Αφηρημένο

Pramanicin (PMC) είναι ένα αντιμυκητιασικό παράγοντα που είχε προηγουμένως αποδειχθεί ότι εμφανίζουν αντιαγγειογενετικές και αντικαρκινικές ιδιότητες σε λίγες

in vitro

μελέτες. Αρχικά διαλογή έναν αριθμό αναλόγων PMC για την κυτταροτοξική επιδράσεις τους στην HCT116 κύτταρα καρκίνου ανθρώπινου κόλον. PMC-A, το ανάλογο με το πιο ισχυρό αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση επιλέχτηκε για να ανακρίνει περαιτέρω τον υποκείμενο μηχανισμό δράσης. PMC-Α οδήγησε σε απόπτωση μέσω της ενεργοποίησης της κασπάσης-9 και -3. Η αποπτωτική φύση του κυτταρικού θανάτου επιβεβαιώθηκε με κατάργηση του κυτταρικού θανάτου με προκατεργασία με ειδικούς αναστολείς κασπάσης. Σχετίζονται με το στρες MAPKs JNK και ρ38 ενεργοποιημένα και τα δύο concomittantly με την εγγενή αποπτωτικό μονοπάτι. Επιπλέον, η φαρμακολογική αναστολή της ρ38 απέδειξε να εξασθενήσει την επαγωγή κυτταρικού θανάτου, ενώ προκατεργασία με αναστολέα JNK δεν παρουσίασαν μια προστατευτική επίδραση. Αντίσταση του Βαχ – /- κύτταρα και την προστατευτική φύση της κασπάσης-9 αναστολής υποδεικνύουν ότι τα μιτοχόνδρια παίζουν κεντρικό ρόλο στην PMC-Α επαγόμενη απόπτωση. Πρόωρη ανύψωσης μετά την έκθεση των κυτταρικών Bim και Bax ακολουθήθηκε από μια οριακή μείωση του Bcl-2 και διάσπαση προσφορά. Περαιτέρω ανάλυση αποκάλυψε ότι Bcl-2 προς τα κάτω ρύθμιση λαμβάνει χώρα στο επίπεδο του mRNA και είναι κρίσιμης σημασίας να μεσολαβεί PMC-Α απόπτωση, όπως έκτοπη έκφραση Bcl-2 γλιτώσει ουσιαστικά τα κύτταρα από τον θάνατο. Αντιστρόφως, η αναγκαστική έκφραση Bim αποδείχθηκε να αυξήσει σημαντικά τον κυτταρικό θάνατο. Επιπλέον, οι αναλύσεις της p53 – /- κύτταρα έδειξαν ότι Bcl-2 /Bim /Bax διαφοροποίηση και ΜΑΡΚ ενεργοποιήσεις λαμβάνουν χώρα ανεξάρτητα από την έκφραση p53. Στο σύνολό τους, p53-ανεξάρτητη μεταγραφική Bcl-2 προς τα κάτω ρύθμιση και σηματοδότηση p38 φαίνεται να είναι τα βασικά γεγονότα ρυθμιστική στη PMC-Α απόπτωση που επάγεται

Παράθεση:. Bodur C, Kutuk O, Karsli-Uzunbas G, Isimjan TT, Harrison P, Basaga Η (2013) Pramanicin Αναλογική επάγει την απόπτωση σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου: Κρίσιμη Ρόλοι για Bcl-2, Bim, και p38 ΜΑΡΚ σηματοδότησης. PLoS ONE 8 (2): e56369. doi: 10.1371 /journal.pone.0056369

Επιμέλεια: Jose Vina, Πανεπιστήμιο της Βαλένθια, Ισπανία

Ελήφθη: 22, Οκτ του 2012? Αποδεκτές: 8, Γενάρη του 2013? Δημοσιεύθηκε: 18 του Φεβρουαρίου του 2013

Copyright: © 2013 Bodur et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η χρηματοδότηση για την εργασία που παρέχεται από το Πανεπιστήμιο Sabanci ερευνητική σχολή κεφάλαια. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ένα πλήθος από φυσικά ή συντιθέμενα μόρια έχουν υποβληθεί σε έλεγχο για θεραπευτική χρήση τους στην ιατρική ή την κτηνιατρική. Έχοντας καιρό γίνει αντικείμενο εκμετάλλευσης ως απολυμαντικά και συντηρητικά στη βιομηχανία, αντιμυκητιακούς παράγοντες δεν έχουν εξαιρέσεις σε αυτό. Pramanicin (PMC) είναι μια μυκητιασική προϊόν ζύμωσης που ανήκουν σε μία κατηγορία αντιμυκητιακών παραγόντων που ορίζονται από ένα υψηλής functionilized πολική κεφαλή και μία αλειφατική πλευρική αλυσίδα. Η προηγούμενη

in vitro

αναλύσεις σε καλλιεργημένα ενδοθηλιακά και λευχαιμικά Τ-κύτταρα επιβεβαιώθηκε το θεραπευτικό δυναμικό του τόσο ως αντιαγγειογενές και αντικαρκινικό παράγοντα [1], [2].

Η παρατεταμένη έκθεση σε

in vitro

αποτελεσματικές δόσεις PMC προηγουμένως δείχθηκε να μειώνει τη βιωσιμότητα των κυττάρων και να προκαλέσει κασπάσης-εξαρτώμενη απόπτωση [2]. PMC-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο αποδείχθηκε ότι διαμεσολαβείται από την ενεργοποίηση και των δύο σχετίζεται με το στρες κινασών p38 που ενεργοποιείται από μιτογόνο κινάσης πρωτεΐνης (ΜΑΡΚ) και c-Jun Ν-τερματικής κινάσης (JNK), ενώ εξωκυτταρική ρυθμιζόμενη κινάσης (ERK) δραστηριότητα αναφέρθηκε σε σημαντικά μειώνονται κατά την έκθεση στον παράγοντα. Παρά το γεγονός ότι μια παροδική ενδοκυτταρική αύξηση ασβεστίου έχει αναφερθεί να ακολουθήσει PMC έκθεσης σε καλλιεργημένα πνευμονικά ενδοθηλιακά κύτταρα, το φαινόμενο αυτό δεν ήταν συγχρονισμένα είτε με την ενδοθηλιακή δυσλειτουργία ή κυτταρικό θάνατο [1].

Φυσικές ή χημικές περιβαλλοντικές πιέσεις συμπεριλαμβανομένης της ακτινοβολίας, ωσμωτική καταπόνηση , και το οξειδωτικό στρες ή κυτταρικής επιφάνειας συνδέτες υποδοχέων όπως αυξητικοί παράγοντες, φλεγμονώδεις κυτοκίνες ή συνδέτες υποδοχέων θανάτου μπορεί να ενεργοποιήσει έναν καταρράκτη κινάσης που τελικά διεγείρει άγχος ενεργοποιούμενη MAPKs ρ38 και ΙΝΚ. Upstream σερίνης /θρεονίνης κινασών ΜΑΡ κινάση κινάση (MEKKs) και κινάσες ΜΑΡ κινάσης (MKKs) είναι υπεύθυνοι για την ενεργοποίηση με φωσφορυλίωση και μετέπειτα πυρηνική μετατόπιση της JNK και ρ38 [3]. Μόλις ενεργοποιηθεί, JNK και ρ38 είναι γνωστό ότι είναι ικανά να αποπτωτικών διαμόρφωσης μέσω ενεργοποίηση /απενεργοποίηση μιας σειράς παραγόντων μεταγραφής.

Η απόπτωση είναι ένας σφικτά ρυθμιζόμενη μηχανισμός κυτταρικού θανάτου η οποία ενεργοποιείται σε απόκριση προς διάφορες ενδο- /εξωκυτταρικά ερεθίσματα όπως το οξειδωτικό στρες και την ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία που βλάπτουν κυτταρικά μακρομόρια ή σημάτων, συμπεριλαμβανομένων φλεγμονωδών κυτοκινών και αυξητικών παραγόντων. Τα αποπτωτικά εκτέλεση αναλαμβάνεται από μια οικογένεια πρωτεασών κυστεΐνης που ονομάζεται κασπάσες που ενεργοποιούνται σε ένα καλά καθορισμένο τρόπο [4]. Ενώ η ενδογενής οδός ενεργοποιείται από apoptogenic μόριο απελευθέρωση από τα μιτοχόνδρια, η εξωγενής οδός ενεργοποιείται μέσω συνδέτη δέσμευσης σε υποδοχείς θανάτου στην κυτταρική επιφάνεια. Είτε ο ενδογενούς ή εξωγενούς μονοπατιού αποπτωτικό θα είναι στη δράση καθορίζεται γενικά από τη φύση του ερεθίσματος. Ανεξάρτητα από την πορεία που ενεργοποιήθηκε αρχικά, τόσο οι ενδογενείς και εξωγενείς οδούς θα μπορούσαν να συμμετέχουν για να ενισχύσουν το αποπτωτικό σήμα σε διαφορετικές περιστάσεις.

Το κυτόχρωμα απελευθέρωση c από τα μιτοχόνδρια που σηματοδοτεί το σημείο χωρίς επιστροφή για την εγγενή αποπτωτική δραστηριότητα είναι περίπλοκα ρυθμίζεται από αλληλεπιδράσεις μεταξύ των Bcl-2 οικογένεια πρωτεϊνών. Η λεπτή ισορροπία μεταξύ των αντι- και προαποπτωτική μέλη της οικογένειας προσδιορίζει την αποπτωτική φορτίο εντός του κυττάρου. Πολλών τομέων, προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών Bcl-2 και Bax Bak έχουν την ικανότητα ομο- /ετερο στην εξωτερική μιτοχονδριακή μεμβράνη (OMM) που προκαλεί διαπερατότητα της OMM και την απελευθέρωση των μορίων apoptogenic συμπεριλαμβανομένου του κυτοχρώματος c στο κυτταρόπλασμα. Ενώ αντιαποπτωτικού πρωτεϊνών Bcl-2, όπως Bcl-2, Bcl-XL, Α1 και Mcl-1 κρατήσει προαποπτωτικής Bax /Bak απορροφάται τους εμποδίζουν από την έναρξη OMM διαπερατότητας, προαποπτωτικής ΒΗ3 (Bcl-2 ομολογία 3) -μόνο πρωτεΐνες συμπεριλαμβανομένων Bim, προσφοράς, Noxa, κακός και Puma θα μπορούσε να λειτουργήσει για να εξουδετερώσει αντιαποπτωτικού μέλη της οικογένειας [5], [6]. Αν και οι ακριβείς μηχανισμοί ρύθμισης Bcl-2 πρωτείνες παραμένουν ασαφείς σε μεγάλο βαθμό, η ισορροπία μεταξύ σχετικών κυτταρικών ποσότητες και τις δραστηριότητες της προ- και αντιαποπτωτικών πρωτεΐνες Bcl-2 είναι γνωστό ότι ελέγχονται αυστηρά στα επίπεδα του γονιδίου και της πρωτεΐνης σε υγιή κύτταρα θηλαστικών . Από αυτή την άποψη, κυτταρικά επίπεδα προαποπτωτικών ΒΗ3-μόνο πρωτεΐνες Bcl-2 σε σχέση με αντιαποπτωτική ομολόγους τους είναι κρίσιμη για να ρυθμίσετε Βαχ /Bak ελεύθερος να κινήσει την εγγενή αποπτωτική παθολογική οδό.

Εκτός από τους ρόλους της στην επιδιόρθωση του DNA και ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, ο γνωστός ογκοκατασταλτικό ρ53 έχει δειχθεί ότι είναι σε θέση να ρυθμίζουν άμεσα απόπτωση. Μέχρι στιγμής, ο κανονισμός αυτός έχει αποδειχθεί να συμβεί μέσω της διαφοροποίησης των Bcl-2 πρωτεϊνών της οικογένειας ή των υποδοχέων θανάτου εκφράσεις. Εκτός από μεταγραφικά προς τα πάνω ρύθμιση Βαχ, Bid, Puma, Noxa, Bak και διαμεμβρανικών υποδοχέων θανάτου ως παράγοντας μεταγραφής, ρ53 επίσης αναφερθεί ότι είναι ικανή να ενεργοποιεί άμεσα Bax στο πρωτεϊνικό επίπεδο [7] – [13]. Πρόσφατα στοιχεία δείχνουν επίσης ότι η ίδια ρ53 μπορεί επίσης να συμπεριφέρεται ως BH3-μόνο προαποπτωτικών πρωτεΐνη να ανταγωνίζονται αντιαποπτωτικό πρωτεΐνες Bcl-2 καθώς επίσης και προκαλώντας μετακαταστολή αντιαποπτωτικών μεταγραφής γονιδίου Bcl-2 [14] – [17].

σε αυτή τη μελέτη, ορίζουμε ένα μηχανισμό για ενδογενή ενεργοποίηση αποπτωτικής οδού πυροδοτείται από PMC-α, ενός ισχυρού αναλόγου PMC στην οποία η εποξική ομάδα επί της πλευρικής αλυσίδας της PMC έχει αντικατασταθεί από ένα αλκένιο (Εικ. 1). PMC-Α απόπτωση που διαμεσολαβείται μέσω ρ53-ανεξάρτητη ενεργοποίηση της ρ38 και Bcl-2 προς τα κάτω ρύθμιση σε HCT-116 ανθρώπινου καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα. Ταυτόχρονα, Bax και Bim οι δύο συσσωρευτεί στα κύτταρα που εκτίθενται σε PMC-Α με επακόλουθη περικοπή προσφορά.

Η

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture και θεραπείες

άγριας τύπου (wt), ρ53 – /-, και Βαχ – /- HCT116 ανθρώπινου καρκίνου κόλου κύτταρα ευγενώς από Bert Vogelstein (Howard Hughes Medical Institute, Johns Hopkins University, USA) [18], [19], καλλιεργήθηκαν σε McCoy 5Α συμπληρωμένο με 10% FBS και ΗΙ 100 IU /ml πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη. Οι καλλιέργειες διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε

2 ατμόσφαιρα υγροποιημένη 5% CO. Αιθανόλη (μέγιστο 0,5%, ν /ν) προστέθηκε σε όλα τα φρεάτια ελέγχου /πινακίδες σε κάθε πείραμα. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν, ποσοτικοποιούνται σε πλήρες μέσο και σπάρθηκαν (100.000 κύτταρα /ml) σε 12-φρεατίων, 6-φρεατίων ή χιλιοστά καλλιέργειας 60 πλάκες ανάλογα με το πείραμα. Pramanicin και ανάλογα προστέθηκαν στις πλάκες καλλιέργειας 36 ώρες αργότερα. Προ-θεραπείες με αναστολείς έγιναν για 30 λεπτά πριν από την PMC-A θεραπείας.

Αντιδραστήρια και αναλογική Σύνθεση

Γενικά.

φάσματα NMR καταγράφηκαν σε ΟϋΟ

3 ή CD

3OD σε Bruker AC-200 ή φασματόμετρο AC-600 και αναφέρονται ως εξής: χημική μετατόπιση δ (ppm)? αριθμό πρωτονίων, πολλαπλότητα, σταθερά σύζευξης J (Hz), και ανάθεση. Υπολειμματική πρωτικούς διαλύτες ΟΗΟ

3 (δ = 7,26 ppm) και CH

3OH (δ = 3,30) χρησιμοποιήθηκαν ως εσωτερική αναφορά.

φάσματα 13C NMR καταγράφηκαν σε ΟϋΟ

3 ή CD

3OD σε 50 ΜΗζ σε Bruker AC-200 και 150 MHz σε φασματόμετρο Bruker AC-600, χρησιμοποιώντας την κεντρική συντονισμού ΟϋΟ

3 (δ = 77,16 ppm) ως εσωτερική αναφορά. Φασμάτων υπερύθρου καταγράφηκαν σε μηχανή Perkin-Elmer 983G. Τα φάσματα μάζας ελήφθησαν σε ένα Micromass Quattro Ultima (LC-ESI /ΑΡΟΙ τριπλό τετραπολικό φασματόμετρο μάζας) στο Τμήμα Χημείας, Πανεπιστήμιο McMaster. Οι ακόλουθες τεχνικές ιονισμού Χρησιμοποιήθηκαν: ιονισμού ηλεκτρονίων (ΕΙ), και ηλεκτροψεκασμού (ES). Τα σημεία τήξης προσδιορίστηκαν σε συσκευή θερμού σταδίου Reichert. Οι οπτικές περιστροφές καταγράφηκαν σε ένα Perkin-Elmer (241 MC Πολωσίμετρο, λ = 589, Na λάμπα).

Pramanicin (PMC) και pramanicin Α (PMC-Α) παρασκευάσθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [20]. Flash χρωματογραφία στήλης διεξήχθη επί πυριτικής πηκτής (silica gel 60). Χρωματογραφία λεπτής στιβάδας (TLC) εκτελέστηκε σε προ-επικαλυμμένες πλάκες διοξειδίου του πυριτίου (ALUGRAM SIL G /UV

254) και οπτικοποιήθηκαν με υν, βανιλλίνη ή δημήτριο διάλυμα νιτρικού αμμωνίου. Τα υδατικά διαλύματα κορέστηκαν εκτός αν ορίζεται διαφορετικά. Η αναλογία των διαλυτών σε μείγματα αναφέρεται στις ποσότητες που χρησιμοποιούνται. Όλες οι αντιδράσεις διεξήχθησαν υπό ατμόσφαιρα αζώτου ή αργού σε ξηρανθείσα σε φούρνο γυάλινα σκεύη, το οποίο ψύχθηκε κάτω από ένα συνεχές ρεύμα αζώτου αμέσως πριν από τη χρήση, εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά. THF αποστάχθηκε από βενζοφαινονοκετυλονάτριο, CH

2Cl

2 και το τολουόλιο από υδρίδιο του ασβεστίου, και EtOAc από ανθρακικό κάλιο. Άλλοι διαλύτες και αντιδραστήρια χρησιμοποιήθηκαν όπως παρέχονται.

3-τετραδεκανοϋλ-1-Βινυλοπυρρολιδιν-2-όνη (2).

Πρόσφατα απεσταγμένο

N

-vinylpyrrolidin-2- ένα (1) (0,96 mL, 9 mmol) προστέθηκε σε ΝαΗ (1,44 g, 36 mmol) σε αναρρέον THF (15 mL). Το μίγμα αναδεύτηκε για 30 λεπτά στους 90 ° C, και στη συνέχεια με οξικό μυριστικό (4.3 mL, 10.3 mmol) προστέθηκε. Μετά από 3 ώρες, το διάλυμα θερμάνθηκε σε θερμοκρασία δωματίου, σβήστηκε με κορεσμένο υδατικό ΝΗ

4Cl, και εκχυλίζεται με αιθέρα. Τα εκχυλίσματα ξηραίνονται (Ν &

2SO

4), διηθήθηκε, και συμπυκνώθηκε. Το προκύπτον στερεό διαλύθηκε σε CH

2Cl

2, διηθείται και συμπυκνώνεται, και καθαρίζεται με χρωματογραφία (CH

2Cl

2 /EtOAc, 1:01) για να αποδώσει 2 σαν λευκούς κρυστάλλους (3.54 g , 82%): mp 39-40 ° C? IR (φιλμ) 2920, 2851 (C-H, str.), 1685, 1637 (C = O, str.), 1459 (C = C, λυγίσει.), 1391, 861 εκατοστά

-1?

1Η NMR (ΟϋΟ

3, 200 ΜΗz) δ 7,01 (1Η, dd,

3J = 9,0,

3J = 16.0, NCH = CH

2), 4,46 (2Η, m , NCH = CH

2), 3,68 (1Η, dd,

3J = 9,0,

3J = 6,0, COCHCO), 3,54 (1Η, ddd,

2J = 9,0,

3J = 8,5,

3J = 5,5, CH

2Ν), 3,47 (1Η, ddd,

2J = 9,0,

3J = 8,5,

3J = 5,7, CH

2Ν) , 3,01 (1Η, m, CH

2CH

2CO), 2,68 (1Η, m, CH

2CH

2CO), 2,67 (1Η, dddd,

2J = 13.8,

3J = 5,7,

3J = 8,5,

3J = 6,0, CH

2CH

2Ν), 2,12 (1Η, dddd,

2J = 13,6,

3J = 8,5,

3J = 9,0,

3J = 5,5, CH

2CH

2Ν), 1,57 (2Η, m, CH

2CH

2CO), 1.24 (20Η, m, C

10Η

20), 0,87 (3Η, t,

2J = 6,7, CH

3CH

2)?

13C NMR (ΟϋΟ

3, 50 MHz)? δ 204.2 (CH

2CO), 169,9 (CON), 130.0 (NCH = CH

2), 94.5 (NCH = CH

2), 57,3 (COCHCO), 44,0 (CH

2Ν) , 43,5 (CH

2CH

2CO), 32.7, 30.4, 30.2, 29.8, 24.1, 23.5 (C

10Η

20), 20,1 (CH

2CH

2CH

2), 14,9 (CH

3)? MS (ΕΙ

+) m /z = 321 (Μ

⋅ +), HRMS (ΕΙ) υπολογίστηκε για C

20Η

35NO

2 (Μ

⋅ +) 321.2668 , βρέθηκε 321,2679.

3-Tetradecanoylpyrrolidin-2-όνη (3).

η ένωση 2 (520 mg, 1,6 mmol) θερμάνθηκε στους 90 ° C σε ένα μίγμα 95% C

2Η

5OH (35 mL) και συμπυκνωμένο HCl (0,5 mL). Η αντίδραση παρακολουθήθηκε με TLC. Το διάλυμα ψύχεται σε θερμοκρασία δωματίου, ξηραίνεται (Ν &

2SO

4), διηθήθηκε, και συμπυκνώθηκε. Το προκύπτον στερεό καθαρίστηκε με χρωματογραφία (CH

2Cl

2 /EtOAc, 1:01) για να δώσει 3 σαν λευκούς κρυστάλλους (241 mg, 50,4%): mp 73-74 ° C? IR (φιλμ) 3226 (Ν-Η str.), 2920, 2851 (C-H, str.), 1716, 1671 (C = O, str.), 1468, 1375, 1278 εκατοστά

-1?

1Η NMR (ΟϋΟ

3, 600 MHz) δ 5,73 (1Η, brs, ΝΗ), 3,50 (1Η, dd,

3J = 9,0,

3J = 6.0 COCHCO), 3,44 (1Η , ddd,

2J = 9,0,

3J = 8,5,

3J = 5,5, CH

2Ν), 3,34 (1Η, ddd,

2J = 9,0,

3J = 9,0 ,

3J = 5,4, CH

2Ν), 2,95 (1Η, ddd,

2J = 17,4,

3J = 7,4,

3J = 7.5 CH

2CH

2CO ), 2,57 (1Η, ddd,

2J = 17,4,

3J = 7,2,

3J = 7.2 CH

2CH

2CO), 2,65 (1Η, dddd,

2J = 11.0,

3J = 5,4,

3J = 9,0,

3J = 9,0, CH

2CH

2Ν), 2.17 (1Η, dddd,

2J = 11,0,

3J = 8,5,

3J = 9,0,

3J = 5,5, CH

2CH

2Ν), 1,59 (2Η, m, CH

2CH

2CO), 1.23 (22Η, m, C

11Η

22), 0.88 (3Η, t,

3J = 6,8, CH

3CH

2)?

13C NMR (ΟϋΟ

3, 150 MHz) δ 205,9 (CH

2CO), 171.6 (CONH), 53.9 (COCHCO), 42,9 (CH

2CO), 40,6 (CH

2Ν), 32,1 (CH

3CH

2CH

2), 29.8~29.2, 23,5 (CH

2CH

2CH

2CO), 22,9 (CH

2CH

2CH

2ΝΗ), 14,9 (CH

3)? MS (ΕΙ

+) m /z = 295 (Μ

⋅ +), HRMS (ΕΙ) υπολογίστηκε για C

18Η

33NO

2 (Μ

⋅ +) 295.2511 , βρέθηκε 295,2554.

(2R, 5S) -2- (ρ-φθοροφαινυλο) -3-οξα-1-αζαδικυκλο [3.3.0] οκταν-8-όνη (4).

ένα διάλυμα 5-υδροξυμεθυλπυρρολιδίνης-2-όνη (580 mg, 5 mmol) και

σ

-φθοροβενζαλδεϋδης (810 mg, 6,5 mmol) σε τολουόλιο (20 mL) που περιέχει PPTS (30 mg) θερμάνθηκε σε κάθετο ψυκτήρα για 13 ώρες χρησιμοποιώντας ένα διαχωριστή νερού Dean-Stark. Μετά την ψύξη, το διάλυμα αραιώθηκε με EtOAc, πλύθηκε με κορεσμένο NaHCO

3 υδατικό διάλυμα, κατόπιν άλμη, ξηράνθηκε (θειικό μαγνήσιο

4), και εξατμίστηκε υπό μειωμένη πίεση για να δώσει ένα καφέ έλαιο. Χρωματογραφικός διαχωρισμός επί πήγματος πυριτικού οξέος με έκλουση με ΟΗΟ

3 έδωσε 4 ως ωχροκίτρινο έλαιο (586 mg, 53%): IR (φιλμ) 2920, 2851 (CH, str.), 1701 (C = O, str. ), 1559, 1507, 1437 (αρωματικό C = C στροφή) 1301, 1099, 821, 668 εκατοστά

-1.?

1 NMR (ΟϋΟ

3, 200 MHz) δ 7,34 (2Η, dd,

3J = 8,0,

4J = 5.5, Η-Ph), 6,95 (2Η, dd,

3J = 8,6,

4J

HF = 8.6, Η-Ph), 6.20 (1Η, s, OCHPh), 4,15 (1Η, dd,

2J = 7,4,

3J = 6,4, CH

2O), 4,04 (1Η, m, NCHCH

2O), 3,40 (1Η, t,

2J = 7,4,

3J = 7,6, CH

2O), 2,74 (1Η,

2J = 17.4

3J = 9,6,

3J = 9,4, CH

2CO), 2,47 (1Η, ddd,

2J = 17,4,

3J = 3.7,

3J = 9,8, CH

2CO), 2,31 (1Η, dddd,

2J = 20.2,

3J = 3.7,

3J = 7,6,

3J = 7,0, CH

2CH

2CHN), 1,87 (1Η, dddd,

2J = 20.2,

3J = 4,7,

3J = 9,4,

3J = 9,8, CH

2CH

2CHN) ?

13C NMR (ΟϋΟ

3, 50 MHz) δ 178.2 (CON), 163.5 (1C, d,

1J

CF = 244,4, CF), 129,5 (2C, d,

3J

CF = 8,2, CHCHCF), 115,4 (2C, d,

2J

CF = 21,5, CHCF), 86,7 (OCHPh), 71,8 (CH

2O), 58.9 (NCH), 33,6 (COCH

2), 23,1 (COCH

2CH

2).

(2R, 5S) -2- (ρ-φθοροφαινυλ) -7-τετραδεκανοϋλ-3-οξα- 1-αζαδικυκλο [3.3.0] οκταν-8-όνη (5).

σε ένα διάλυμα προστατευμένης λακτάμης 4 (222 mg, 1 mmol) και ΗΜΡΑ (5 ml) σε THF (15 mL), LiN (TMS)

2 (1.0 Μ, 1.3 mL, 1.3 mmol) σε THF προστέθηκε στους -78 ° C. Το μίγμα της αντίδρασης αναδεύτηκε για 30 λεπτά, και στη συνέχεια με οξικό μυριστικό (0.4 mL, 1.2 mmol) προστέθηκε. Το διάλυμα θερμάνθηκε αργά σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από 3 ώρες, το μίγμα της αντίδρασης σβήστηκε με κεκορεσμένο ΝΗ

υδατικό διάλυμα 4Cl, εκχυλίζεται με αιθέρα, και το εκχύλισμα ξηράνθηκε (Ν &

2SO

4), και συμπυκνώθηκε. Το προκύπτον προϊόν καθαρίστηκε με χρωματογραφία (εξάνια /ΕΐΟΑο, 2:01) για να δώσει 5 σαν λευκούς κρυστάλλους (233 mg, 53%) η οποία διαμορφώθηκε ως μίγμα δύο διαστερεομερών: mp 60-62 ° C? IR (φιλμ) 2918, 2851 (CH, str.), 1716, 1681 (C = O, str.), 1559, 1512 (αρωματικό C = C στροφή.), 1401, 1240, 1035, 802 εκατοστά

– 1? MS (ΕΙ

+) m /z = 431 (Μ

⋅ +), HRMS (ΕΙ) υπολογίστηκε για C

26Η

38NFO

3 (Μ

⋅ +) 43.2913 , βρέθηκε 431,2914.

(5R) -5- (υδροξυμεθυλ) -3-tetradecanoylpyrrolidin-2-όνη (6).

ένα διάλυμα των προστατευόμενων λακτάμης 5 (50 mg, 0.15 mmol) σε 5 mL AcOH /THF /h

2O (3:07: 1) θερμάνθηκε στους 90 ° C για 3 ώρες. Βενζόλιο (30 ml) προστέθηκε στο μίγμα και εξατμίζεται υπό ελαττωμένη πίεση. Flash χρωματογραφία διεξήχθη (ΕίΟΑο /CH

3OH, 10:01) για να δώσει 6 ως λευκοί κρύσταλλοι (22 mg, 60%) ενός μίγματος διαστερεομερών: mp 73-76 ° C? IR (φιλμ) 3385 (ΝΗ str.), 3307 (ΟΗ, str.), 2920 (C-H, str.), 1699, 1653 (C = O, str.), 1457, 1119 εκατοστά

-1? MS (ΕΙ

+) m /z = 325 (Μ

⋅ +), HRMS (ΕΙ) υπολογίστηκε για C

19Η

35NO

3 (Μ

⋅ +) 325.2617 , βρέθηκε 325,2599.

(2S, 5S, 7R) -7-υδροξυ- (4-φθοροφαινυλ) -3-οξα-1-αζαδικυκλο [3.3.0] οκταν-8-όνη (7).

η ένωση 6 (200 mg, 0.46 mmol) προστέθηκε σε ένα εναιώρημα του ΚΕΣΔ

3.7H

2O (5.6 mg, 0.015 mmol) σε 2 mL

i-ΡγΟΗ

. Το εναιώρημα αναμίχθηκε με διοχέτευση αέρα μέσω αυτού για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Το μίγμα της αντίδρασης συμπυκνώθηκε. Flash χρωματογραφία διεξήχθη (CH

2Cl

2 /EtOAc, 1:01) για να δώσει 7 ως άχρωμο έλαιο (120 mg, 57%): (. ΟΗ, str) IR (φιλμ) 3384, 1715, 1698 (C = O, str.), 1511, 1230, 1156 εκατοστά

-1? [Α]

D

23 = -0.05

0 (c = 0.8 g /100 ml, CH

3OH)?

1Η NMR (DMSO-d

6, 600 MHz) δ 7,41 (2Η, dd,

3J = 8,9,

4J = 5.5, Η-Ph), 7,23 (2Η, dd,

3J = 8,9,

4J

HF = 8.9, Η-Ph), 6.62 (1Η, s, ΟΗ), 6,11 (1Η, s, Η-Ph), 4,28 (1Η, dd,

2J = 8,1,

3J = 8,4, CH

2O), 4,01 (1Η, dddd,

3J = 6,8,

3J = 7,0,

3J = 8,4,

3J = 6.0, NCHCH

2), 3,51 (1Η, t,

2J = 8,4,

3J = 8,1, CH

2O), 2,75 (1Η, dd,

2J = 13,0,

3J = 6,8, CH

2CHN), 2,69 (2Η, dd,

2J = 18,5,

3J = 7,2, CH

2CH

2CO), 1,90 (1Η, dd ,

2J = 13,0,

3J = 7,0, CH

2CHN)?

13C NMR (DMSO-d

6, 150 MHz) δ 209.3 (CH

2CO), 172.3 (CON), 162,2 (

1J

CF = 244,4, C-Ph), 134,7 (C-Ph), 128,3 (2C,

3J

CF = 8,4, C-Ph), 115,2 (2C,

2J

CF = 21,7, C-Ph), 87,7 (C ΟΗ), 85,6 (CH-Ph), 72,2 (CH

2O), 54,6 (CH

2CHN), 37,2 (CH

2CHN), 36,2 (CH

2CH

2CO) , 22,6 (CH

2CH

2CO), 22.05~31.25, 13,9 (CH

3CH

2)? MS (ΕΙ

+) m /z = 447 (Μ

⋅ +), HRMS (ΕΙ) υπολογίστηκε για C

26Η

42FN

2O

4 [(Μ

⋅ + ΝΗ

4)

+] 465,3129 βρέθηκε 465,3126.

(3S, 5R) -3-υδροξυ-5- (υδροξυμεθυλ) -3-τετραδεκανοϋλ πυρρολιδιν-2-όνη (8 )

Ένα διάλυμα της ένωσης 7 (60 mg, 0.13 mmol) σε 5 mL AcOH /THF /h

2O (3:07:. 1) θερμάνθηκε στους 90 ° C για 3 ώρες. C

6Η

6 (30 mL) προστέθηκε στο μίγμα και εξατμίζεται υπό ελαττωμένη πίεση. Flash χρωματογραφία διεξήχθη (ΕίΟΑο /CH

3OH, 10:01) για να δώσει 8 σαν λευκούς κρυστάλλους (22 mg, 48%): mp 74-76 ° C? IR (φιλμ) 3300 (ΝΗ, str.), 3226 (ΟΗ, str.), 2995, 2849 (C-H, str.), 1688, 1650 εκατοστά

-1 (C = O, str.)? [Α]

D

23 = -4,25 ° (c = 0,04 g /100 mL, CH

3OH)? 1Η NMR (CD

3OD, 600 MHz) δ 3,81 (1Η, dddd,

3J = 4,9,

3J = 5,4,

3J = 6,3,

3J = 7,9, CH

2CHN), 3,62 (1Η, dd,

2J = 11.1,

3J = 4,9, CH

2O), 3,53 (1Η, dd,

2J = 11.1,

3J = 6,3 , CH

2O), 2,74 (2Η, m, CH

2CH

2CO), 2,38 (1Η, dd,

2J = 14.1,

3J = 5,4, CH

2CHN ), 2,10 (1Η, dd,

2J = 14.1,

3J = 7,9, CH

2CHN), 1,56 (2Η, m, CH

2CH

2CO), 1,31 (3Η, t,

3J = 7,0, CH

3CH

2)?

13C NMR (CD

3OD, 150 MHz) δ 212,2 (CO), 176,7 (CON), 84,5 (COH), 65,5 (CH

2ΟΗ), 54.3 (CHN), 38,7 (CH

2CO), 33.1~30.8, 24,3 (CH

2CH

2CO), 14,4 (CH

3CH

2)? MS (ΕΙ

+) m /z = 341 (Μ

⋅ +), HRMS (ΕΙ) υπολογίστηκε για C

19Η

35NO

4 (Μ

⋅ +) 341.2617 βρέθηκε 341,2599.

PMC και αναλόγων διαλύθηκαν σε αιθανόλη. McCoy 5Α, FBS και αντιβιοτικά ήταν από Pan Biotech GmbH (Aidenbach, Γερμανία). κοκτέιλ αναστολέα φωσφατάσης (PhosStop) και κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης ελήφθησαν από την Roche (F. Hoffman-La Roche Ltd., Basel, Switzerland). Αννεξίνη V (FITC) ήταν από την Alexis Biochemicals (Enzo Life Sciences, Inc. Farmingdale, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής). Διασπασμένη κασπάση 3, διασπασμένη κασπάση-9, JNK, Ρ-JNK, ρ38, Ρ-ρ38, Bcl-2, αντισώματα Βαχ, Bid, Bim και β-ακτίνης αγοράστηκαν από την Cell Signaling Technology Inc. (Beverly, ΜΑ, USA ). ΜΑΡΚ αναστολείς SP600125 και SB203580 ήταν από την Calbiochem (La Jolla, CA, USA). αναστολείς κασπάσης Ζ-VAD-FMK (γενικός αναστολέας κασπάσης), Ζ-DEVD-FMK (κασπάσης-3 αναστολέα), Ζ-LEHD-FMK (κασπάση-9 αναστολέα), και Ζ-IETD-FMK (κασπάση-8 αναστολέα) ήταν αγοράστηκε από την BD Biosciences (San Jose, CA, USA). Τρις, η γλυκίνη και Tween-20 ήταν από Molekula Ltd (Shaftesbury, Ηνωμένο Βασίλειο). Όλα τα άλλα χημικά ελήφθησαν από την Sigma (Darmstadt, Germany).

ΜΤΤ την Κυτταρική Βιωσιμότητα ΔΟΚΙΜΑΣΙΑ

Κυτταρική βιωσιμότητα κατά την έκθεση σε ανάλογα PMC προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα ΜΤΤ (θειαζολυλο διμεθυλ διφαινυλ τετραζόλιο) κιτ δοκιμασίας ( Roche, Mannheim, Germany) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα κύτταρα HCT116 βάρος σε πλάκες 96-φρεατίων υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως υποδεικνύεται, και 10 μΐ αντιδραστηρίου σήμανσης ΜΤΤ προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο, μετά την οποία οι πλάκες επωάστηκαν για 4 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν σε 100 μΐ του διαλύματος διαλυτοποίησης για 12 ώρες, και η απορρόφηση μετρήθηκε με μια συσκευή ανάγνωσης πλάκας μικροτιτλοδότησης (Bio-Rad, CA, USA) σε δοκιμαστικό μήκος κύματος 550 nm και ένα μήκος κύματος αναφοράς 650 nm. Τοις εκατό βιωσιμότητας υπολογίστηκε ως (OD του OD δείγματος /έλεγχο των ναρκωτικών-θεραπεία) × 100.

κυτταρομετρίας ροής

Ο κυτταρικός θάνατος προσδιορίζεται από μία δοκιμασία συγγένειας Annexin-V. Wt, ρ53 – /-, και Βαχ – /- HCT116 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 12-φρεατίων μορφομετατράπηκαν /αγωγή όπως υποδεικνύεται, μεταφέρθηκαν σε σωλήνες κυτταρομετρία ροής και τα κύτταρα συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση στα 300 g για 5 λεπτά. Στη συνέχεια, τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε 1 ml ψυχρού PBS και φυγοκεντρείται και πάλι εις 300 g επί 5 λεπτά. Μετά την απομάκρυνση του υπερκείμενου, τα κύτταρα επωάστηκαν σε ρυθμιστικό αννεξίνης V (140 mM HEPES, 10 mM NaCl, 2,5 mM ΟαΟ

2, ρΗ: 7,4) που περιέχει 1% (ν /ν) Annexin V (FITC) για 15 λεπτά στο σκοτάδι. Τα κύτταρα αναλύθηκαν με FACS (FACSCanto, Becton Dickinson).

Protein Εκχύλιση και ανοσοκηλίδωση

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως υποδεικνύεται και συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση στα 300 g για 30 δευτερόλεπτα. Μετά επαναιώρηση σε 1 ml παγωμένου PBS και μεταφορά σε σωλήνες μικροφυγοκέντρου 1,5-ml, τα κύτταρα περιστράφηκαν σε 13.200 rpm για 30 δευτερόλεπτα. Το σφαιρίδιο λύονται με επώαση για 30 λεπτά σε 200 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος λύσης κρύο κύτταρο που περιέχει 50 mM Tris-HCl (ρΗ: 8,0), 150 mM NaCl, 1 mM φθοριούχου φαινυλμεθανιοσουλφονύλιο, πρωτεάση και τον αναστολέα της φωσφατάσης κοκτέιλ, και Nonidet Ρ-40 1 % (ν /ν). Μετά από φυγοκέντρηση στις 13200 rpm για 10 λεπτά, το υπερκείμενο που περιείχε το συνολικό πρωτεϊνικό εκχύλισμα απομακρύνθηκε και αποθηκεύτηκε στους -80 ° C. Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης προσδιορίσθηκαν με προσδιορισμό πρωτεΐνης DC (Bio-Rad, Munich, Germany). Πρωτεΐνες (30 μg) αναμίχθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης (4% SDS, 20% γλυκερόλη, 10% 2-μερκαπτοαιθανόλη, 0.004% κυανό βρωμοφαινόλης, 0.125 Μ Tris-HCl ρΗ: 6,8) και διαχωρίστηκαν σε 10-15% SDS- PAGE και στυπώθηκαν πάνω σε μεμβράνες PVDF. Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με 5% αντιδραστήριο αποκλεισμού (ECL Advance, Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Γερμανία) σε PBS-Tween20 και επωάστηκαν με κατάλληλη πρωτοταγή και συζευγμένο με HRP δεύτερα αντισώματα (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Γερμανία) σε 5% αντιδραστήριο μπλοκαρίσματος . Μετά απαιτούνται πλύσεις με PBS-Tween20, οι πρωτεΐνες τελικά αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα σύστημα ανίχνευσης ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (ECL Advance, Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Γερμανία) και εκτέθηκαν σε Hyperfilm-ECL (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Γερμανία).

οι επιμολύνσεις

κύτταρα HCT116 wt επιμολύνθηκαν με Bcl-2 και πλασμιδίων έκφρασης Bim (Addgene Inc., Cambridge, ΜΑ, USA) με τη χρήση Fugene 6 αντιδραστήριο επιμόλυνσης (Roche, F. Hoffman-La Roche Ltd., Βασιλεία, Ελβετία) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Συνολική πρωτεϊνική εκχύλιση διεξήχθη μετά από 24 ώρες μετά την ολοκλήρωση της διαδικασίας επιμόλυνσης για την επιβεβαίωση της έκτοπη έκφραση. κύτταρα Το πλασμίδιο-επιμολυσμένα υποβλήθηκαν σε αγωγή με PMC-Α όπως υποδεικνύεται και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής μετά από 24 ώρες.

Στατιστική Ανάλυση

Όλα τα απεικονίζεται αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν μία από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα με παρόμοια αποτελέσματα . Όλα τα αριθμητικά δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσο ± ως SD. Η στατιστική σημαντικότητα της απόκρισης διαφορές μεταξύ των διαφορικά θεραπεύονται ή διαφορικά επιμολυσμένα κυτταρικών πληθυσμών αξιολογήθηκαν με t-test unpaired ή ζεύγη μαθητή, αντίστοιχα. Οι τιμές των P & lt? 0.05 και η P & lt? Τα 0,01 επισημαίνονται ως * ή **, αντίστοιχα

Αποτελέσματα

PMC-Α αποδεικνύεται περισσότερο Κυτταροτοξικοί σύγκριση με Προδρόμου PMC και διάφορα ανάλογα του κατά HCT116 κύτταρα

PMC δείχθηκε προηγουμένως να βλάψουν εκλεκτικά αγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα σε

in vitro

λειτουργικές μελέτες σχετικά αορτή αρουραίου και αρτηρίες σκύλος [1], [21], [22]. PMC και ανάλογα επίσης αποδειχθεί ότι προκαλεί κυτταρικό θάνατο σε καλλιεργημένα βόεια αγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα λευχαιμίας και Jurkat Τ [1], [2]. Στη μελέτη μας, μελετήσαμε αρχικά την προηγουμένως αναφερθείσα φυσικά προϊόντα PMC και PMC-A [20], και στη συνέχεια συντίθενται διάφορα ανάλογα να διερευνήσει τις σχέσεις δομής-λειτουργίας (Εικ. 1). Έτσι, PMC-Γ παρασκευάσθηκε από την εμπορική

N

-vinylpyrrolidinone (1) με σχηματισμό του ενολικού, τότε ακυλίωση με μυριστικό αιθυλεστέρα για να δώσει 2. Η βινυλίου προστατευτική ομάδα στη συνέχεια απομακρύνθηκε με υδατικό οξύ, δίνοντας Pmc- C (3) ως ρακεμικό μίγμα σε εύκολα επιμερίζεται στερεοκέντρο (Εικ. 2).

η

Για τα ανάλογα PMC-D και -F, εμπορική (

R

) -5- υδροξυμεθυλοπυρρολιδίνης-2-όνη μετατράπηκε στο προστατευμένο παράγωγο 4, χρησιμοποιώντας μια διαδικασία της βιβλιογραφίας [23], τότε αποπρωτονιώνονται και ακυλιώνεται με μυριστικό αιθύλιο, δίνοντας 5. η αποπροστασία τότε απέδωσε PMC-D (6). Εναλλακτικά, η υδροξυλίωση της 5 με οξυγόνο και χλωριούχο δημήτριο ως καταλύτη σύμφωνα με τη μέθοδο του Christoffers [24] έδωσε 7 το οποίο στη συνέχεια αποπροστατεύεται για να δώσει PMC-F (8). Η χρήση του

σ

-φθοροφαινύλιο προστατευτική ομάδα βολικά οδήγησε σε ουσιαστικά πλήρως στερεοεπιλεκτική υδροξυλίωση, ενώ άλλοι υποκαταστάτες επί του δακτυλίου βενζολίου έδωσε μείγματα. Η στερεοχημεία 8 ιδρύθηκε με κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ, η οποία αποκάλυψε ότι η υδροξυ ομάδα ήταν

trans

προς τον υποκαταστάτη υδροξυμεθυλίου, σε αντίθεση με το

cis

σχέση σε pramanicin. Ως εκ τούτου, το ενδιαφέρον ήταν να διαπιστωθεί κατά πόσον αυτή η ομάδα υδροξυλίου και στερεοχημεία της είναι σημαντική για τη δραστηριότητα, και έτσι συμπεριλάβαμε αυτή την ένωση στον πίνακα ελέγχου.

Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε μια δοκιμασία κυτταροτοξικότητας 24 ώρες για να αναζητήσετε τις πιο ισχυρές αναλογικό εναντίον κυττάρων HCT116. ΜΤΤ δοκιμή μείωση η οποία καθορίζει εμμέσως βιωσιμότητα κυττάρου /πολλαπλασιασμός με παρακολούθηση της μεταβολικής δραστηριότητας, αποκάλυψε ότι 100 μΜ PMC προκαλείται περίπου 8% μείωση της βιωσιμότητας των κυττάρων (Εικ. 3). Ωστόσο, PMC-Α, η οποία διαθέτει ένα διπλό δεσμό C = C αντί μιας εποξειδικής ομάδας στην πλευρική αλυσίδα του, μείωσε την κυτταρική βιωσιμότητα κατά 70% περίπου σε σύγκριση με το μη επεξεργασμένο μάρτυρα. Αξίζει να σημειωθεί ότι, τα ανάλογα PMC-C, -Ε και -F όλα διατήρησε σημαντική δραστικότητα, που δείχνει ότι ένα ακυλιωμένο πυρρολιδινόνη (όπως στο PMC-C), το πολύ, είναι το κλειδί φαρμακοφόρο και ότι πολλοί από τους υποκαταστάτες (εποξείδιο, διενίου, C- 5 υδροξυμεθυλομάδα και η ομάδες αλκοόλης C-3 και 4-C) είναι μη βασικά, αλλά ενισχύουν τη δραστικότητα.

Βιωσιμότητες κυττάρων HCT116 αναλύθηκαν με ανάλυση ΜΤΤ μετά από αγωγή 24 ώρες με 100 μΜ του κάθε αναλόγου PMC . κύτταρα HCT116 Άγριου-τύπου αναλύθηκαν χρωματομετρικά μετά από 24 ώρες αγωγή με ανάλογα PMC. Οι μέσες τιμές απορρόφησης σε σχέση με μη επεξεργασμένο μάρτυρα που εμφανίζεται μετά τον πολλαπλασιασμό με 100. Τα αποτελέσματα από τουλάχιστον 3 ανεξάρτητα πειράματα παρουσιάζονται ως μέσο ± SD. Διαφορά των μέσων τιμών μεταξύ επεξεργασμένων και μη επεξεργασμένων δειγμάτων εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας t-test unpaired φοιτητή? ** P & lt? 0,01. Κύτταρα ελέγχου υποβλήθηκαν σε αγωγή με διαλύτη μόνο. Όλα δοκιμαστεί ανάλογα με εξαίρεση τον πρόδρομο PMC οδήγησε σε σημαντική απώλεια της βιωσιμότητας /πολλαπλασιασμού, ενώ PMC-Α και -F αποδείχθηκε πιο κυτταροτοξική στα κύτταρα.

Η

PMC-Α επάγει τον κυτταρικό θάνατο μέσω επαγωγής της Εγγενής αποπτωτικό μονοπάτι

In vitro

αποτελεσματικές δόσεις του ισχυρού PMC αναλογικό PMC-Α (25-100 μΜ) προκάλεσε κυτταρικό θάνατο με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο μεταξύ όλων των τριών HCT116 καρκίνου του παχέος εντέρου κυτταρικές γραμμές (wt, ρ53 – /-, και Βαχ – /-), όπως υποδεικνύεται από την αυξημένη συγγένειες Annexin-V σε κυτταρικούς πληθυσμούς (Σχήμα 4Α).. Προκειμένου να αναλυθεί κυτταρικό θάνατο και τον προσδιορισμό της βέλτιστης δόσης για χρήση σε κλίμακα χρόνου 24 ωρών, εφαρμόσαμε κυτταρομετρία ροής εξής Annexin-V χρώση των κυττάρων που εκτίθενται σε τέσσερα φυσιολογικώς σχετικές συγκεντρώσεις PMC-A. επαγωγή κυτταρικού θανάτου ήταν εμφανής για όλες τις δόσεις σε όλες τις κυτταρικές σειρές και αυξημένη δόση-εξαρτώμενο τρόπο. Δεδομένου ότι, περισσότερο από το 50% των κυττάρων ήταν νεκρά κβ μετά έκθεση 24 ωρών σε 100 μΜ PMC-Α, πραγματοποιήσαμε το υπόλοιπο των πειραμάτων ανοσοαποτύπωση χρησιμοποιώντας δόση των 50 μΜ στην οποία περίπου το 70% των κυττάρων παρέμειναν ζωντανά στις 24 ώρες μετά