Αφηρημένο

θεραπεία στέρησης ανδρογόνων έχει γίνει η επεξεργασία γροθιά γραμμή θεραπεία του μεταστατικού καρκίνου του προστάτη? Ωστόσο, η εξέλιξη της νόσου στην ευνουχισμού αντίσταση εμφανίζεται στην πλειοψηφία των ασθενών. Επομένως, υπάρχει επείγουσα ανάγκη για βελτιώσεις στη θεραπεία για ευνουχισμό ανθεκτικά καρκίνο του προστάτη. Οι στόχοι της παρούσας μελέτης ήταν να προσδιοριστεί η αποτελεσματικότητα ανάλογο σωματοστατίνης οκτρεοτίδη (OCT), σε συνδυασμό με μια χαμηλή δόση docetaxel (DTX) χρησιμοποίηση ανθεκτικών ευνουχισμός κυττάρων καρκίνου του προστάτη και για τη διερεύνηση των μοριακών μηχανισμών συμμετέχουν in vitro. Οι αντι-πολλαπλασιαστική και συνεργία πιθανές επιπτώσεις προσδιορίστηκαν με δοκιμασία ΜΤΤ. Διέγερση απόπτωσης αναλύθηκε απασχολούν προσαρτώντας χρώση V και ιωδιούχο προπίδιο και κυτομετρία ροής. VEGFA, έκφραση CASP9, CASP3 και γονίδιο ABCB1 αξιολογήθηκε με RT-PCR και ανάλυση Q-RT-PCR. Οκτώβριο σε συνδυασμό με θεραπείες DTX για τη μετανάστευση των κυττάρων DU145 αξιολογήθηκε επίσης. Έρευνα αποκάλυψε ότι η συνδυασμένη χορήγηση DTX και OCT είχαν σημαντικές, συνεργικά μεγαλύτερη κυτταροτοξικότητα από DTX ή Οκτώβριο θεραπεία μόνη της. Ο συνδυασμός των δύο φαρμάκων προκάλεσε εντονότερη αύξηση στην απόπτωση και οδήγησε σε μεγαλύτερη καταστολή του διηθητικού δυναμικού, είτε από μεμονωμένες παράγοντα. Υπήρξε εμφανής αύξηση της κασπάσης 3 έκφραση σε μόνο και δύο φαρμάκων σε συνδυασμό ομάδες θεραπείας, όμως, η έκφραση VEGFA ήταν σημαντικά κατασταλεί σε αυτά ΥΧΕ. Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν το συμπέρασμα ότι ανάλογα σωματοστατίνης σε συνδυασμό με docetaxel μπορεί να ενισχύσει τις efficacies χημειοθεραπεία μέσω πολλαπλών μηχανισμών στον ευνουχισμό-ανθεκτική γραμμή κυττάρων του προστάτη. Το έργο αυτό παρέχει ένα προκλινικό σκεπτικό για τις θεραπευτικές στρατηγικές για τη βελτίωση της θεραπείας για τη νόσο αντίσταση ευνουχισμού

Παράθεση:. Zhu S, Oremo JA, Li S, Τζεν Μ, Tang Υ, Du Υ (2014) Synergistic αντικαρκινικές δράσεις του Docetaxel και Οκτρεοτιδίου συνδεθεί με τον αποπτωτικό-Η αναβάθμιση σε Ευνουχισμός-Resistant καρκίνο του προστάτη. PLoS ONE 9 (3): e91817. doi: 10.1371 /journal.pone.0091817

Επιμέλεια: Allen Gao, UC Davis Περιεκτική Κέντρο Καρκίνου, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 31 του Δεκέμβρη του 2013? Αποδεκτές: 13 του Φλεβάρη 2014? Δημοσιεύθηκε: 14 Μαρτίου 2014

Copyright: © 2014 Zhu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε σε μέρη με επιχορήγηση από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (81041102) και την επιστημονική Preferred Ίδρυμα Ερευνών για το επιστρεφόμενο Overseas κινέζικα Υποτρόφων, μέλος του Υπουργείου Παιδείας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη (PCA) είναι η πιο κοινή μορφή καρκίνου που αντιπροσωπεύει μια μεγάλη απειλή για την υγεία των ανδρών. Θεραπεία στέρησης ανδρογόνων (ADT) που περιλαμβάνει τη χειρουργική ή χημικός ευνουχισμός είναι η τυπική θεραπεία για ασθενείς με προχωρημένο προστάτη [1]. Ωστόσο, οι περισσότεροι ασθενείς θα γίνει ανθεκτικοί σε στέρησης ανδρογόνων και τελικά προχωρήσουν με ευνουχισμό-ανθεκτική ασθένειες [2], συνήθως μέσα σε 12-24 μήνες από την έναρξη της ορμονικής θεραπείας [3]. Η εμφάνιση της επιθετικής ευνουχισμού ανθεκτικών κλώνων κατά τη διάρκεια της ADT είναι λογική για θεραπεία με ταξάνη με βάση, η οποία είναι η μόνη τάξη χημειοθεραπεία για να δείξει ένα όφελος επιβίωσης σε μεταστατικό καρκίνο του ευνουχισμού ανθεκτικά προστάτη (CRPC) [4], [5].

η docetaxel (DTX) είναι το χημειοθεραπευτικό επιλογή πρώτης γραμμής για τη συμπτωματική CRPC ασθενείς που είναι υποψήφιοι για χημειοθεραπεία [6], η οποία ενισχύει τη συνολική απάντηση, κλινική ύφεση των ασθενών με καρκίνο του προστάτη [7]. DTX θεραπεία αυξάνει φωσφορυλίωση Bcl-2, ρυθμίζει προς τα κάτω τα επίπεδα πρωτεΐνης Bcl-XL, προκαλεί ρ53 και έτσι οδηγεί σε απόπτωση [8], [9]. Επιπλέον, DTX αναφέρθηκε ότι ασκούν αντιαγγειογόνο δράση [10]. Μας θυμίζει τις αρχές στοιχεία που αποδεικνύουν ότι η ταξοτέρη θα μπορούσε να αναστείλει τον πολλαπλασιασμό του κυτταρικού πολλαπλασιασμού φλέβας ενδοθηλιακών ανθρώπινου ομφάλιου μέσω της αναστολής του VEGF έκκρισης [11]. Συνεπώς, ερευνήσαμε έκκριση VEGFA πριν και μετά τη θεραπεία με διάφορους παράγοντες. Ωστόσο, κυτταροτοξικότητες ειδικά περιφερική νευροτοξικότητα και αιμοποιητικών παρενέργειες είναι σημαντικές και αναπόφευκτες εξέλιξη λαμβάνει χώρα μετά τη θεραπεία DTX [12], [13]. Αντίσταση μπορεί να αναπτυχθεί μέσα από μια ποικιλία μηχανισμών περιλαμβάνουν αναστολή της απόπτωσης και ενεργοποίηση των οδών εξωκυτταρικό σήμα που σχετίζονται με ΡΙ3 κινάση /Akt επιβίωση με την ανάπτυξη της μετάστασης [14]. Λόγω της αντίστασης, συχνά αποτυγχάνει να θεραπεύσει τους ασθενείς, ως εκ τούτου, είναι σημαντικό να προσδιοριστούν καλύτερα ή εναλλακτικές θεραπευτικές στρατηγικές που αντιστρέψει την αντίσταση χημειοθεραπεία και να ενισχύσει την ευαισθησία στην docetaxel με βάση τα φάρμακα χημειοθεραπείας.

Η σωματοστατίνη (SST) ανακαλύφθηκε ως ένας αναστολέας της αυξητικής ορμόνης η οποία απομονώθηκε πρώτα από τον υποθάλαμο του προβάτου. Διανέμεται σε πολλά όργανα του ανθρώπου και των όγκων με μια ποικιλία λειτουργιών, όπως η αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, τη ρύθμιση των δραστηριοτήτων φωσφοτυροσίνης φωσφατάση για την αναστολή της κινάσης ΡΙ3 και ΜΑΡ κινάσης δραστηριότητες [15]. Πολλά συνθετικά ανάλογα σωματοστατίνης (οκτρεοτίδη, λανρεοτίδη, βαπρεοτίδη και depreotide) αναπτύχθηκαν και πέντε διαφορετικούς υποτύπους υποδοχέων σωματοστατίνης μπορεί να δεσμεύεται από αυτούς [16]. Η σωματοστατίνη υποδοχείς είναι παρόντες επί των κυτταρικών μεμβρανών του ευνουχισμού-ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές PCa, ωστόσο, δυναμική έκφραση τους μπορεί να ποικίλει ανάλογα με τη φαινοτυπική χαρακτηριστικό της κάθε κυτταρικής σειράς [17]. Το ανάλογο σωματοστατίνης οκτρεοτίδη συνθετικό (OCT) έχει μελετηθεί εκτεταμένα ως μία από τις αναλόγων SST και συσσώρευση στοιχεία υποστηρίζουν αντικαρκινική δράση της στη θεραπεία του καρκίνου [18], [19]. Οκτώβριος έχει εγκριθεί από το FDA για να χρησιμοποιηθεί ως πρότυπο φροντίδας για την ιατρική περίθαλψη σε διάφορους τύπους καρκίνων. Έχει μια πολύ βελτιωμένη σταθερότητα σε σύγκριση με το φυσικό σωματοστατίνη, επιτρέποντας μακροχρόνια θεραπεία [20].

κτένισμα διαφορετικών αντικαρκινικών παραγόντων είναι μια λογική στρατηγική με την οποία για να ληφθεί μια ισχυρή κυτταροτοξική δράση στα καρκινικά κύτταρα. Στη μελέτη μας, προσδιορίσαμε την επίδραση της συνδυασμένης θεραπείας της DTX και OCT σχετικά με το προφίλ των γονιδίων έκφρασης που σχετίζονται με την απόπτωση, αγγειογένεση και ναρκωτικά ανοχής σε DU-145 κύτταρα. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται εδώ έδειξαν ότι η σύνδεση των DTX και OCT παρέχεται περισσότερο από ένα αθροιστικό αποπτωτική απόκριση. Αυτή η νέα συνδυασμού φαρμάκων ήταν πιο αποτελεσματική στην επαγωγή της απόπτωσης και τη μείωση της μετανάστευσης από κάθε φάρμακο χωριστά. Τα αποτελέσματα αυτά παρέχουν μια συνολική κατανόηση των κλινικών στρατηγικές του καρκίνου του προστάτη και αναστροφή της αντίστασης στα φάρμακα.

Υλικά και Μέθοδοι

Κύτταρα και κυτταρική καλλιέργεια

DU145 του προστάτη καρκινικά κύτταρα και PC3 κύτταρα παρασχέθηκαν ευγενικά ως δώρο από τον καθηγητή Peter Nelson (Έρευνας Καρκίνου Fred Hutchinson Κέντρο). Αγοράζονται από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε Dulbecco Τροποποιημένο Eagle Medium (DMEM, Invitrogen, Carlsbad, USA), που συμπληρώθηκε με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) (Hyclone) και 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα με 5% CO2. Συρρέοντα κύτταρα περάστηκαν με θρυψίνη-ΕϋΤΑ (0,05% θρυψίνη και 0,53 mM EDTA τετρανατρίου) και συλλέχθηκαν για την παρασκευή του mRNA, όπως περιγράφεται παρακάτω.

Θεραπεία και η βιωσιμότητα των κυττάρων δοκιμασία

κύτταρα καρκίνου του προστάτη DU145 σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε quintuplicate με βασικό μέσο Dulbecco συν 10% ορό εμβρύου μόσχου και διατηρήθηκαν σε καλλιέργεια για 24 ώρες. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DTX (5, 10, 20, 50 ή 100 ηΜ) και OCT (10, 10 2, 10

3, 10

4, 10

5 ηΜ

), χρησιμοποιήθηκε μόνες ή σε ταυτόχρονη συνδυασμοί για 24 ώρες, 48 ώρες και 72 ώρες, αντίστοιχα. Στο τέλος της επωάσεων, κυτταρικό μέσο απομακρύνθηκε και (/0,5 mg ml σε PBS) προστέθηκαν 100 μL /φρεάτιο διαλύματος ΜΤΤ. Στη συνέχεια, οι πλάκες επωάστηκαν για 3 ώρες (στους 37 ° C, προστατευμένο από το φως). Μετά από επώαση στους 37 ° C, 5% CO2 για 4 ώρες, τα υπερκείμενα απομακρύνθηκαν προσεκτικά, και 150 μΐ DMSO προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο. Τα κύτταρα στη συνέχεια σοκαρισμένος για 10 λεπτά στο σκοτάδι. Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 450 nm σε Microplate Reader (Bio-Rad 680). Η ανάλυση των αποτελεσμάτων που λαμβάνονται έγινε χρησιμοποιώντας GraphPad Prism πρόγραμμα 4 υπολογιστή για την αξιολόγηση του ρυθμού πολλαπλασιασμού των κυττάρων και κυτταροστατικά ρυθμό. Μη επεξεργασμένα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες.

RNA και DNA εκχύλιση

Ολικά RNAs από καλλιεργημένα κύτταρα εκχυλίστηκαν χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Takara, Dalian, Κίνα) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και οι συγκεντρώσεις τους προσδιορίστηκαν με ένα φασματοφωτόμετρο (NanoDrop, Nyxor Biotech). Γονιδιωματικό DNA από καλλιεργημένα κύτταρα εκχυλίστηκαν χρησιμοποιώντας DNeasy Blood & amp? Κιτ ιστού (Qiagen) και οι συγκεντρώσεις τους μετρήθηκαν με τη NanoDrop Φασματοφωτόμετρο. Όλες οι διαδικασίες διεξήχθησαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

RT-PCR και Q-RT-PCR

ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR εκτελέστηκε με το κύριο μίγμα QPK-201 SYBR Green (Toyobo, Osaka, Japan) και το σύστημα ΑΒΙ 7300 από την Applied Biosystems. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη ελήφθησαν από την Invitrogen (Πεκίνο, Κίνα) και παρουσιάζονται στον Πίνακα 1. παραμέτρους θερμοκυκλοποίηση περιελάμβανε ένα βήμα RT στους 50 ° C για 20 λεπτά, που ακολουθείται από ένα στάδιο ενεργοποίησης πολυμεράσης DNA στους 95 ° C για 2 λεπτά και 50 κύκλοι PCR (95 ° C για 20 s, 60 ° C για 30 s). Όλες οι αντιδράσεις διεξήχθησαν εις τριπλούν. Η πολλαπλή μεταβολή στη διαφορική έκφραση για κάθε γονίδιο υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τη συγκριτική C

Tmethod (επίσης γνωστό ως 2

-ΔΔCTmethod) όπως περιγράφεται από τους Lu et al. [21]

Η

Ροή κυτταρομετρίας αξιολόγηση της αννεξίνης V FITC-/κύτταρα ΡΙ-χρώση

τα καρκινικά κύτταρα αναπτύχθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων για 24 ώρες, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με DTX (20 ηΜ) και OCT (10

3 ηΜ) μόνα τους ή σε ταυτόχρονο συνδυασμό για επιπλέον 48 ώρες. Για την ανίχνευση αποπτωτικά γεγονότα, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS και το ίζημα επαναιωρήθηκε σε 1 × Annexin ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης σε μία συγκέντρωση 10

6cells /ml. Στη συνέχεια, 100 μΙ του κυτταρικού εναιωρήματος μεταφέρθηκε σε σωλήνα καλλιέργειας 5 ml. Στη συνέχεια, 5 μΐ του αννεξίνης V-FITC και 5 μΐ ιωδιούχου προπιδίου προστέθηκαν σε κάθε δοκιμή, και τα δείγματα επωάστηκαν για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι. Μετά το χρόνο αυτό, 400 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος δέσμευσης αννεξίνης 1 × προστέθηκαν σε κάθε σωληνάριο και τα κύτταρα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα BD FacsCanto κυτταρόμετρο ροής (BD Biosciences). Κάθε πείραμα περιελάμβανε τα δείγματα ελέγχου κύτταρα χρωματίστηκαν με Αννεξίνη V-FITC (χωρίς ΡΙ) και τα κύτταρα χρωματίστηκαν με ΡΙ (χωρίς αννεξίνης V-FITC). Βιώσιμα κύτταρα ήταν Annexin V-FITC- και ΡΙ-αρνητικά, τα κύτταρα σε πρώιμη απόπτωση ήταν Annexin V-FITC-θετικά και ΡΙ-αρνητικά και τα κύτταρα στα τέλη απόπτωση ή νεκροί ήταν θετικά τόσο για Αννεξίνη-FITC και ΡΙ. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως φορές αλλαγές στις σχετικές μέσοι λόγοι μεταξύ των κυττάρων χωρίς αγωγή, σε σύγκριση με τις διάφορες μεθόδους θεραπείας. Κάθε πείραμα διεξήχθη εις τριπλούν.

πληγή επούλωση δοκιμασία

Ο προσδιορισμός μηδέν διεξήχθη για να αξιολογηθεί η επίδραση της DTX και OCT σχετικά με τον καρκίνο του προστάτη κινητικότητα των κυττάρων μόνα τους και σε συνδυασμό. κύτταρα DU145 σπάρθηκαν σε υψηλή πυκνότητα σε τρυβλία 6 φρεατίων και αναπτύχθηκαν για 24 ώρες. Το μέσο απομακρύνθηκε και αντικαταστάθηκε με μέσο που περιέχει DTX ή /και OCT για άλλες 24 ώρες. Τα κύτταρα μονοστοιβάδας είχαν σωματικά τραυματίες από το ξύσιμο της επιφάνειας με ένα ρύγχος πιπέτας (1000 μΐ) ως ομοιόμορφα και κατ ‘ευθείαν το δυνατόν περισσότερο. Οι εικόνες των κυττάρων που εισβάλλουν στην γρατσουνιά συλλήφθηκαν σε δεικνυόμενα χρονικά σημεία (0, 4, 6, 8 και 24 ώρες) χρησιμοποιώντας μικροσκοπία αντίθεσης φάσης (IX 70 της Olympus Optical Co., Γερμανία). Οι εικόνες αξιολογήθηκαν με μέτρηση της διαφοράς στην περιοχή των τραυμάτων με ένα σύστημα ανάλυσης εικόνας Leica (Leica, Mannheim, Germany) και ο ρυθμός μετανάστευσης εκφράζεται ως ποσοστό του κλεισίματος μηδέν υπολογίστηκε ως εξής:% του κλεισίματος μηδέν = a-b /a, όπου (α) είναι μία απόσταση μεταξύ των άκρων της πληγής, και (β) είναι η απόσταση η οποία παρέμεινε ελεύθερο κυττάρων κατά τη διάρκεια της μετανάστευσης κυττάρων για να κλείσει το τραύμα. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν εις τριπλούν φρεάτια τουλάχιστον δύο φορές.

Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα από τα πειράματα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό SPSS 18.0 και εκφράζεται με τη μορφή του μέσου όρου ± SD. t-test των δύο όψεων του Student χρησιμοποιήθηκε για να αναλυθούν οι διαφορές στα πειράματα. Η τιμή p & lt? 0,05 θεωρήθηκε ως σημαντική λαμβάνοντας υπόψη ότι η τιμή p & lt? 0,01 ή & lt? 0.001 ως ιδιαίτερα σημαντική

Αποτελέσματα

αποπτωτικά ιδιότητες των κυττάρων DU145 αντιμετωπίζονται από DTX μόνο, Οκτώβριος μόνη της και ο συνδυασμός τους για 48 ώρες

στην αρχική μελέτη, εξετάστηκε η επίδραση ανασταλτική ανάπτυξης των DTX, Οκτώβριος και ο συνδυασμός τους σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη DU145. Μετά από αυτές τις παράγοντες επεξεργασίας, τμήματα των κυττάρων αρχίζουν να συρρικνώθηκε, απόσταση μεταξύ των κυψελών έγινε μεγαλύτερο και απόθεση κυτταροπλασματική σωματιδίων παρατηρήθηκε στο DTX και OCT επεξεργασμένα κύτταρα. Αυτό το αποτέλεσμα ήταν πολύ πιο ισχυρό στην ομάδα θεραπείας με συνδυασμό από ό, τι των επιμέρους ομάδων θεραπείας. Υπήρχαν περισσότερα επίπλευσης και αφρισμού κύτταρα εμφανίζονται μορφολογικά χαρακτηριστικά της απόπτωσης στις ομάδες θεραπείας συνδυασμού και η αύξηση της συγκέντρωσης θεραπεία ενισχυμένης τα αποπτωτικά εμφανίσεις. Σύκο. 1 δείχνει την κυτταρική μορφολογία των διαφορετικών συγκεντρώσεων DTX και /ή θεραπεία ΥΧΕ 48 ώρες. Επιπλέον, καθώς ο χρόνος επεξεργασίας προχώρησε, την ανάπτυξη των κυττάρων έγινε αργή και υπήρχαν αυξημένους αριθμούς επιπλεόντων κυττάρων μπορεί να παρατηρηθεί στο μέσο.

A. Μη επεξεργασμένα κύτταρα? Β 1 nM DTX? Γ 100 nM Οκτώβριο? Δ 10 nM DTX? Ε Δύο φάρμακο συνδυασμού 10 nM DTX και 100 nM Οκτώβριο? ΣΤ 100 nM DTX. Αναστολή

Η

Ανάπτυξη από DTX και OCT μόνη αντίστοιχα

Η ανασταλτική επίδραση της ανάπτυξης των DTX και OCT εξετάστηκε αντίστοιχα. Είναι προφανές ότι κάθε μία από τις δύο παραγόντων που εμφανίζονται επίδραση κατά του πολλαπλασιασμού σε κύτταρα DU145 (Εικ. 2Α και 2Β). Τόσο DTX και OCT μειώθηκε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε ένα χρόνο και εξαρτάται από τη δόση τρόπο. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2C, σε σύγκριση με μη κατεργασμένους μάρτυρες, υπήρχαν 14%, 31% και 43% αναστολή στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων DU145 εκτέθηκαν σε 10 ηΜ του DTX στις 24 ώρες, 48 ώρες και 72 ώρες. Όσο για OCT (Εικ. 2D), σε σύγκριση με τον έλεγχο, ο υπήρξε 10%, 18% και 29% αναστολή στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων DU145 εκτέθηκαν σε 100 ηΜ του φαρμάκου σε 24 ώρες, 48 ώρες, και 72 ώρες . Τα δεδομένα έδειξαν ότι η υψηλότερη κυτταροτοξικότητα ήταν στις 72 ώρες και IC

50 αξίες της DTX (Εικ. 2Α) και OCT (Σχ. 2Β) υπολογίστηκαν από γραφικές παραστάσεις του κυτταρικού πολλαπλασιασμού αντίστοιχα. DTX παρουσίασαν ισχυρότερη κυτταροτοξικότητα με τη χαμηλότερη IC

50 με αξία 10.784 ± 3.122 nM από το Οκτώβριο έδειξαν ασθενέστερη επίδραση αναστολή με IC

50 είναι 2.342 ± 0.262 μΜ.

Η βιωσιμότητα των κυττάρων ήταν προσδιορίζεται με δοκιμασία ΜΤΤ και εκφράζεται ως ποσοστό της τιμής ελέγχου (μέση ± SEM τριών πειραμάτων που έγιναν εις τριπλούν)? γραμμές σφάλματος = SEM (n = 6).

Η

DTX μαζί με OCT παράγει συνεργική αναστολή της ανάπτυξης σε ανθρώπινα κύτταρα DU145

Για να αξιολογηθούν οι πιθανές συνέργειες μεταξύ της DTX-Οκτ συνδυάζεται η ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων, τα κύτταρα DU145 εκτέθηκαν σε διαφορετικές συγκεντρώσεις DXT και OCT συνδυάζονται για 72 ώρες (Εικ. 3Β). Παρατηρήθηκε Η συνεργική δράση της DTX και OCT επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων DU145. Τα ποσοστά αναστολής της κυτταρικής ανάπτυξης που προκαλείται από DTX σε συνδυασμό με OCT ήταν μεγαλύτερες από κάθε μεμονωμένο παράγοντα μόνο. Στη συγκέντρωση των 10

3 ηΜ, ΟΚΤ μείωσε σημαντικά την τιμή IC50 (Ρ & lt? 0,05) και προώθησε την απόπτωση (Ρ & lt? 0,05) στα κύτταρα DU145 σε απόκριση προς DTX. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3Α, 10 ηΜ DXT και 10

2 ηΜ Οκτώβριο ως αποτέλεσμα μια 39% και 14% αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων DU145, αντίστοιχα, ενώ και οι δύο σε συνδυασμό στις ίδιες δόσεις προκάλεσε μία μείωση 68% του πολλαπλασιασμού των κυττάρων σε σύγκριση με το μη επεξεργασμένο έλεγχο, ο οποίος έδειξε μία ισχυρή συνέργεια.

τα αποτελέσματα είναι το ποσοστό της τιμής ελέγχου που λαμβάνεται με μη επεξεργασμένα κύτταρα (μέση ± SEM τριών πειραμάτων που έγιναν εις τριπλούν). (**) Ο πολλαπλασιασμός μειώθηκε σημαντικά (

σ

& lt? 0.001)? μπάρες σφάλματος = SEM.

Η

VEGFA, CASP3, CASP9 και έκφραση ABCB1 mRNA σε κύτταρα DU145

Για να διερευνήσουν τις δυνατότητες μηχανισμός με τον οποίο DTX συν Οκτώβριο επάγει αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο, η έκφραση της γονίδια που εμπλέκονται σε αποπτωτικό σήμα, κύτταρο ανθεκτικότητα σε DTX και αγγειογένεση αξιολογήθηκαν με RT-PCR και qRT-PCR επόμενες 48 ώρες (Εικ. S3) και 72 ώρες της θεραπείας. Σε σύγκριση με τον μάρτυρα, 10 ηΜ DTX και 100 ηΜ ΥΧΕ, ο συνδυασμός δύο παραγόντων ομάδα μειώθηκε αισθητά έκφραση VEGFA mRNA (Σχήμα 4Α). (Ρ & lt? 0,01). Όσο για CASP9 και CASP3, το βασικό επίπεδο mRNA του CASP9 και CASP3 ήταν χαμηλά αλλά ανιχνεύσιμα και η έκφραση mRNA αυξήθηκε σημαντικά όπως αποδεικνύεται στο Σχ. 4Β και σχ. 4C (P & lt? 0,01). Το επίπεδο έκφρασης πρωτεΐνης των δύο γονιδίων κασπάσης Εξετάστηκε επίσης και σύμφωνα με το αποτέλεσμα της qRT-PCR (Σχ. S4). Επιπλέον, η έκφραση του ABCB1, η οποία αναγνωρίζεται ως ένα γονίδιο που συνδέεται με την αντίσταση του φαρμάκου [22], δεν επηρεάστηκε στις ομάδες θεραπείας (Εικ. 4D). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η δράση κατά του όγκου της DTX σε συνδυασμό με OCT μπορεί να εμπλέκεται στην προαγωγή της απόπτωσης που σχετίζεται με υψηλή έκφραση της κασπάσης 9 και κασπάσης 3.

M: Marker, εξετάστηκαν τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων στόχου με RT-PCR (Α, Β, Γ και Δ) και ποσοτική πραγματικού χρόνου -PCR (Β, D, F και η) αντίστοιχα, χρησιμοποιώντας κύτταρα επεξεργασμένα με τα φάρμακα δοκιμής για 72 ώρες. Το επίπεδο έκφρασης του mRNA κάθε κανονικοποιήθηκε στο επίπεδο του mRNA β-ακτίνης. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν το μέσο ± SD της τριπλούν αναλύσεις (*

σ

& lt? 0,05, **

σ

& lt? 0,01).

Η

Επιπτώσεις της DTX, ΟΚΤ μόνο και θεραπεία συνδυασμού δύο φαρμάκων σε κύτταρα DU145 απόπτωση

Σύμφωνα με τα αποτελέσματα qRT-PCR, τα πειράματα χωρίστηκαν σε τέσσερις ομάδες θεραπείας, συμπεριλαμβανομένου του ελέγχου, DTX (10 ηΜ), ΟΚΤ (100 ηΜ) και οι συνδυασμός δύο φαρμάκων ομάδες (Εικ. 5). Μετά την κατεργασία για 48 ώρες, μια δοκιμή της απόπτωσης διεξήχθη με κυτταρομετρία ροής σύμφωνα με τις οδηγίες που παρέχονται στο κιτ Annexin V-FITC χρώσης /ΡΙ (Εικ. 5Α). Σε αντίθεση με την ομάδα ελέγχου, η απόπτωση προκλήθηκε σε δύο ομάδες DTX και OCT (Ρ & lt? 0,05). Σε συμφωνία με προηγούμενες παρατηρήσεις, το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων ήταν σημαντικά αυξημένη με εφαρμογή DTX συν ΥΧΕ σύγκριση με DTX ή την ΥΧΕ θεραπεία μόνο (Σχ. 5Β). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η θεραπεία συνδυασμού ενισχυμένης αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο σε κύτταρα DU145.

Τα δεδομένα είναι μέσοι ± SEM από δύο ανεξάρτητα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. ***

σ

& lt?. 0.000 έναντι ελέγχου

Η

Επίδραση της DTX, ΟΚΤ μόνη της και ο συνδυασμός των δύο φαρμάκων για τη μετανάστευση των κυττάρων DU145

για την ανίχνευση του αποτελέσματος του συνδυασμού των δύο φαρμάκων για την μετανάστευση των κυττάρων DU145, μία δοκιμασία επούλωσης πληγών εκτελέσθηκε ακολουθώντας 24 θεραπεία h. Τα αποτελέσματα της επούλωσης τραυμάτων δοκιμασίες έδειξαν ότι είτε του φαρμάκου μόνο του έχει το ανασταλτικό αποτέλεσμα επί των κυττάρων μετανάστευση. Αλλά τα κύτταρα στην ομάδα συνδυασμού μετανάστευσε πιο αργά από ό, τι εκείνα του φαρμάκου και μόνο και χωρίς θεραπεία ομάδες ελέγχου (Σχ. 6Α). Σε σύγκριση με τον έλεγχο, η σχετική μετεγκατεστημένα απόσταση των κυττάρων στο DTX, ΟΚΤ και DTX /ΥΧΕ, σε συνδυασμό ομάδες (Εικ. 6Β), αντίστοιχα ήταν 76,5 ± 10,21, 53,2 ± 12,13, 79,4 ± 13,04 (P & lt? 0,05). Τα κύτταρα επωάζονται στην ομάδα ελέγχου μετανάστευσαν σε μια περιοχή η οποία ήταν σημαντικά μεγαλύτερη από εκείνη των κυττάρων που επωάζονται στην ομάδα φαρμάκου-σε συνδυασμό, υποδεικνύοντας ότι DTX σε συνδυασμό με OCT ανέστειλε τη μετανάστευση των κυττάρων DU145.

( Α) τραύματος δοκιμασία επούλωσης να προσδιοριστεί η επίδραση των φαρμάκων που αναφέρεται σε κύτταρα DU145 μετανάστευση. (Β) Η αναλογία συνοψίζονται μετανάστευση (%) μετά από αγωγή 72 ώρες μετρήθηκε με δοκιμασία επούλωσης πληγών. Κάθε στήλη αντιπροσωπεύει το μέσο όρο ± SEM. **

σ

& lt?. 0.01, έναντι του ελέγχου

Η

Συζήτηση

μικροσωληνίσκων στόχευση χημειοθεραπεία με βάση είναι η πιο ευρέως χρησιμοποιούμενη μέθοδος για τη θεραπεία του καρκίνου του προστάτη [23]. Ωστόσο, η μακροχρόνια θεραπεία συχνά οδηγεί σε παρενέργειες και η αντίσταση χημειοθεραπεία, συνήθως συμβάλλουν στις μεταβλητές κλινικές εκβάσεις μεταξύ των ασθενών με φαινομενικά παρόμοιους τύπους όγκων. Σε μια προσπάθεια να ξεπεράσει την αντίσταση του φαρμάκου, αποφασίσαμε να διερευνήσει τις αποτελεσματικές συγκεντρώσεις κυτταροτοξικών και αποπτωτικά της μικροσωληνίσκους στόχευσης docetaxel φάρμακο (DTX) και ανάλογο σωματοστατίνης οκτρεοτίδη (OCT) και συνεργιστική τους επίδραση των δύο φαρμάκων σε ευνουχισμό ανθεκτικά προστάτη καρκινική κυτταρική γραμμή DU145.

Στην παρούσα μελέτη, αξιολογήσαμε το συνδυασμένο αποτέλεσμα της DTX και OCT κατά του καρκίνου του προστάτη DU145 και τα κύτταρα PC3 (Εικ. S1). Ο συνδυασμός της DTX με OCT προκάλεσε μεγαλύτερη μείωση στην βιωσιμότητα των κυττάρων από οποιονδήποτε παράγοντα μεμονωμένα. Οκτώβριος μείωσε το IC

50 αξία των DTX σε DU145 και τα κύτταρα PC3 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, ανέστειλαν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του προστάτη (Εικ. S2), αυξημένη ευαισθησία DTX, κυτταρική κυτταροτοξική και απόπτωση. Μολονότι βρήκαμε ότι τα κύτταρα PC3 έδειξε περισσότερο ευαίσθητα σε DTX από κύτταρα DU145 δυνάμενα συνεπής με την in vivo μελέτης (Εικ. S5). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι οι ΥΧΕ ενισχύει συνεργικά την αποτελεσματικότητα των παραγόντων μικροσωληνίσκων στόχευσης σε κύτταρα PCa in vitro. Αυτά σύμφωνα με την πρόσφατη μελέτη από Lattanzio et al. docetaxel σε συνδυασμό με οκτρεοτίδη ενισχυμένη συνεργικά την επίδραση της συνδυασμένης θεραπείας σε μια κυτταρική γραμμή ιδιαίτερα docetaxel ανθεκτική PC-3 [24]. Ωστόσο, βρήκαμε ένα από τα δύο φάρμακα μόνο του διεγείρει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων DU145 σε μια χαμηλότερη συγκέντρωση της DTX & lt? 1 ηΜ ή την ΥΧΕ & lt?. 10 ηΜ αντίστοιχα, οι οποίες δεν παρατηρήθηκε στην ομάδα συνδυασμένης τους

Η αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση της DTX και OCT μπορεί να οφείλεται είτε κυτταρικής νέκρωσης ή κυτταρικής απόπτωσης. Συνεπώς ερευνήσαμε την αποπτωτικό αποτέλεσμα DTX, ΟΚΤ μόνο και θεραπεία συνδυασμού τους σε κύτταρα DU145. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ο συνδυασμός της DTX με OCT μειωμένη βιωσιμότητα των κυττάρων και την αύξηση της κασπάσης 9/3 δραστηριότητα σε μεγαλύτερο βαθμό από ό, τι είτε απλός παράγων μόνη της σε ένα χρόνο εξαρτώμενο τρόπο (Εικ. S4). Σε σύγκριση με τον έλεγχο υπάρχει εμφανής αύξηση στην έκφραση της κασπάσης 3 ιδιαίτερα στις μόνο και δύο φάρμακο συνδυασμένης θεραπείας ομάδες OCT. Αυτό είναι σύμφωνο με την έκθεση έδειξε ότι Οκτ αύξησε την κασπάσης έκφραση 3 mRNA και επαγόμενη κυτταρική απόπτωση στα κύτταρα HepG2 [18]. Αναφέρθηκε ότι αποπτωτικό πρόγραμμα κυτταρικού θανάτου απολύθηκε με την ενεργοποίηση του εκκινητή κασπάση-8, επάγοντας μιτοχονδριακής διαπερατότητας της εξωτερικής μεμβράνης (ΜΟΜΡ), μιτοχονδριακή κατακερματισμό, και τελικά την ενεργοποίηση των κατάντη πρωτεασών κασπάσης-9 και -3. ΜΟΜΡ προκάλεσε την έξοδο του κυτοχρώματος c, το σχηματισμό αποπτωσώματος και τελικά την ενεργοποίηση της κασπάσης-9 [25]. Στην παρούσα μελέτη, η δραστηριότητα κασπάσης 9 αυξήθηκε σημαντικά μετά την αγωγή των κυττάρων DU145 μετά τη συνένωση των DTX και OCT θεραπεία, που εμπλέκουν τη ΜΟΜΡ και επαγωγή μιτοχονδριακή κατακερματισμό, με αποτέλεσμα την παρατηρούμενη ενεργοποίηση της απόπτωσης στην κυτταρική γραμμή DU145.

σηματοδότηση VEGF προάγει αγγειογένεση διεγείροντας τον σχηματισμό του αγγειακού ενδοθηλίου κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και σωλήνα και αυξάνει σημαντικά την αγγειακή διαπερατότητα [26]. Η οικογένεια VEGF περιλαμβάνει πέντε μέλη, VEGF-A, VEGF-Β, VEGF-C, VEGF-D και του πλακούντα αυξητικό παράγοντα (ΡΙΟΡ) και VEGF-A είναι γνωστή για τους βασικούς ρόλους του στην αγγειογένεση των όγκων που σχετίζονται με [27]. Συνεπώς, διερευνήσαμε την επίδραση της ΥΧΕ, DTX και ο συνδυασμός των δύο φαρμάκων επί της έκφρασης VEGFA σε κύτταρα DU145. Μελέτη έδειξε ότι ο συνδυασμός του DTX και OCT ασκήσει μια μεγάλη ανασταλτική επίδραση στην έκφραση του mRNA VEGFA αλλά είχε μία μέτρια επίδραση από DTX μόνη θεραπεία. Έκθεση έδειξαν ότι η έκφραση του VEGF κατεστάλη σημαντικά σε κύτταρα γλοιώματος ανά ΥΧΕ δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Ωστόσο, ΟΚΤ είχε μικρή επίδραση στο μικροπεριβάλλον της παραγωγής VEGF υποξία προκαλούμενη in vivo [28].

Στην παρούσα μελέτη αποδείξαμε μία σημαντική μείωση στην κυτταρική μετανάστευση in vitro μετά από έκθεση στη θεραπεία συνδυασμού δύο-φαρμάκου . Μελέτη δείχνει ότι DTX σε συνδυασμό με OCT αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό DU145 ή μετανάστευση μέσω της αναστολής της αποδέσμευσης του πεπτιδίου VEGFA και στη συνέχεια έχει ως αποτέλεσμα την αναστολή της κυτταρικής μετανάστευσης. Μελέτη ανέφερε ότι η αύξηση της αλληλεπίδρασης VEGF /VEGFR ενισχύει τη μετανάστευση των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου [29]. Ωστόσο, ορισμένα αντιφατικά αποτελέσματα της μελέτης έχουν ανακαλυφθεί. Για παράδειγμα, στην Ηπατική μοντέλο τραυματισμού ισχαιμίας-επαναιμάτωσης, ΟΚΤ έδειξε το ανασταλτικό αποτέλεσμα επί της ηπατοκυτταρικής απόπτωσης και εξασθενημένου βλάβη των ηπατοκυττάρων που προκαλούνται από ισχαιμικά-επαναιμάτωσης [30]. Βραχυπρόθεσμη εφαρμογή του Οκτώβρη θα μπορούσε να προκαλέσει Οκτώβριο υποδοχέα SSTR2 απευαισθητοποίηση και εσωτερίκευση, το οποίο ανέστειλε την αποπτωτική δράση των ΥΧΕ καρκίνο του ήπατος κύτταρα [31]. Αυτά τα αντίθετα αποτελέσματα μπορεί να οφείλονται σε διαφορετικά χαρακτηριστικά των κυττάρων, μικροπεριβάλλον των κυττάρων, έκφραση της συγκέντρωσης θεραπεία υποδοχείς και OCT.

Έχει αναφερθεί ότι ABCB1 εκφράζεται σε πάνω από πενήντα τοις εκατό των καρκίνων ανθεκτικών στα φάρμακα και αναγνωρίζονται ως ένα κύριος μηχανισμός υποκείμενη αντίσταση στα φάρμακα [32]. έκφραση ABCB1 ήταν ρυθμισμένα προς τα πάνω μετά από χημειοθεραπεία σε διάφορους όγκους ως μια γενικευμένη αντίδραση στο στρες [33], [34]. Στη μελέτη μας καμία σημαντική διαφορά παρατηρήθηκε μεταξύ των διαφόρων ομάδων που έλαβαν θεραπεία με συνδυασμένη DTX και OCT, κάθε απλού παράγοντα μόνο και το untreatment ελέγχου. Υψηλή έκφραση του γονιδίου ABCB1 πριν και μετά την εν λόγω θεραπεία φαρμάκων υποδεικνύει ένα DTX ή /και OCT ανθεκτικών στα φάρμακα κυτταρική γραμμή των κυττάρων καρκίνου του προστάτη DU145 που έχει παρατηρηθεί σε προηγούμενη μελέτη μας με το μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού in vivo (τα δεδομένα δεν έχει δημοσιευθεί).

Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η συνδυασμένη θεραπεία της DTX και OCT σε DU145 και PC3 κύτταρα άσκησαν μεγαλύτερη αναστολή του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων και σημαντικά απόπτωση, η οποία μπορεί να σχετίζεται με την αυξητική ρύθμιση της δραστικότητας κασπάσης 9/3 και μειωμένη έκφραση VEGFA in vitro. Παρά το γεγονός ότι θα πρέπει να επεκταθεί και σε in vivo μοντέλα σε μελλοντικές μελέτες τα αποτελέσματα μας, ανεβάζουν την ενδιαφέρουσα δυνατότητα ότι η στόχευση μικροσωληνίσκων με ένα ταξάνιο συνδυάζεται ένα ανάλογο σωματοστατίνης μπορεί να είναι μια χρήσιμη προσέγγιση για τη βελτίωση των αποτελεσμάτων στον καρκίνο του προστάτη.

Υποστήριξη Πληροφοριών

Εικόνα S1.

Επίδραση της DTX μόνο, συνεργιστική δράση των DTX σε συνδυασμό με 100 ηΜ ΥΧΕ από πολλαπλασιασμό των κυττάρων PC3 ακόλουθες 48 ώρες (Α) και 72 ώρες (Β) της αγωγής. Τα αποτελέσματα είναι το ποσοστό της αξίας ελέγχου που λαμβάνεται με μη επεξεργασμένα κύτταρα (μέση ± SEM τριών πειραμάτων που έγιναν εις τριπλούν). (**) Ο πολλαπλασιασμός μειώθηκε σημαντικά (

σ

& lt? 0.001)? γραμμές σφάλματος = SEM

doi:. 10.1371 /journal.pone.0091817.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2.

Συνεργική επίδραση του DTX σε συνδυασμό με OCT στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων DU145 ακόλουθες 48 ώρες της θεραπείας. Τα αποτελέσματα είναι το ποσοστό της αξίας ελέγχου που λαμβάνεται με μη επεξεργασμένα κύτταρα (μέση ± SEM τριών πειραμάτων που έγιναν εις τριπλούν). (**) Ο πολλαπλασιασμός μειώθηκε σημαντικά (

σ

& lt? 0.001)? γραμμές σφάλματος = SEM

doi:. 10.1371 /journal.pone.0091817.s002

(ΔΕΘ)

Εικόνα S3.

Επιδράσεις της DTX μόνος, ΟΚΤ μεμονωμένα και του συνδυασμού του DTX /ΥΧΕ από την έκφραση του VEGFA, κασπάσης 9, κασπάσης 3 και ABCB1 σε DU145 κύτταρα με qRT-PCR αντίστοιχα, χρησιμοποιώντας κύτταρα μετά από 48 ώρες θεραπείας. Το επίπεδο έκφρασης του mRNA κάθε κανονικοποιήθηκε προς το επίπεδο του β-ακτίνης. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν το μέσο ± SD της τριπλούν αναλύσεις (*

σ

& lt? 0,05, **

σ

& lt? 0,01)

doi: 10.1371 /journal.pone.0091817.s003.

(ΔΕΘ)

Εικόνα S4.

Ανίχνευση της κασπάσης 3, και η έκφραση της κασπάσης 9 σε κύτταρα DU145 με κηλίδα western (Α). Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι σημαντικά αυξημένα επίπεδα της κασπάσης 3 και κασπάσης 9 έκφραση σε DTX μόνο και σε συνδυασμό με OCT μετά από θεραπεία 48 ώρες. (Β) Ανάλυση πυκνομετρική διεξήχθη χρησιμοποιώντας Kodak λογισμικό μονοδιάστατη ανάλυση εικόνας. (P & lt? 0,01)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0091817.s004

(ΔΕΘ)

Εικόνα S5.

Καμπύλες ανάπτυξης του καρκίνου του προστάτη ξενομοσχεύματος PC3 (Α) και DU145 (Β) σε ποντίκια ελέγχου, ευνουχισμένων ποντίκια και ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με docetaxel συμπεριλαμβανομένων δύο ομάδες των 10 mg /kg και 20 mg /kg θεραπεία docetaxel. μέτρησης του όγκου ξεκινά από τη φαρμακευτική θεραπεία (p & lt? 0.015). (N = 5)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0091817.s005

(ΔΕΘ)