Αφηρημένο

Οι αναστολείς της πολυ [ADP-ριβόζη] πολυμεράσης 1 (PARPis) δείχνουν υπόσχεση για τη θεραπεία των καρκίνων που στερούνται της ικανότητας για ομόλογο ανασυνδυασμό επισκευή (HRR). Ωστόσο, οι νέες θεραπευτικές στρατηγικές απαιτούνται προκειμένου να ξεπεραστεί έμφυτη και επίκτητη αντίσταση σε αυτά τα φάρμακα και έτσι επεκτείνει το φάσμα των καρκίνων που θα μπορούσαν να επωφεληθούν από αυτές. Δείχνουμε ότι ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές που ανταποκρίνονται καλά στην ABT-888 (α PARPi), γίνονται ευαίσθητα σε αυτό, όταν συν-θεραπεία με vorinostat (αναστολέας των αποακετυλασών των ιστονών (HDACi)). Vorinostat επίσης ευαισθητοποιημένα PARPis αναίσθητη καρκινικές κυτταρικές σειρές σε 6-θειογουανίνη (6-TG) -α φάρμακο που στοχεύει PARPis ευαίσθητα κύτταρα. Η επίδραση ευαισθητοποίησης των vorinostat συσχετίστηκε με αυξημένη φωσφορυλίωση των ευκαρυωτικών παράγοντα έναρξης (ΕΤΕ) 2α η οποία από μόνη της αυξάνει την ευαισθησία των καρκινικών κυττάρων στην ABT-888. Είναι σημαντικό ότι, αυτοί οι συνδυασμοί φαρμάκου δεν επηρέασε την επιβίωση των φυσιολογικών ινοβλαστών και κυττάρων του μαστού, και αύξησε σημαντικά την αναστολή της ξενομοσχεύματος όγκου ανάπτυξης σε σχέση με κάθε φάρμακο μόνο, χωρίς να επηρεάζεται το βάρος ποντικούς ή ηπατικής και νεφρικής λειτουργίας τους. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι ο συνδυασμός του vorinostat και ΑΒΤ-888 θα μπορούσε ενδεχομένως να αποδειχθούν χρήσιμα για τη θεραπεία του καρκίνου με έμφυτη αντίσταση στην PARPis οφείλεται στην ενεργό μηχανήματα HRR, ενώ ο συνδυασμός των vorinostat και 6-TG θα μπορούσε δυνητικά να ξεπεραστούν έμφυτη ή επίκτητη ανθεκτικότητα σε PARPis λόγω δευτεροβάθμιας ή αναστροφή μεταλλάξεις BRCA, με μειωμένο επίπεδο PARP-1 ή σε αυξημένη έκφραση των πολλαπλών ανθεκτικών πρωτεϊνών ναρκωτικών. Είναι σημαντικό, φάρμακα που αυξάνουν τη φωσφορυλίωση της eIF2α μπορεί να μιμηθεί τη δράση ευαισθητοποίησης των vorinostat στην κυτταρική απόκριση σε PARPis ή 6-TG, χωρίς την ενεργοποίηση όλων των κατάντη δράστες της

Παράθεση:. Yalon Μ, Tuval-Kochen L, Castel D, Moshe Ι, Mazal Ι, Cohen O, et al. (2016) Ξεπερνώντας αντίσταση των καρκινικών κυττάρων να PARP-1 αναστολείς με τρία διαφορετικά συνδυασμούς φαρμάκων. PLoS ONE 11 (5): e0155711. doi: 10.1371 /journal.pone.0155711

Επιμέλεια: Gayle Ε Woloschak, Northwestern University Feinberg School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 5 του Ιούλη 2015? Αποδεκτές: 3 του Μάη του 2016? Δημοσιεύθηκε: May 19, 2016

Copyright: © 2016 Yalon et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. https://ec.europa.eu/research/mariecurieactions/Grant # PCIG10-GA-2011 έως 303.795. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

έχει πρόσφατα ανακαλύφθηκε ότι τα κύτταρα του μαστού, των ωοθηκών και του καρκίνου του προστάτη που φέρουν δύο αλληλόμορφα μεταλλάξεις για γονιδιακή προδιάθεση του καρκίνου του μαστού (BRCA) 1 ή BRCA 2 ή που είναι φωσφατάση και tensin ομόλογο ανεπάρκεια (και ως εκ τούτου δεν μπορεί να εκφράζουν RAD51), είναι εξαιρετικά ευαίσθητα σε αναστολείς του PARPis και της διαγραφής του ΡΑΚΡ-1 [1,2]. Αυτά τα ευρήματα ενίσχυσε την αντίληψη ότι μειωμένη ικανότητα για HRR αποτελέσματα στην ευαισθησία προς PARPis.

Η οικογένεια ανθρώπινη PARP αποτελείται από 17 ενζύμων καθένα από τα οποία είναι το προϊόν ενός διαφορετικού γονιδίου. Τα ένζυμα διαθέτουν όλες συντηρημένες καταλυτικές περιοχές και πεδία σύνδεσης DNA. ΡΑΚΡ-1 δεσμεύεται με αδιέξοδο πιρούνια αναδιπλασιασμού καθώς και σε ενιαία διαλείμματα κλώνου (SSB,) που μπορεί να σχηματίσει αυθόρμητα, κατά την επισκευή βάση εκτομή ή σε απόκριση σε παράγοντες βλάβης του DNA. Δέσμευση σε βλάβες του DNA ενεργοποιεί PARP-1 που οδηγεί σε προσθήκη πολυ (ADP-ριβόζη) τμήματα από NAD

+ για πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην επιδιόρθωση του DNA και αντιγραφή συμπεριλαμβανομένων PARP-1 μόνη της και να ιστόνες στη γειτονία των θέσεων σύνδεσης PARP-1 του . Συσσώρευση πολυ (ADP-ριβόζη) οδηγεί σε πρόσληψη πρωτεϊνών επιδιόρθωσης του DNA. Στο SSB, ο κύριος ρόλος της PARP-1 είναι η πρόσληψη πρωτεΐνης cross-συμπλήρωση επισκευής x-ray 1 (ΧΚΧΧ1), ενώ στασιμότητα πιρούνια αναπαραγωγή της δραστηριότητα περιλαμβάνει την πρόσληψη του οδοφράγματος κινάσης 1 (CHK1) [3-5]. PARP-2 ενεργοποιείται επίσης από βλάβη του DNA και έχει ένα ρόλο στην καταστολή αυθόρμητο σχηματισμό του DNA τοξικών αλλοιώσεων, ωστόσο σχετική αφθονία του και καταλυτικές δραστηριότητες είναι χαμηλότερες από εκείνες του ΡΑΚΡ-1 [3]. Ενώ PARP-1 – /- ή PARP-2 – /- ποντίκια είναι βιώσιμα και υγιή, τα ποντίκια τα διπλά νοκ-άουτ πεθάνει στη μήτρα, γεγονός που υποδηλώνει ότι ορισμένοι από τους ρόλους που διαδραμάτισε καθεμία από αυτές τις PARPs είναι απαραίτητες και περιττές [1,3] . Η φαρμακολογική αναστολή της ΡΑΚΡ-1 δραστικότητα ή την διαγραφή του αναστέλλει την επισκευή του SSB, το οποίο εν απουσία της λειτουργικής HRR μπορεί να οδηγήσει σε σχηματισμό επιδιορθώθηκε θραύσεων διπλής έλικος (DSBs) κατά τη διάρκεια αντιγραφής, να αντιγραφή κατάρρευση πιρούνι και κυτταρικό θάνατο [1,3,4 ]. Είναι, επομένως, σαφές γιατί PAPRis ​​κύτταρα-στόχους με μεταλλαγμένο BRCA ή που είναι άλλως διαταράσσεται η ικανότητά τους για HRR. Δυστυχώς, εκτός από περιορισμένο πληθυσμό-στόχο τους, την ανάπτυξη της αντίστασης στην PARPis είναι μια σημαντική ανησυχία. Δευτερογενής μεταλλάξεις BRCA, που αποκαθιστούν το πλαίσιο του BRCA ανοικτή ανάγνωσης (ORF) και λειτουργικά τερματικό C, καθώς και αυξημένη έκφραση της αντίστασης σε πολλαπλά φάρμακα (MDR) 1 ή μειωμένη έκφραση ΡΑΚΡ-1 όλα οδηγούν στην απώλεια της ευαισθησίας σε αναστολείς PARP-1 [1 , 3]. Επίσης, η μειωμένη έκφραση της 53BP1 έχει αποδειχθεί να καταργήσει την ευαισθησία του BRCA1 μεταλλαγμένα κύτταρα να PARPis [6]. Είναι, επομένως, σημαντικό να βρούμε τρόπους για να ξεπεράσει την αντίσταση στην PARPis ανεξάρτητα από αυτό που αποκτώνται ή έμφυτη.

Σχετικά με την έννοια αυτή είναι τα ευρήματα που HDACis μειώνουν το επίπεδο των πρωτεϊνών HRR και στα 5 μΜ, vorinostat (η πρώτη HDACi να είναι εγκεκριμένη από την FDA για τη θεραπεία του καρκίνου) μειώνει δραματικά το επίπεδο αυτών των πρωτεϊνών σε καρκινικά κύτταρα αλλά όχι σε φυσιολογικά κύτταρα [7,8]. Ως εκ τούτου, vorinostat αναμένεται να ευαισθητοποιήσει τα καρκινικά κύτταρα σε θεραπεία με PARPis, ανεξάρτητα από έμφυτη ικανότητά τους για την επιδιόρθωση του DNA. Επίσης, η δραστικότητα του ΝΡ-κΒ και CHK1 η οποία συνδέεται με αντίσταση στην vorinostat [7] εξαρτάται από ΡΑΚΡ-1 δραστικότητα [5,9]. Ως εκ τούτου, vorinostat και PARPis αναμένεται την αμοιβαία ενίσχυση της αντι-νεοπλασματικής επίδρασης από την άλλη. Πράγματι, ενώ η εργασία αυτή ήταν σε εξέλιξη αρκετά εργαστήρια αναφέρθηκε ότι HDACis ευαισθητοποιημένα καλλιεργημένα καρκινικά κύτταρα να PARPis [10-14].

Εκτός PARPis, ο αντι-μεταβολίτης 6-θειογουανίνη (6-TG) επίσης στόχους κύτταρα με μετάλλαξη BRCA ή με άλλες ελλείψεις στην ικανότητά τους για HRR [15]. 6-TG χρησιμοποιείται σήμερα στη θεραπεία της οξείας λεμφοβλαστικής λευχαιμίας. Εντός κυττάρων 6-TG μεταβολίζεται σε 6-TG νουκλεοτίδιο το οποίο ενσωματώνεται στο DNA κατά τη διάρκεια της αντιγραφής. Μετά την ενσωμάτωσή τους στο DNA το νουκλεοτίδιο 6-TG υποβάλλεται σε S-μεθυλίωση, ενεργοποιώντας την επισκευή ασυμφωνία (MMR) και προκαλώντας σχηματισμό ϋδΒδ που απαιτούν HR για την επισκευή [16]. Επιπλέον, η 6-TG-εξαρτώμενη συσσώρευση των δραστικών μορφών οξυγόνου οδηγεί στην οξείδωση του ενσωματωμένου 6-TG και να MMR-ανεξάρτητο σχηματισμό ενδο-κλώνου εγκάρσιες συνδέσεις (ICL) [17], η οποία απαιτεί τη συνδυασμένη δράση του Fanconi αναιμία ( FA) και HRR πορείες για την επισκευή τους [17,18]. Είναι ενδιαφέρον ότι, τα κύτταρα που έγιναν ανθεκτικά σε PARPis λόγω δευτερογενούς μετάλλαξη BRCA2 ήταν ακόμη ευαίσθητα σε 6-TG [15]. Προφανώς, δευτεροβάθμια μεταλλάξεις δεν επιτρέπουν τις πρωτεΐνες BRCA να επισκευάσει MMR ανεξάρτητη βλάβες μετά το σχηματισμό της ICL [15,18]. Όπως αποδείχθηκε, το BRCA1 έχει ένα μοναδικό ρόλο στην FA-εξαρτώμενη επισκευή της ICL, η οποία δεν μπορεί να εκπληρωθεί από BRCA1 με μια δευτερεύουσα μετάλλαξη που κατήργησε την ευαισθησία να PARPis [18]. Η ικανότητα των vorinostat να μειώσει δραματικά το επίπεδο των πρωτεϊνών επιδιόρθωσης του DNA συμπεριλαμβανομένων των BRCA1 είναι πιθανό να ενισχύσει την επίδραση της 6-TG με τη μείωση τόσο FA-εξαρτώμενη και HR επισκευή. Επίσης, ούτε vorinostat ούτε 6-TG είναι πολλαπλά ανθεκτικών στα φάρμακα (MDR) 1 υποστρώματα [7,15] και, ως εκ τούτου συνδυασμένη δράση τους δεν θα πρέπει να επηρεαστεί από μια πιθανή αύξηση του επιπέδου των MDR1. Τέλος, vorinostat προκαλούμενη αύξηση στην φωσφορυλίωση της eIF2α αναμένεται επίσης να συμβάλει στην αναστολή της HRR [19] με αποτέλεσμα την αυξημένη κυτταρική απόκριση σε δύο PARPis και 6-TG.

Τα πειράματα που παρουσιάζονται εδώ δείχνουν ότι τα κύτταρα τα οποία ανταποκριθεί ανεπαρκώς σε PARP-1 αναστολέας-ABT- 888 -become ευαίσθητα σε αυτό με την παρουσία του vorinostat. Ομοίως, vorinostat ενίσχυσε την απόκριση των καρκινικών κυττάρων σε 6-TG. Υπό πειραματικές συνθήκες μας, η συνδυασμένη θεραπεία vorinostat και ΑΒΤ-888 έδειξε μόνο μια μέτρια επίδραση στο επίπεδο των γονιδίων BRCA1 και κανένας σε RAD51, αλλά έκανε οδηγούν σε αυξημένη φωσφορυλίωση της eIF2α. Πειράματα με τον αναστολέα φαρμακολογική του eIF2α αποφωσφορυλίωσης-salubrinal-καθώς και με την phosphomimetic S51D και μη φωσφορυλιώσιμη παραλλαγές S51A του eIF2α έδειξαν ότι η αυξημένη φωσφορυλίωση της eIF2α -σε και της ίδιας-ευαισθητοποιεί τα καρκινικά κύτταρα να ΑΒΤ-888.

Τέλος, οι συνδυασμένες θεραπείες της vorinostat και ΑΒΤ-888 ή vorinostat και 6-TG αυξηθεί σημαντικά η αναστολή των ξενομοσχευμάτων όγκων ανάπτυξης σε σχέση με κάθε φάρμακο μόνο χωρίς να επηρεάζει τα νεφρά ή το συκώτι λειτουργίες ή να προκαλεί σημαντική απώλεια βάρους.

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταρική καλλιέργεια

ανθρώπινο μαστού MDA ΜΒ-231-, ΒΤ-549 και MCF-7 και ανθρώπινου γλοιοβλαστώματος U-87 κυτταρικές γραμμές καρκίνου καθώς και πρωτογενή ανθρώπινα κύτταρα του μαστού ήταν από την American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA). Δερματική ανθρώπινους ινοβλάστες ελήφθησαν με τη γραπτή συγκατάθεση από δύο δότες (εγκρίθηκαν από το Διοικητικό κριτική Θεσμικών σε Sheba Medical Center, πρωτόκολλο # 7044). MDA-MB-231, MCF-7, ΒΤ-549 και U-87 ήταν επικυρώνονται από μικρή διαδοχική επανάληψη προφίλ.

Οι συνθήκες ανάπτυξης

MCF-7 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε χαμηλά επίπεδα γλυκόζης Dulbecco τροποποιημένο Eagle Medium (DMEM), τα κύτταρα υ87 αναπτύχθηκαν σε υψηλής γλυκόζης ϋΜΕΜ, MDA-MB-231 και ΒΤ-549 κύτταρα σε Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640. media γραμμή κυττάρων που έχει συμπληρωθεί με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FBS), πενικιλίνη και στρεπτομυκίνη από Biological Industries Kibbutz Beit-Haemek, Il. Το μέσο ανάπτυξης της ΒΤ-549 επίσης συμπληρώθηκε με 0.023 IU /ml ανθρώπινης ανασυνδυασμένης ινσουλίνης (Sigma, St. Louis, ΜΟ.). Οι ινοβλάστες αναπτύχθηκαν σε ϋΜΕΜ υψηλής γλυκόζης συμπληρωμένο με 20% FBS, πενικιλίνη-στρεπτομυκίνη, 1% μη απαραίτητα αμινοξέα και 0,2% β-μερκαπτοαιθανόλη (Invitrogen, Life Technologies Grand Island, ΝΥ). Πρωτογενή φυσιολογικά ανθρώπινα κύτταρα του μαστού αναπτύχθηκαν σε μαστικούς βασικό μέσο επιθηλιακού κυττάρου που περιέχει ανασυνδυασμένη ανθρώπινη ινσουλίνη, και ΤΟΡα, L-γλουταμίνη, επινεφρίνη, απο-τρανσφερρίνης, εκχύλισμα υπόφυσης και υδροκορτιζόνη ημιηλεκτρική όλα από την ATCC. Για την ανάλυση στυπώματος Western των κυτταρικών πρωτεϊνών κύτταρα απλώθηκαν σε μια πυκνότητα 4 · 10

3 ανά cm

2 και φάρμακα προστέθηκαν 48 ώρες μετά την επίστρωση από διαλύματα παρακαταθήκης σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) (Sigma, St. Louis ΜΟ). Οι έλεγχοι έλαβαν το όχημα. Η συγκέντρωση του DMSO στο μέσο ανάπτυξης δεν υπερβαίνει το 0,08%.

Ναρκωτικά

Salubrinal ήταν από την Calbiochem-Merck4Biosciences (Darmstadt, Γερμανία), vorinostat από εργαστήρια LC (Boston, MA), ABT -888 από SelleckChem ή APExBIO (Houston, ΤΧ), 6-TG από Tocris Bioscience (Bristol, UK) ή Sigma, (St. Louis, ΜΟ.), Ζ-VAD-FMK αγοράστηκε από APExBIO και γήρανση χρώση β-γαλακτοσιδάσης kit αγοράστηκε από την Cell Signaling Technologies (Boston, MA).

Colony δοκιμασία επιβίωσης

Επίστρωση για δοκιμασία επιβίωσης αποικίας, καταμέτρηση των αποικιών, και υπολογισμός του ποσοστού κλωνογονικού θανάτου (CD) πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19-21]. Οι αποικίες σταθεροποιήθηκαν, χρωματίστηκαν και μετρήθηκαν 10-14 ημέρες μετά την επίστρωση, όταν 90-95% των αποικιών στον έλεγχο κατείχε περισσότερο από 50 κύτταρα. Πειραματική δείκτες συνδυασμού (CI) και προσομοιούμενα στο ED50, ED75, ED90 και ED95 λήφθηκαν με την χρησιμοποίηση του προγράμματος υπολογιστή CompuSyn σύμφωνα με τους Chou [21]. CI & lt? 0.9 δείχνουν συνεργιστική αλληλεπίδραση. Πρωτογενή κύτταρα του μαστού δεν σχηματίζουν αποικίες. Ως εκ τούτου, τα κύτταρα απλώθηκαν σε πυκνότητα 300 κυττάρων /cm

2 και οι διάφορες φάρμακα προστέθηκαν μια ημέρα αργότερα για επιπλέον πέντε ημέρες. Ο κυτταρικός θάνατος προσδιορίσθηκε με δοκιμασία εξαίρεσης κυανούν τρυπανίου εκτελέστηκε εις τριπλούν και εκφράζονται ως επί τοις εκατό θανάτου κυττάρου (CD). Οι συγκεντρώσεις των φαρμάκων που χρησιμοποιούνται στην δοκιμασία επιβίωσης αποικίας μας ήταν στο εύρος των Cmax πλάσματος επιτυγχάνεται σε προκλινικές μελέτες με πειραματόζωα [22,23] και σε κλινικές μελέτες με ανθρώπινα [24].

ανάλυση κηλίδος Western

Παρασκευή των κυτταρολυμάτων και ανάλυση της θεραπείας που προκαλείται από αλλαγές στο επίπεδο της πρωτεΐνης και φωσφορυλίωση έγιναν όπως περιγράψαμε πριν από [19]. Η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη προσδιορίζεται με ένα αντιδραστήριο δικιγχονινικού οξέος (Bio-Rad, Hercules, CA), και ίση φόρτωση επιβεβαιώθηκε με μέτρηση της απορρόφησης στα 520 nm του Ponceau S (Sigma, St-Louis, ΜΟ) εκχυλίστηκε με ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (2,67 mM ΚΟΙ, 1.47 mM ΚΗ

2 ΡΟ

4, 8,1 mM Na

2HPO

4 και 1.125 Μ NaCl) από μεμονωμένες λωρίδες από ένα δίδυμο τρέξιμο [19,20]. Τα στυπώματα εκτέθηκαν σε φιλμ ακτίνων Χ για χημειοφωταύγεια μετά από αγωγή με αντιδραστήριο West Pico ECL (Thermo Scientific Rockford, IL). Οι τιμές για την ολοκληρωμένη πυκνότητα φωτός του αυτοραδιογραφήματα ελήφθησαν με Image λογισμικό J ΝΙΗ και χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό της θεραπείας που προκαλείται από τις αλλαγές στα επίπεδα της πρωτεΐνης και στην αναλογία του φωσφορυλιωμένου eIF2α (ρ-eIF2α) στο συνολικό επίπεδο της πρωτεΐνης. αντισώματα κουνελιού τα οποία αναγνωρίζουν είτε π-eIF2α (# 9721) ή και τα δύο (# 9722) η φωσφορυλιωμένη και μη-φωσφορυλιωμένη eIF2α, κουνελιού αντι-RAD51 (# D4B10), κουνελιού αντι-53BP1 (# 4937), κουνελιού αντι-PARP (# 46D11) και μονοκλωνικά αντισώματα κουνελιού έναντι c-IAP1, c-IAP2, survivin και ΧΙΑΡ (# 9770) ήταν από τη Cell Signaling Technologies (Boston, ΜΑ). Ποντίκι μονοκλωνικά αντισώματα εναντίον BRCA1 (κλώνος D9 # sc-6954) και κατά θειορεδοξίνης αλληλεπιδρώντας πρωτεΐνη (TXNIP) # sc-166234 ήταν από την Santa Cruz Biotechnology Inc. (Dallas, TX). Mouse μονοκλωνικά αντισώματα έναντι Πολυ (ADP) ριβόζη (PADPR) (10Η # ab14459) ήταν από abcamBiochemicals

® (Cambridge, UK).

Γήρανση σχετιζόμενη β-γαλακτοσιδάσης χρώση

Γήρανση β-γαλακτοσιδάσης κιτ χρώσης ήταν από τη Cell Signaling Technologies και χρώση πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

η επιμόλυνση των κυττάρων με πλασμίδια που κωδικοποιούν για παραλλαγές eIF2α

heIF2α S51A και heIF2α S51D σε pcDNA3.CD2 ελήφθησαν από Addgene (Cambridge, ΜΑ). Παροδική διαμόλυνση εκτελέστηκε με JetPei (Polyplus, New York, ΝΥ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή όπως περιγράφεται προηγουμένως [19]. Τα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν σε τρυβλία 6 φρεατίων, με 1.5 μg πλασμιδίου σε 2 ml μέσου ανάπτυξης χωρίς αντιβιοτικά επί 24 ώρες πριν από την προσθήκη 0.5 ml μέσου και προχωρώντας με το πειραματικό πρωτόκολλο.

Η ανάπτυξη του όγκου σε γυμνά ποντίκια

Όλες οι μελέτες σε ζώα διεξήχθησαν σύμφωνα με το πειραματικό πρωτόκολλο # 609/10 /ANIM το οποίο εγκρίθηκε από τη Φροντίδα και Χρήση Επιτροπής Θεσμικών ζώων σε Sheba Medical Center. Τα κύτταρα αιωρήθηκαν σε ένα μίγμα από matrigel (μειωμένη αυξητικό παράγοντα) (BD Biosciences, Bedford, ΜΑ) και RPMI (1: 1). Τα κύτταρα (1,5 * 10

6 σε 200 μλ) εγχύθηκε στην βουβωνική μαστικό λιπώδες στρώμα αθυμικών

nu

– /

nu

– θηλυκά ποντίκια ( Harlan, Ισραήλ) με βάρος ~ 20 gr. Τα ζώα ζυγίστηκαν 1-2 φορές την εβδομάδα και το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε 2-3 φορές την εβδομάδα με ένα ψηφιακό παχύμετρο. όγκος του όγκου υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον τύπο

V

= (

μια

×

β

2) × 0,5, όπου

«μια

» είναι η μεγαλύτερη διάσταση και

«β

» η κάθετη διάμετρο. Πειράματα που περιλαμβάνονται 7 ποντικούς ανά πειραματική ομάδα κατά τη δοκιμή το συνδυασμένο αποτέλεσμα των vorinostat και 6-TG στην αύξηση του όγκου και 10 ποντίκια ανά ομάδα κατά τη δοκιμή το συνδυασμένο αποτέλεσμα των vorinostat και ΑΒΤ-888. Το όχημα αποτελείται από 40% PEG και 20% DMSO σε 0,72% NaCl. Φάρμακα χορηγήθηκαν καθημερινά μέσω ενδοπεριτοναϊκής ένεσης (ε.π.) σε όλο το πείραμα αρχίζοντας μία ή δύο ημέρες πριν από τον ενοφθαλμισμό των κυττάρων και έλεγχοι έλαβαν το όχημα. Ο όγκος έγχυσης ήταν 250 μλ. Λόγω τυχαία ζημιά που προκαλείται από τις ενέσεις, μερικά ποντίκια ανέπτυξαν, εντός 24 ωρών μετά την ένεση, πολύ μεγάλα αιματώματα στο ένεση πλευρά που σχετίστηκαν με συμπτώματα δυσφορίας (καμπούρα στάση και τις δυσκολίες στις κινήσεις). Αυτοί οι ποντικοί υποβλήθηκαν σε ευθανασία με CO

2 ασφυξία. Ο αριθμός τους στο πείραμα που δοκιμάστηκε το αποτέλεσμα της συνδυασμένης vorinostat και θεραπεία ΑΒΤ-888 ήταν ως ακολούθως: C- (3 από 11), V- (2 από 10), ΑΒΤ-888 – (κανένα), V και ΑΒΤ -888 (2 από 11). Ο αριθμός των ποντικών που πέθαναν κατά τον ίδιο τρόπο κατά τη διάρκεια του πειράματος που δοκιμάστηκε το αποτέλεσμα της συνδυασμένης vorinostat και θεραπεία 6-TG ήταν ως ακολούθως: C- (κανένα) V- (1 από 7) 6-TG- (1 από 7) V και 6-TG- (1 από 7). Τα πειράματα που έληξε περίπου τέσσερις εβδομάδες μετά την έναρξη της διαδικασίας, όταν οι όγκοι άρχισαν να δείχνουν σημάδια νέκρωσης. Τα ποντίκια θυσιάστηκαν με CO

2 ασφυξία και δείγματα αίματος ελήφθησαν με καρδιακή παρακέντηση. Πλήρης αρίθμηση αίματος, μαζί με λειτουργίες ήπατος και των νεφρών διεξήχθησαν με A.M.L Κτηνιατρική Division, Herzlia, Il. Τα δείγματα από τα εσωτερικά όργανα σταθεροποιήθηκαν σε 4% ρυθμισμένη φορμαλίνη και υποβάλλονται σε επεξεργασία για αιματοξυλίνη και εοσίνη (Η &? Ε) και το κυανό της Πρωσίας χρώση

Στατιστική ανάλυση

in vitro αναλύσεις για κλωνογόνο επιβίωση:. Σημασία της διαφορές μεταξύ των πειραματικών ομάδων που έλαβαν θεραπεία με δύο παράγοντες και κάθε μία από τις ομάδες που λαμβάνουν θεραπεία με έναν παράγοντα ή ελέγχων επαληθεύθηκε με unpaired Student

t

δοκιμής.

P

& lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Πειράματα με γυμνά ποντίκια:. ANOVA με επαναλαμβανόμενες μετρήσεις χρησιμοποιήθηκε για τη δοκιμή για τη σημασία των παρατηρούμενων διαφορών στο μέγεθος του όγκου μεταξύ των διαφόρων πειραματικών ομάδων. Η ανάλυση περιελάμβανε ποντίκια που επέζησαν σε όλα τα πειράματα. χρησιμοποιήθηκαν φορά εντός αντικείμενο παράγοντα και V και ΑΒΤ ή V και 6-TG μεταξύ υποκειμένου παράγοντες. Για την προσέγγιση κανονική κατανομή, τα δεδομένα αναλύθηκαν μετά τετραγωνική ρίζα μετασχηματισμό. ANOVA με επαναλαμβανόμενες μετρήσεις χρησιμοποιήθηκε επίσης για να αποδείξει την έλλειψη θεραπείας που προκαλείται από αλλαγές στο βάρος ποντίκια.

σ

& lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική.

Αποτελέσματα

Vorinostat ευαισθητοποιεί τα καρκινικά κύτταρα in vitro με τη θεραπεία με ABT- 888

Έχει αναφερθεί ότι vorinostat μειώνει το επίπεδο των πρωτεϊνών επιδιόρθωσης του DNA στον καρκίνο αλλά όχι σε φυσιολογικά κύτταρα [8]. Έχουμε επίσης παρατηρήσει ότι vorinostat οδήγησε σε εξαρτώμενη από τη δόση μείωση της τάξης του BRCA1 και το επίπεδο RAD51 σε MDA-MB-231 κύτταρα (S1 Εικ). Αυτά τα αποτελέσματα μας ώθησε να δοκιμαστεί η επίδραση του vorinostat στην ευαισθησία των καρκινικών κυττάρων στον PARPi-ΑΒΤ-888.

Έχει αναφερθεί ότι 5 μΜ ΑΒΤ-888 οδηγεί σε ~ 90% μείωση στην κλωνογονική επιβίωση των MDA-MB-436 BRCA1 μεταλλαγμένα καρκινικά κύτταρα του μαστού γραμμής [25]. Σε αντίθεση, MDA-MB-231 η οποία διαθέτει άγριου τύπου BRCA1 [26] ανταποκρίθηκαν ανεπαρκώς σε αγωγή με 7-10 μΜ ΑΒΤ-888 (Σχήμα 1). Ακόμα, ο αναστολέας ήταν ενεργός εντός των κυττάρων όπως αποδεικνύεται από την ικανότητά της να καταργήσει H

2O

2 προκαλούμενη σχηματισμό πολυ (ADP) ριβόζης (Εικόνα 1 b). Η τριπλή αρνητική ΒΤ-549 καρκίνου του μαστού κυτταρική γραμμή και το γλοιοβλαστώματος U-87 ήταν παρόμοια ανθεκτική σε ΑΒΤ-888, ενώ το οιστρογόνο εξαρτώμενος MCF-7 καρκίνου του μαστού κυτταρική γραμμή ήταν σχετικά ευαίσθητος στο φάρμακο. Παρ ‘όλα αυτά, όπως σημειώνεται στο σχήμα 1α, vorinostat-ενίσχυσε την απόκριση όλων αυτών των κυτταρικών σειρών για ΑΒΤ-888 και όλα τα πειραματικά και προσομοιωμένα CI έδειξε ότι η αλληλεπίδραση μεταξύ vorinostat και ΑΒΤ-888 είναι συνεργιστική (Εικ 1α και S1 πίνακα). Υπό πειραματικές συνθήκες μας, φυσιολογικές ανθρώπινες ινοβλάστες και τα κύτταρα του μαστού επηρεάστηκαν ελάχιστα από οποιοδήποτε από αυτούς τους παράγοντες ή συνδυασμό τους.

α. Κλωνογονικού θάνατο σε απάντηση συνδυασμένη θεραπεία vorinostat και ΑΒΤ-888: κυτταρικές σειρές του καρκίνου και ινοβλάστες καλλιεργήθηκαν για αναλύσεις κλωνογόνο επιβίωση και αντιμετωπίζονται με vorinostat, ΑΒΤ-888 ή και τα δύο. Οι τιμές είναι μέσοι κλωνογόνο θανάτου (CD) (%) των τριπλών ± SEM. Προσδιορισμός τοις εκατό θανάτου κυττάρου (CD) για τα φυσιολογικά κύτταρα του μαστού πραγματοποιήθηκε με δοκιμασία εξαίρεσης κυανούν τρυπανίου. Το πείραμα επανελήφθη μια φορά με παρόμοια αποτελέσματα. Οι διαφορές μεταξύ των CD της συνδυασμένης θεραπείας και κάθε μία από τις επεξεργασίες μοναδικού ή τους μάρτυρες ήταν σημαντικές. *

σ

& lt? 0,05, ** p & lt? 0,01. δείκτες συνδυασμού (CI) ήταν & lt? 0.9. σι. ΑΒΤ-888 είναι ενεργή εντός των κυττάρων: ΜϋΑ-ΜΒ-231 κύτταρα επωάστηκαν όλη τη νύκτα με 10 μΜ ΑΒΤ-888 από 15 λεπτά με 1 mM Η2Ο2 πριν τη συγκομιδή και επεξεργασία για την ανίχνευση της πολυ (ADP-ριβόζη) (PADPR) με western blot .

η

Μοριακοί μηχανισμοί που διέπουν τη δράση ευαισθητοποίησης των vorinostat

Χρησιμοποιώντας τις πειραματικές συνθήκες που απεικονίζονται στο σχήμα 1α καθορίσαμε το επίπεδο της πρωτεΐνης επιδιόρθωσης του DNA σε κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με vorinostat, ΑΒΤ-888 και ο συνδυασμός τους. Σε αντίθεση με τις προσδοκίες μας, βρήκαμε ότι ο συνδυασμός των vorinostat και ΑΒΤ-888 είχε μόνο μια μέτρια επίδραση στο επίπεδο των γονιδίων BRCA1, μειώνοντάς την κατά περισσότερο από ~ 40%, ενώ το επίπεδο της RAD51 ήταν ανεπηρέαστη. Περιέργως, το επίπεδο της 53-ΒΡ1 αυξήθηκε κατά vorinostat, και με ΑΒΤ-888, και ο συνδυασμός τους αύξησε το επίπεδο 53BP1 περισσότερο από ότι έκαστο φάρμακο μόνο του (Σχήμα 2a-2c). Η πιθανή επίπτωση της αύξησης του επιπέδου της 53BP1 στο πρόσωπο μειωμένο επίπεδο του BRCA1 για την κυτταρική ευαισθησία στην PARPis θεωρείται στη συζήτηση (Σχήμα 2).

Η συνδυασμένη θεραπεία vorinostat και ΑΒΤ-888 μείωσε το επίπεδο της BRCA 1 κατά ~ 30% (α), δεν επηρέασε το επίπεδο της RAD51 (β), αύξησε το επίπεδο 53BP1 σχέση με το μάρτυρα ΑΒΤ-888 ή κύτταρα που υπέστησαν αγωγή vorinostat (γ) και μείωσε το επίπεδο του TXNIP (δ). ΑΒΤ-888 (10 μΜ), vorinostat (0,5 μΜ) και ο συνδυασμός τους προστέθηκαν στα κύτταρα 48 ώρες μετά την επίστρωση. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν 48 ώρες αργότερα και σε επεξεργασία για ανάλυση στυπώματος Western των μεταβολών στα επίπεδα του BRCA1, RAD51 και TXNIP. Οι αριθμοί στο κάτω μέρος των αυτοακτινογραφημάτων δείχνουν τις αλλαγές σε σχέση με τους ελέγχους στο επίπεδο του BRCA1, RAD51, TXNIP και φορτώνονται πρωτεϊνών (Ponceau). Το πείραμα επανελήφθη μια φορά με παρόμοια αποτελέσματα. Unabridged εικόνες των αυτοραδιογραφημάτων παρουσιάζονται σε πίνακες (α) και (β) φαίνεται στο S2 Σχ.

Η

Σε περίπτωση απουσίας ενός δραματική επίδραση της συνδυασμένης θεραπείας με το επίπεδο της BRCA 1 ή RAD51 προσδιορίσαμε η επίδραση της vorinostat, ΑΒΤ-888 και ο συνδυασμός τους με το επίπεδο της κυτταρικής θειορεδοξίνης πρωτεΐνη αλληλεπίδρασης (TXNIP). Έχει αναφερθεί ότι πριν από αυξημένη έκφραση του TXNIP διέπει τη διαφορική επίδραση της vorinostat επί καρκινικών κυττάρων [27]. Έχουμε επίσης καταδείξει ότι οι υψηλές συγκεντρώσεις vorinostat οδήγησε σε δοσοεξαρτώμενη αύξηση του TXNIP σε MDA-MB-231 κύτταρα (S1 Εικ). Ωστόσο, υπό πειραματικές μας συνθήκες, ο συνδυασμός των vorinostat και ΑΒΤ-888, η οποία ενίσχυσε κυτταρικό θάνατο επανειλημμένα οδήγησε σε μείωση και όχι την αύξηση του επιπέδου των TXNIP σε MDA-MB-231 κύτταρα (Σχ 2d).

Εκτός από την TXNIP, αυξημένη φωσφορυλίωση του eIF2α έχει επίσης αποδειχθεί, από διάφορα εργαστήρια, συμπεριλαμβανομένων δική μας, να μεσολαβούν στην κυτταροτοξική δράση του Vorinostat επί καρκινικών κυττάρων [19,28]. Ως εκ τούτου, εξετάστηκε το επίπεδο της φωσφορυλίωσης eIF2α σε κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με τόσο vorinostat και ΑΒΤ-888 και διαπίστωσε ότι vorinostat σε συγκεντρώσεις που αυξημένη ευαισθησία στην ABT-888, οδήγησε σε σημαντική αύξηση της φωσφορυλίωσης eIF2α, ενώ ΑΒΤ-888 και μόνο οδήγησε σε ένα μόνο ελαφρά αύξηση στη φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης. Σε κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με δύο παράγοντες, το επίπεδο της φωσφορυλιωμένης eIF2α ήταν παρόμοια με εκείνη που λαμβάνεται μόνο με vorinostat. Αντιθέτως, η συνδυασμένη δράση των vorinostat και ΑΒΤ-888 απέτυχε να αυξήσει το επίπεδο της φωσφορυλιωμένης eIF2α σε ανθρώπινους ινοβλάστες ή σε ανθρώπινα φυσιολογικά κύτταρα του μαστού (Εικ 3α).

α. Vorinostat αυξημένη φωσφορυλίωση eIF2α σε ΑΒΤ-888 αγωγή MDA-MB-231 κύτταρα αλλά όχι σε ΑΒΤ-888 ινοβλαστών θεραπεύεται και τα φυσιολογικά κύτταρα του μαστού: ΑΒΤ-888 (10 μΜ), vorinostat (0,5 μΜ) και ο συνδυασμός τους προστέθηκαν στα κύτταρα 48 ώρες μετά την επίστρωση. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν 48 ώρες αργότερα και σε επεξεργασία για ανάλυση κηλίδος western των μεταβολών του λόγου ρ-eIF2α /eIF2α. Οι αριθμοί στο κάτω μέρος των αυτοραδιογραφημάτων υποδεικνύουν αλλαγές σε σχέση με τους ελέγχους της ρ-eIF2α /eIF2α και φορτώνονται πρωτεϊνών (Ponceau). Το πείραμα επανελήφθη μια φορά με παρόμοια αποτελέσματα. σι. Salubrinal αυξάνει CD των κυττάρων MDA-MB-231 κυττάρων σε απόκριση σε ΑΒΤ-888: Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με salubrinal, ΑΒΤ-888 ή και τα δύο. Οι τιμές είναι μέσοι CD (%) των τριπλών ± SEM. Το πείραμα επανελήφθη μια φορά με παρόμοια αποτελέσματα. Οι διαφορές μεταξύ των CD (%) της συνδυασμένης θεραπείας και κάθε μία από τις πειραματικές θεραπείες ή έλεγχοι ήταν σημαντικές. **

σ

& lt? 0,01, *

σ

& lt? 0,05. CI ήταν & lt? 0.9. ντο. Μια παραλλαγή phosphomimetic eIF2α αυξήσεις κλωνογονικού θάνατο σε απόκριση ΑΒΤ-888: The PARPi (10 μΜ) προστέθηκε στα κύτταρα 18 ώρες μετά την επιμόλυνση με 1.5μg /2 ml eIF2α S51A ή eIF2α S51D. Οι αποικίες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για ανάλυση 10 ημέρας μετά την έναρξη της θεραπείας. Οι τιμές είναι μέσοι CD (%) των δειγμάτων εις τριπλούν ± SEM. Το πείραμα επαναλήφθηκε δύο φορές με παρόμοια αποτελέσματα. Διαφορές μεταξύ καθενός από τους ελέγχους και τους ομολόγους τους αντιμετωπίζονται ΑΒΤ-888, καθώς και μεταξύ των αντιμετωπίζονται S51A και S51D παραλλαγές ΑΒΤ-888 ήταν σημαντικές. SA-μη-φωσφορυλίωσης S51A eIF2α, SD-phosphomimetic S51D eIF2α. ρε. Salubrinal αυξάνει φωσφορυλίωση eIF2α και έκφραση 53BP1 σε κύτταρα κατεργασμένα ΑΒΤ-888 χωρίς να επηρεάζει το επίπεδο της BRCA 1 ή RAD51: ΑΒΤ-888 (10 μΜ) και salubrinal (4,5 μΜ) προστέθηκαν στα κύτταρα 48 ώρες μετά την επίστρωση. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν 48 ώρες αργότερα και σε επεξεργασία για ανάλυση western blot των μεταβολών της BRCA1, RAD51, 53BP1 και ο λόγος ρ-eIF2α /eIF2α. Οι αριθμοί στο κάτω μέρος των αυτοακτινογραφημάτων είναι οι αλλαγές σε σχέση με τους ελέγχους του επιπέδου του BRCA1, RAD51, 53P1, η αναλογία p-eIF2α /eIF2α και τα ποσά των φορτωμένων πρωτεϊνών (Ponceau). Το πείραμα επανελήφθη μια φορά με παρόμοια αποτελέσματα. μι. Το επίπεδο της φωσφορυλιωμένης eIF2α είναι υψηλότερο και το επίπεδο της συνολικής eIF2α είναι χαμηλότερη σε κανονικούς ινοβλάστες και τα κύτταρα του μαστού σε σύγκριση με καρκινικά κύτταρα: Τα κύτταρα συλλέχθηκαν για ανάλυση στυπώματος western τέσσερα ημέρες μετά επιμετάλλωσης. Το πείραμα επανελήφθη μια φορά με παρόμοια αποτελέσματα. Οι αριθμοί στο κάτω μέρος των αυτοραδιογραφημάτων υποδεικνύουν αλλαγές σε σχέση με τον έλεγχο των peIF2α /eIF2α και η ποσότητα του φορτώνεται πρωτεϊνών (Ponceau). Το πείραμα επανελήφθη μια φορά με παρόμοια αποτελέσματα. Χωρίς περικοπές εικόνες του αυτοραδιογράμματος MDA στον πίνακα (α) του RAD51 και 53BP1 στον πίνακα (δ) και των αυτοραδιογραφημάτων στο πάνελ (ε) παρουσιάζονται στο S3 Εικ.

Η

Για να προσδιοριστεί εάν η αυξημένη φωσφορυλίωση της eIF2α σε ΑΒΤ-888 αγωγή καρκινικά κύτταρα συνεισφέρει στην επίδραση ευαισθητοποίησης του vorinostat, αξιολογήσαμε την επίδραση της salubrinal-αναστολέας της eIF2α αποφωσφορυλίωσης-σχετικά με την ευαισθησία των κυττάρων σε ΑΒΤ-888. Όπως σημειώνεται στο σχήμα 3β και σε S2 Πίνακα, salubrinal ενίσχυσε την ευαισθησία των κυττάρων σε ΑΒΤ-888, και ελήφθησαν παρόμοια αποτελέσματα με την παραλλαγή phosphomimetic eIF2α S51D (Σχήμα 3c). Σε συμφωνία με την επίδρασή του στην ευαισθησία των καρκινικών κυττάρων στην ABT-888, salubrinal μιμήθηκε την επίδραση της vorinostat την αυξημένη φωσφορυλίωση της eIF2α στην ABT 888 κύτταρα αντιμετωπίζονται και παρόμοια με το συνδυασμό vorinostat και ΑΒΤ-888, ο συνδυασμός των salubrinal και ΑΒΤ-888 δεν μειώνει το επίπεδο της RAD51. Ωστόσο, σε αντίθεση με την επίδραση της vorinostat, η δράση ευαισθητοποίησης του salubrinal επιτεύχθηκε χωρίς καθόλου επηρεάζουν το επίπεδο της BRCA 1 (Σχήμα 3δ). Είναι ενδιαφέρον ότι η επίδραση της salubrinal μόνος στο επίπεδο της 53BP1 ήταν υψηλότερο από αυτό που παρατηρείται με vorinostat ή ΑΒΤ-888 και μόνο, και σε κύτταρα επεξεργασμένα με τόσο salubrinal και ΑΒΤ-888, το επίπεδο του 53BP1 ήταν υψηλότερο από εκείνο που παρατηρήθηκε σε ΑΒΤ-888 κατεργασία κύτταρα και παρόμοια με εκείνη που αναφέρεται στα κύτταρα κατεργασμένα με salubrinal μόνο (Σχήμα 3δ).

Αξίζει να σημειωθεί, σε μη επεξεργασμένα ινοβλάστες ή φυσιολογικά κύτταρα του μαστού, το επίπεδο των συνολικών eIF2α ήταν πολύ χαμηλότερο και το επίπεδο του φωσφορυλιωμένου πρωτεΐνης ήταν πολύ υψηλότερο σε σχέση με το μη επεξεργασμένο ανθρώπινου καρκίνου του μαστού κυτταρική γραμμή MDA-MB-231 (Σχήμα 3Ε), υποδεικνύοντας ότι τα φυσιολογικά κύτταρα μπορεί να είναι πιο ανεκτική από τα καρκινικά κύτταρα σε αυξημένη φωσφορυλίωση eIF2α.

Υπό πειραματικές συνθήκες μας, η ερεθιστική επίδραση του vorinostat στην κυτταρική απόκριση σε ΑΒΤ-888 δεν επηρεάστηκε από την παρουσία του παν-κασπάσης αναστολέα-z-VAD-fmk (S4 Εικ). Μια κασπάσης-ανεξάρτητη επίδραση της vorinostat στην επιβίωση των κυττάρων αποδείχθηκε πριν από Xu et al. [29]. Περιέργως, z-VAD-fmk από μόνη της οδήγησε σε μια δοσο-εξαρτώμενη μείωση στην επιβίωση-ένα κύτταρο φαινόμενο που έχει παρατηρηθεί προηγουμένως σε διάφορα κυτταρικά συστήματα [30-32].

σχετικά υψηλές συγκεντρώσεις vorinostat (5 -10 διπλώνει υψηλότερες από αυτές που χρησιμοποιούνται στις μελέτες μας) έχουν δειχθεί ότι μειώνουν δραματικά το επίπεδο του αναστολέα της πρωτεΐνης απόπτωση) οικογένεια (ΙΑΡ όπως c-IAP1, c-IAP2, ΧΙΑΡ και survivin [29]. Συνεπώς εξετάσαμε την επίδραση της vorinostat και εκείνη της συνδυασμένης θεραπείας της vorinostat και ΑΒΤ-888 στο επίπεδο αυτών των πρωτεϊνών (S5 Εικ). Υπό πειραματικές συνθήκες μας, vorinostat δεν επηρέασε το επίπεδο της γ-IAP1, survivin και ΧΙΑΡ. Επίσης, ΑΒΤ-888 δεν επηρέασε το επίπεδο αυτών των πρωτεϊνών. Το επίπεδο της γ-IAP2 μειώθηκε κατά επεξεργασίας vorinostat, αλλά αυξήθηκε κατά ΑΒΤ-888. Παρ ‘όλα αυτά, κάτω από πειραματικές συνθήκες μας, η συνδυασμένη θεραπεία έκανε να μην επηρεάζουν το επίπεδο αυτών των ΙΑΡ.

Η συνδυασμένη θεραπεία vorinostat και ΑΒΤ-888 ήταν όμως σχετίζεται με αυξημένη εμφάνιση της διευρυμένης επίπεδη γηρασμένα αναζητούν κύτταρα τα οποία χρωματίζονται για δραστικότητα β-γαλακτοσιδάσης (S6 Εικ). Εδώ επίσης, μια παρόμοια επίδραση των vorinostat έχει αναφερθεί πριν από Xu et al. [33].

Είναι ενδιαφέρον ότι, παρόμοια με τη θεραπεία με vorinostat και ΑΒΤ-888, η θεραπεία με salubrinal και ΑΒΤ-888 οδήγησε σε αυξημένη εμφάνιση του γηρασμένων κυττάρων τα οποία αναζητούν χρώση για β-γαλακτοσιδάση (S6 Εικ). Επίσης, όπως vorinostat, salubrinal δεν επηρεάζουν το επίπεδο της γ-IAP1, survivin και ΧΙΑΡ, αλλά οδήγησε σε μειωμένο επίπεδο της γ-IAP2, και όπως vorinostat και ΑΒΤ-888, συνδυασμένη θεραπεία της salubrinal και ΑΒΤ-888 δεν επηρέασε το επίπεδο αυτών των ΙΑΡ (S5 Σχήμα).

αυξημένη αναστολή της ανάπτυξης όγκου ξενομοσχεύματος σε ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με αμφότερα vorinostat και ΑΒΤ-888

η επίδραση της vorinostat στην ευαισθησία των κυττάρων MDA-MB-231 να ABT-888 είχε αναπαραχθεί in vivo. Συνδυασμένη θεραπεία του vorinostat και ΑΒΤ-888 οδήγησε σε σημαντική αναστολή της ανάπτυξης όγκου σε σχέση με κάθε μόνη θεραπεία (Εικ 4α). Οι διάφορες θεραπείες δεν οδηγούν σε σημαντική επίδραση στο σωματικό βάρος (Σχήμα 4β) και δεν φαίνεται να επηρεάζει γενική αίματος, ηπατική ή νεφρική λειτουργίες (S3 και S4 πίνακες). Η &? Ε χρώση τομών από εσωτερικού οργάνου δεν έδειξαν θεραπεία επαγόμενης μεταβολές στην καρδιά, το ήπαρ, τους νεφρούς και τους πνεύμονες.