουν την APC απώλεια της λειτουργίας [63]. Καθώς η παραλλαγή E1317Q APC είναι σπάνια στο γενικό σύγχρονο πληθυσμό (0,3%, NCBI SNP βάση δεδομένων rs1801166) [40], οι πιθανότητες να κληρονομήσει ένα μεταλλαγμένο αλληλόμορφο από κάθε γονέα είναι πολύ χαμηλό το οποίο αυξάνει την πιθανότητα ότι είχε πράγματι συμβεί μια σωματική μετάλλαξη. Παρ ‘όλα αυτά, δεν έχουμε στοιχεία σχετικά με το οικογενειακό ιστορικό μούμια 88 ή της συχνότητας αλληλόμορφου σε 18

ου αιώνα Ουγγαρία, ως εκ τούτου, δεν μπορούμε να αποκλείσουμε την κληρονομιά των homozygousity για E1317Q σε αυτή την περίπτωση. Απουσία της μετάλλαξης σε ιστούς που λαμβάνονται από άλλα υπόλοιπα όργανα, θα έχουν επιβεβαιώσει τη μετάλλαξη είναι σωματική και όχι μια κληρονομική μετάλλαξη βλαστικής σειράς. Δυστυχώς, το γονιδιωματικό επίπεδο διατήρησης DNA στους άλλους ιστούς του δείγματος από μούμια 88 (ήπαρ) δεν ήταν επαρκής για την επιτυχή ενίσχυση των γονιδιωματικών αλληλουχιών APC. Σε γενικές γραμμές, σωματικές μεταλλάξεις σε αυτό το μέρος της MCR του γονιδίου APC είναι πιο κοινά στη σύγχρονη πληθυσμούς από μεταλλάξεις βλαστικής [64].

Η παχυσαρκία, η έλλειψη σωματικής άσκησης, μια διατροφή πλούσια σε κόκκινο ή επεξεργασμένο κρέας, αλκοόλ κατανάλωση και μακροπρόθεσμη καπνίσματος είναι συγκεκριμένοι παράγοντες κινδύνου για καρκίνο του παχέος εντέρου [3]. Αυτοί οι παράγοντες κινδύνου ήταν λιγότερο συχνές στην ανύπαρκτη σε προ-βιομηχανικές 18

ου αιώνα Ουγγαρία [65,66]. Οι συχνότητες εμφάνισης καρκίνου στο ιστορικό πληθυσμούς, όπως η 18

ουγγρικό πληθυσμό ου αιώνα θα μπορούσε να συνδέεται με την απουσία της σύγχρονης ζωής περιβαλλοντικούς παράγοντες όπως η χρήση καπνού ή της ρύπανσης [57,67]. Παρά το γεγονός ότι η APC MCR είναι μια περιοχή του γονιδιώματος συχνά μεταλλάσσεται σε σύγχρονο πληθυσμό ημέρα [68], η μόνη μετάλλαξη ανιχνεύτηκε στις ακολουθίες APC MCR που παράγονται από τις 3 μούμιες ήταν E1317Q σε μούμια 88. Τα στοιχεία αυτά σε συνδυασμό με τις μελλοντικές δεδομένα από παρόμοιες μελέτες που εκτείνονται σε διαφορετικούς χρόνους και τις θέσεις μπορεί να διαφωτίσει τη σχέση μεταξύ της εμφάνισης του καρκίνου του παχέος εντέρου προδιαθέτουν μεταλλάξεις και ιστορικά στον τρόπο ζωής. Η ανθρώπινη κοινωνία έχει υποστεί τεράστιες τρόπο ζωής και τις περιβαλλοντικές αλλαγές κατά τη διάρκεια των τελευταίων αιώνων. Η ικανότητα να συγκρίνει το φάσμα των ιστορικών μεταλλάξεων στο σύγχρονο φάσμα φαίνεται σημαντικό για την κατανόηση της αιτιολογίας και της παθογένεσης της μοριακής νεοπλασίας. Τα δεδομένα μας, υποδεικνύοντας την παρουσία ενός καρκίνου που προδιαθέτουν μετάλλαξη και πιθανώς καρκίνο σε ένα πρόσωπο από το 18

ου αιώνα σε συνδυασμό με τα δεδομένα που θα συσσωρευτεί από μελλοντικές μελέτες Adna μπορούν να παρέχουν μια πληρέστερη εικόνα της επιδημιολογίας του καρκίνου.

Ευχαριστίες

θα θέλαμε να ευχαριστήσουμε Nir Skalka και Hila Μαΐου, για να βοηθήσει με την εργαστηριακή εργασία.