PLoS One: Χαρακτηρισμός της χρωμοσωμικής αστάθειας στην Ποντικού Κολίτιδα-Associated παχέος Cancer


Αφηρημένο

Ιστορικό

Οι ασθενείς που πάσχουν από ελκώδη κολίτιδα (UC) φέρουν αυξημένο κίνδυνο για καρκίνο του παχέος εντέρου. Λόγω χαμηλής κολίτιδας που σχετίζεται με τον καρκίνο (CAC) και του μεγάλου χρόνου μεταξύ της έναρξης UC και απροκάλυπτη καρκίνωμα, διαλεύκανση των μηχανισμών της φλεγμονής που σχετίζεται με την καρκινογένεση στο έντερο είναι ιδιαίτερα προκλητική. Επαρκής ποντικού μοντέλα είναι έτσι ιδιαίτερα επιθυμητή. Για ανθρώπινη ΣΔΙ θα μπορούσε να αποδειχθεί μια υψηλή συχνότητα χρωμοσωμικής αστάθειας (CIN) αντανακλάται από ανευπλοειδία, που υπερβαίνει εκείνη των σποραδικών καρκινωμάτων. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να αναλύσει μοντέλα ποντικών της CAC σε σχέση με CIN. Επιπλέον, η έκφραση της πρωτεΐνης του p53, β-κατενίνης και Ki67 μετρήθηκε για να χαρακτηρίσει την περαιτέρω ανάπτυξη των όγκων ποντικών σε σύγκριση με UC-συνδέονται καρκινογένεση στους άνδρες.

Μέθοδοι

Η /DSS μοντέλο ΑΟΜ (n = 23) και IL-10

– /- ποντίκια (η = 8) εφαρμόσθηκαν για την παρακολούθηση της ανάπτυξης κακοήθειας μέσω ενδοσκόπηση και να αναλύσει προκακοήθεις και κακοήθεις στάδια της ΣΔΙ. CIN αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία DNA-εικόνα. Πρωτεΐνη έκφραση του p53, βήτα-κατενίνης και Ki67 αξιολογήθηκε με ανοσοϊστοχημεία. Ο βαθμός της φλεγμονής αναλύθηκε με ιστολογία και παραλληλίζεται με την τοπική απελευθέρωση ιντερφερόνης-γ.

Αποτελέσματα

CIN ανιχνεύθηκε στο 81,25% του συνόλου των ποντικών που επάγεται από ΠΔΙ ΑΟΜ /DSS, ενώ όλα τα καρκινώματα ότι προέκυψε το IL-10

– /- ποντίκια ήταν χρωμόσωμα σταθερή. έκφραση β-κατενίνης ήταν έντονα μεμβρανώδη σε IL-10

– /- ποντίκια, ενώ 87,50% του ΑΟΜ όγκων /DSS επαγόμενη έδειξε κυτταροπλασματική και /ή πυρηνική μετατόπιση της β-κατενίνης. έκφραση p53 ήταν υψηλή και στα δύο μοντέλα και χρώση Ki67 αποκάλυψε υψηλότερο πολλαπλασιασμό των IL-10

– /-. επαγόμενη ΣΔΙ

Συμπεράσματα

ΑΟΜ /DSS-κολίτιδα, αλλά όχι IL- 10

– /- ποντίκια, θα μπορούσε να παρέχει ένα ισχυρό μυϊκό μοντέλο για τη διερεύνηση μηχανιστικά CIN στην κολίτιδα που σχετίζεται με την καρκινογένεση

Παράθεση: Gerling Μ, Glauben R, Habermann JK, Kühl ΑΑ, Loddenkemper C, Lehr ΗΑ. , et al. (2011) Χαρακτηρισμός της χρωμοσωμικής αστάθειας στην Ποντικού Κολίτιδα-Associated Καρκίνος του παχέος εντέρου. PLoS ONE 6 (7): e22114. doi: 10.1371 /journal.pone.0022114

Επιμέλεια: Reiner Albert Veitia, Institut Jacques Monod, Γαλλία

Ελήφθη: 20 του Απρ, 2011? Αποδεκτές: 16 του Ιούνη 2011? Δημοσιεύθηκε: 22 του Ιουλίου του 2011

Copyright: © 2011 Gerling et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Μελέτες εν μέρει ιδρύθηκε από το γερμανικό Ίδρυμα Ερευνών (Deutsche Forschungsgemeinschaft) με αριθμό DFG Si-749 /5-3 και SFB633, www.dfg.de. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Καμία πρόσθετη εξωτερική χρηματοδότηση ελήφθη για τη μελέτη αυτή

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Οι ασθενείς που πάσχουν από ελκώδη κολίτιδα (UC) αντιμετωπίζουν αυξημένο κίνδυνο της ζωής της ανάπτυξης καρκίνου του παχέος εντέρου (CRC) [1]. Όπως η φλεγμονή που σχετίζεται με κακοήθειες του παχέος εντέρου παρουσιάζουν διακριτές διαφορές σε σποραδικές καρκινώματα: αναπτύσσονται σε νεότερους ασθενείς, πιο συχνά στους άνδρες, και σύγχρονη καρκινώματα είναι συχνότερα βρίσκονται [2]. Στο επίπεδο του γονιδιώματος, έχει υποτεθεί ότι η χρόνια φλεγμονή οδηγεί σε αυξημένη χρωμοσωμική αστάθεια (CIN) από αντιδραστικά είδη οξυγόνου και αζώτου (Rons), υπερμεθυλίωση pericentromeric περιοχών DNA, τελομερών τριβή, και άλλες λιγότερο καλά καθορισμένους μηχανισμούς [3], [ ,,,0],4], [5]. CIN παρατηρείται σε χρόνιες φλεγμονώδεις καταστάσεις όπως οισοφάγος Barrett, χρόνια ηπατίτιδα, και UC σε υψηλό βαθμό [6], [7], [8]. Σε UC, ανευπλοειδία ως μετρήσιμο επακόλουθο του CIN μπορεί να εφαρμοστεί ως προγνωστική δείκτης για τον κακοήθη μετασχηματισμό και είναι ανιχνεύσιμη μέχρι και μια δεκαετία πριν από τη διάγνωση του καρκίνου του [8], [9]. Πρόσφατα, θα μπορούσε να αποδειχθεί ότι CIN χαρακτηρίζει καρκινώματα κολίτιδα σχετιζόμενη (CAC) με συχνότητα φθάνει το 100% σε ένα σύνολο 31 ΣΔΙ που αναλύθηκαν, ενώ βρέθηκαν Αντίθετα μόνο το 75% των σποραδικών CRCs ανευπλοειδικών [10], [11]. Στο σύνολό τους, τα στοιχεία στερέωσης προτείνει μια αιτιώδη σχέση μεταξύ φλεγμονής και CIN, με την παρουσία του CIN είναι μια έξυπνη δείκτης για τα δύο, την ανάπτυξη κακοήθειας και κατώτερης πρόγνωση φορά έχει συμβεί κακοήθη εξαλλαγή.

διελεύκανση αίτια και τις επιπτώσεις της CIN σε ένα μηχανιστικό επίπεδο θα μπορούσε, επομένως, να βοηθήσει ουσιαστικά την ανάπτυξη στρατηγικών για την πρόληψη και τη θεραπεία του καρκίνου με νέες, στοχευμένες προσεγγίσεις. Έτσι, κατάλληλα ζωικά μοντέλα είναι ιδιαίτερα επιθυμητό να επιταχυνθεί η έρευνα της προόδου. Κατά προτίμηση, τα μοντέλα αυτά θα πρέπει να παρουσιάζουν χαρακτηριστικά παρόμοια με την ανθρώπινη τους ομολόγους τους, τα οποία σε περίπτωση κολίτιδα που σχετίζεται με την καρκινογένεση απαραιτήτως να περιλαμβάνει ανευπλοειδία.

Εκτός από τη CIN, προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει περαιτέρω διαφορές μεταξύ σποραδική και κολίτιδα σχετιζόμενη καρκινογένεσης με αφορά την κανονική μονοπάτια της κακοήθους εξαλλαγής:

από καιρό ήταν γνωστό ότι η p53-σημειακές μεταλλάξεις συμβαίνουν νωρίς το UC-συνδέονται εξέλιξη νεοπλασματικών και συσχετίζεται άμεσα με την ανευπλοειδία [12], [13], [14], [ ,,,0],15].

Σε CRC και άλλων όγκων, η ενεργοποίηση της Wnt σηματοδότησης προάγει την επιβίωση των κυττάρων και αναστέλλει τον κυτταρικό θάνατο. Μετά την ενεργοποίηση του Wnt-μονοπάτι σηματοδότησης, συσσώρευση και μετατόπιση των β-κατενίνης από την κυτταρική μεμβράνη στο κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα μπορεί να παρατηρηθεί, με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση μιας ποικιλίας γονιδίων στόχων [16]. Υπάρχουν μόνο περιορισμένα δεδομένα για την βήτα-κατενίνης-έκφραση στην CAC. Μια μελέτη εστιάζει στις γενετικές αλλοιώσεις δίπλα στον τόπο βήτα-κατενίνης στο χρωμόσωμα 3p22-p21.3 δεν μπορούσε να βρει τη διαφορά μεταξύ της συχνότητας της απώλειας της ετεροζυγωτίας μεταξύ UC-συνδέονται και σποραδικά καρκινώματα [17]. Αντίθετα, μια πρόσφατη μελέτη σχετικά με Wnt σηματοδότησης ενεργοποίησης CAC κατέληξε στο συμπέρασμα ότι η οδός ενεργοποιείται σε μια πρώιμη φάση του κακοήθους μετασχηματισμού στην κολίτιδα, και βρήκε χρώση των πυρηνικών βήτα-κατενίνης χρήσιμες στην ανίχνευση νεοπλασίας σε CAC [18].

Μια ποικιλία ζωικών μοντέλων UC χρησιμοποιείται συνήθως. Σε ένα κανονικό μοντέλο κολίτιδας επάγεται με δεξτράνη θειικού νατρίου (DSS) [19]. Είναι ενδιαφέρον ότι, η μακροχρόνια χορήγηση DSS μπορεί μόνη της να προκαλέσει κακοήθη μετασχηματισμό σε τρωκτικά [20], [21], ενώ η επίδραση αυτή επιδεινώνεται από επιπλέον εφαρμογή της αζοξυμεθάνιο (ΑΟΜ), ένα μεταλλαξιογόνο παράγοντα που από μόνη της προκαλεί την ανάπτυξη των όγκων παχέος εντέρου σε ποντικούς [ ,,,0],22]. Όγκοι προκαλούνται μόνος με ΑΟΜ δεν δείχνουν CIN [23]. Μια δοσοεξαρτώμενη δράση προαγωγής των DSS για τους όγκους ΑΟΜ που προκαλείται έχει αναφερθεί, ενώ CIN δεν έχει μελετηθεί στον /DSS-μοντέλο ΑΟΜ [24].

Ένα συμπληρωματικό μοντέλο ποντικού της UC είναι η ιντερλευκίνη 10

– /- (IL-10

– /-) – ποντίκι [25]. Σε αυτό το μοντέλο, οι φλεγμονώδεις αλλαγές αρχίζουν στο άπω κόλον σε περίπου τρεις εβδομάδες από την ηλικία και την πρόοδο εγγύτατα χωρίς πρόσθετη χορήγηση εξωτερικούς παθογόνους παράγοντες [26]. Οι Παχέος βλάβες που χαρακτηρίζονται από φλεγμονώδεις διηθήσεις στον βλεννογόνο και υποβλεννογόνο, καθώς κρύπτη αποστήματα [26]. Έχει περιγραφεί ότι στους έξι μήνες της ηλικίας, το 60% των IL-10

– /- ποντίκια αναπτύσσουν αδενοκαρκινώματα [26]. Έχουμε δείξει προηγουμένως ότι αυλού πλήρωση προκύψουν όγκοι στα IL-10

– /- ποντίκια, τα οποία μοιάζουν πολύ με τα ανθρώπινα αδενοκαρκινώματα ιστολογικά [27]. Επιπλέον, έχει αναφερθεί ότι νεοπλασματικό μετασχηματισμό σε αυτά τα ποντίκια μπορούν να επιδεινωθούν από τη χορήγηση της celecoxib [25], [27].

Ο στόχος αυτού του προγράμματος ήταν να χαρακτηρίσει τη φλεγμονή που σχετίζεται με CRCs ποντικού σε σχέση με CIN και άλλα γνωστά χαρακτηριστικά του ανθρώπινου ομολόγου τους. εκτιμήθηκε η έκταση της CIN σε προκαρκινικές και κακοήθεις στάδια των δύο μοντέλα ποντικών για κολίτιδα με τη μεσολάβηση καρκινογένεση. Περαιτέρω, η έκφραση της πρωτεΐνης ρ53 και βήτα-κατενίνης αξιολογήθηκε σε όγκους ποντικού, καθώς επίσης και σε μία παραδειγματική σύνολο ανθρώπινων ΣΔΙ. χρώση Κί67 χρησίμευσε για τον προσδιορισμό του κλάσματος ανάπτυξη των όγκων. Τέλος, φλεγμονώδη δραστηριότητα επιβεβαιώθηκε μέσω ενδοσκόπηση, ιστολογία, καθώς και μια τοπική αύξηση της προ-φλεγμονωδών κυτοκινών ιντερφερόνη-γ (ΙΡΝγ)

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθικά Ζητήματα

πρωτόκολλα των ζώων εγκρίθηκαν από την περιφερειακή επιτροπή ζωική μελέτη του Βερολίνου (LAGeSo, ID έγκριση G0297 /03) και για τα δύο μοντέλα που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη.

Ποντίκια

Όλα τα ζώα αγοράστηκαν από την Harlan Winkelmann (Borchen, Germany). Συνολικά, 23 ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με ΑΟΜ και DSS, όπως περιγράφεται παρακάτω, χρησιμοποιήθηκαν για αυτή τη μελέτη. Συμπληρωματικά, οκτώ IL-10

– /-. Ποντικοί ερευνήθηκαν

ΑΟΜ /DSS-επαγόμενη ανάπτυξη όγκων

DSS και ΑΟΜ χορηγήθηκαν σε ποντικούς C57BL /6J ποντίκια σε ηλικία έξι εβδομάδων όπως περιγράφηκε προηγουμένως [27]. Εν συντομία, οι ποντικοί έλαβαν μία μόνο ενδοπεριτοναϊκή ένεση του μεταλλαξογόνου παράγοντα ΑΟΜ (12,5 mg /kg σωματικού βάρους). Ξεκινώντας από την πέμπτη ημέρα μετά την εφαρμογή ΑΟΜ, 3,5% DSS διαλύθηκε στο πόσιμο νερό για τρεις κύκλους πέντε ημερών η κάθε μία με διαλείπουσα διαστήματα 14 ημερών της τακτικής πόσιμου νερού, προκαλώντας έτσι μια χρόνια DSS κολίτιδα. Ενδοσκοπική παρακολούθηση πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται παρακάτω σε εβδομαδιαία βάση και τα ποντίκια θυσιάστηκαν κατά την ημέρα 50, σε εκείνο το σημείο που εμφανίζουν είτε αδενοκαρκινώματα ή κολίτιδα χωρίς εμφανή νεοπλάσματα (βλέπε αποτελέσματα, πίνακας 1).

Η

Στο σύνολο, δέκα υγιείς, μη επεξεργασμένα C57BL /6J-ποντικοί χρησιμοποιήθηκαν ως φυσιολογικοί μάρτυρες (σχήμα 1)

(Α) Ενδοσκοπική εικόνες φλεγμονή βλεννογόνου και του όγκου του ΑΟΜ /DSS κολίτιδα καθώς και η IL10

. – /- μοντέλο. Ογκογένεση εκτιμήθηκε με υψηλή ανάλυση ενδοσκόπηση

in vivo

. Μπλε του μεθυλενίου χρησιμοποιήθηκε για να ενισχύσει την ανίχνευση δυσπλασίας, όπως φαίνεται παραδειγματικά για ΑΟΜ /DSS μέγεθος κολίτιδα (Β) όγκου όπως εκτιμήθηκε από το σκορ μέγεθος του όγκου που περιγράφονται στην ενότητα μεθόδους, -levels ΙΡΝγ, και η βαθμολογία της φλεγμονής όπως εκτιμώνται Η.Ε. χρώση για μη επεξεργασμένους μάρτυρες, ΑΟΜ /DSS-ποντικούς, και IL10

– /- ποντίκια. Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν μέσο, ​​whishkers αντιπροσωπεύουν πρότυπο σφάλμα της μέσης τιμής (SEM). Παχέος δείγματα βλεννογόνου 10 υγιών μη επεξεργασμένων C57BL /6J-ποντίκια που εφαρμόζεται για την εκτίμηση των παραμέτρων ιστολογική και ΙΡΝγ -έκφραση

Η

IL-10

-. /- Ποντίκια

Σε δώδεκα εβδομάδες ηλικία, το κυκλοοξυγενάσης 2 αναστολέα σελεκοξίμπη (500 mg /ποντικό /ημέρα) χορηγήθηκε από το στόμα σε IL-10

– /- ποντίκια (C57BL /6J -Ιστορικό, n = 8) για πέντε ημέρες, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [ ,,,0],25]. Τα ποντίκια παρατηρήθηκαν για τέσσερις επιπλέον εβδομάδες και υποβλήθηκαν σε εβδομαδιαία κάτω ενδοσκόπηση, πριν να θυσιαστούν με ή χωρίς συμπτώματα κακοήθους ανάπτυξης (πίνακας 1).

Ενδοσκοπική επιτήρηση και μετά τη σφαγή εξέταση

ανάπτυξη των όγκων παρακολουθήθηκε μακροσκοπικά χρησιμοποιώντας ένα σύστημα ενδοσκοπίου ποντίκι υψηλής ανάλυσης (Karl Storz GmbH, Tuttlingen, Germany) όπως περιγράφεται προηγουμένως [28]. Ενδοσκοπήσεις διεξήχθησαν εβδομαδιαίως αρχίζοντας μία εβδομάδα μετά την ΑΟΜ-θεραπεία και celecoxib-θεραπεία, αντίστοιχα. Με βάση την παρατηρούμενη ανάπτυξη του όγκου, ημέρα 50 και 28 μετά την έναρξη κάθε αγωγής επιλέχθηκαν ως τελικό σημείο για το ΑΟΜ /DSS και IL-10

– /- ομάδα, αντίστοιχα. Ενδοσκοπικές διαδικασίες που ρωτήθηκαν σε μια έγχρωμη οθόνη καταγράφηκαν ψηφιακά (DSR-20MD, Sony, Κολωνία, Γερμανία).

Εκτός από την προετοιμασία του παχέος εντέρου ιστού όπως περιγράφεται παρακάτω, μετά θάνατον αυτοψία πραγματοποιήθηκε μακροσκοπικά. Ιδιαίτερα, για τη διαλογή απομακρυσμένες μεταστάσεις, φρέσκο ​​πνεύμονα και ήπατος ιστός κόπηκε σε τμήματα 5 mm, τα οποία διερευνήθηκαν για μακροσκοπική σημάδια νεοπλασμάτων.

DNA-image κυτταρομετρία

αξιολογήσεων πλοειδίας πυρηνικό DNA ήταν εκτελείται με τη βοήθεια DNA-εικόνας κυτταρομετρία χρησιμοποιώντας βαμμένους κατά Γθυΐσθη ιστολογικές τομές πάχους 8 μm. Χρώση διαδικασίες, τα κριτήρια επιλογής των κυττάρων, και την εσωτερική τυποποίηση βασίστηκαν στις μεθόδους που περιγράφηκαν προηγουμένως [29]. Ένας μέσος αριθμός 110 πυρήνων εντεροκυττάρων (κλίμακα 100 έως 120, SD = 3.4) μετρήθηκαν ανά δείγμα μετά διαδραστική επιλογή χρησιμοποιώντας ένα ψηφιακό σύστημα απεικόνισης (Ahrens ACAS, Αμβούργο, Γερμανία). Όλες οι τιμές του DNA εκφράζονται σε σχέση με τους εσωτερικούς ελέγχους χρώσης (λεμφοκύτταρα), τα οποία είχαν την 2c αξία. προφίλ DNA ταξινομήθηκαν σύμφωνα με Auer [29]. Ιστογράμματα χαρακτηρίζεται από μια μοναδική αιχμή στην διπλοειδή ή σχεδόν διπλοειδή περιφέρεια (1,5-c 2.5 γ) ταξινομήθηκαν ως τύπου Ι Τύπος ιστογράμματα II έδειξε μία μονή κορυφή στο τετραπλοειδείς περιοχή (3,5-c 4.5 γ) ή κορυφές τόσο στο διπλοειδή και τετραπλοειδείς περιοχές (& gt? 90% του συνολικού κυτταρικού πληθυσμού). Ο αριθμός των κυττάρων με τιμές DNA μεταξύ του διπλοειδούς και τετραπλοειδούς περιοχή και εκείνων που υπερβαίνουν το τετραπλοειδές περιοχή (& gt? 4.5 γ) ήταν & lt? 10%. ιστογράμματα τύπου III που αναπαριστάται εντόνως πολλαπλασιαστικά εγγύς διπλοειδή κυτταρικούς πληθυσμούς και αποτελούνταν από αξίες DNA που κυμαίνονται μεταξύ του διπλοειδή και την τετραπλοειδούς περιοχή. Μόνο ένας μικρός αριθμός κυττάρων (& lt? 5%) έδειξαν περισσότερο από 4,5 c. Τα ιστογράμματα DNA των τύπων I, II και III χαρακτηρίζουν έτσι euploid κυτταρικούς πληθυσμούς. ιστογράμματα τύπου IV έδειξαν αυξημένη (& gt? 5%) ή /και ευδιάκριτα διάσπαρτα αξίες DNA που υπερβαίνει το τετραπλοειδές περιοχή (& gt? 4.5 γ). Αυτά τα ιστογράμματα προτάθηκαν να αντανακλούν ανευπλοειδικών πληθυσμούς των πυρήνων εντερικά κύτταρα.

καλλιέργεια οργάνων του παχέος εντέρου και μετρήσεις κυτοκίνης

Ποντικού παχύ έντερο κόπηκαν ανοιχτή κατά μήκος και πλένονται με PBS. Λωρίδες 1 cm

2 τοποθετήθηκαν σε 48 επίπεδου πυθμένα πλάκες καλλιέργειας φρεατίων που περιέχουν 0,5 ml RPMI χωρίς ορό 1640 με πενικιλίνη (100 U /ml) και στρεπτομυκίνη (100 μg /ml), και επωάστηκαν στους 37 ° C για 24 ώρες. Τα υπερκείμενα καλλιέργειας συλλέχθηκαν, αναλύθηκαν για ΙΡΝγ, και συνολική περιεκτικότητα σε πρωτεΐνες ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τον προσδιορισμό πρωτεΐνης Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Μόναχο, Γερμανία). Ποντικού ΙΡΝγ προσδιορίστηκε με ειδικό προσδιορισμό ELISA σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή (BD Biosciences, Heidelberg, Germany) με μια σειρά από ποσοτικοποίηση 20 pg /ml έως 10 ng /ml.

ιστοπαθολογία και ανοσοϊστοχημεία

Όλες οι όγκοι και βλεννογόνο δείγματα υποβλήθηκαν σε

αιματοξυλίνη

& amp?

Ηωσίνη

(H & amp? Ε) χρώση για την αξιολόγηση ιστοπαθολογική εξέταση από έμπειρο παθολόγο (H.-A. L). Από τα ποντίκια DSS επεξεργασμένο ΑΟΜ /ή IL-10

– /- ποντίκια, πλήρης κόλον σταθεροποιήθηκαν. Παραφίνης τομές βάφτηκαν με Η &? Ε. Η ιστολογική σημάδια φλεγμονής εκτιμήθηκαν ως ένα συνδυασμένο αποτέλεσμα της διήθηση φλεγμονωδών κυττάρων (0-3) και βλάβη ιστού (0-3), με αποτέλεσμα ένα σκορ που κυμαίνονται από 0 έως 6 όπως περιγράφεται προηγουμένως [30]. Το μέγεθος του όγκου βαθμολογήθηκε ως εξής: 0, δεν αδένωμα? 1, εστιακό? 2, επεκταθεί ή /και συρροή? 3, επεκτάθηκε και έθεσε? και 4, πλήρωση του αυλού. Αντισώματα για ρ53, βήτα-κατενίνης, και Ki67 αγοράστηκαν από την ϋΑΚΟ (Αμβούργο, Γερμανία? Αντι-Κί67 αντίσωμα? Κλώνος TEC3? IgG2a αρουραίου), New England Biolabs (Φρανκφούρτη, Γερμανία? Αντι-βήτα-κατενίνης αντίσωμα? Κλώνος 6B3, κουνέλι IgG), και Cell Signaling (Danvers, ΜΑ, USA? αντίσωμα αντι-ρ53, Ser15? πολυκλωνικά κουνελιού). Η χρώση διαδικασίες πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τα πρωτόκολλα των κατασκευαστών. Τουλάχιστον δέκα πεδία υψηλής ισχύος χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση ημιποσοτικά πρωτεϊνική έκφραση. Για ανοσοϊστοχημεία βαθμολόγησης παρακαλούμε ανατρέξτε στον πίνακα 1.

στατιστικές αναλύσεις

αναλύσεις Στατιστικά στοιχεία πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του Microsoft Excel 2003, DigDB v7.1.3.3 (Sunnyvale, CA, USA), και XLStat Pro v7.5 (Addinsoft, New York, NY, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής). Τα δεδομένα εκφράζονται σε μέσο (χρησιμοποιώντας τυπικό σφάλμα των μέσων, SEM). Για επαγωγικό συμπέρασμα, χρησιμοποιήθηκαν nonparameteric τεστ rank-sum να συγκρίνουν τις παραμέτρους θέση των διανομών στοιχείων. Δύο ανεξάρτητα δείγματα, π.χ. διαφορετικών πλοειδίας κατάστασης, συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας τεστ Wilcoxon του. Αντίστοιχες συχνότητες αναλύθηκαν μέσω ακριβές τεστ του Fisher. Το ποσοστό σφάλματος τύπου 1 ορίστηκε σε 5%.

Αποτελέσματα

Διοίκηση του ΑΟΜ /DSS και IL-10 αποτέλεσμα ανεπάρκεια σε κολίτιδα με τη μεσολάβηση καρκινώματα

Στο σύνολο, 16 από 23 ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με ΑΟΜ και DSS αναπτύχθηκε νεοπλάσματα του παχέος εντέρου μετά από μια μέση ηλικία των επτά εβδομάδες μετά τη χορήγηση του ΑΟΜ. την ανάπτυξη του όγκου θα μπορούσε να ακολουθηθεί ενδοσκοπικά και όγκοι έμοιαζε πολύ με την ανθρώπινη αδενοκαρκινώματα ιστολογικά. Σε ποντίκια που ανέπτυξαν νεοπλάσματα (n = 16), ο αριθμός των όγκων κυμαίνονταν από δύο έως 19 ανά ζώο με ένα μέσο όρο εννέα όγκους ανά ποντικό (Εικόνα 1Α). Από κάθε άτομο, έναν εκπρόσωπο του όγκου επιλέχθηκε για περαιτέρω αναλύσεις με βάση του μεγέθους του όγκου. Ωστόσο, σε μία μόνο από τις 16 περιπτώσεις, παρατηρήθηκε εισβολή μέσω του κολονικού τοιχώματος, ενώ όλα τα άλλα καρκινώματα χαρακτηρίζονται από παρεμπόδιση ενδοφωτοδοτικό ανάπτυξη χωρίς διείσδυση πέρα ​​από το βλεννογόνο υμένα. Νεοπλάσματα παρατηρήθηκαν αποκλειστικά στο κόλον

IL-10

-. /- Ποντίκια, με μέση ηλικία 15 εβδομάδων επικείμενες δυσπλασίες προχωρήσει σε διηθητικά αδενοκαρκινώματα σε συνολικά τέσσερα ζώα (από τα οκτώ ζώα παρατηρήθηκαν όπως περιγράφεται στο «μέθοδοι»). αριθμός των όγκων κυμαίνονταν από επτά σε 24 όγκους ανά ζώο, με μια μέση τιμή 16 νεοπλάσματα ανά ποντίκι. Ένας όγκος του κάθε ζώου επιλέχθηκε για μεταγενέστερες αναλύσεις όπως περιγράφεται παραπάνω. Νεοπλασματικό μετασχηματισμό αναγκάστηκε να την παχέος εντέρου

Η μακροσκοπική απομακρυσμένες μεταστάσεις είχαν δει ούτε μετά ΑΟΜ /DSS-θεραπείας, ούτε στην IL-10

-. /-. Ποντίκια

Η χρόνια εντερική φλεγμονή και στα δύο μοντέλα ως προϋπόθεση για την ογκογένεση

η χρόνια φλεγμονή στο σημείο της ογκογένεσης χαρακτηρίστηκε από τη σημαντική αύξηση της ιστολογικής βαθμολογίας φλεγμονή παράλληλα με αυξημένα επίπεδα ΙΡΝγ στα υπερκείμενα καλλιέργειας του παχέος εντέρου και των δύο μοντέλων, σε σύγκριση με τους υγιείς μάρτυρες (εικόνα . 1β)

IL-10

– /- κολίτιδα αποτελέσματα στο χρωμόσωμα σταθερή όγκους

Ένα σύνολο τεσσάρων IL-10

– /- ποντίκια ανέπτυξαν επεμβατική ορθοκολικό καρκίνωμα στερείται CIN. Το σχήμα 2α δείχνει ένα DNA-ιστόγραμμα φλεγμονή βλεννογόνου και ένα παράδειγμα ενός διηθητικού καρκινώματος σε IL-10

– /- ποντίκια, και τα δύο που απεικονίζει ένα διπλοειδή-πολλαπλασιαστική μοτίβο. Ιστογράμματα δείχνουν μια πολλαπλασιαζόμενα καρκινικά χωρίς ακαθάριστο αστάθεια του γονιδιώματος. Συνολικά, και τα τέσσερα καρκινώματα του IL-10

– /- ποντίκια παρουσίασε διπλοειδή μοτίβα. Ομοίως, όλα τα μη νεοπλασματικά δείγματα βλεννογόνου έδειξαν διπλοειδή ιστογράμματα. Όλες οι μη-νεοπλασματικές δείγματα βλεννογόνου που εφαρμόστηκαν για το DNA-κυτταρομετρία και IHC παρουσιάζονται με συμπτώματα χρόνιας φλεγμονής (μέσος όρος φλεγμονή 2.1), ενώ η απουσία της νεοπλασίας εξασφαλίστηκε ιστολογικά (βαθμολογία όγκου = 0).

( Α) Αντιπροσωπευτική ιστογράμματα DNA σε λογαριθμική κλίμακα των προκαρκινικών και κακοήθους ιστού του IL-10

– /- ποντίκια. Και τα δύο ιστογράμματα απεικονίζουν διπλοειδή πολλαπλασιαστικές μοτίβα. (Β) Ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με ΑΟΜ /DSS έδειξε διπλοειδή-πολλαπλασιαστική μοτίβα σε προκαρκινικές στάδια. Στο εδώ παρουσιάζεται παράδειγμα του CAC, το 23% όλων των κυττάρων μετρήθηκε υπερβεί το όριο των 4,5 γ, αντιπροσωπεύει μια ανευπλοειδές κυτταρικό πληθυσμό.

Η

προκαλείται από ΑΟΜ όγκους που προκύπτουν σε ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με DSS δείχνουν σημάδια του ακαθάριστου CIN

μη-κακοήθεις βλεννογόνου μετά τη χορήγηση της ΑΟΜ και DSS αποκάλυψε ένα διπλοειδή μοτίβο στο DNA-κυτταρομετρία (n = 7/7). Η χρόνια φλεγμονή ήταν παρούσα σε όλες τις μη νεοπλασματικές βιοψίες με μέση βαθμολογία φλεγμονής 0.5, σκορ όγκου = 0.

Καταρχήν, οι εμφανείς του παχέος νεοπλάσματα βάσει του ΑΟΜ /DSS-κολίτιδα παρουσιάζεται ανευπλοειδισμών με μια σημαντική ποσότητα των κυττάρων που υπερβαίνει 4 γ (Σχήμα 2Β). Συνολικά, 13 από τα 16 καρκινώματα που προκύπτουν σε ΑΟΜ /DSS-κολίτιδας έδειξε ανευπλοειδία αντανακλώντας CIN. Η συχνότητα της ανευπλοειδίας διέφερε σημαντικά μεταξύ ΑΟΜ /όγκους DSS επαγόμενη και IL-10

– /-. Προκληθέντες όγκους (ρ = 0.007)

Protein έκφραση του CRC που σχετίζεται γονιδιακών προϊόντων διαφέρει μεταξύ των δύο όγκων τύποι

Σε όλες τις IL-10

– /- καρκινώματα (n = 4), μεμβρανώδη βήτα-κατενίνης εντοπισμό βρέθηκε, ενώ αυτή ήταν η περίπτωση για δύο από τα 16 ΑΟΜ όγκων /DSS που προκαλείται. Σε εννέα από 16 ΑΟΜ /DSS επαγόμενη καρκινώματα, παρατηρήθηκε έκφραση πυρηνικών ή πυρηνικών και κυτταροπλασματικών βήτα-κατενίνης (πίνακας 1). Η κατανομή της έκφρασης β-κατενίνης διέφεραν σημαντικά μεταξύ των δύο ομάδων (p = 0.020). Σε τέσσερα από τα επτά μη κακοηθών ελέγχους του ΑΟΜ /DSS-κολίτιδα, μεμβρανώδη εντοπισμός παρατηρήθηκε, ενώ τα υπόλοιπα τρία δείγματα βλεννογόνου χαρακτηρίζονταν από μεμβρανώδη και κυτταροπλασματική έκφραση, κανείς δεν έδειξε πυρηνική έκφραση. Και τα τέσσερα μη κακοήθη ελέγχους της IL-10

– /- κολίτιδα παρουσιάστηκε μεμβρανώδη έκφραση της β-κατενίνης

IL-10

-. /- Κολίτιδα, καθώς και σε IL-10

– /- ανιχνεύθηκαν επαγόμενων όγκων, πολύ υψηλά επίπεδα έκφρασης ρ53-πρωτεΐνης. Αντίθετα, ενώ η έκφραση της ρ53 ήταν ακόμη αυξημένα σε ΑΟΜ /DSS-κολίτιδας, ήταν σημαντικά χαμηλότερα από εκείνο που παρατηρήθηκε σε IL-10

– /- όγκους (ρ = 0,010, πίνακας 1). Επιπλέον, προκαρκινικές βλεννογόνο του ΑΟΜ /DSS κολίτιδα αποκάλυψαν σημαντικά χαμηλότερη p53-έκφραση από ΑΟΜ /CRCs DSS-επαγώμενη (p = 0.015).

Εντός της ομάδας του ΑΟΜ όγκων /DSS-επαγόμενη, δεν υπήρχε ούτε μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ της παρουσίας ανευπλοειδίας και της έκφρασης β-κατενίνης (p = 0,580), ούτε μεταξύ ανευπλοειδίας και της έκφρασης p53 (p = 0.730). Το κλάσμα ανάπτυξη του όγκου ήταν γενικά υψηλότερη στην IL-10

– /- που προκαλείται από ό, τι στην ΑΟΜ /DSS-κολίτιδας επαγόμενης καρκινώματα (πίνακας 1). Έτσι, η υψηλή έκφραση του Κί67 παρατηρήθηκε για προκαρκινικές βλεννογόνο του IL-10

– /-. Ζώα, ενώ ήταν χαμηλή σε προκαρκινικές στάδια της ΑΟΜ /DSS επαγόμενη κολίτιδα (πίνακας 1, σχήμα 3)

Συζήτηση

Προηγουμένως, μια σημαντικά υψηλότερη συχνότητα ανευπλοειδίας αντανακλώντας χρωμοσωμική αστάθεια στο ανθρώπινο κολίτιδα σχετιζόμενη καρκινώματα σε σύγκριση με την σποραδική ομόλογό έχει περιγραφεί [10]. Για να εκτιμηθεί κατά πόσον κανονικά μοντέλα ποντικών της κολίτιδας που σχετίζεται με την καρκινογένεση υπάρχουν ότι εξίσου εμφανίζουν σημάδια CIN, ερευνήσαμε πλοειδίας μοτίβα σε ποντικού κολίτιδα που σχετίζεται με νεοπλάσματα των δύο μοντέλα ποντικών CAC

Στην IL-10

. – /- ποντίκια, νεοπλάσματα αναπτύξουν που μοιάζουν με ανθρώπινο αδενοκαρκινώματα, η οποία έχει περιγραφεί προηγουμένως [26], [31], [32]. Σοβαρότητα της φλεγμονής μπορεί να επιδεινωθούν και κακοήθη μετασχηματισμό επιταχυνθεί με επιπλέον χορήγηση της celecoxib [25]. Καρκινώματα του

IL-10 – /- μοντέλο /celecoxib δεν εμφανίζουν σημάδια της γονιδιωματικής αστάθειας στη μελέτη μας. Αντίθετα, οι όγκοι που προκύπτουν στην ΑΟΜ /DSS-μοντέλο παρουσιάζεται με το ακαθάριστο ανευπλοειδία στη συντριπτική πλειοψηφία των περιπτώσεων. Παρά το γεγονός ότι ο αριθμός των δειγμάτων διερευνήθηκαν διέφερε μεταξύ των δύο ομάδων με σημαντικά μικρότερο αριθμό στο IL-10

– /- ομάδα, οι διαφορές στη συχνότητα της ανευπλοειδίας φτάσει στο επίπεδο σημαντικότητας. Η παρουσία των βιολογικών διαφορών μεταξύ των CAC στα δύο μοντέλα είναι επίσης διατυπωθεί από διαφορική έκφραση της β-κατενίνης

Στην IL-10

-. /- Ποντίκια δεν εξωγενή καρκινογόνο απαιτείται για να προκαλέσει ογκογένεση. Ωστόσο, η πλήρης απουσία μιας κρίσιμης κυτοκίνης για εντερική ομοιοστασία αντιπροσωπεύει μια μη φυσιολογική κατάσταση, ακόμη και αν αλλαγμένη έκφραση IL-10 έχει προηγουμένως συσχετιστεί με την ανθρώπινη UC [33], [34]. Τα δεδομένα μας αποδεικνύουν ότι η χρόνια φλεγμονή οφείλεται σε ανεπάρκεια IL-10 δεν επάγει CIN, παρά την παρουσία σοβαρής κολονικής φλεγμονής. Επιπλέον, περαιτέρω χαρακτηρισμό των όγκων δείχνει ότι η έκφραση β-κατενίνης σε προκαρκινικές στάδια και σε καρκινώματα περιορίζεται στην κυτταρική μεμβράνη. Αυτό φαίνεται να σταθεί σε αντίθεση με την ανθρώπινη CACs, στην οποία τα APC μεταλλάξεις πιστεύεται ότι αναστέλλουν την αποικοδόμηση β-κατενίνης και έτσι να προωθήσει την πυρηνική μετατόπιση, αν και λεπτομερή δεδομένα σε ανθρώπους λείπει [18], ενώ η υψηλή έκφραση της φωσφορυλιωμένης ρ53 παρατηρήθηκε σε αυτούς τους όγκους είναι σύμφωνες με τα αποτελέσματα στην ανθρώπινη UC-συνδέονται καρκινώματα [13].

σε ΑΟΜ /DSS κολίτιδα, μια εξωγενής καρκινογόνο απαιτείται για να προκαλέσει κακοήθη εξαλλαγή. Η χορήγηση του DSS – και ως εκ τούτου την έναρξη της χρόνιας κολίτιδας – επιταχύνει την ανάπτυξη κακοήθειας, καθιστώντας το μοντέλο ιδιαίτερα ενδιαφέρουσα για τη μελέτη της κολίτιδας που σχετίζεται με την καρκινογένεση [22], [35]. Εδώ, θα μπορούσαμε να δείξουμε ότι ένα υψηλό ποσοστό των ΣΔΙ που προκύπτουν μετά την επεξεργασία ΑΟΜ /DSS έκθεμα CIN (81,25%). Το εύρημα αυτό είναι ιδιαίτερα αξιόλογη, δεδομένου ότι έχει ήδη αποδειχθεί ότι CRCs επάγεται αποκλειστικά από τη χορήγηση του ΑΟΜ, η οποία ως εκ τούτου προκύπτουν στερείται χρόνιας φλεγμονής, είναι γενετικά σταθερά [23]. Έτσι, μπορεί να υποτεθεί ότι είναι παρόμοια με την ανθρώπινη κολίτιδα, ποντικού επάγει κολονική φλεγμονή ή σημαντικά συμβάλλει στην CIN. ΑΟΜ /DSS κολίτιδα μπορεί συνεπώς να παρέχει ένα ισχυρό μοντέλο για τη μελέτη της ανάπτυξης της φλεγμονής που προκαλείται CIN

in vivo

. Επιπλέον, ΑΟΜ /DSS επαγόμενων όγκων, κυτταροπλασματικών ή /και πυρηνική μετατόπιση του βήτα-κατενίνης παρατηρήθηκε, υποδεικνύοντας ενεργοποίηση της οδού [18] Wnt σηματοδότησης, [36].

Η έκφραση της φωσφορυλιωμένης ρ53 αυξήθηκε σε ΑΟΜ /DSS προκληθέντες όγκους, παράλληλα με την αύξηση του κλάσματος της ανάπτυξης σε σύγκριση με προκακοήθη στάδια. Καμία συσχέτιση μεταξύ της παρουσίας του ανευπλοειδίας και έκφραση της ρ53 ή βήτα-κατενίνης θα μπορούσε να αποδειχθεί, η οποία μπορεί να οφείλεται σε ανεπαρκή αριθμό (n = 3 για την διπλοειδή ομάδα). Μεγαλύτερες μελέτες θα είναι απαραίτητες για τη διαλεύκανση διαφορική έκφραση του σχετιζόμενου με τον όγκο πρωτεΐνες σε σχέση με CIN σε αυτό το μοντέλο ποντικού.

Σε καμία από δύο μοντέλα διερευνήθηκαν σε αυτή τη μελέτη, θα μπορούσε να παρατηρηθεί μακροσκοπικά απομακρυσμένων μεταστάσεων. Αυτό είναι σύμφωνο με προηγούμενα ευρήματα [26], [37], αλλά έρχεται σε αντίθεση με CRCs στον άνθρωπο, στην οποία ηπατικές μεταστάσεις εμφανίζονται έως και στο 50% των ασθενών κατά τη διάρκεια της πορείας της νόσου [38]. Σε αυτό το πλαίσιο, αναπόφευκτη περιορισμοί να μεταφράσει βιολογικά ευρήματα από ποντικούς στο ανθρώπινο σύστημα πρέπει να εκτιμηθεί. Για CIN σε φλεγμονή που σχετίζεται με την καρκινογένεση συγκεκριμένα, βράχυνσης των τελομερών μπορεί να σχετίζονται με αυξημένη γενωμική αστάθεια [39]. Καθώς υπάρχουν διαφορές μεταξύ ποντικού και ανθρώπου τελομερών βιολογία με ποντίκια που φέρουν πλέον τελομερή και συστατική δραστικότητα τελομεράσης [40], μπορεί να είναι αμφισβητήσιμη για την αντιμετώπιση των τελομερών τριβή στο μοντέλο /DSS ΑΟΜ. Ωστόσο, ε. σολ. σε επιθηλιακά καρκίνους ποντικού, τελομερών και η δυσλειτουργία της τελομεράσης έχουν δειχθεί ότι είναι καίριας σημασίας για την ανάπτυξη των όγκων, αποδεικνύοντας ένα πιθανό ρόλο για τελομερών βιολογία στην καρκινογένεση του ποντικού [41]. Επιπλέον, άλλοι μηχανισμοί όπως ελαττώματα συνοχή χρωματίδων έχουν συσχετιστεί με CIN σε CRC, οι οποίες συνεπάγονται πρωτεΐνες πολύ παρόμοια στον άνθρωπο και ποντικούς και μελετήθηκε σε δύο οργανισμούς [42], [43].

Εν περιλήψει, IL- 10-ανεπαρκή ποντίκια δεν αντιπροσωπεύουν ένα κατάλληλο ζωικό μοντέλο για τη μελέτη της οδού CIN καρκινογένεσης. Επιπλέον, η ανάπτυξη του όγκου σε αυτό το μοντέλο δεν εξαρτάται από βήτα-κατενίνης μετατόπιση.

Αντίθετα, με την παρουσία της ανευπλοειδίας και ενεργοποίηση βήτα-κατενίνης, το μοντέλο του ΑΟΜ /DSS-κολίτιδα μπορεί να παρέχει ένα πολύτιμο εργαλείο για να κερδίσει μια πιο λεπτομερή εικόνα για τη μοριακή αρχιτεκτονική της φλεγμονής που σχετίζεται με την καρκινογένεση και μηχανιστικά διερευνήσει κολίτιδα σχετιζόμενη με την καρκινογένεση με ιδιαίτερη έμφαση στις CIN.

ευχαριστίες

Οι συγγραφείς επιθυμούν να εκφράσουν την ευγνωμοσύνη τους για την Κάτια Grollich για εκτέλεση ανοσοϊστοχημεία και Gisela Grosser-Pape για την εξαιρετική βοήθεια για την προετοιμασία των διαφανειών για το DNA-κυτταρομετρία. Επιχορηγήσεις από το Ίδρυμα Werner και Κλάρα Kreitz και τη γερμανική Καρκίνο Βοήθειας (DKH # 108446: το

Βόρεια γερμανική Tumorbank του καρκίνου του παχέος εντέρου

) είναι ευγνωμοσύνη

.

You must be logged into post a comment.