Αφηρημένο

Παρά τη βέλτιστη ακτινοθεραπεία (RT), χημειοθεραπεία και /ή χειρουργική επέμβαση, η πλειοψηφία των ασθενών με τοπικά προχωρημένο μη μικροκυτταρικό καρκίνος του πνεύμονα (NSCLC) αποτύχει θεραπεία. Για τον εντοπισμό νέων στόχων γονίδιο για τη βελτίωση του ελέγχου του όγκου, πραγματοποιήσαμε ολόκληρο το γονιδίωμα RNAi οθόνες για τον εντοπισμό knockdowns που αυξάνουν πιο αναπαραγώγιμα NSCLC κυτταροτοξικότητα. Αυτές οι οθόνες εντοπίστηκαν αρκετές πρωτεασώματος υπομονάδες μεταξύ των κορυφαίων χτυπήματα, συμπεριλαμβανομένου του ανώτατου χτύπημα

PSMA1

, ένα συστατικό του πυρήνα 20 S πρωτεασώματος. αναστολή της ακτινοβολίας και πρωτεασώματος έδειξε συνεργικά αποτελέσματα. αναστολή πρωτεασώματος ως αποτέλεσμα μια μείωση 80-90% σε ομόλογο ανασυνδυασμό (HR), μείωση κατά 50% στην έκφραση του NF-κΒ-επαγώγιμων γονιδίων HR

BRCA1

και

FANCD2

, και μείωση του BRCA1, FANCD2 και RAD51 ιονίζουσα ακτινοβολία που προκαλείται από εστίες. ΙκΒα RNAi νοκ ντάουν διασωθεί NSCLC ραδιοαντοχή. Η ακτινοβόληση των ποντικών με NCI-H460 ξενομοσχεύματα μετά επαγώγιμων

PSMA1

shRNA νοκ ντάουν σημαντικά αυξημένη επιβίωση ποντικών σε σύγκριση με είτε τη θεραπεία μόνη της. η αναστολή του πρωτεασώματος είναι μια πολλά υποσχόμενη στρατηγική για NSCLC ραδιοευαισθητοποίηση μέσω αναστολής του NF-κΒ με τη μεσολάβηση έκφραση Αναιμία Fanconi /HR γονίδια επιδιόρθωσης του DNA

Παράθεση:. Cron KR, Zhu Κ, Kushwaha DS, Hsieh G, Merzon D, Rameseder J, et al. (2013) Επισκευή DNA αναστολείς πρωτεασώματος Block και ραδιοευαισθητοποιεί μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 8 (9): e73710. doi: 10.1371 /journal.pone.0073710

Επιμέλεια: Α Ρ Μ Ruhul Amin, Winship Cancer Institute του Πανεπιστημίου Emory, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 30 Απρ, 2013? Αποδεκτές: 19, Ιουλίου 2013? Δημοσιεύθηκε: 5 Σεπτέμβρη του 2013

Copyright: © 2013 Cron et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα υποστηρίχθηκε από την αμερικανική Εταιρεία Ακτινοθεραπευτικής Ογκολογίας (ASTRO) Τζούνιορ Σχολή Καριέρα Βραβείο Έρευνας Εκπαίδευσης, ένα Κοινό Κέντρο Ακτινοθεραπευτικής θεραπεία Ίδρυμα Grant, ένας Dana-Farber /Harvard Cancer Center SPORE Αναπτυξιακή Βραβείο Έρευνας Έργο του πνεύμονα Cancer Research, και το National Cancer Ινστιτούτο των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας στο πλαίσιο Βραβείο Αριθμός K08CA172354. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η ακτινοθεραπεία (RT) είναι ένα κρίσιμο τροπικότητα στη θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα. Είναι ιδιαίτερα αποτελεσματικό όταν νόσος είναι εντοπισμένη, και θεραπευτική δόσεις μπορούν να χορηγηθούν με ασφάλεια. Για παράδειγμα, Στάδιο Ι μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) μπορεί να αντιμετωπιστεί με αρκετά υψηλές δόσεις ιονίζουσας ακτινοβολίας (IR) για να αποδώσει 3 ετών τοπικά ποσοστά ελέγχου γύρω από το 90% [1]. Αυτό οφείλεται στα υψηλά βιολογικά αποτελεσματικές δόσεις (κρεβατάκι) που μπορούν να χορηγηθούν σε απομονωμένη όγκων του πνεύμονα χρησιμοποιώντας στερεοτακτική ακτινοθεραπεία σώματος σε μεγάλο βαθμό. Δυστυχώς, μόνο το 15% των ασθενών παρουσιάζουν με τέτοιους όγκους [2]. Πιο προχωρημένους όγκους, τα οποία είναι σημαντικά πιο κοινά, δεν μπορεί να αντιμετωπίζεται σε υψηλότερες κρεβάτι, λόγω της διείσδυσης, ή κοντά σε, ακτινοευαίσθητα δομές συμπεριλαμβανομένων των πνευμόνων, του νωτιαίου μυελού, του οισοφάγου και της καρδιάς [3]. Ο περιορισμός αυτός αντιπροσωπεύει τα υψηλότερα τοπικά ποσοστά αποτυχίας της τάξης του 30% [4]. Κατά συνέπεια, οι συστημικές παράγοντες χορηγούνται για την ενίσχυση της απόκρισης ακτινοβολία. Τέτοιοι παράγοντες περιλαμβάνουν κυτταροτοξικά χημειοθεραπευτικά που οι ίδιες έχουν σημαντικές τοξικότητες περιορισμού δόσεως και περιορισμένα αποτελέσματα σχετικά με τον έλεγχο του όγκου. Μόνο μια μειοψηφία των όγκων παρουσιάζουν τα γενετικά χαρακτηριστικά, όπως EGFR μεταλλάξεις ενεργοποίησης [5] ή EML4-ALK μεταθέσεις [6], που επιτρέπουν για στοχευμένες θεραπείες? Οι πρόσθετες επιλογές χρειάζονται.

έχουν

Αρκετές μελέτες γονιδιώματος σε επίπεδο ολοκληρώθηκε σε NSCLC, συμπεριλαμβανομένης της αλληλουχίας του DNA [7], αριθμός αντιγράφων ανάλυση [8] και γονιδιακή έκφραση προφίλ [9]. Οι μελέτες αυτές προσέφεραν μια αμερόληπτη αναγνώριση από τις πιο συχνές και σημαντικές γενετικές και επιγενετικές μεταβολές μεταξύ των 20-25.000 γονίδια του ανθρώπινου γονιδιώματος [10]. Αποκάλυψαν ενδιαφέρουσες ενώσεις μεταξύ γονιδίων και κλινικές συμπαράγοντες, αλλά δεν ήταν σε θέση να αποδείξουν άμεσα τις σχέσεις αιτίου-αποτελέσματος μεταξύ μετατροπές και θεραπευτικά αποτελέσματα. Σε αντίθεση, παρεμβολή RNA (RNAi) μπορούν να αποδείξουν άμεσα τα αποτελέσματα της μειωμένης έκφρασης του γονιδίου στο κύτταρο φυσιολογία και την επιβίωση [11].

Συγκεντρωτικά μικρή φουρκέτα RNA (shRNA) οθόνες, όπου τα καρκινικά κύτταρα εκτίθενται σε αρκετές χιλιάδες διαφορετικές αλληλουχίες shRNA, κατά μέσο όρο ένα νοκ ντάουν γονιδίου ανά κύτταρο, έχουν πολλά δυνατά χαρακτηριστικά. Πρώτον, η επίδραση των σταθερών knockdown shRNA διάρκεια αρκετών διπλασιασμούς κυττάρου μπορεί να διερευνηθεί, σε σύγκριση με παροδική διαμόλυνση μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) αλληλουχιών με βραχύβια αποτελέσματα. Κατά συνέπεια, οι θεραπείες shRNA μιμείται έκφραση φάρμακο που συνήθως δίνεται κατά τη διάρκεια αρκετών εβδομάδων παρά ημέρα. Επίσης, κύτταρα που φιλοξενούν διαφορετικές αλληλουχίες shRNA ανταγωνίζονται αποτελεσματικά μεταξύ τους μέσα στην πισίνα, καθώς πολλαπλασιάζονται, δημιουργώντας επιτυχίες που αποφέρουν πιο έντονες επιδράσεις στον πολλαπλασιασμό [12].

Επειδή η ακτινοθεραπεία είναι ο στυλοβάτης της θεραπείας NSCLC, η γονιδιακή silencings που οδηγούν σε συνεργιστική κυτταροτοξικότητα όταν συνδυάζονται με ιοντίζουσα ακτινοβολία (IR) είναι επιθυμητές. Πολλές θεραπείες για τον καρκίνο είναι προσθετικές στη φύση, και συνδυάζονται επειδή οδηγούν σε απόκλιση προφίλ παρενεργειών [13]. Synergistic θεραπείες που έχουν ως αποτέλεσμα μεγαλύτερες επιδράσεις όταν χορηγούνται ταυτόχρονα, σε σύγκριση με τα προσθετικά αποτελέσματα κάθε αγωγής δίνονται ξεχωριστά, μπορεί να είναι ιδιαίτερα χρήσιμοι ως ραδιοευαισθητοποιητές, από την παράδοση RT μπορεί να περιορίζεται σε ένα περιορισμένο όγκο, και οι παρενέργειες μπορεί να είναι λιγότερο έντονη εκτός ακτινοβολημένα όγκου.

Επίδειξη του μηχανισμού της ραδιοευαισθητοποίησης shRNA μπορεί επίσης να αποκαλύψει βιοδείκτες για την επιλογή των ασθενών και την αξιολόγηση της θεραπείας. DNA διπλής διαλείμματα σκέλος (DSBs) είναι μεταξύ των αποτελεσμάτων της IR που συσχετίζονται καλύτερα με κυτταροτοξικότητα της. Μια ενιαία επιδιορθώθηκε DSB είναι αρκετή για να οδηγήσει σε αναπαραγωγική κυτταρικό θάνατο μέσω G2 σύλληψη ή μιτωτική καταστροφή [14]. DSBs Οι κυρίως επισκευαστεί μέσω δύο οδών, ομόλογο ανασυνδυασμό (HR) και μη-ομόλογες άκρο συναρμογής (NHEJ) [15]. silencings γονίδιο ή μικρών μορίων αναστολέων του κάθε μονοπατιού μπορεί να προωθήσει ραδιοευαισθητοποίηση.

Εδώ εξετάζουμε την αναστολή πρωτεασώματος ως μια στρατηγική για NSCLC ραδιοευαισθητοποίηση μέσω αναστολής της επιδιόρθωσης του DNA DSB. αναστολή του πρωτεασώματος έχει διερευνηθεί σε πολλαπλές κλινικές μελέτες εντάχθηκαν ασθενείς με ΜΜΚΠ, με ποικίλα αποτελέσματα. Για παράδειγμα, μια μελέτη Φάσης ΙΙ των 114 ασθενών που έλαβαν θεραπεία με βορτεζομίμπη συν γεμσιταβίνη και καρβοπλατίνη ως θεραπεία πρώτης γραμμής του προχωρημένου NSCLC, παρουσίασαν ποσοστό ανταπόκρισης 23% και ένα ποσοστό ελέγχου της νόσου (ανταποκρίσεις + σταθερή νόσος) του 68%, που δικαιολογούν έτσι περαιτέρω μελέτες [16]. Βορτεζομίμπη δεν έδειξε δραστηριότητα ως μονοθεραπεία σε μια μελέτη Φάσης ΙΙ από τους 14 ασθενείς, κανένας από τους οποίους έδειξαν αντικειμενικές ανταποκρίσεις, και τρεις (21%) είχαν σταθερή νόσο που διαρκεί 3.4 έως 11.5 μήνες [17]. Με βάση τα δεδομένα μας, προτείνουμε ότι οι αναστολείς πρωτεασώματος μπορεί να είναι χρήσιμες σαν ραδιοευαισθητοποιητές, δεδομένης κατασταλτικά αποτελέσματά τους στην ΝΡ-κΒ διαμεσολαβούμενη έκφραση γονιδίων που απαιτούνται για την οδό HR.

Αποτελέσματα

Πολλαπλές Proteasome τα γονίδια είναι Top Hits στον NSCLC ολόκληρη Οθόνες γονιδιώματος RNAi

Μια ολόκληρη την οθόνη του γονιδιώματος shRNA διεξήχθη σε δύο κυτταρικές σειρές NSCLC, Α549 και NCI-Η460. Αυτές οι γραμμές μοιράζονται κοινά γενετικά χαρακτηριστικά, συμπεριλαμβανομένων των μεταλλάξεων στο

KRAS

και

STK11

(aka LKB1). Αυτές οι μεταλλάξεις που βρέθηκαν σε όγκους που είναι ιδιαίτερα επιθετική και ανθεκτικό σε θεραπεία, και για τα οποία στοχευμένες θεραπείες είναι διαθέσιμες [18], [19]. Οι κυτταρικές γραμμές είναι άγριου τύπου σε

ΤΡ53

και ως εκ τούτου είναι λιγότερο πιθανό, σε σύγκριση με μεταλλαγμένες γραμμές, να επιδεικνύουν γενωμική αστάθεια κατά τη διάρκεια μιας οθόνης που εκτείνονται πολλαπλάσιο εβδομάδα [20]. Επίσης, η γενετική ομοιότητα τους, από την άποψη των βασικών ογκογόνων και όγκου γονίδια καταστολής, αυξάνει την πιθανότητα ότι οθόνη χτυπήματα σε μία γραμμή θα αναπαραχθεί στην άλλη (Πίνακας S1).

Η βιβλιοθήκη Hannon-Elledge περιέχει 74.705 διακριτές shRNA αλληλουχίες και τους στόχους σχεδόν 18.000 γονίδια [21]. Μετά από μεταγωγή με αυτήν τη βιβλιοθήκη και επιλογή πουρομυκίνης για σταθερές ενσωματώσεις, τα κύτταρα ανακαλλιεργήθηκαν και η σχετική αντιπροσώπευση του κάθε αλληλουχίας εντός μιας ομάδας προσδιορίστηκε πριν και μετά από δώδεκα διπλασιασμούς πληθυσμού. ShRNA αλληλουχίες που κατευθύνονται έναντι γονιδίων απαραίτητα για τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό επιλεκτικά χαθεί. 1667 γονίδια ήταν οι στόχοι της τουλάχιστον μίας αλληλουχίας shRNA οποίων η αφθονία μειωθεί τουλάχιστον δύο φορές κατά τη διάρκεια της διόδου στις δύο κυτταρικές σειρές (Πίνακας S2). Πολλαπλές υπομονάδες πρωτεασώματος αριθμούνται μεταξύ των χτυπήματα στις δύο κυτταρικές σειρές, συμπεριλαμβανομένων κορυφή hit

PSMA1

, μία υπομονάδα του πυρήνος 20 S πρωτεασώματος [22] (Σχ. 1 και Πίνακας S3).

διάγραμμα του 26 S πρωτεασώματος παρουσιάζει πολλαπλές οθόνη ολόκληρο το γονιδίωμα shRNA χτυπά με τον ακόλουθο κώδικα χρώματος: top hit (κόκκινο), ισχυρό χτύπημα (& gt? 1 shRNA ακολουθία ανά γονίδιο στις δύο κυτταρικές σειρές, σκούρο πορτοκαλί), τα ανήλικα χτύπημα (1 shRNA ακολουθία ανά γονίδιο στις δύο κυτταρικές σειρές, ανοιχτό πορτοκαλί), τύπου χυμοθρυψίνης πρωτεολυτική καταλυτική θέση (όχι ένα χτύπημα, αλλά τονίζεται για επεξηγηματικούς σκοπούς, πράσινο). Κάθε χτύπημα που σημαίνονται με τη χρήση των τελευταίων δύο αλφαριθμητικών χαρακτήρων της ονοματολογίας HUGO του γονιδίου? π.χ., Α1 = PSMA1, B5 = PSMB5, ​​Μ1 = SHFM1.

Η

αναστολέων πρωτεασώματος ευαισθητοποιήσει NSCLC κυττάρων στην ακτινοβολία

Η δοξυκυκλίνη επαγόμενο shRNA νοκ ντάουν του

PSMA1

σε Α549 και ΝΟΙ-Η460 είχε σαν αποτέλεσμα απώλεια πρωτεΐνης έκφραση τόσο PSMA1 και PSMB5, ​​μια άλλη υπομονάδα του πυρήνος 20 S πρωτεασώματος και η καταλυτική θέση του τύπου χυμοτρυψίνης (CTL) δραστηριότητα του πρωτεασώματος [22] (Σχ. 2Α). Αυτό το αποτέλεσμα επιβεβαιώνει τον ουσιαστικό ρόλο του

PSMA1

σε 20 συναρμολόγηση πρωτεασώματος S. Η θεραπεία με το μικρό μόριο πρωτεασώματος bortezomib αναστολέα ή

PSMA1

shRNA knockdown προκάλεσε απώλεια της δραστικότητας CTL (Σχ. 2Β).

(Α) Western blot που δείχνει τα επίπεδα πρωτεΐνης του PSMA1 και PSMB5 σε Α549 και τα κύτταρα NCI-H460 NSCLC μετά

PSMA1

shRNA νοκ ντάουν σε σύγκριση με τον έλεγχο μη φίμωση shRNA. (Β) χυμοθρυψίνης δοκιμασία δραστικότητας (CTL) πρωτεασώματος σε Α549 (αριστερά) και τα κύτταρα NCI-H460 (δεξιά) NSCLC μετά τη θεραπεία με bortezomib, ή

PSMA1

siRNA knockdown. Όλα τα αποτελέσματα είναι μέσες ± SEM και ομαλοποιήθηκε ως προς τον έλεγχο του οχήματος DMSO. (C) ποσοτικός προσδιορισμός Κλωνογόνος επιβίωση των Α549 (αριστερά) και ΝΟΙ-Η460 (δεξιά) μετά από IR και bortezomib. Σηματοδότησε μπάρες δείχνουν το ποσοστό θανάτωσης των δειγμάτων bortezomib σε σύγκριση με το έλεγχο του οχήματος DMSO σε κάθε δόση IR. Όλα τα αποτελέσματα είναι μέσες ± SEM και ομαλοποιήθηκε ως προς τον έλεγχο του οχήματος DMSO. δοκιμασία ανίχνευσης (D) Απόπτωση του ΝΟΙ-Η460 ακόλουθες 2 και 4 Gy IR και 50 ηΜ bortezomib. Bars δείχνουν ποσοστό κυττάρων σε πρώιμη απόπτωση (αριστερά) ή αργά απόπτωση (δεξιά) μέσω Annexin V και χρώση με ιωδιούχο propidum, αντίστοιχα. Όλα τα αποτελέσματα είναι μέση τιμή ± SD και Ρ τιμές υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας το

t

μια δοκιμασία two-tailed του Student.

Η

Η βορτεζομίμπη είναι ένας ενεργός παράγοντας

in vitro

σε NSCLC γραμμές, συμπεριλαμβανομένων των Α549 [23] και ΝΟΙ-Η460 [24], και έχει αποδειχθεί στο παρελθόν ραδιοευαισθητοποίησης ιδιότητες σε προκλινικές μελέτες [25]. Η ικανότητα των αναστολέων πρωτεασώματος για να αυξήσει τις επιδράσεις της ακτινοθεραπείας, μια κλινική μέθοδος παροχής ημερήσιας ακτινοβολίας σε μικρές δόσεις για την ελαχιστοποίηση της μακροχρόνιας τοξικότητας [26], κατά συνέπεια, να διερευνηθούν. Bortezomib και κλασματοποιημένη ακτινοβολία απέδωσε συνεργιστικές επιδράσεις (Σχ. 2C). Synergy παρατηρήθηκε επίσης με ακτινοβολία μίας δόσης (Εικ. S1), αν και το αποτέλεσμα με κλασματοποιημένη ακτινοβολία είναι περισσότερο κλινικά σχετικό. Αυτή η συνεργιστική επίδραση επί του κυτταρικού θανάτου διαμεσολαβήθηκε τουλάχιστον εν μέρει από απόπτωση? 2 Gy IR μόνο του δεν διεγείρει απόπτωση, ενώ ο συνδυασμός των IR και bortezomib επάγεται σημαντικά αυξημένη απόπτωση σε σύγκριση με είτε θεραπεία μόνο (Σχ. 2D).

επισκευής DNA διπλής έλικος Break Proteasome Αναστολή εξασθενεί την ακτινοβολία που προκαλείται μειώνοντας ο ομόλογος ανασυνδυασμός

Δεδομένης της συνέργειας μεταξύ αναστολή του πρωτεασώματος και της ακτινοβολίας, εμείς επόμενο καθοριστεί αν οι αναστολείς πρωτεασώματος επηρεάζουν το DNA διπλής διαλείμματα που προκαλείται από ακτινοβολία σκέλος (DSBs) [26] (Σχήμα 3). Σε ουδέτερο κομήτη προσδιορισμούς, τα κύτταρα NSCLC επισκευαστεί η συντριπτική πλειοψηφία του DNA DSBs που δημιουργούνται από υψηλή δόση ακτινοβολίας εντός μιας ώρας. Αντίθετα, η θεραπεία bortezomib πριν από ακτινοβολία καθυστέρησε σημαντικά την επιδιόρθωση του DNA DSBs τουλάχιστον μέχρι και 8 ώρες μετά την ακτινοβόληση (Σχ. 3Α-Β). Αυτή η επιμονή του DSBs μπορεί να οδηγήσει σε αυξημένη καταστροφή μιτωτικό [27], η οποία πιστεύεται ότι είναι η κυρίαρχη αιτία του κυτταρικού θανάτου σε ακτινοβολημένα στερεές κακοήθειες.

(Α) Απεικόνιση ενός ουδέτερου κομήτη δοκιμασία δείχνει IR επάγεται DNA DSB σε κύτταρα ΝΟΙ-Η460 1, 4 και 8 ώρες μετά από 40 Gy IR και προ-επεξεργασία με 50 ηΜ bortezomib σε σύγκριση με τον έλεγχο φορέα DMSO. (Β) Ποσοτικοποίηση του ουδέτερου κομήτη δοκιμασία μέσω στιγμή ελιάς (αριστερά) και% DNA σε ουρά (δεξιά) σε 1, 4 και 8 ώρες μετά την 40 Gy IR με και χωρίς 50 ηΜ bortezomib σε κύτταρα ΝΟΙ-Η460. Κάθε σημείο δεδομένων αντιπροσωπεύει το 3 ανεξάρτητα πειράματα αντιγραφή της τουλάχιστον 50 κύτταρα. Όλα τα αποτελέσματα είναι μέσες ± SD και οι τιμές ρ υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας

t

δοκιμή δύο ουρών Student. (Β) δοκιμασία αναφοράς GFP για ομόλογο ανασυνδυασμό μετά την αναστολή του πρωτεασώματος για 24 ώρες μέσω βορτεζομίμπη ή

PSMA1

siRNA νοκ ντάουν στον Α549 (αριστερά) και ΝΟΙ-Η460 (δεξιά). Όλα τα αποτελέσματα είναι μέσες ± SD και ομαλοποιήθηκε ως προς τον έλεγχο φορέα DMSO (Veh) ή nonsilencing ελέγχου siRNA. Ρ τιμές υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας το

t

μια δοκιμασία two-tailed του Student.

Η

Για να παρατηρήσουμε τα αποτελέσματα της βορτεζομίμπης ή RNAi νοκ ντάουν του

PSMA1

για την επιδιόρθωση του DNA, ένα GFP κατασκευή αναφοράς για HR [28] εισήχθη στο Α549 και ΝΟΙ-Η460 κύτταρα. Σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα, εκείνους που έλαβαν είτε με βορτεζομίμπη ή

PSMA1

siRNA έδειξε μία στατιστικά σημαντική μείωση στο HR-μεσολάβηση επισκευή Ι

Sce

Ι-επαγόμενη DSBs DNA (Σχ. 3C). Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν για NHEJ (Εικ. S2). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν μια άμεση επίδραση της αναστολής πρωτεασώματος σχετικά με τους μηχανισμούς επιδιόρθωσης του DNA DSB, σύμφωνα με προηγούμενες μελέτες [29] – [31].

Για να κατανοήσουμε το μηχανισμό της αναστολής ΥΕ, διερευνήσαμε την επίδραση της βορτεζομίμπης στην σχηματισμό πυρηνική επίκεντρο των βασικών πρωτεϊνών στο Fanconi αναιμία (FA) οδός /ΥΕ. IR επαγόμενη σχηματισμός πυρηνικών εστίαση RAD51, η οποία είναι ένας βιοδείκτης για HR [32], ήταν σημαντικά μειωμένη με bortezomib ή

PSMA1

RNAi (Σχ. 4Α, Σχ. S3-S4). έκφραση της πρωτεΐνης FANCD2 και το σχηματισμό FANCD2 εστίαση IR-επαγόμενη ομοίως μειώθηκαν κατά βορτεζομίμπη ή

PSMA1

RNAi (Σχ. 4Β, Σχ. S3-S4). Τέλος, ο σχηματισμός BRCA1 εστίαση IR-επαγόμενη μειώθηκε σημαντικά από τη βορτεζομίμπη ή

PSMA1

RNAi (Σχ. 4C, Εικ. S3-S4). Στο σύνολό τους, τα στοιχεία αυτά δείχνουν ότι η αναστολή του πρωτεασώματος μπορεί να επηρεάσουν HR-μεσολάβηση επισκευή IR που προκαλείται DSBs DNA, μειώνοντας τη διαθεσιμότητα ή την πρόσληψη των βασικών πρωτεϊνών /ΥΕ FA να βλάψει sites.

(Α) Μετά από βορτεζομίμπη × 24 ώρες ή

PSMA1

νοκ ντάουν × 72 ώρες, Α549 ή κύτταρα NCI-H460 είχαν ακτινοβοληθεί συνέχεια σταθεροποιήθηκαν μετά από 6 ώρες. εστίες RAD51 ανιχνεύθηκαν με ανοσοφθορισμό. Κύτταρα με ≥5 εστίες βαθμολογήθηκαν ως θετικές (n & gt? 100). Όλα τα αποτελέσματα είναι μέσες ± SEM. Οι τιμές Ρ υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας δοκιμή t δύο ουρών Student. Φωτογραφίες δείχνουν αντιπροσωπευτικές εικόνες για NCI-H460 αγωγή με bortezomib, bar = 10 μm. (Β) Όπως στο (Α), αλλά για FANCD2, συμπεριλαμβανομένων κηλίδα Western και ανοσοφθορισμό. (Γ) Όπως στο (Α), αλλά και για το BRCA1.

Η

Proteasome Αναστολή Μπλοκ NF-κΒ επαγόμενη έκφραση του Fanconi αναιμία /Γονίδια ομόλογο ανασυνδυασμό

Είμαστε δίπλα διερευνηθεί η σχέση μεταξύ του πρωτεασώματος αναστολή και ο /ΥΕ οδός FA μέσω NF-κΒ σηματοδότηση. Dalton και οι συνεργάτες του [33] στο παρελθόν έδειξαν ότι η βορτεζομίμπη μειώνει την έκφραση του γονιδίου FA /BRCA σε πολλαπλά κύτταρα μυελώματος, και ότι η NF-κΒ ρυθμίζει προς τα πάνω μεταγραφικά την οδό /BRCA FA. Για παράδειγμα, ο ΝΡ-κΒ προσδένεται απευθείας στον προαγωγό του

FANCD2

, με βάση τη δοκιμασία μετατόπισης ηλεκτροφορητικής κινητικότητας (EMSA) (εικ. 5Α). Ένας μηχανισμός με τον οποίο bortezomib ρυθμίζει προς τα κάτω την οδό ΝΡ-κΒ είναι μέσω της αναστολής του πρωτεασώματος μεσολάβηση αποικοδόμηση του ΙκΒα [34]. ΙκΒα, το οποίο απομονώνει ΝΡ-κΒ στο κυτταρόπλασμα, και φωσφορυλίωση ΙκΒα από τον αναστολέα του ΝΡ-κΒ κινάσες (IKKS) απελευθερώνει ΝΡ-κΒ, επιτρέποντας την είσοδο της στον πυρήνα [35]. Bortezomib ρυθμίζει προς τα κάτω και το μονοπάτι ΝΡ-κΒ επάγοντας πυρηνική μετατόπιση του ΙκΒα, με αποτέλεσμα την καταστολή του ΝΡ-κΒ ρ65 /50-εξαρτώμενης μεταγραφής [36].

(Α) Διάγραμμα της υποκινητές ΝΡ-κΒ στο

FANCD2

και

BRCA1

γονίδια. (Β) Έκφραση από qPCR του

FANCD2

μετά την αναστολή του πρωτεασώματος ± 30 nM (Α549) ή 50 nM (NCI-Η460) βορτεζομίμπη ή ± επαγώγιμων

PSMA1

shRNA, και ± 10 Gy IR. Όλες οι τιμές κανονικοποιούνται προς ACTB και όλα τα αποτελέσματα είναι μέσες ± SEM. (C) Όπως στο (Β), αλλά με BRCA1. (Δ) η επιβίωση των κυττάρων NSCLC μετά από βορτεζομίμπη και IR μερικώς διασωθεί από

IkBα

siRNA νοκ ντάουν όταν γίνεται εκ των προτέρων. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα ΑΤΡ φωταύγεια που βασίζεται δοκιμασία μέτρησης της σχετικής φωταύγειας μονάδες (RLU). Όλα τα αποτελέσματα είναι μέσος όρος ± SEM.

Η

Για το λόγο αυτό ζητείται να προσδιοριστεί αν η IR-επαγόμενη μεταγραφή των γονιδίων /ΥΕ FA

FANCD2

και

BRCA1

μειώνεται από αναστολή του πρωτεασώματος. Η μεταγραφή του

FANCD2

και

BRCA1

αυξήθηκε μέσα σε 30 λεπτά της ακτινοβολίας, και ουσιαστικά αποκλειστεί από κάθε βορτεζομίμπη ή

PSMA1

RNAi (Σχ. 5Β-C). Αυτό το σύντομο χρονικό διάστημα θα μπορούσαν να ευθύνονται για τη βραχυπρόθεσμη επίδραση στην επιδιόρθωση DSB που παρατηρήθηκε στην κομήτη δοκιμασία. Για τη δημιουργία της αιτιότητας, πραγματοποιήσαμε ένα πείραμα διάσωσης σε κύτταρα NSCLC προεπεξεργασία με ΙκΒα siRNA. Τα κύτταρα στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε πρωτεασώματος αναστολή και την ακτινοβόληση. IkBa νοκ ντάουν διασωθεί ραδιοαντοχή και κυτταρική επιβίωση των κυττάρων bortezomib αγωγή (Σχ. 5D). Αυτά τα δεδομένα αποδεικνύουν ένα ρόλο για τους αναστολείς πρωτεασώματος ως ραδιοευαισθητοποιητές, μέσω του αποκλεισμού του NF-κΒ που προκαλείται από την έκφραση των γονιδίων /ΥΕ FA (Εικ. 6).

Proteasome αναστολή από βορτεζομίμπη ή

PSMA1

νοκ ντάουν αποτελέσματα σε αύξηση ΙκΒα, η οποία με τη σειρά της μειώνει την NF-κΒ σύνδεση με τους φορείς των γονιδίων /ΥΕ FA συμπεριλαμβανομένων των

FANCD2

και

BRCA1

. Αυτό μειώνει τη διαθεσιμότητα αυτών των πρωτεϊνών επιδιόρθωσης του DNA για την πρόσληψη στις περιοχές βλάβη στο DNA, με αποτέλεσμα την μειωμένη σχηματισμό εστίαση RAD51 και ΥΕ μετά την επαγωγή του DNA διπλής διαλείμματα σκέλος από την ιονίζουσα ακτινοβολία.

Η

Συνδυασμός Proteasome Αναστολή και Ακτινοβολία ενισχύει

όγκων Ελέγχου

Είμαστε δίπλα φρόντισε να διαπιστώσει αν η αναστολή του πρωτεασώματος μπορεί να είναι μια χρήσιμη στρατηγική

in vivo

. Κακή διείσδυση της βορτεζομίμπης σε όγκους μπορεί να περιορίσει την αποτελεσματικότητά του σε στερεές κακοήθειες [37]. Ως εκ τούτου, δοκιμάζονται αν επαγώγιμων

PSMA1

RNAi νοκ ντάουν ενισχύει τον έλεγχο των ξενομοσχευμάτων αντιμετωπίζονται με κλασματοποιημένη ακτινοθεραπεία (RT).

Για τη χορήγηση κλασματοποιημένα RT, χρησιμοποιήσαμε μια πλατφόρμα έρευνας μικρή ακτινοβολία των ζώων (SARRP) που μπορεί να παραδώσει CT-καθοδηγούμενη σύμμορφη RT σε όγκους σε ποντίκια [38], [39]. Η πλατφόρμα αυτή εξασφαλίζει την πλήρη θεραπεία του όγκου, ελαχιστοποιώντας ταυτόχρονα την ακτινοβόληση των αμέτοχη ιστών. Θα διευκόλυνε επίσης ογκομετρική αξιολογήσεις της ανάπτυξης του όγκου και εν μέρει συσχετίζεται (r = 0.61), με μετρήσεις της εσωτερικής διαμέτρου (Εικ. 7Α-Β).

10

6 κύτταρα NCI-H460 επιμολυσμένα με δοξυκυκλίνη επαγόμενο

PSMA1

shRNA εγχύθηκαν στα πλευρά του 6-8 εβδομάδων NCr γυμνά ποντίκια. Μόλις όγκοι έφτασαν διάμετρο 3 mm (ημέρα 0),

PSMA1

knockdown ξεκίνησε με δοξυκυκλίνη πόσιμο νερό. Μία εβδομάδα αργότερα, η RT άρχισε να δώσει συνολικά πέντε 4 κλάσματα Gy κάθε άλλη ημέρα χρησιμοποιώντας μία πλατφόρμα έρευνας μικρή ακτινοβολία των ζώων (SARR). (Α) Ορθογώνια εικόνες από μια δέσμη κώνο αξονική τομογραφία (CT), που λαμβάνεται με τη χρήση της SARRP, ενός ποντικού που φέρει υποδόρια ξενομοσχεύματος. (Β) Συσχέτιση των μετρήσεων ογκομετρική όγκου χρησιμοποιώντας την ακτίνα SARRP κώνο CT σε σύγκριση με τις παραδοσιακές δαγκάνες. (C) σχήμα Θεραπεία. (Δ) Οι ποντικοί στη συνέχεια ακολούθησε έως ότου οι όγκοι έφθασαν διαμέτρου 2 cm, τα ζώα έγιναν ετοιμοθάνατα ή για 100 ημέρες. (Ε) Kaplan-Meier αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με ζεύγη τεστ log-rank να αξιολογήσει τις διαφορές στην επιβίωση. Οι αριθμοί που επιβίωσαν από τα 10 ποντίκια ανά ομάδα την ημέρα 100 αναφέρεται σε παρένθεση. Για RT εναντίον RT +

PSMA1

νοκ ντάουν, log rank

P = 0,0003

.

Η

Στα ποντίκια εμφυτεύτηκαν κύτταρα NCI-H460 υποθάλπουν ένα δοξυκυκλίνη επαγόμενο

PSMA1

κατασκεύασμα shRNA. Μία εβδομάδα μετά την έναρξη της

PSMA1

knockdown, οι όγκοι ακτινοβολήθηκαν σε μία δόση των 20 Gy σε πέντε κλάσματα. Μετά θεραπείες RT,

PSMA1

νοκ ντάουν διακόπηκε, και τα ποντίκια παρακολουθήθηκαν για έως και 100 ημέρες μετά το σχηματισμό όγκων (Σχ. 7C). Ανεπεξέργαστα ποντικοί έδειξαν ταχεία ανάπτυξη των όγκων. Ποντίκια που έλαβαν θεραπεία είτε με RT ή επαγόμενου

PSMA1

νοκ ντάουν σε καρκινικά κύτταρα έδειξαν επίσης προοδευτική ανάπτυξη του όγκου και την κακή επιβίωση. Ποντίκια που έλαβαν θεραπεία ταυτόχρονα με τις δύο θεραπείες, ωστόσο έδειξε ελάχιστη έως καθόλου ανάπτυξη ξενομοσχεύματος και% επιβίωση 100 (Σχ. 7D-Ε). σχηματισμό FANCD2 εστίαση IR-επαγόμενη μειώθηκε επίσης σε δείγματα όγκων δείχνει επαγώγιμων

PSMA1

νοκ ντάουν (Εικ. 8Α). Η μείωση αυτών των εστιών μπορεί να χρησιμεύσει στο μέλλον ως βιοδείκτη για τη μείωση του IR-επαγόμενη ενεργοποίηση της FA οδού /ΥΕ μετά την αναστολή του πρωτεασώματος. Σημαντικά αυξημένες IR επαγόμενη γ-H2AX εστίες σε δείγματα όγκων συνεχίστηκε σε 1, 6, και 24 ώρες με

PSMA1

knockdown σύγκριση με τον έλεγχο, δείχνοντας καθυστέρηση επιδιόρθωσης του DNA DSB. (Εικ. 8Β-C).

(Α) FANCD2 ανοσοφθορισμού σε 10 Gy ακτινοβολούνται εναντίον μη ακτινοβολημένα NCI-H460 ξενομοσχευμάτων ανακτήθηκαν από τα ποντίκια με ή χωρίς δοξυκυκλίνη που προκαλείται

PSMA1

έκφραση shRNA στον όγκο κύτταρα. Bar = 10 μm. (Β) ανοσοϊστοχημεία γ-Η2ΑΧ σε όγκους ξενομοσχεύματος NCI-Η460 με ή χωρίς δοξυκυκλίνη επαγόμενη

PSMA1

shRNA knockdown, ανακτώνται από ποντικούς 1, 6 και 24 ώρες μετά από 10 Gy ακτινοβολία. Bar = 10 μm. (Γ) Ποσοτικοποίηση της ανοσοϊστοχημείας για γ-Η2ΑΧ στο (Β). Κύτταρα με ≥5 εστίες βαθμολογήθηκαν ως θετικές (n & gt? 400 κύτταρα). Όλα τα αποτελέσματα είναι μέσες ± SEM. Ρ τιμές υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας t δοκιμασία ενός two-tailed του Student.

Η

Τα δραματικά αποτελέσματα που παρατηρήθηκαν με το

PSMA1

νοκ ντάουν είναι σε αντίθεση με αυτά που παρατηρήθηκαν στο παρελθόν με βορτεζομίμπη

in vivo

, συμπεριλαμβανομένων των γενετικά μοντέλα ποντικών (GEMMs) του αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα [40]. Λαμβάνοντας υπόψη τα αποτελέσματα με

PSMA1

νοκ ντάουν, η ικανότητα της βορτεζομίμπης να ραδιοευαισθητοποιεί NCI-Η460 ξενομοσχεύματα εξετάστηκε για να διαπιστωθεί αν μπορεί να υπάρξει μεγαλύτερη ογκοκατασταλτικό αποτέλεσμα με αυτό της θεραπείας συνδυασμού. Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στην επιβίωση των ποντικών που έλαβαν θεραπεία με ακτινοθεραπεία με ή χωρίς bortezomib (Σχήμα S5). Για να καθοριστεί εάν αυτό οφειλόταν στην κακή διείσδυση φαρμάκου όγκου, χυμοθρυψίνης ενεργότητα του πρωτεασώματος εξετάστηκε σε όγκους που έλαβαν θεραπεία με ή χωρίς bortezomib σε σύγκριση με τους όγκους, με ή χωρίς PSMA1 knockdown. Υπήρχε πολύ πιο πρωτεασώματος αναστολή ακόλουθα PSMA1 νοκ ντάουν σε σύγκριση με εκείνη μετά από βορτεζομίμπη (Σχήμα S6). Αυτό υποδηλώνει ότι η περιορισμένη αποτελεσματικότητα που παρατηρείται με βορτεζομίμπη

in vivo

μπορεί να σχετίζεται με φτωχή διείσδυση του φαρμάκου όγκου, η οποία θα μπορούσε να εξηγήσει τις διαφορές στα αποτελέσματα

in vitro

και

in vivo

.

Συζήτηση

Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να δημιουργήσει ένα σκεπτικό για την αναστολή πρωτεασώματος ως μια στρατηγική για NSCLC ραδιοευαισθητοποίηση. Εμείς αιτιολογημένη ότι από DNA διπλής διαλείμματα σκέλος (DSBs) συσχετίζονται με την κυτταροτοξικότητα της ιονίζουσας ακτινοβολίας (IR) [26], παράγοντες που καθυστερούν την επισκευή αυτών των διαλειμμάτων μπορούν να ενεργούν ως ραδιοευαισθητοποιητές. Κατά συνέπεια, παρατηρούμενες μειώσεις σε ομόλογο ανασυνδυασμό (HR) μετά την αναστολή πρωτεασώματος, σημαντικές καθυστερήσεις στο DNA DSB επισκευάσει τόσο

in vitro

και

in vivo,

και μειωμένα επίπεδα IR-επαγόμενης έκφρασης και βλάβη ιστοσελίδα εντοπισμό των πρωτεϊνών επιδιόρθωσης του DNA. Αναστολείς πρωτεασώματος λειτουργία, τουλάχιστον εν μέρει, αναστέλλοντας τη μονοπατιού ΝΡ-κΒ με την παρεμπόδιση της υποβάθμισης του ΙκΒα, η οποία αναστέλλει κατάντη δραστικότητα ΝΡ-κΒ [34], [35]. Bortezomib μείωσε το IR-επαγόμενη έκφραση εξής πρωτεασώματος αναστολή του Fanconi αναιμία (FA) /γονίδια BRCA, η πλειοψηφία των οποίων έχουν υποθετικές θέσεις πρόσδεσης ΝΡ-κΒ [33]. Είναι σημαντικό, έχουμε έσωσαν bortezomib που προκαλείται ακτινοευαισθησία από φίμωση ΙκΒα, υποστηρίζοντας τον προτεινόμενο μηχανισμό. Ως εκ τούτου, οι αναστολείς πρωτεασώματος φαίνεται να ραδιοευαισθητοποιεί NSCLC παρεμβαίνοντας με επιδιόρθωση του DNA DSB με μείωση της έκφρασης των βασικών ΝΡ-κΒ-επαγώγιμων γονιδίων HR.

Μια εναλλακτική εξήγηση για τα αποτελέσματα της αναστολής του πρωτεοσωματίου επί ραδιοευαισθησία είναι μέσω της επαγωγής της απόπτωσης . Πολλαπλές μελέτες έχουν δείξει μια αύξηση στην απόπτωση μετά από βορτεζομίμπη θεραπεία [41]. Η απόπτωση δεν έχει αποδειχθεί ως ο κυρίαρχος τρόπος του κυτταρικού θανάτου σε ακτινοβολημένα NSCLC. Για παράδειγμα, οι υψηλές δόσεις όπως 20 ακτινοβόληση Gy του Α549 ή κυττάρων NCI-H460 αποδώσει ποσοστά απόπτωσης μόνο 5-35% [42]. κύτταρα NCI-H460 αντιμετωπίζονται με τόσο 2 Gy IR και bortezomib έδειξαν αυξημένη απόπτωση σε σύγκριση με είτε τη θεραπεία μόνη της. Αξίζει να σημειωθεί ότι η επιμονή του DNA DSBs μετά την ακτινοβόληση των κυττάρων που εκτέθηκαν σε αναστολείς πρωτεασώματος μπορεί επίσης να συμβάλει η ίδια στην απόπτωση.

παρατηρήθηκε μειωμένη ανάπτυξη των NSCLC ξενομοσχευμάτων μετά την αναστολή του πρωτεασώματος σε συνδυασμό με RT. GEMMs του καρκίνου του πνεύμονα μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να επιβεβαιώσει την επίδραση των πρωτογενών όγκων του πνεύμονα αντιμετωπίζονται

in situ

. Εξερευνώντας αυτό σε πολλαπλές GEMMs μπορεί να έχει το πρόσθετο πλεονέκτημα της αναγνώρισης γονότυπους που ιδιαίτερα ανταποκριθεί στις πρωτεασώματος αναστολή. Για παράδειγμα, οι όγκοι που προκύπτουν από τα ποντίκια που φέρουν επαγώγιμων

KRAS

και

TP53

μεταλλάξεις ανταποκρίθηκαν στη βορτεζομίμπη, σε αντίθεση με τους όγκους από τα ποντίκια με μεταλλαγμένο

KRAS

και άγριου τύπου

TP53

[40]. Παρατηρήσαμε σημαντικές διαφορές σε επιβίωση με επαγώγιμο πρωτεασώματος knockdown σε NSCLC ξενομοσχεύματα που εκφράζουν άγριου τύπου

ΤΡ53

, η οποία είναι σε αντίθεση με αυτά τα αποτελέσματα. Προτείνουμε ότι ο συνδυασμός με ακτινοβολία μπορεί να ξεκλειδώσει το δυναμικό της αναστολής πρωτεασώματος σε ένα ευρύτερο φάσμα των γονότυπων του όγκου.

Η υιοθέτηση των αναστολέων πρωτεασώματος στην κλινική θα απαιτήσει βελτίωση στην παράδοση του όγκου. Bortezomib απέδωσε σχετικά μικρή αναστολή πρωτεασώματος σε μελέτες ξενομοσχεύματος μας σε σύγκριση με δοξυκυκλίνη που προκαλείται

PSMA1

shRNA νοκ ντάουν. Στρατηγικές, συμπεριλαμβανομένων λιποσωμική ενθυλάκωση, το οποίο έχει χρησιμοποιηθεί με επιτυχία για την δοξορουβικίνη [43], ή τη χρήση των αναστολέων πρωτεασώματος δεύτερης γενιάς, όπως carfilzomib, marizomib ή MLN9708 [44] μπορεί να βελτιώσει στερεά διείσδυση του όγκου και η αναστολή του πρωτεασώματος.

Η τα αποτελέσματά της αναστολής πρωτεασώματος σε ασθενείς με NSCLC αντιμετωπίζονται χωρίς ακτινοθεραπεία έχουν αναμιχθεί [16], [17]. αναστολή του πρωτεασώματος εξετάστηκε με ταυτόχρονη χημειοραδιοθεραπεία στο I δίκη μία φάση δώδεκα ασθενείς [45]. Σε αυτή την μελέτη κλιμάκωσης δόσης, οι ασθενείς με παθολογικά τεκμηριωμένη στάδιο της νόσου IIIA-B έλαβαν εβδομαδιαίως καρβοπλατίνη και πακλιταξέλη, μαζί με bortezomib 0,3-0,7 mg /m

2 δύο φορές την εβδομάδα, κατά τη διάρκεια της ακτινοθεραπείας σε μία δόση των 61.2 Gy σε 34 κλάσματα καθημερινά, που ακολουθείται από χειρουργική εκτομή. Δεν υπήρχαν απρόβλεπτες οξεία τοξικότητα κατά τη διάρκεια χημειοραδιοθεραπεία? Βαθμού 2-3 μυελοκαταστολή ήταν κοινή, όπως αναμενόταν με καρβοπλατίνη και πακλιταξέλη. Δυστυχώς όμως, τρεις από τους εννέα ασθενείς που υποβλήθηκαν σε χειρουργική εκτομή έχασαν τη ζωή τους μετά την επέμβαση? δύο πέθαναν δύο με τρεις ημέρες μετά την επέμβαση και ένας τρίτος πέθανε 21 ημέρες μετά την επέμβαση. Το συμπέρασμα ήταν ότι η καθυστερημένη τοξικότητα ήταν σοβαρή και απρόβλεπτη. Ωστόσο, και οι τρεις ασθενείς είχαν υποβληθεί σε δεξιά πνευμονεκτομή μετά από υψηλή δόση εισαγωγική χημειοακτινοθεραπεία. Δεξιά pneumonectomy ακόλουθη εισαγωγική θεραπεία έχει συσχετισθεί με σημαντικά αυξημένο κίνδυνο θνησιμότητας, ανεξάρτητα από την προσθήκη νέων συστημικών παραγόντων. Για παράδειγμα, υπήρξε μια αναφερόμενη θνησιμότητα σχετιζόμενη με τη θεραπεία 18% μετά από δεξιά πνευμονεκτομή, σε σύγκριση με ποσοστό 4% μετά την αριστερή πνευμονεκτομής, μετά την εισαγωγική ακτινοθεραπεία σε μία μέση δόση 54 Gy με ταυτόχρονη χημειοθεραπεία [46].

Ποια ήταν αξιοσημείωτη για την μελέτη φάσης Ι [45] ήταν το υψηλό ποσοστό των παθολογικών πλήρους ανταπόκρισης (pCR) παρατηρήθηκε σε ασθενείς που έλαβαν θεραπεία με εισαγωγική χημειοραδιοθεραπεία συμπεριλαμβανομένων βορτεζομίμπης. Δείγματα από πέντε από τους εννέα ασθενείς (56%) που υποβλήθηκαν σε χειρουργική εκτομή έδειξε μια PCR και ένα επιπλέον δύο έδειξαν 99% νέκρωση. Αυτό συγκρίνεται ευνοϊκά με το pCR ποσοστό 17,7% παρατηρήθηκε στο INT-0139 ακόλουθη εισαγωγική χημειοραδιοθεραπεία μεταξύ των 164 ασθενών που υποβλήθηκαν σε εκτομή [47]. Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι, με φροντίδα, η αναστολή του πρωτεασώματος μπορεί να αξίζει να διερευνηθεί περαιτέρω σε συνδυασμό με ριζικές χημειοραδιοθεραπεία, ίσως σε χειρουργική υποψηφίους ή για αριστερής πλευράς ή άλλους όγκους που δεν θα απαιτούν σωστό pneumonectomy για εκτομή.

Τέλος, πρωτεασώματος αναστολείς μπορούν δυσανάλογα ωφελήσει τους ασθενείς των οποίων οι όγκοι βασίζονται σε HR-μεσολάβηση επισκευή ϋδΒδ DNA που προκαλείται από ακτινοβολία. Για παράδειγμα, υψηλό επίπεδο έκφρασης πρωτεΐνης RAD51 έχει συσχετιστεί με μειωμένη επιβίωση των ασθενών με NSCLC [48]. Επίσης, κακώς διαφοροποιημένοι όγκοι NSCLC έχουν αυξημένη έκφραση των γονιδίων HR [49]. Σε μια ανάλυση των δημοσιευμένων δεδομένων μικροσυστοιχιών από 442 ασθενείς [9], τα υψηλά επίπεδα του

RAD51

και

BRCA1

το καθένα συνδέεται με μειωμένη συνολική επιβίωση (Σχήμα S7). Τα χαρακτηριστικά αυτά μπορούν να χρησιμεύσουν ως βιοδείκτες πρόβλεψης της ανταπόκρισης σε αναστολείς πρωτεασώματος ως ραδιοευαισθητοποιητές. Επίσης, μειώσεις που προκαλείται από ακτινοβολία DNA DSB πρωτεΐνη επισκευής εστίες, συμπεριλαμβανομένων FANCD2 και BRCA 1, μετά από θεραπεία με αναστολείς πρωτεασώματος, μπορεί να χρησιμεύσει ως βιοδείκτες για την ανταπόκριση σε όγκους θεραπεία.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια

Bortezomib αγοράστηκε από Σέλεκ Χημικών Προϊόντων (Houston, TX). 800 mM αποθέματα σε DMSO αποθηκεύτηκαν στους -20 ° C, και πριν από τη χρήση αραιώθηκαν και αποθηκεύτηκαν στους 4 ° C για μέχρι μία εβδομάδα. Όλες οι θεραπείες ήταν σε μιά τελική συγκέντρωση 30 ηΜ για Α549 ή 50 ηΜ για ΝΟΙ-Η460, εκτός αν ορίζεται διαφορετικά. Τα ακόλουθα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν στις εισηγμένες αραιώσεις για τη Δυτική ανοσοστυπώματα: PSMA1 (ARP40417, Aviva Systems Biology, San Diego, CA, 1:2000), PSMB5 (BML-PW8895, Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, 1:1000), FANCD2 (SC-20022, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, 1:200), βινκουλίνης (SC-25336, Santa Cruz Biotechnology, 1:1000), αντι-ποντικού (NA931v, GE Healthcare UK Ηνωμένο, Little Chalfont, Buckinghamshire , UK, 1:3000) και αντι-κουνελιού (NA934v, GE Healthcare UK Ηνωμένο, 1:3000) υπεροξειδάση αρμορακίας-συνδεδεμένη δευτερογενή αντισώματα. Τα ακόλουθα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν στις εισηγμένες αραιώσεις για ανοσοφθορισμό: BRCA1 (SC-6954, Santa Cruz Biotechnology, 1:50), RAD51 (PC-130, EMD Millipore, Billerica, ΜΑ, 1:1000), FANCD2 (sc-20022 https://array.nci.nih.gov/caarray/project/details.action?project.experiment.publicIdentifier=jacob-00182.