Αφηρημένο

Σήμερα, η θεραπεία για τον καρκίνο των ωοθηκών συνεπάγεται χειρουργική επέμβαση κυπαρομειωτική ακολουθούμενη από χημειοθεραπεία, κυρίως, καρβοπλατίνη σε συνδυασμό με paclitaxel. Αν και αυτή η αγωγή είναι αρχικά αποτελεσματική σε ένα υψηλό ποσοστό περιπτώσεων, βρέθηκε εντός λίγων μηνών από την αρχική θεραπεία, υποτροπή του όγκου παρουσιάζεται εξαιτίας πλατίνα-αντίστασης. Αυτό αποδίδεται στην χημειο-αντίσταση των καρκινικών βλαστικών κυττάρων (ΚΕΠ). Εδώ δείχνουμε για πρώτη φορά ότι withaferin Α (WFA), μία βιοδραστική ένωση απομονώνεται από το φυτό somnifera Withania, όταν χρησιμοποιούνται μόνα τους ή σε συνδυασμό με σισπλατίνη (CIS) στοχεύει υποθετικό ΚΕΠ. Θεραπεία γυμνών ποντικών που φέρουν ορθοτοπική όγκους των ωοθηκών που δημιουργείται με την έγχυση ανθρώπινων επιθηλιακών καρκινική κυτταρική σειρά ωοθηκών (Α2780) με WFA και σισπλατίνη (WFA) μόνη ή σε συνδυασμό οδήγησε σε μείωση κατά 70 έως 80% στην ανάπτυξη του όγκου και την πλήρη αναστολή της μετάστασης σε άλλα όργανα σε σύγκριση με δείγματα αναφοράς άνευ αγωγής. Η ιστοχημική και ανάλυση κηλίδας Western των όγκων αποκάλυψε ότι η συμπερίληψη του WFA (2 mg /kg) είχε ως αποτέλεσμα μια ιδιαίτερα σημαντική εξάλειψη των κυττάρων που εκφράζουν δείκτες CSC – CD44, CD24, CD34, CD117 και Oct4 και προς τα κάτω ρύθμιση Notch 1, Hes1 και Hey1 γονίδια. Σε αντίθεση θεραπεία των ποντικών με μόνη CIS (6 mg /kg) δεν είχε αντίθετο αποτέλεσμα επί αυτών των κυττάρων. Αύξηση σε κύτταρα που εκφράζουν δείκτες CSC και Notch 1 μονοπατιού σηματοδότησης σε όγκους που εκτίθενται σε CIS μπορεί να εξηγήσει υποτροπή του καρκίνου σε ασθενείς που έλαβαν θεραπεία με καρβοπλατίνη και πακλιταξέλη. Δεδομένου ότι, WFA μόνο του ή σε συνδυασμό με ΚΑΚ εξαλείφει υποθετικό ΚΕΠ, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι WFA σε συνδυασμό με CIS μπορεί να παρουσιάσει πιο αποτελεσματική θεραπεία για τον καρκίνο των ωοθηκών

Παράθεση:. Kakar SS, Ratajczak MZ, Πάουελ KS, Moghadamfalahi Μ, Miller DM, Batra SK, et al. (2014) Withaferin Α μόνη και σε συνδυασμό με σισπλατίνη καταστέλλει την ανάπτυξη και μετάσταση του καρκίνου των ωοθηκών από Στόχευση Υποθετικά καρκινικά βλαστικά κύτταρα. PLoS ONE 9 (9): e107596. doi: 10.1371 /journal.pone.0107596

Επιμέλεια: Deodutta Roy, Διεθνές Πανεπιστήμιο της Φλόριντα, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 16 Ιούλη του 2014? Αποδεκτές: 5 Αύγ του 2014? Δημοσιεύθηκε: 29 Σεπτεμβρίου του 2014

Copyright: © 2014 Kakar et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Βεβαιώνω ότι όλα τα δεδομένα βασίζονται οι διαπιστώσεις της μελέτης μου είναι ελεύθερα διαθέσιμα στο χειρόγραφο

Χρηματοδότηση:. ΝΙΗ /NCI CA124630, James Graham Brown Cancer Center Κονδυλίων Έρευνας, της Ιατρικής Σχολής του βασικού προγράμματος Έρευνα Grant. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Συν-συγγραφέας Surinder Batra είναι μια Συντακτική μέλος του Διοικητικού Συμβουλίου PLoS ONE. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών (EOC) παραμένει η κύρια αιτία θανάτου στις γυναίκες μεταξύ των γυναικολογικών καρκίνων και είναι η 5η μεγαλύτερη αιτία του καρκίνου που σχετίζονται με θανάτους στις γυναίκες στις Ηνωμένες Πολιτείες [1], [2]. Η πλειονότητα των καρκίνων των ωοθηκών διαγιγνώσκονται σε προχωρημένο στάδιο, λόγω της κυρίως μη ειδικά συμπτώματα. Επί του παρόντος, η θεραπεία για τον καρκίνο των ωοθηκών συνεπάγεται χειρουργική κυτταροστατική ακολουθούμενη από χημειοθεραπεία, χρησιμοποιώντας κυρίως συνδυασμός πλατίνας /ταξάνιο [3]. Αν και αυτή η αγωγή είναι αποτελεσματική αρχικά σε ένα υψηλό ποσοστό των περιπτώσεων (70 έως 80%), βρέθηκε 70% των γυναικών αναπτύσσουν υποτροπιάζοντος καρκίνου εντός λίγων μηνών από την αρχική θεραπεία ως αποτέλεσμα της πλατίνας αντοχής [4], [5]. Επιπλέον, η σισπλατίνη (CIS) σχετίζεται με πολλές σοβαρές παρενέργειες, όπως ναυτία, έμετος, μυελοκαταστολή, ηπατοτοξικότητα, νευροτοξικότητα, τη νεφροτοξικότητα και την ωτοτοξικότητα [4], [6] – [9]. Ως εκ τούτου, η ανάγκη για νέες θεραπευτικές επιλογές που στοχεύουν τα καρκινικά κύτταρα και ιδίως το υποτιθέμενο καρκινικά βλαστικά κύτταρα είναι υποχρεωτική είτε σε ρύθμιση πρώτης γραμμής ή ακόμη περισσότερο στην διαχείριση πρώτης και δεύτερης γραμμής του υποτροπιάζοντα καρκίνο των ωοθηκών.

προηγούμενες μελέτες μας [10], δείξαμε για πρώτη φορά ότι withaferin α (WFA), μια βιοδραστική ένωση απομονώνεται από το φυτό somnifera Withania, όταν χρησιμοποιούνται μόνα τους ή σε συνδυασμό με CIS είχε ένα χρόνο και την εξαρτώμενη από τη δόση συνεργική επίδραση στην αναστολή της του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και επαγωγή του κυτταρικού θανάτου, μειώνοντας έτσι απαιτούμενη δοσολογία της σισπλατίνης. Δείξαμε επίσης ότι ενώ WFA επιτυγχάνει αποτέλεσμα κατά του όγκου του μέσω παραγωγή ROS που οδηγεί σε βλάβη του DNA, CIS επιτυγχάνει τα αποτελέσματά του όμως απευθείας συνδέσεως με DNA προκαλώντας το σχηματισμό προϊόντων προσθήκης DNA. θεραπεία συνδυασμού οδήγησε επίσης σε μια σημαντική ενίσχυση της αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) παραγωγή και βλάβες στο DNA.

WFA έχει ένα μέρος της ινδικής παραδοσιακής ιατρικής για αιώνες. Είναι διαθέσιμο σε US over-the-counter, ως συμπλήρωμα διατροφής και είναι γνωστό για τη θεραπεία διαφόρων διαταραχών που οφείλονται σε αντι-φλεγμονώδη [11], [12], αντι-βακτηριακή [13], και καρδιο προστατευτικές ιδιότητες του [14]. Τα τελευταία χρόνια, WFA έχει προταθεί ως ένας πιθανός αντικαρκινική ένωση αποδειχθεί ότι εμποδίζει την ανάπτυξη του όγκου, της αγγειογένεσης και της μετάστασης [15], [16] σε διάφορους τύπους καρκίνου [17] – [26]. Μηχανισμοί με τους οποίους WFA επιτυγχάνει αντικαρκινική δράση της περιλαμβάνουν απενεργοποίηση της Akt και NF-κΒ [27] για την επίτευξη της απόπτωσης, μειώνονται σε προ-επιβίωσης πρωτεΐνη Bcl-2 [28], G2 /M διακοπή του κυτταρικού κύκλου [29], [30], παραγωγή δραστικών μορφών οξυγόνου (ROS) [31], [32], η επαγωγή της Par-4 [17], η ενεργοποίηση της κασπάσης 3 και 9 δραστηριότητες, βλάβη του DNA [10], η αναστολή της HSP90 [20], η ρύθμιση της FOXO3a και Bim [15] αναστολή του Notch-1 [33], καθώς και προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης του HPV Ε6 και Ε7 ογκοπρωτεϊνών [19].

Ανάπτυξη της ανθεκτικότητας στα φάρμακα και υποτροπή του καρκίνου των ωοθηκών ήταν ένα σημαντικό κλινικό πρόβλημα. Έχουν προταθεί ένας αριθμός μηχανισμών που διεγείρουν αντοχή φαρμάκου. Κατά τα τελευταία χρόνια, υπήρξε μία αυξανόμενη απόδειξη ότι «καρκινικά βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ)», είναι η πιο σημαντική σκανδάλη εξέλιξης του όγκου, χημειο-αντίσταση και υποτροπής μετά την αρχική θεραπεία [34], [35]. Πρώτη απόδειξη για την ύπαρξη των βλαστικών κυττάρων του καρκίνου του ήρθε κατά το έτος 1997, με την αναγνώριση της λευχαιμίας βλαστικών κυττάρων [36], [37]. Κατά το έτος 2003, Al-Hajj et al. [38] πειραματικά αποδείξει την ιεραρχική βλαστοκύτταρα στον καρκίνο του μαστού. Ωστόσο, μέχρι πρόσφατα η ύπαρξη υποθετικών καρκινικά βλαστικά κύτταρα εντός συμπαγών όγκων παρέμεινε αμφιλεγόμενη [39]. Σε πρόσφατες μελέτες με χρήση μοντέλων ποντικών για τον εγκέφαλο, το δέρμα και εντερική όγκους, τρεις ανεξάρτητες ομάδες έδωσαν πειστικά στοιχεία για την ύπαρξη ΚΕΠ σε όγκους και ο ρόλος τους στην επέκταση του όγκου [40] – [42]. Κατά συνέπεια, ΚΕΠ εντός μάζας όγκου υποβάλλονται σε αυτο-ανανέωση και να οδηγήσει σε ετερογενείς καταγωγές καρκίνου που περιλαμβάνουν ιστό του όγκου. ΚΕΠ καθαρίζεται αναλόγως με ορισμένους δείκτες επιφάνειας μπορούν να σχηματίσουν όγκους όταν εγχέονται σε γυμνά ποντίκια [36], [43], [44]. Δεδομένου ότι, ο καρκίνος των ωοθηκών είναι πολύ ετερογενής? Οι διαφορετικοί δείκτες κυτταρικής επιφάνειας έχουν αναφερθεί για υποθετικό ΚΕΠ των ωοθηκών. Πιο συχνά αναφερόμενες περιλαμβάνουν CD24, CD34, CD44, CD133, CD117, ΑΙ_ϋΗ1, Oct4, MyD88 και EpCAM [45] – [53]. Δεδομένου ότι, τα ΚΕΠ θεωρούνται σημαντικοί παράγοντες υπεύθυνοι για την ανάπτυξη ανθεκτικότητας στα φάρμακα και ως εκ τούτου οδηγεί σε επανεμφάνιση του καρκίνου [52], [53], με στόχο ΚΕΠ και την αναστολή της αυτο-ανανέωσή τους θα οδηγήσει σε μείωση της ανάπτυξης του καρκίνου [33].

στην τρέχουσα μελέτη μας, δείχνουμε για πρώτη φορά ότι WFA μόνο του ή σε συνδυασμό με CIS εάν χρησιμοποιηθούν για να θεραπεύουν ποντικούς που φέρουν ορθοτοπική ανθρώπινων όγκων των ωοθηκών, όχι μόνο καταστέλλει την ανάπτυξη του όγκου αλλά στοχεύει τα κύτταρα που εκφράζουν δείκτες CSC καθώς αναστέλλει Notch 1 και του κατάντη γονίδια σηματοδότησης (Hes1 και Hey1) που έχουν αναφερθεί να διαδραματίσει κρίσιμο ρόλο στην αυτο-ανανέωση και τη συντήρηση των ΚΕΠ (33).

Υλικό και Μέθοδοι

γραμμή κυττάρων και κυτταρικών καλλιεργειών

ωοθηκών επιθηλιακού καρκίνου κυτταρική γραμμή Α2780 αρχικά ελήφθη από Denise Connolly (Fox Chase Κέντρο Καρκίνου) και διατηρήθηκε σε RPMI 1640 μέσο που περιέχει ινσουλίνη και συμπληρωμένο με πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (100 IU /ml και 100 μg /ml) και 10% ορό εμβρύου μόσχου (FCS) (Hyclone, Atlanta, GA) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [10].

η μετανάστευση των κυττάρων Boyden δοκιμασίες θάλαμος

η μετανάστευση των κυττάρων in vitro ελέγχθηκε με προσδιορισμό της ικανότητας του κυττάρων να μεταναστεύουν μέσω μιας συνθετικής μεμβράνης. Η διαδικασία που χρησιμοποιήθηκε ήταν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [54]. Εν συντομία, τα φίλτρα πολυανθρακικού (8 μΜ) τοποθετήθηκαν σε τροποποιημένο θάλαμο Boyden. Α2780 κύτταρα σε λογαριθμική φάση υπέστησαν κατεργασία τρυψίνης και επιστρώθηκαν σε 6 φρεάτια πλακών. Μετά από 24 ώρες επιμετάλλωση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με WFA και CIS και μεμονωμένα και σε συνδυασμό, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [10]. Μετά από 24 ώρες αγωγής, τα κύτταρα τρυψινοποιήθηκαν και εναιωρήθηκαν σε μέσο χωρίς ορό. Ένα σύνολο 2 × 10

5 κύτταρα μεταφέρθηκαν στην κορυφή του θαλάμου. Το μέσο που περιέχει 5% FBS προστέθηκε στον κάτω θάλαμο. Τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C για 24 ώρες και αφέθηκε να μεταναστεύσει διαμέσου της μεμβράνης. Μη μετεγκατάσταση κύτταρα απομακρύνθηκαν με ένα καθαρό βαμβάκι. Κύτταρα που μετανάστευσαν στην άλλη πλευρά της μεμβράνης βάφτηκαν με κρυσταλλικό ιώδες και μετρήθηκαν σε τρία διαφορετικά πεδία κάτω από μικροσκόπιο Olympus. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές. Οι τιμές που αντιπροσωπεύεται είναι ο μέσος όρος ± SEM τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Δημιουργία ορθοτοπική όγκους των ωοθηκών σε γυμνούς ποντικούς και θεραπεία με WFA και ΚΑΚ μεμονωμένα και σε συνδυασμό

ορθοτοπική όγκους των ωοθηκών παρήχθησαν με έγχυση Α2780 γραμμή ωοθηκών καρκινικά κύτταρα απευθείας σε κύτταρα ωοθήκης, όπως περιγράφεται από τον Νούνιες Cruz et al. [55]. Εν συντομία, Α2780 (1 × 10

6) κύτταρα απευθείας εγχέεται αριστερά ωοθήκη 5 έως 6 εβδομάδων ηυ /ηυ θηλυκών ποντικών (Jackson Laboratory) κάτω από άσηπτες συνθήκες και υπό ελαφρά αναισθησία. Μετά από 10 ημέρες μετά την ένεση των κυττάρων, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή με 1) τον έλεγχο του οχήματος (10% DMSO και 90% γλυκερύλιο τριοκτανοϊκή), 2) WFA 2 mg /kg, 3), CIS 6 mg /kg, και 4) WFA 2 mg /kg συν CIS 6 mg /kg. Πέντε ζώα τυχαία συμπεριελήφθησαν σε κάθε ομάδα. CIS σε φυσιολογικό ορό εγχύθηκε ε.π. μία φορά την εβδομάδα, ενώ WFA εγχύθηκε ε.π. μέρα παρά μέρα. Μετά από 4 εβδομάδες θεραπείας, τα ζώα θυσιάστηκαν? όγκου και άλλους ιστούς όπως un-εγχυθεί ωοθηκών, του πνεύμονα, του νεφρού, του ήπατος, των επινεφριδίων και η καρδιά συλλέχθηκαν από το κάθε ποντίκι. Οι όγκοι ζυγίστηκαν κατά τη στιγμή της συλλογής. Οι όγκοι και άλλους ιστούς χωρίστηκαν σε δύο μέρη, ένα μέρος καταψύχθηκε, και το δεύτερο μέρος σταθεροποιήθηκε σε 10% ρυθμισμένη φορμαλίνη. πειράματα των ζώων εγκρίθηκαν από το Πανεπιστήμιο του Louisville, θεσμικές φροντίδα των ζώων και την Επιτροπή Χρήση (IACUC) (πρωτόκολλο # 12063).

φορμόλη σταθερό όγκο και ιστοί υποβλήθηκαν σε επεξεργασία και ενσωματωμένα σε παραφίνη χρησιμοποιώντας τυποποιημένα πρωτόκολλα όπως περιγράφηκε προηγουμένως [56]. Πέντε μm πάχους τομές των ενσωματωμένων όγκων και ιστούς παρασκευάστηκαν και χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η &? Ε). Τμήματα εις τριπλούν εξετάστηκαν κάτω από το μικροσκόπιο και φωτογραφήθηκαν. Histopatholoigcal ανάλυση των τμημάτων έγινε από έναν εκπαιδευμένο παθολόγο Δρ Mana Moghadamfalahi.

Ανοσοϊστοχημεία

Τα σταθεροποιημένα με φορμαλίνη ενσωματωμένα σε παραφίνη ιστοί αποπαραφινοποιήθηκαν σε ξυλόλιο και επανυδατώθηκαν σε μια φθίνουσα διαβαθμισμένη σειρά αιθανόλης όπως περιγράφηκε προηγουμένως [ ,,,0],56]. Οι τομές θερμάνθηκε στους 95 ° C σε 10 mM κιτρικού νατρίου (ρΗ 6.0) για 20 λεπτά, ψύχεται σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια ξεπλύθηκαν σε PBS. Οι τομές επωάστηκαν με υπεροξείδιο του υδρογόνου 0,3% εντός μεθανόλης επί 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου για τη σβέση της ενδογενούς υπεροξειδάσης που ακολουθείται από δύο εκπλύσεις σε PBS (5 λεπτά το καθένα), και αποκλείστηκαν με φυσιολογικό ορό κατσίκας χρησιμοποιώντας αντιδραστήρια από κιτ ABC από Vector Laboratories για 60 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου σύμφωνα με τις οδηγίες από τον προμηθευτή. Το διάλυμα δέσμευσης απομακρύνθηκε με αποστράγγιση και οι τομές επωάστηκαν με αντίσωμα ειδικό με κατάλληλη αραίωση σύμφωνα με τις οδηγίες από τους προμηθευτές στους 4 ° C για όλη την νύχτα σε υγροποιημένο θάλαμο. Τα αντισώματα για CD24 (cat # SAB14202713), CD44 (cat # SAB1405590), CD117 (cat # SAB4300489) και Oct4 (cat # P0873) ελήφθησαν από την Sigma-Aldrich, και το αντίσωμα για CD34 ελήφθη (cat # sc-19587) από Santa Cruz Biotechnology. Μετά το ξέπλυμα τα τμήματα τρεις φορές (5 λεπτά κάθε φορά) με PBS, οι τομές επωάστηκαν με βιοτινυλιωμένη αντι-κουνελιού (για πολυκλωνικά αντισώματα) ή αντι-ποντικού (για μονοκλωνικά αντισώματα) από τα κιτ ABC (Vector Laboratories) σε θερμοκρασία δωματίου για 45 λεπτά που ακολουθείται από επώαση με στρεπταβιδίνη. Μετά από τρεις εκπλύσεις (5 λεπτά κάθε φορά) με PBS, οι τομές επωάστηκαν με 3,3′-διαμινοβενζιδίνη (DAB, Sigma) για την ανάπτυξη χρώματος. Οι τομές εξετάστηκαν υπό Nikon Elipse E400 μικροσκόπιο και φωτογραφήθηκαν.

απομόνωση πρωτεϊνών και ανάλυση Western blot

Α2780 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε τρυβλία 6 φρεατίων. Μετά από 24 ώρες επιμετάλλωση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με WFA και CIS και μεμονωμένα και σε συνδυασμό, όπως περιγράφηκε προηγουμένως (10). Μετά από 48 ώρες αγωγής, τα κύτταρα λύθηκαν σε παγωμένο ρυθμιστικό διάλυμα λύσης [50 mM Tris-HCl (ρΗ 7.5), 150 mM NaCl, 0,1% ΝΡ-40, 1 mM Να

3νο

4, και 1 mM NaF ) συμπληρωμένο με Complete Mini δισκίο αναστολέα πρωτεάσης (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, ΙΝ). Για την παρασκευή εκχυλίσματος από φυσιολογικών και καρκινικών ιστών, οι ιστοί εναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό λύσης και ομογενοποιούνται επί πάγου χρησιμοποιώντας ομογενοποιητή Polytron που ακολουθείται από φυγοκέντρηση στις 10.000 rpm για 5 λεπτά. Τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν και η συγκέντρωση της πρωτεΐνης σε κάθε δείγμα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Bradford (BioRad Laboratories) σύμφωνα με τις οδηγίες του προμηθευτή. Σαράντα μg πρωτεΐνης από κάθε δείγμα κλασματοποιήθηκε επί πηκτωμάτων SDS-πολυακρυλαμιδίου και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης όπως περιγράφηκε προηγουμένως [56]. Δέσμευση μη ειδικών πρωτεϊνών διεξήχθη με επώαση των μεμβρανών με 5% άπαχο ξηρό γάλα σε ρυθμισμένο με Tris αλατούχο διάλυμα Tween-20 (TBST) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Οι μεμβράνες επωάστηκαν με ειδικό αντίσωμα με κατάλληλη αραίωση, όπως προτείνεται από τους προμηθευτές. Αντίσωμα για Notch 1 (cat # N6786), Hey1 (cat # SAB1404975) και β-ακτίνη (cat # A3854) ελήφθησαν από την Sigma-Aldrich, και το αντίσωμα για Hes1 (cat # sc-165996) ελήφθη από την Santa Cruz Biotechnology. Οι μεμβράνες πλύθηκαν τρεις φορές (5 λεπτά καθένα) με TBST, που ακολουθείται από επώαση με ραφανιδική υπεροξειδάση συζευγμένο δευτερεύον αντίσωμα (1:5,000 αραίωση) σε TBST. Οι μεμβράνες ξεπλένονται τρείς φορές (5 λεπτά καθένα) με TBST και τα ανοσο-αντιδραστικά ζώνες έγιναν ορατές με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια. Οι μεμβράνες απογυμνώνεται για 10 λεπτά με μεθανόλη που περιέχει 3% Η

2O

2 και διερευνήθηκαν με αντίσωμα β-ακτίνης προκειμένου να χρησιμεύσει ως ένας εσωτερικός έλεγχος.

Στατιστική ανάλυση

η στατιστική σύγκριση των δεδομένων πραγματοποιήθηκε με δοκιμή t του μαθητή (για τα ενιαία σύγκριση). Πιθανότητα p & lt? 0,05 καθορίζεται από τη δοκιμή δύο όψεων θεωρήθηκε σημαντική. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση SPSS 10.0 λογισμικού.

Αποτελέσματα

WFA /συνδυασμός CIS αναστέλλει τη μετανάστευση των κυττάρων in vitro

Τα διάφορα στάδια εξέλιξης του όγκου και των μεταστάσεων, συμπεριλαμβανομένων αποκόλληση των καρκινικών κυττάρων από την κύρια θέση του όγκου, μετανάστευση σε lymph- ή τα αιμοφόρα αγγεία, προσκόλληση στο ενδοθήλιο σε απομακρυσμένες θέσεις μετάστασης ακολουθούμενη από σπορά σε νέα θέση και την επακόλουθη επέκταση. Να εξετάσει την επίδραση της WFA και της ΚΑΚ στο Α2780 κυτταρική μετανάστευση, θα αντιμετωπίζονται τα κύτταρα Α2780 με WFA και της ΚΑΚ, τόσο μεμονωμένα και σε συνδυασμό για 48 ώρες. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1, με την χρησιμοποίηση Boyden θαλάμων παρατηρήσαμε ότι η επεξεργασία των κυττάρων με WFA ή CIS μόνη ανέστειλε την κυτταρική μετανάστευση σε ένα εξαρτώμενο από τη δόση τρόπο σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου. Ενώ επεξεργασία των κυττάρων με 20 μΜ CIS ανέστειλε κυτταρική μετανάστευση, η προσθήκη WFA (0,5 μΜ ή 1,5 μΜ) προς CIS σαν αποτέλεσμα αυξημένη αναστολή της κυτταρικής μετανάστευσης, γεγονός που υποδηλώνει ότι WFA συνδυασμό με CIS είναι πιο αποτελεσματική από κάθε παράγοντα που χρησιμοποιείται.

κύτταρα Α2780 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με διαφορετική συγκέντρωση της WFA και της ΚΑΚ, τόσο μεμονωμένα και σε συνδυασμό για 48 ώρες. Τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και υποβλήθηκαν για κυτταρική μετανάστευση χρησιμοποιώντας Boyden θάλαμο. Τα κύτταρα χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες και φωτογραφήθηκαν (Α). Τα χρωματισμένα κύτταρα μετρήθηκαν υπό μικροσκόπιο χρησιμοποιώντας τρεις διαφορετικές περιοχές? τιμές που δείχνονται είναι μέση τιμή ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. * Αντιπροσωπεύει σημαντική σε σύγκριση με τον έλεγχο σε p ≤ 0,05 (Β). Con = ελέγχου, W = WFA. Οι τιμές που παρουσιάζονται σε παρένθεση είναι μΜ.

Η

WFA /συνδυασμός CIS καταστέλλει την ανάπτυξη του όγκου και των μεταστάσεων σε άτριχα ποντίκια

in vitro

μελέτες μας, έδειξαν ότι η θεραπεία του CIS-ευαίσθητων κυτταρικών σειρών (Α2780 και Caov3), καθώς και των κυττάρων CIS-αντίσταση γραμμής (Α2780 /CP70) με WFA και ΚΑΚ μεμονωμένα και σε συνδυασμό ανέστειλε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό σε ένα χρόνο- και δοσο-εξαρτώμενο τρόπο και την επαγωγή απόπτωσης και βλάβη του DNA. Επιπλέον, το συνδυασμένο αποτέλεσμα της WFA και της ΚΑΚ ήταν συνεργιστική [10]. Για να εκτιμηθεί η αποτελεσματικότητα της WFA /συνδυασμός CIS στην ανάπτυξη και μετάσταση όγκου in vivo, ελέγξαμε την επίδραση της WFA και CIS και μεμονωμένα και σε συνδυασμό επί της ανάπτυξης όγκου και μετάστασης σε γυμνούς ποντικούς που φέρουν εμβολιάστηκαν ορθοτοπική ανθρώπινων όγκων των ωοθηκών. Ποντικού ορθοτοπική όγκων καθορίστηκαν με ένεση κυττάρων Α2780 κατευθείαν σε αριστερό ωοθήκη 5 έως 6 εβδομάδων ηυ /ηυ θηλυκών ποντικών. Ξεκινώντας από την ημέρα 10 μετά τον εμβολιασμό των καρκινικών κυττάρων, τα ζώα υποβλήθηκαν σε αγωγή με WFA και CIS και μεμονωμένα και σε συνδυασμό, όπως περιγράφεται λεπτομερώς στο τμήμα Υλικά και Μέθοδοι. Μετά από 4 εβδομάδες θεραπείας, τα ζώα θυσιάστηκαν. Έχουμε παρατηρήσει ότι ο έλεγχος ψεύτικη θεραπεία ζώα ανέπτυξαν ιδιαίτερα vascularized και μεγάλους όγκους (Εικ. 2). Ταυτόχρονα 4 από τα 5 WFA (2 mg /kg) μόνη αγωγή ζώα ανέπτυξαν όγκους που ήταν σημαντικά μικρότερες σε μέγεθος. Παρομοίως, 3 από τα 5 ζώα που υπέστησαν αγωγή με CIS (6 mg /kg) ανέπτυξαν όγκους που ήταν σημαντικά μικρότερα σε μέγεθος σε σύγκριση με ψευδο-κατεργασμένα δείγματα αναφοράς. Επιπλέον, η θεραπεία των ζώων με WFA (2 mg /kg) σε συνδυασμό με CIS (6 mg /kg) είχε ως αποτέλεσμα 70 έως 80% μείωση στο βάρος του όγκου σε σύγκριση με τα ζώα ελέγχου χωρίς αγωγή (Εικ. 2) και από 5 ποντίκια, μόνο τρία ποντίκια ανέπτυξαν όγκους. Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές στο βάρος του όγκου παρατηρήθηκαν σε ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με WFA και CIS μόνες ή σε συνδυασμό (σχήμα 2)

Α:. 1 × 10

6 κύτταρα Α2780 ενέθηκαν σε θηλυκούς ωοθήκη ποντικού. Μετά από 10 ημέρες μετά την ένεση, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή με WFA και CIS τόσο μόνες ή σε συνδυασμό για τέσσερις εβδομάδες. Οι ποντικοί θυσιάστηκαν? όγκοι αποκόπηκαν έξω, φωτογραφήθηκαν και σταθμίζονται. Οι όγκοι που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά από κάθε ομάδα. Β: βάρος Όγκοι απεικονίστηκε γραφικά από κάθε ομάδα. Οριζόντια γραμμή αντιπροσωπεύει διάμεσο βάρος εκάστης ομάδας. Αντιμετωπίζονται ομάδα έδειξε σημαντικά χαμηλότερο βάρος από ποντίκια χωρίς θεραπεία. Τα αποτελέσματα είναι μέση τιμή (κόκκινη γραμμή) και ± SD (κάθετη γραμμή). * Αντιπροσωπεύει σημαντική σε σύγκριση με τον έλεγχο σε p ≤ 0,05

Η

H & amp?. Ε ιστο-παθολογική ανάλυση των un-ένεση απέναντι ωοθήκες, το συκώτι, οι πνεύμονες και έδειξε μετάσταση στο συκώτι και τις ωοθήκες σε ψευδώς ζώα αντιμετωπίζονται μόνο . Μεταστατικά κύτταρα αποτελούνται ~ 10% των κυττάρων σε αυτά τα όργανα (Εικ. 3). Αντίθετα δεν παρατηρήθηκαν μεταστάσεις σε WFA και ΚΑΚ ομάδων. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι ο συνδυασμός χαμηλής δόσης της WFA (2 mg /kg) με υποβέλτιστη δόση του CIS (6 mg /kg) είναι ιδιαίτερα αποτελεσματική στην καταστολή της ανάπτυξης του όγκου και η μετάσταση ορθοτοπική όγκους των ωοθηκών σε γυμνά ποντίκια. Αυτό δείχνει ότι θα ήταν δυνατή η μείωση της θεραπευτικής δόσης του CIS όταν συνδυάζεται με WFA σε ανθρώπους για να βελτιώσει τις παρενέργειες που συνδέονται με την υψηλή δοσολογία των CIS.

Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε θεραπεία με WFA και της ΚΑΚ, όπως υποδεικνύεται στο Σχήμα 2. Όγκοι και άλλους ιστούς τομές χρωματίστηκαν με η &? Ε και εξετάζονται από έναν εκπαιδευμένο παθολόγο. Μετάσταση (φαίνεται από τα βέλη) παρατηρήθηκε σε un-ένεση ωοθήκες και στο συκώτι και αντιπροσωπεύουν περίπου το 10% των κυττάρων.

Η

WFA μόνο του ή σε συνδυασμό με ΚΑΚ εξαλείφει υποθετικό καρκινικά βλαστικά κύτταρα σε ορθοτοπική όγκους των ωοθηκών

χημειοθεραπείες-αντίσταση και υποτροπή του καρκίνου των ωοθηκών είναι ένα σημαντικό πρόβλημα και αιτία θανάτου. Τα τελευταία χρόνια, μια έννοια του ΚΕΠ σε στερεά καρκίνους συμπεριλαμβανομένων των καρκίνων των ωοθηκών έχει προταθεί [57], [58]. έχουν ΚΕΠ αναφερθεί ότι είναι υπεύθυνος για την χημειο-αντίσταση, την ανάπτυξη του όγκου και υποτροπή του καρκίνου μετά τη θεραπεία. Οι Υποθετικές ΚΕΠ αναφερθεί ως καρκινικά κύτταρα έναρξη ικανά να αναπτύξουν όγκους όταν εγχέονται σε γυμνά ποντίκια [57]. Για να ελεγχθεί αν WFA όταν χρησιμοποιούνται μόνα τους ή σε συνδυασμό με τους στόχους της ΚΑΚ ΚΕΠ, πραγματοποιήσαμε ανοσοϊστοχημική ανάλυση των όγκων που συλλέγονται από τα ψευδο-αγωγή ζώα και τα ζώα που έλαβαν θεραπεία με WFA και ΚΑΚ μεμονωμένα και σε συνδυασμό με τη χρήση των αντισωμάτων για δείκτες εκφράζονται από υποθετικούς ΚΕΠ συμπεριλαμβανομένων των CD44, CD24, CD34, CD117 και Oct4 [56]. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4-6, παρατηρήσαμε ~ 10-20% των κυττάρων θετικά για CD44, CD24, CD34, CD117 και Oct4 σε όγκους που συλλέγονται από ζώα χωρίς αγωγή. Ωστόσο, η θεραπεία των ζώων με WFA (2 mg /kg) είχε ως αποτέλεσμα μια πολύ σημαντική μείωση του αριθμού αυτών των κυττάρων. Αντίθετα, η θεραπεία των ζώων με μόνη CIS σε δόση 6 mg /kg οδήγησε σε σημαντική αύξηση των CD44, CD24, CD34, CD117 και OCT 4 θετικά κύτταρα (60%) (Σχ. 4-6). Το πιο σημαντικό, η θεραπεία των ζώων με WFA σε συνδυασμό με CIS (6 mg /kg) μείωσε σημαντικά τον αριθμό των κυττάρων που εκφράζουν δείκτες CSC.

Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά δύο ανεξάρτητων πειραμάτων. W = WFA. Οι τιμές που παρουσιάζονται σε παρένθεση είναι mg /kg.

Η

Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά δύο ανεξάρτητων πειραμάτων. W = WFA. Οι τιμές που παρουσιάζονται σε παρένθεση είναι mg /kg.

Η

Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά δύο ανεξάρτητων πειραμάτων. W = WFA. Οι τιμές που παρουσιάζονται σε παρένθεση είναι mg /kg.

Η

WFA μόνο του ή σε συνδυασμό με ΚΑΚ ρυθμίζει προς τα κάτω την έκφραση της CSC που σχετίζονται με δείκτες

Για να επιβεβαιώσετε ανοσο-ιστοχημική ανάλυση μας CD44, θετικών κυττάρων CD24, CD34, CD117 και Oct4 σε ορθοτοπική όγκους, εκτελέσαμε ανάλυση στυπώματος Western των εκχυλισμάτων όγκου χρησιμοποιώντας ειδικό αντίσωμα για δείκτες ανιχνεύονται με χρώση ανοσο-ιστοχημικές. Όπως φαίνεται στο Σχ. 7, η έκφραση της CD24, CD34, CD44, και αντιγόνα Oct4 σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται σε όγκους που συλλέγονται από ζώα που έλαβαν θεραπεία με WFA μόνη, σε σύγκριση με τους όγκους από ψευδο-αγωγή ζώα. Σε αντίθεση, παρατηρήθηκε μία σημαντική αύξηση στην έκφραση του CD24, CD34, CD44 και Oct4 σε εκχυλίσματα όγκου από ζώα που υπέστησαν αγωγή με CIS (6 mg /kg) σε σύγκριση με ψευδο-κατεργασμένα ποντίκια ή ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με WFA (2 mg /kg) μόνο . Είναι ενδιαφέρον ότι, η θεραπεία των ζώων με WFA (2 mg /kg) σε συνδυασμό με CIS (6 mg /kg) είχε ως αποτέλεσμα σημαντική εξάλειψη των κυττάρων που εκφράζουν αντιγόνα CD44, CD24, CD34 και Oct4.

β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά δύο ανεξάρτητων πειραμάτων. Con = ελέγχου, W = WFA. Οι τιμές που παρουσιάζονται σε παρένθεση είναι mg /kg.

Η

Αύξηση του αριθμού των κυττάρων που εκφράζουν δείκτες υποθετικών ΚΕΠ σε όγκους που συλλέγονται από ζώα που υπέστησαν αγωγή με CIS όπως αναλύεται με ανοσο-χρώση, καθώς και ανάλυση στυπώματος Western δείχνει ότι θεραπεία με CIS μπορεί να αυξήσει τον αριθμό των κυττάρων που εκφράζουν αυτούς τους δείκτες και μπορεί να εξηγήσει την ανάπτυξη της χημειο-αντίσταση και επανεμφάνιση του καρκίνου των ωοθηκών σε ασθενείς που έλαβαν θεραπεία με CIS ή παράγωγο του, όπως η καρβοπλατίνη σε συνδυασμό με πακλιταξέλη που χρησιμοποιούνται συνήθως στη χημειοθεραπεία. Σε αντίθεση εξάλειψη των κυττάρων που εκφράζουν δείκτες CSC σε όγκους κατά την κατεργασία με WFA μόνο ή σε συνδυασμό με CIS (6 mg /kg) καταδεικνύει ότι WFA είναι ιδιαίτερα αποτελεσματική στην εξάλειψη κύτταρα που εκφράζουν δείκτες CSC.

WFA μόνοι ή σε συνδυασμό με CIS αναστέλλει Notch 1 και κατάντη γονίδια σήμανσης της (Hes1 και Hey1)

Αυτο-ανανέωση, ανθεκτικότητα στα φάρμακα και η διαφοροποίηση είναι βασικά χαρακτηριστικά των ΚΕΠ. Sonic Hedgehog (Shh), Notch1, Twist1, σαλιγκάρι και Wnt1 μονοπάτια μεταγωγής σηματοδότησης παίζουν μείζονα ρόλο στην αυτο-ανανέωση των κυττάρων αυτών [33], [59] – [68]. WFA έχει αναφερθεί ότι αναστέλλει γονίδια σηματοδότηση Notch-1 και κατάντη (Hes1 και Hey1) [33], [68]. Notch 1 σηματοδοτικό μονοπάτι συνδέεται με τη ρύθμιση του κυτταρικού μοίρα σε διάφορα διακριτά αναπτυξιακά στάδια και έχει εμπλακεί στην έναρξη του καρκίνου και την εξέλιξη [63], [69], [70]. Στη παρούσα μελέτη μας, όπως φαίνεται στο Σχ. 8, παρατηρήσαμε πολύ σημαντική αναστολή της έκφρασης του Notch 1 και κατάντη γονίδια της σηματοδότησης Hes1 και Hey1 σε όγκους που συλλέγονται από ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με WFA (2 mg /kg) σε σύγκριση με τους όγκους ελέγχου από ψευδο-αγωγή ζώα. Αντίθετα, τα ζώα που έλαβαν θεραπεία με CIS (6 mg /kg) έδειξαν μία πολύ σημαντική αύξηση στα επίπεδα του Notch 1, Hes1 και Hey1 γονίδια. Αυτό που είναι σημαντικό, οι όγκοι συλλέχθηκαν από ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με WFA (2 mg /kg) σε συνδυασμό με CIS (6 mg /kg) έδειξαν σημαντικά μειωμένα επίπεδα του Notch 1, καθώς και πρωτεΐνες Hes1 και Hey1 (Εικ. 8), γεγονός που υποδηλώνει ρύθμιση προς τα κάτω του Notch 1 σηματοδότηση από WFA μόνο του ή σε συνδυασμό με CIS που οδηγεί σε εξάλειψη του υποτιθέμενου ΚΕΠ.

βήτα-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά δύο ανεξάρτητων πειραμάτων. Con = ελέγχου, W = WFA. Οι τιμές που παρουσιάζονται σε παρένθεση είναι mg /kg.

Η

Συζήτηση

Η πιο συνηθισμένη πρώτη γραμμή χημειοθεραπείας που χρησιμοποιούνται για τον καρκίνο των ωοθηκών μετά από κυτταρομειωτική χειρουργική επέμβαση είναι καρβοπλατίνη σε συνδυασμό με πακλιταξέλη. Η αρχική ταχύτητα απάντησης σε αυτό το συνδυασμό είναι πολύ υψηλή (70 έως 80%), ωστόσο μέσα σε 6 με 20 μήνες μετά την αρχική θεραπεία υποτροπή του όγκου και οι ασθενείς καθίστανται αντίσταση στην CIS [71]. Αντοχή σε CIS έχει συσχετισθεί με τον αριθμό των μηχανισμών, όπως αύξηση των επιπέδων της γλουταθειόνης και μεταλλοθειονεΐνη, μείωση στην πρόσληψη του φαρμάκου, αύξηση της μηχανισμούς επιδιόρθωσης του DNA (λόγω ενισχυμένη έκφραση των γονιδίων επιδιόρθωσης εκτομής) και ανοχή του σχηματισμού των προϊόντων προσθήκης λευκοχρύσου-ϋΝΑ [ ,,,0],72]. Μεταβολή της κατάστασης της ρ53 έχει επίσης αναφερθεί ότι παίζει σημαντικό ρόλο στην ευαισθησία των CIS [73], [74].

Τα τελευταία χρόνια, αρκετοί ερευνητές έχουν αναφέρει την παρουσία του μικρού πληθυσμού των ΚΕΠ σε ιστούς όγκων σε είναι υπεύθυνη για την επαγωγή της χημειο-αντίστασης και υποτροπή του καρκίνου [75] – [77]. Η πειστικά στοιχεία για το ρόλο του ΚΕΠ στον καρκίνο των ωοθηκών δόθηκε από Bapat et al. [45] οι οποίοι έδειξαν την παρουσία ΚΕΠ στο επίπεδο του ενός κυττάρου στον ασκίτη ενός ασθενή με καρκίνο των ωοθηκών, που θα μπορούσε να διαδοθεί διαδοχικά όγκου για αρκετές γενεές. Σε συμφωνία με αυτό, πολλοί άλλοι ερευνητές ανέφεραν την παρουσία ΚΕΠ σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου των ωοθηκών, όγκους των ωοθηκών των ασθενών και σχετίζεται με όγκο-ασκίτη [57], [76], [77]. Ως συνέχεια των παρατηρήσεων αυτών ΚΕΠ έχουν απομονωθεί με βάση την παρουσία κάποιων εξωκυτταρικών δεικτών. Τα πιο κοινά κατασκευαστές που χρησιμοποιούνται για την ΚΕΠ ωοθηκών περιλαμβάνουν CD44, CD24, CD34, CD117 και CD133. ΚΕΠ εκφράζουν επίσης ΑΙ_ϋΗ1, Oct4, Myd88 και EpCAM [47], [51], [57], [60], [78], [79]. Μια αύξηση του αριθμού των ΚΕΠ σε όγκους των ωοθηκών σχετίζεται με κακή πρόγνωση, συμπεριλαμβανομένων μικρότερη συνολικά και επιβίωσης χωρίς νόσο [80] – [82]. Ανάπτυξη του χημειο-αντίσταση του καρκίνου των ωοθηκών μπορεί να εξηγηθεί από εμπλουτισμού για ΚΕΠ [77], [83] – [85]. Σε μια πρόσφατη μελέτη, Abubaker et al. [53] κατέδειξε χρησιμοποιώντας δύο κυτταρικές γραμμές καρκίνου ωοθηκών (επιθηλιακό OVCA433 και μεσεγχυματικά ΗΕΥ) ο εμπλουτισμός για έναν πληθυσμό κυττάρων με υψηλή έκφραση δεικτών CSC κατά της πρωτεΐνης όπως επίσης και mRNA επίπεδα μετά από θεραπεία με CIS, πακλιταξέλη και το συνδυασμό των δύο. Επιπλέον, αυτές οι ερευνητές έδειξαν αύξηση στην ογκογονικές ιδιότητες των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών σε απόκριση σε φάρμακα χημειοθεραπείας. Στην παρούσα μελέτη, δείχνουμε με κάποιο τρόπο σε συμφωνία με αυτές τις μελέτες [53] ότι ο αριθμός των ΚΕΠ αυξάνει στα ζώα που φέρουν ορθοτοπική όγκους των ωοθηκών που έλαβαν θεραπεία με CIS σε 6 mg /kg. Αυτή η αύξηση του πληθυσμού ΚΕΠ σε όγκους των ωοθηκών ποντικών με CIS μπορεί να εξηγήσει την ανάπτυξη της χημειο-αντίστασης και επανεμφάνιση του καρκίνου των ωοθηκών σε ασθενείς που έλαβαν θεραπεία με CIS ή παράγωγο καρβοπλατίνη του που χρησιμοποιήθηκε σε συνδυασμό με πακλιταξέλη.

Αύξηση του αριθμού των ΚΕΠ σε όγκους που έχουν εμβολιαστεί σε γυμνά ποντίκια που ακολουθείται από κατεργασία CIS είναι αποτέλεσμα της ενίσχυσης του ΚΕΠ παρούσα στο ανθρώπινο καρκίνο Α2780 κυτταρική γραμμή. Από άλλη πλευρά αναπτυσσόμενο όγκο θα προσελκύσει ξενιστή προερχόμενα φυσιολογικών αρχέγονων κυττάρων που θα παρέχουν στρώμα και αγγείωση για την επέκταση του ιστού του όγκου. Αυτά τα κύτταρα θα μπορούσαν να παρέχουν τροφικά σήματα για ΚΕΠ, και αυτή τη στιγμή διερευνάται στα εργαστήριά μας.

Κατά τα τελευταία χρόνια μια μεγάλη προσπάθεια έχει αφιερωθεί στην ανάπτυξη φαρμάκων που μπορεί να σκοτώσει τα καρκινικά κύτταρα, καθώς και τα ΚΕΠ, ώστε για τη μείωση της χημειο-αντίσταση και επανεμφάνιση του καρκίνου μετά τη θεραπεία. WFA όπως αναφέρθηκε εμφανίζει μια ανασταλτική δράση έναντι αρκετών διαφορετικών τύπων καρκινικών κυττάρων. Ωστόσο, η επίδρασή της στις ΚΕΠ δεν έχει διερευνηθεί μέχρι στιγμής. Σε προηγούμενη μελέτη μας [10], αποδείξαμε ότι WFA όταν χρησιμοποιούνται μόνα τους ή σε συνδυασμό με CIS αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και προκαλεί κυτταρικό θάνατο των δύο CIS-ευαίσθητα (Α2780 και Caov3), καθώς και CIS-ανθεκτική (Α2780 /CP70) κυτταρικές γραμμές . Στην παρούσα μελέτη παρακολούθησης μας δείχνουμε ότι WFA (2 mg /kg) όταν χρησιμοποιούνται μόνες ή σε συνδυασμό με CIS για τη θεραπεία ποντικούς που φέρουν ορθοτοπικό όγκο μειωμένη ανάπτυξη του όγκου των ωοθηκών με 70 έως 80% και εμπόδισε μετάσταση σε άλλα όργανα. Επιπλέον, η θεραπεία των ποντικών που φέρουν όγκους των ωοθηκών ορθοτοπική με WFA μόνη ή WFA + CIS εξαλειφθεί κύτταρα που εκφράζουν δείκτες CSC. (CD44, CD24, CD34, CD117 και Oct4). Σε αντίθεση, ο αριθμός των κυττάρων αυτών, όπως αναφέρονται ανωτέρω, αυξήθηκαν στα χέρια μας μετά από τη θεραπεία με CIS και μόνο. Έτσι, τα αποτελέσματα μας αποδεικνύουν σαφώς ότι ο συνδυασμός χαμηλής δόσης της WFA (2 mg /kg) με υποβέλτιστη δόση του CIS (6 mg /kg) είναι εξαιρετικά αποτελεσματική στην καταστολή της ανάπτυξης του όγκου και την εξάλειψη των υποτιθέμενων ΚΕΠ «διευρυμένη» με επεξεργασία CIS. Δεδομένου ότι, θεραπευτική δόση του ΤΣΠ είναι 8 mg /kg [19], WFA σε συνδυασμό με το CIS έχει τη δυνατότητα να είναι άκρως αποτελεσματική και αποτελεσματική θεραπεία για τον καρκίνο των ωοθηκών και μπορεί να βελτιώσει σχετίζονται με παρενέργειες CIS-θεραπεία.

Αυτο- ανανέωση, αντοχή φαρμάκου και διαφοροποίηση αποτελούν βασικά χαρακτηριστικά των ΚΕΠ και διάφορα αναπτυξιακά μονοπάτια όπως Sonic hedgehog (Shh), Notch, Wnt και ΤΟΡβ, Twist, και σαλιγκάρι που έχει αποδειχθεί ότι είναι κρίσιμη σε αυτές τις διαδικασίες [33], [59] – [67], [86]. WFA έχει αναφερθεί ότι αναστέλλει Notch 1 και κατάντη γονίδια σηματοδότησης (Hes1 και Hey1) [43], [77] που έχουν ενοχοποιηθεί στην έναρξη και την εξέλιξη [63] καρκίνου, [69], [70].

στη παρούσα μελέτη μας, δείχνουμε για πρώτη φορά πολύ σημαντική αναστολή της Notch 1 και κατάντη πρωτεΐνες σηματοδότησης του Hes1 και Hey1 σε όγκους που συλλέγονται από ζώα που υπέστησαν αγωγή με WFA (2 mg /kg) σε σύγκριση με τους όγκους από ψευδο-αγωγή ζώα. Αντίθετα, τα ζώα που έλαβαν θεραπεία με CIS (6 mg /kg) μόνο έδειξε σημαντική αύξηση στα επίπεδα του Notch 1, Hes1 και Hey1 γονίδια τα οποία είναι συνεπής με την αύξηση του αριθμού των ΚΕΠ, γεγονός που υποδηλώνει ένα σημαντικό ρόλο του Notch 1 οδού μεταγωγής στην ενίσχυση εκείνων κύτταρα.