Αφηρημένο

Φόντο

Η έκφραση της Livin, μέλος των αναστολέων της οικογένειας πρωτεϊνών απόπτωσης, συνδέεται με την ανάπτυξη και την εξέλιξη του όγκου. Οι στόχοι αυτής της μελέτης ήταν να αξιολογήσει κατά πόσον Livin επηρεάζει ογκογόνο βιολογική συμπεριφορά του καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρων, και να τεκμηριώνει τη σχέση ανάμεσα στην έκφραση του και διάφορα κλινικοπαθολογικών παραμέτρων σε καρκίνο του παχέος εντέρου.

Μέθοδοι

Ερευνήσαμε ο αντίκτυπος της Livin στη συμπεριφορά των καρκινικών κυττάρων με τη χρήση του μικρό παρεμβαλλόμενο RNA και ροϋΝΑ3.1 φορέα σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου SW480 και DKO1. Η έκφραση του Livin διερευνήθηκε με RT-PCR και ανοσοϊστοχημεία σε coloretcal καρκινικούς ιστούς. Τα αποπτωτικά κύτταρα έγιναν ορατά με δοκιμασία TUNEL, και πολλαπλασιαστικά κύτταρα έγιναν ορατά με χρώση αντίσωμα Ki-67.

Αποτελέσματα

εξόντωση Livin κατέστειλε μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων και εισβολή σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα. Εξόντωση Livin προκάλεσε την απόπτωση με διέγερση έκφρασης p27-up ρυθμίσεως της κασπάσης-3, -7 και PARP δραστηριότητες και τη διακοπή του κυτταρικού κύκλου με μείωση κυκλίνη D1, κυκλίνη D3, εξαρτώμενη από κυκλίνη κινάση 4 και 6, και με. Οι καταρράκτες σηματοδότησης ΜΑΡΚ σημαντικά μπλοκαριστεί από νοκ ντάουν της Livin. Σε αντίθεση, η υπερέκφραση του Livin ενισχυμένη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων και εισβολή, και ανέστειλε την απόπτωση και κυτταρικό κύκλο σύλληψης. Η μέση τιμή αποπτωτικό δείκτη (ΑΙ) της Livin θετικών όγκων ήταν σημαντικά χαμηλότερη από ό, τι AI των αρνητικών όγκων Livin. Ωστόσο, δεν υπήρξε σημαντική διαφορά μεταξύ Livin έκφρασης και δείκτης σήμανσης Κϊ-67 (ΚΙ). Livin έκφραση ήταν σημαντικά αυξημένη σε καρκίνο του παχέος εντέρου και μεταστατικό ιστούς λεμφαδένα σε σύγκριση με την κανονική του παχέος βλεννογόνου και μη μεταστατικό λεμφαδένα ιστούς και συνδέθηκε με το στάδιο του όγκου, lymphovascular εισβολή, μετάσταση λεμφαδένα και φτωχή επιβίωση.

Συμπεράσματα

Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι Livin συνδέεται με την εξέλιξη του όγκου με την αύξηση των καρκινικών κυττάρων κινητικότητα και την αναστολή της απόπτωσης σε καρκίνο του παχέος εντέρου

Παράθεση:. Myung DS, Πάρκο YL, Chung CY, Πάρκο HC, Kim JS, Cho SB, et al. (2013) Έκφραση του Livin στον Καρκίνο του παχέος εντέρου και τη σχέση του με Όγκων Κυττάρων Συμπεριφορά και πρόγνωση. PLoS ONE 8 (9): e73262. doi: 10.1371 /journal.pone.0073262

Επιμέλεια: DunFa Peng, Πανεπιστήμιο Vanderbilt Ιατρικό Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 19 Φλεβάρη 2013? Αποδεκτές: 19, Ιουλίου 2013? Δημοσιεύθηκε: 2η Σεπτεμβρίου 2013

Copyright: © 2013 Myung et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από μια επιχορήγηση (0720570) από το Εθνικό Δίκτυο Έρευνας & amp? Πρόγραμμα Ανάπτυξης για τον Έλεγχο του Καρκίνου, Υπουργείο Υγείας & amp? Πρόνοιας, Δημοκρατία της Κορέας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος του παχέος εντέρου είναι μία από τις κύριες αιτίες του καρκίνου που σχετίζονται με τη νοσηρότητα και τη θνησιμότητα στον κόσμο. Παρά την απόδειξη ότι 5-ετή επιβίωση είναι 90% όταν ορθοκολικό καρκίνο έχει διαγνωστεί σε πρώιμο στάδιο, & lt? 40% των περιπτώσεων διαγιγνώσκονται όταν ο καρκίνος εξακολουθεί να είναι εντοπισμένη [1]. Ταχεία πρόοδος στην κατανόηση μας για τις μοριακές και βιολογικές χαρακτηριστικά του καρκίνου του παχέος εντέρου έχουν παράσχει χρήσιμες γνώσεις στην παθογένεση του καρκίνου του παχέος εντέρου. Οι βιοδείκτες έχουν αναπτυχθεί για τον εντοπισμό ατόμων που θα ωφεληθούν περισσότερο από την επιτήρηση του καρκίνου και τη διαχείριση [2-5]. Identifiying βιοδείκτες που μπορεί να ανιχνεύσει καρκίνο του παχέος εντέρου νωρίτερα ή την παρακολούθηση της εξέλιξης του καρκίνου θα επιτρέψει εξατομίκευση της ιατρικής και να βελτιώσει τα ποσοστά επιβίωσης των ασθενών με καρκίνο.

Οι υποκείμενοι μηχανισμοί δράσης στην εξέλιξη του καρκίνου αρχίζουν να κατέρρευσε. Οι αναφερόμενες μοριακών και βιοχημικών μηχανισμών που μπορούν να συμβάλλουν στις φαινοτυπικές αλλαγές υπέρ της καρκινογένεσης, περιλαμβάνουν ανέστειλε την απόπτωση, ενισχυμένη πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων, αυξημένη διεισδυτικότητα, διαταραχή προσκόλλησης κυττάρου, προαγωγή αγγειογένεσης, και ανέστειλε ανοσολογική επιτήρηση. Αυτά τα γεγονότα μπορούν να συμβάλουν στην ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου [6-8].

Η απόπτωση παίζει σημαντικό ρόλο σε πολλές βιολογικές εκδηλώσεις, συμπεριλαμβανομένων της μορφογένεσης, ο κύκλος εργασιών των κυττάρων και την εξάλειψη των επιβλαβών κυττάρων. Μια διαταραχή στην απόπτωση μπορεί να παρέχουν ένα πλεονέκτημα επιβίωσης σε κακοήθη κύτταρα που φέρουν γενετικές μεταβολές και ως εκ τούτου την προώθηση της εξέλιξης του καρκίνου [9,10]. Το κεντρικό γεγονός στην απόπτωση είναι η πρωτεολυτική ενεργοποίηση μιας κατηγορίας κυστεΐνης ασπαρτυλ-ειδικές πρωτεάσες, τις κασπάσες. Initiator κασπάσες διασπούν κασπάσες ενέργειας που στη συνέχεια αποικοδομείται έναν αριθμό ενδοκυτταρικών υποστρωμάτων πρωτεΐνης και ως εκ τούτου διεγείρουν τις χαρακτηριστικές μορφολογικές χαρακτηριστικά της απόπτωσης [11]. Οι δραστηριότητες αυτές κασπάσης αναστέλλεται από τους αναστολείς της απόπτωσης πρωτεϊνών οικογένειας (ΙΑΡ). Μέχρι τώρα, έχουν οκτώ ανθρώπινα ΙΑΡ έχουν εντοπιστεί, συμπεριλαμβανομένων των γ-IAP1, c-IAP2, ΝΑΙΡ, ΧΙΑΡ, ILP-2, BRUCE, Survivin και Livin [12]. Livin ταυτοποιήθηκε πρόσφατα ότι είναι μία νέα αντι-αποπτωτικό γονίδιο. Livin προσλαμβάνεται σε συμπλέγματα σηματοδότησης των υποδοχέων θανάτου, όπου αναστέλλει την ενεργοποίηση των κασπασών υπεύθυνα για την απόπτωση και προστατεύει τα κύτταρα από διάφορες προ-αποπτωτικά ερεθίσματα. Livin σχετίζεται με την επαγωγή των ογκογόνων φαινοτύπων συμπεριλαμβανομένης της εισβολής, κινητικότητα, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και η αναστολή της απόπτωσης σε ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές [13-16]. Επιπλέον, Livin έκφραση στη συντριπτική πλειονότητα των ανθρώπινων καρκίνων είναι ενισχυμένη και συσχετίζεται με την ανάπτυξη του καρκίνου και την εξέλιξη [17-22]. Αποσιώπηση του γονιδίου Livin χρησιμοποιώντας μικρά RNA παρεμβολής (siRNA) μειώνει τον όγκο του όγκου με διέγερση απόπτωσης σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος καρκίνου του παχέος εντέρου [23]. Ως εκ τούτου, Livin θεωρείται πιθανό θεραπευτικό στόχο για την θεραπεία καρκίνου του παχέος εντέρου.

Οι στόχοι αυτής της μελέτης ήταν να αξιολογηθεί εάν Livin επηρεάζει ογκογόνο βιολογική συμπεριφορά του ανθρώπινου ορθοκολικού καρκίνου, κύτταρα για την αξιολόγηση Livin έκφραση σε ανθρώπινο ορθοκολικό καρκινικούς ιστούς, και να εξετάσει τη συσχέτιση των Livin με την απόπτωση, τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά, όπως η επιβίωση.

Υλικά και Μέθοδοι

δήλωση Ηθικής

Αυτή η μελέτη εγκρίθηκε από το Institutional Review Διοικητικό Chonnam Εθνικό Πανεπιστήμιο Hwasun Νοσοκομείο (Jeonnam, Κορέα). Μια γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από κάθε συμμετέχοντα πριν από την απόκτηση του ιστού. Όλοι οι συμμετέχοντες έδωσαν γραπτή συγκατάθεση των πληροφοριών τους να αποθηκεύονται στη βάση δεδομένων του νοσοκομείου και να χρησιμοποιηθούν για την έρευνα.

Ασθενείς και δείγματα ιστών

Είκοσι παχέος καρκινικούς ιστούς και σε συνδυασμό φυσιολογικούς ιστούς του παχέος εντέρου συλλέχθηκαν από κολονοσκοπικής βιοψία για το RNA και πρωτεϊνών προετοιμασίες σε Chonnam Εθνικό Πανεπιστήμιο Hwasun Νοσοκομείο. Φορμαλίνη σταθερό και έχει εμπεδωθεί με παραφίνη ιστό δείγματα από 161 τυχαία επιλεγμένα ασθενείς που είχαν υποβληθεί σε χειρουργική επέμβαση για καρκίνο του παχέος εντέρου στο Εθνικό Πανεπιστήμιο Chonnam Hwasun Νοσοκομείο μεταξύ Ιανουαρίου 2004 και Δεκέμβριο του 2004 ελήφθησαν για ανοσοϊστοχημεία. Κανένας ασθενής δεν είχε υποβληθεί σε προεγχειρητική ακτινοθεραπεία ή χημειοθεραπεία. Παθολογική εκθέσεις και κλινικές ιστορίες κατά το χρόνο της χειρουργικής επέμβασης εξετάστηκαν στα ιατρικά αρχεία. μπλοκ ιστού επιλέχθηκαν από την προβολή αρχική παθολογική διαφάνειες και επιλέγοντας μπλοκ που έδειξε τη σύνδεση μεταξύ του φυσιολογικού επιθηλίου του παχέος εντέρου και την περιοχή του όγκου. Οι όγκοι οργανώθηκαν σύμφωνα με τη μεικτή επιτροπή Αμερικής σχετικά με το σύστημα του καρκίνου στάσης [24]. Επιβίωση μετρήθηκε από τη στιγμή της επέμβασης μέχρι την παρακολούθηση στις 31 Δεκεμβρίου, 2010.

Κυτταρική καλλιέργεια και siRNA επιμόλυνση

Οι κυτταρικές σειρές SW480 και DKO1 Ανθρωπίνων καρκίνο του παχέος εντέρου ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA) και καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ (Hyclone, Loan, UT, USA) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Hyclone) σε υγροποιημένο επωαστήρα στους 37 ℃ με ένα 5% CO

2 ατμόσφαιρα. Livin και ομελέτα siRNA αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA) και Qiagen (Valencia, CA, USA), αντίστοιχα. Livin cDNA υποκλωνοποιήθηκε σε φορέα pcDNA3.1 (Invitogen, Carlsbad, CA, USA). Livin κατασκευή επιβεβαιώθηκε με αλληλούχιση. Το συγκεκριμένο γονίδιο επιμολύνθηκαν χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη

TM RNAiMAX και Lipofectamine

TM 2000 (Invitrogen) σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή και κατόπιν επωάστηκαν για 48 ώρες. Επιπλέον, κύτταρα διαμολυσμένα με φορέα pcDNA3.1 επιλεκτικά σε επεξεργασία με 5-φθοριοουρακίλη (5-FU) (10 μg /ml, Choong-WAE, Chung-Nam, Κορέα) για 48 ώρες.

Αντίστροφη transcription- αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (RT-PCR)

το συνολικό RNA εξήχθη χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen) και αντίστροφη μεταγραφή με αντιδραστήρια MMLV μεταγραφής (Invitrogen) σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. PCR ενίσχυση του cDNA πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το γονίδιο ειδικούς εκκινητές και Go Taq

® DNA πολυμεράση (Promega, Madison, WI, USA). Οι ακόλουθες ειδικές εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν? Livin 5′-CACACAGGCCATCAGGACAAG-3/5-ACGGCACAAAGACGATGGAC-3 ‘? GAPDH 5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3/5-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3 ‘.

αποτύπωση

λύματα Δυτική κυττάρων παρασκευάσθηκαν με τη χρήση Μ-PER

® θηλαστικών αντιδραστηρίου πρωτεΐνης εκχύλισης (Θέρμο, Rockford, IL, USA) με Αλτ

TM φωσφατάση αναστολέα και να σταματήσει

κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης TM (Θέρμο). Σύνολο πρωτεΐνες ηλεκτρομεταφέρθηκαν σε PVDF μεμβράνες (Millipore, Billerica, ΜΑ, USA), και οι συγκεκριμένες πρωτεΐνες κηλιδώθηκαν με πρωτογενές αντίσωμα. Τα ακόλουθα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν: αντισώματα εναντίον Livin, X-χρωμόσωμα δέσμευσης ΙΑΡ (ΧΙΑΡ), Survivin και β-τουμπουλίνης αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Αντισώματα έναντι εξωκυτταρικό κινάση σήματος ρυθμιζόμενη (ΕΚΚ), φωσφο-ΕΚΚ, ρ38, και φωσφο-ρ38, c-Jun NH

2-τερματικής κινάσης (JNK), φωσφο-ΙΝΚ, φωσφο-Ακί, Akt, φωσφο-ρ65 , που διασπάται κασπάσης (3, 7, και 9), που διασπάται πολυ (ΑΟΡ-ριβόζη) πολυμεράσης (PARP), εξαρτώμενη από κυκλίνη κινάση 4 (CDK4), CDK6, κυκλίνη D1, κυκλίνη D3, κυκλίνη Β1, ρ21, ρ27, ρ57, ρ15, ρ16 και δεύτερο μιτοχόνδρια προερχόμενο ενεργοποιητής κασπασών /απευθείας ΙΑΡ δέσμευσης πρωτεΐνης με χαμηλή ρΙ (SMAC /DIABLO) αγοράστηκαν από την Cell Signaling Technology (Danvers, ΜΑ, USA). Ανοσοαντιδραστικές πρωτεΐνες έγιναν ορατές με την ενισχυμένης χημειοφωταύγειας υποστρώματος HRP σύστημα ανίχνευσης (Millipore) και το ΣΕΝ-4000 αναλυτή φωταύγειας της εικόνας (Fujifilm, Tokyo, Japan).

τηλέφωνα εισβολή δοκιμασία

Επεμβατική ικανότητα υπολογίστηκε από τον αριθμό των κυττάρων που πέρασαν από transwell θαλάμους φίλτρου (Corning Inc., Corning, ΝΥ, USA) με 8 μm πόρους. φίλτρα Transwell καλύφθηκαν με 1% ζελατίνη όλη τη νύχτα και ξηραίνεται σε θερμοκρασία δωματίου (RT). Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε βιώσιμα κύτταρα 2 χ 10

5 σε 0,2% μέσο BSA στον άνω θάλαμο. Ανθρώπινη ινονεκτίνη του πλάσματος (Calbiochem, La Jolla, CA, USA) προστέθηκε ως μέσο BSA χημειοελκτικό σε 0,2% στον κατώτερο θάλαμο. Μετά από επώαση 24 h, τα κύτταρα εισέβαλαν στην κάτω επιφάνεια του Transwell βάφτηκαν με διάλυμα Diff-Quik (Sysmex, Kobe, Japan) και μετρήθηκαν σε πέντε επιλεγμένα πεδία κάτω από ένα μικροσκόπιο φωτός. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± τυπική απόκλιση του αριθμού των κυττάρων /πεδίου σε τρία ξεχωριστά πειράματα.

Η μετανάστευση των κυττάρων δοκιμασία

Η δοκιμασία μετανάστευσης κυττάρων διεξήχθη χρησιμοποιώντας Culture-Εισάγει (2 χ 0,22 cm

2? Ibidi, Regensburg, Γερμανία). Για να δημιουργήσετε ένα κενό τραύματος, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε Culture-Εισάγει, τα οποία ήπια απομακρύνθηκαν μετά από επώαση 24 h χρησιμοποιώντας αποστειρωμένο τσιμπιδάκι. Η πρόοδος του κλεισίματος του τραύματος φωτογραφήθηκε με ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο. Η απόσταση μεταξύ των κενών ομαλοποιήθηκε έως 1 cm μετά τη σύλληψη από τρεις τυχαίες θέσεις.

Η βιωσιμότητα των κυττάρων

Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με το EZ-CyTox (άλατα τετραζολίου, WST-1) δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας σετ (DAEIL Lab Inc., Σεούλ, Κορέα). Μετά την εφαρμογή του αντιδραστηρίου WST-1 σε 37 ℃, η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη μικροπλακών (άπειρη Μ200, Tecan, Austria GmbH, Βιέννη, Αυστρία) με Magellan V6 λογισμικό ανάλυσης δεδομένων (Tecan). Εις τριπλούν φρεάτια χρησιμοποιήθηκαν για κάθε πείραμα και όλα τα πειράματα διεξήχθησαν τουλάχιστον εις τριπλούν.

Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής

Τα επιμολυσμένα κύτταρα τρυψινοποιήθηκαν, συλλέχθηκαν σε PBS, και επαναιωρήθηκαν σε 1χ ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης (BD Biosciences , San Diego, CA, USA). κυτταρικά εναιωρήματα επωάστηκαν σε APC Annexin V και 7-αμινο-ακτινομυκίνη D (BD Biosciences) σε RT. Για την ανάλυση του κυτταρικού κύκλου, τα κύτταρα επωάστηκαν σε 10 μg /ml ριβονουκλεάσης Α (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ, USA) και 50 μg /ml ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ) σε RT στο σκοτάδι. Ο πληθυσμός της αννεξίνης-V-θετικά κύτταρα και η φάση του κυτταρικού κύκλου αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα BD Cell Quest

® έκδοση 3.3 όργανο (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) και WinMDI έκδοση 2.9 του λογισμικού (το Ερευνητικό Ινστιτούτο Scripps, San Diego, CA, USA).

Ανοσοϊστοχημεία

τομές παραφίνης ιστού από ασθενείς αποπαραφινοποιήθηκαν, επανυδατώθηκαν και ανακτώνται με ρυθμιστικό ανάκτηση. Οι ιστοί υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με υπεροξειδάση-Blocking διάλυμα (Dako, Carpinteria, CA, USA) για να εμποδίσει την ενδογενή δραστηριότητα υπεροξειδάσης και επωάστηκαν με πολυκλωνικό κουνελιού αντι-ανθρώπινο Livin σε πρωτογενείς αραιωτικό διάλυμα (Invitrogen) όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Μετά από έκπλυση σε TBST, οι ιστοί χρωματίσθηκαν χρησιμοποιώντας Dako, Ακίνητη

σύστημα ανίχνευσης HRP /DAB TM Envision (Dako). Βιτρώ ιστοί είδαν και φωτογραφήθηκαν κάτω από ένα οπτικό μικροσκόπιο.

Αξιολόγηση των Livin έκφρασης

ανοσοχρωματίστηκε δείγματα αξιολογήθηκαν ανεξάρτητα από δύο παρατηρητές, χωρίς γνώση των κλινικοπαθολογοανατομικών δεδομένων. Αν υπήρχε μια διαφορά, μια συναίνεση επιτεύχθηκε μετά από περαιτέρω αξιολόγηση. Η ένταση των θετικών καρκινικών κυττάρων βαθμολογήθηκε με κλίμακα από τέσσερα: 0, καμία χρώση των καρκινικών κυττάρων? 1, ασθενής χρώση? 2, μέτρια χρώση? 3, ισχυρή χρώση. Το ποσοστό των καρκινικών κυττάρων χρωματίζονται επίσης βαθμολογήθηκαν σε μια κλίμακα από τέσσερα: 0, κανένας? 1, & lt? 10%? 2, 10-50%? 3, & gt? 50%. Η βαθμολογία της έντασης πολλαπλασιάστηκε με την αξιολόγηση τοις εκατό λεκέ να αποκτήσει μια συνολική βαθμολογία. Η μέση συνολική βαθμολογία για τους 161 όγκους που αναλύθηκαν ήταν 4,0. Έτσι, η μέση συνολική βαθμολογία του 4,0 επιλέχθηκε ως σημείο αποκοπής για την διάκριση Livin κατάσταση έκφρασης. Δείγματα με βαθμολογία & gt?. 4 είχαν θεωρηθεί ως θετική, και εκείνοι με βαθμολογία ≤ 4 είχαν θεωρηθεί ως αρνητική έκφραση

Αξιολόγηση του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων

Τα πολλαπλασιαζόμενα καρκινικά κύτταρα έγιναν ορατά με χρώση ανοσοϊστοχημικά χρησιμοποιώντας ένα αντι-Ki-67 αντίσωμα (ΜΙΒ-1? αραιωμένο 1: 150? Dakopatts, Glostrup, Δανία). Διακριτές πυρηνική Ki-67 ανοσολογική αντίδραση θεωρήθηκε θετική. Ο δείκτης σήμανσης Κϊ-67 (ΚΙ) παρουσιάζεται ως ο αριθμός των Ki-67-θετικών πυρήνων /1000 των καρκινικών κυττάρων πυρήνες. ΚΙ έχει χρησιμοποιηθεί για να εκτιμηθεί η πολλαπλασιαστική ικανότητα των καρκινικών κυττάρων.

Τερματικό δεοξυνουκλεοτιδυλοτρανσφεράσης (TdT) μεσολάβηση δεοξυουριδίνη τριφωσφορική τέλος επισήμανση (dUTP) nick (ΤΟΥΝΕΛ) δοκιμασία

κύτταρα και οι οργανισμοί αποπτωτικά ήταν ανιχνεύεται χρησιμοποιώντας το αδιέξοδο

TM Χρωματομετρική TUNEL System (Promega, Madison, WI, USA), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, τομές ιστών αποκηρώθηκαν και ενυδατώθηκαν μέσω διαβαθμισμένης σειράς αλκοόλη. Η διαπερατότητα συνέχεια διεξήχθη σε διάλυμα Πρωτεϊνάσης Κ για 15 λεπτά. Η επισήμανση διεξήχθη με την προσθήκη του ενζύμου TdT μείγμα αντίδρασης να τομές ιστού στις διαφάνειες για 60 λεπτά σε υγροποιημένο θάλαμο 37 ℃. Τα επισημασμένα κύτταρα αναπτύχθηκαν χρησιμοποιώντας στρεπταβιδίνη HRP και υποστρώματος ενζύμου 3,3-διαμινοβενζιδίνη. Μια ποσοτική μέθοδος για τον υπολογισμό των αποπτωτικών κυττάρων χρησιμοποιήθηκε από δύο ανεξάρτητους παθολόγους. Όλες οι τομές εξετάστηκαν υπό πεδία υψηλής ισχύος (μεγέθυνση 40 χ 10). Τα πεδία επιλέχθηκαν στην υψηλότερη περιοχή με τις ετικέτες για κάθε περίπτωση. Το αποπτωτικό δείκτη (ΑΙ) εκφράστηκε ως ο αριθμός των θετικών πυρήνων συμπεριλαμβανομένων αποπτωτικά σώματα μεταξύ 1.000 κυττάρου όγκου πυρήνες.

Στατιστική ανάλυση

Δεδομένα από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα χρησιμοποιήθηκαν για να συγκριθούν μεταξύ των ομάδων . Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσο ± τυπικές αποκλίσεις. Μαθητή

t-test

χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η στατιστική σημαντικότητα για τις συγκρίσεις διακομματικής. Το χ

2-test και το ακριβές τεστ του Fisher, ανάλογα με την περίπτωση, χρησιμοποιήθηκαν για να συγκρίνουν Livin έκφρασης με διάφορες κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους. Οι σχέσεις μεταξύ Livin έκφρασης και την ΚΙ ή AI αξιολογήθηκαν από τον μαθητή του

t-test

. Αναλογιστική ποσοστά επιβίωσης των ασθενών με θετική ή αρνητική έκφραση Livin αξιολογήθηκαν σύμφωνα με τη μέθοδο Kaplan-Meier, και οι διαφορές ελέγχθηκαν με μια δοκιμασία log-rank. Η Στατιστική Πακέτο για τις Κοινωνικές Επιστήμες (SPSS /PC + 15.0, Chicago, IL, USA) χρησιμοποιήθηκε για όλες τις αναλύσεις. Η τιμή p & lt? 0.05 θεωρήθηκε σημαντική.

Αποτελέσματα

Ο αντίκτυπος των Livin για την εισβολή, τη μετανάστευση και τον πολλαπλασιασμό των ανθρώπινων καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα

Για να διερευνήσουν τη λειτουργία Livin για ογκογόνο βιολογική συμπεριφορά του ορθοκολικού καρκίνου, κύτταρα Livin siRNA ή pcDNA3.1-Livin χρησιμοποιήθηκε για τον έλεγχο της έκφρασης ενδογενούς γονιδίου Livin σε ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές SW480 και DKO1. Livin γονιδιακής έκφρασης σε όλες τις δοκιμασμένες κύτταρα, έδειξε μια ειδική μείωση στο mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης με επιμόλυνση Livin siRNA και μια συγκεκριμένη αύξηση με επιμόλυνση του pcDNA3.1-Livin. Οι αριθμοί της εισβολής Livin siRNA επιμολυσμένα κύτταρα SW480 και DKO1 ήταν 30,2 ± 3,1 και 55,3 ± 11,0, ενώ 51,8 ± 9,5 και 115,3 ± 10,3 κύτταρα παρατηρήθηκαν για ομελέτα siRNA επιμολυσμένα κύτταρα. Τα κύτταρα μετρήθηκαν σε έξι τυχαία 0,5 × 0,5 mm

2 μικροσκοπικά πεδία χρησιμοποιώντας 10 μg /ml ινονηκτίνης ως χημειοελκτικό. Η διαφορά μεταξύ των δύο τύπων κυττάρων ήταν σημαντική (ρ = 0,015 και ρ & lt? 0.001, αντίστοιχα). Σε αντίθεση, ο αριθμός των κυττάρων που εισβάλλουν αυξήθηκε σημαντικά σε pcDNA3.1-Livin επιμολυσμένα κύτταρα SW480 και DKO1 σύγκριση με άδειο-pcDNA3.1 επιμολυσμένα κύτταρα (ρ = 0,024 και ρ = 0,012, αντίστοιχα) (Σχήμα 1Α). Το χάσμα τεχνητή πληγή σε πλάκες των κωδικοποιημένων siRNA επιμολυσμένα κύτταρα έγινε σημαντικά στενότερο από ότι σε Livin siRNA επιμολυσμένα κύτταρα σε 48 h σε SW480 και στις 24 ώρες στα κύτταρα DKO1 (ρ = 0.012 και ρ = 0.016, αντίστοιχα). Το χάσμα τεχνητή πληγή σε pcDNA3.1-Livin επιμολυσμένα SW480 κύτταρα κατέστησαν σημαντικά στενότερο από ότι σε άδειο-pcDNA3.1 επιμολυσμένα κύτταρα στις 24 και 48 ώρες (ρ = 0,034 και ρ = 0,008, αντίστοιχα) (Σχήμα 1Β). Η δοκιμασία κυτταρικού πολλαπλασιασμού πραγματοποιήθηκε σε 2, 3, 4, και 5 ημέρες μετά την επιμόλυνση Livin siRNA ή pcDNA3.1-Livin για πρόσβαση στο δυναμικό των Livin επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Τα πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα, όπως προσδιορίστηκε με απορρόφηση, μειώθηκε σημαντικά στα Livin siRNA-επιμολυσμένα κύτταρα SW480 σε σύγκριση με τα κωδικοποιημένα siRNA-επιμολυσμένα κύτταρα σε 3, 4 και 5 ημέρες (ρ = 0.005, & lt? 0.001, και 0.022, αντίστοιχα), αλλά όχι σημαντική διαφορά παρατηρήθηκε στα κύτταρα DKO1. Επιπρόσθετα, σε όλες τις ελεγχόμενες κύτταρα, δεν υπήρχε σημαντική διαφορά του πολλαπλασιασμού των κυττάρων μεταξύ pcDNA3.1-Livin και empty-pcDNA3.1 επιμολυσμένα κύτταρα (Σχήμα 1 C).

(Α) Η επίδραση των Livin για εισβολή καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα. Η δοκιμασία εισβολή χρησιμοποιώντας το siRNA ή κύτταρα pcDNA3.1-επιμολυσμένα διεξήχθη. Βιτρώ εισβάλλοντας κύτταρα μετρήθηκαν και απεικονίζονται ως ένα γράφημα μεταξύ των ομάδων. Ο αριθμός των κυττάρων LS-επιμολυσμένα που εισέβαλαν ήταν σημαντικά χαμηλότερη από εκείνη των SS-επιμολυσμένα κύτταρα. Ο αριθμός των κυττάρων που εισβάλλουν ήταν σημαντικά υψηλότερη στην LV-επιμολυσμένα κύτταρα σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα EV-(μέση ± τυπικό σφάλμα [SE], n = 6? * Ρ & lt? 0,05). (Β) Ο αντίκτυπος της Livin για τη μετανάστευση καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρων. Η δοκιμασία επούλωσης πληγών με τη χρήση siRNA ή κύτταρα pcDNA3.1-επιμολυσμένα διεξήχθη και γραφικές παραστάσεις της κυτταρικής μετανάστευσης εμφανίζεται ως σχετικές αποστάσεις επούλωση. Η μετανάστευση των κυττάρων ήταν σημαντικά διαταραχθεί σε LS-επιμολυσμένα SW480 και DKO1 κύτταρα και αυξήθηκαν σε LV-επιμολυσμένα SW480 κύτταρα (μέση ± SE, η = 3? * ρ & lt? 0,05). (Γ) Η επίδραση της Livin επί του πολλαπλασιασμού του καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρων. Η απορρόφηση που δείχνει πολλαπλασιαζόμενα βιώσιμα κύτταρα μειώθηκε στα SW480 κύτταρα LS-επιμολυσμένα αλλά δεν υπήρχε σημαντική διαφορά μεταξύ πολλαπλασιασμού των κυττάρων και LV EV επιμολυσμένα κύτταρα (μέση ± SE, η = 3? * Ρ & lt? 0,05). SS? αγωνίζομαι siRNA, LS? Livin siRNA, EV? Αδειάστε-pcDNA3.1, LV? pcDNA3.1-Livin.

Η

Ο αντίκτυπος των Livin στην απόπτωση στα ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου

Πραγματοποιήσαμε κυτταρομετρίας ροής αναλύει την αξιολόγηση των επιπτώσεων της Livin στην απόπτωση. Η αποπτωτική ποσοστό κυττάρων που προκαλείται από επιμόλυνση Livin siRNA αυξήθηκε σημαντικά, σε σύγκριση με εκείνη που προκαλείται από επιμόλυνση κωδικοποιημένο siRNA (6,9

vs.

19,6%) σε κύτταρα SW480 αλλά Livin knockdown είχε μια ελάχιστη επίδραση επί της απόπτωσης (11,3

vs.

16,7%) σε DKO1 κύτταρα (Σχήμα 2Α). 5-FU είναι πολύ γνωστό ότι επάγει την απόπτωση και να επηρεάσει τον κυτταρικό κύκλο των καρκινικών κυττάρων. Η υπερέκφραση του Livin με επιμόλυνση του pcDNA3.1-Livin ανέστειλε την απόπτωση των κυττάρων SW480 σε απόκριση σε 5-FU, αλλά υπερέκφραση Livin είχε ελάχιστη επίδραση επί της απόπτωσης σε κύτταρα DKO1 (Σχήμα 2Α). Ερευνήσαμε περαιτέρω δραστηριότητες κασπάσης-ειδικά για να προσδιοριστεί η ενεργοποίηση κασπασών διάρκεια knockdown και υπερέκφραση του Livin. Διασπασμένη κασπάσες-3 και -7 και PARP εκφράσεις επάνω ρυθμισμένη στα κύτταρα SW480 και DKO1 μετά Livin knockdown και ρυθμισμένα προς τα κάτω μετά υπερέκφραση Livin (Σχήμα 2Β). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Γ, το επίπεδο της πρωτεΐνης Σουρβιβίνης μειώθηκε λόγω Livin knockdown σε κύτταρα SW480 και DKO1, αλλά τα επίπεδα της πρωτεΐνης ΧΙΑΡ και SMAC /DIABLO δεν μεταβλήθηκαν σε απόκριση προς Livin knockdown. Επιπροσθέτως, ο Survivin, ΧΙΑΡ και SMAC /DIABLO επίπεδα της πρωτεΐνης δεν μεταβλήθηκε μετά την υπερέκφραση του Livin.

(Α) Το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων που επάγεται από την επιμόλυνση του LS ήταν μεγαλύτερη από εκείνη που προκαλείται από επιμόλυνση των SS (6,9 έναντι 19,6%) σε κύτταρα SW480 αλλά Livin νοκ ντάουν είχε μια ελάχιστη επίδραση στην απόπτωση (11,3 έναντι 16,7%) σε κύτταρα DKO1. Η υπερέκφραση του Livin με επιμόλυνση του LV ανέστειλε την απόπτωση των κυττάρων SW480 σε απόκριση προς 5-FU αλλά υπερέκφραση Livin είχε ελάχιστη επίδραση επί της απόπτωσης σε κύτταρα DKO1 (Β) Έκφραση διασπασμένη κασπάση 3, -7, -9, και PARP πρωτεΐνες. Η κασπάση-3, -7 και PARP εκφράσεως είναι αυξημένο στα κύτταρα SW480 και DKO1 μετά Livin knockdown, και μειώθηκαν μετά την υπερέκφραση του Livin (γ) έκφραση των ρυθμιστικών πρωτεϊνών απόπτωσης. το επίπεδο της πρωτεΐνης survivin μειώθηκε μετά Livin νοκ ντάουν στα κύτταρα SW480 και DKO1, αλλά τα επίπεδα της πρωτεΐνης ΧΙΑΡ και SMAC /DIABLO δεν μεταβλήθηκαν σε απάντηση Livin νοκ ντάουν. Επιπλέον, τα επίπεδα πρωτεΐνης Σουρβιβίνης, ΧΙΑΡ και SMAC /DIABLO δεν μεταβλήθηκε μετά από υπερέκφραση του Livin. PARP? Πολυ (ADP-ριβόζη) πολυμεράση, ΧΙΑΡ? δεσμευτική ΙΑΡ, SMAC /DIABLO Χ-χρωμόσωμα? δεύτερη μιτοχόνδρια που προέρχονται από ενεργοποιητής των κασπασών /άμεσης πρωτεΐνη με χαμηλό ρΙ, SS δεσμευτική IAP? αγωνίζομαι siRNA, LS? Livin siRNA, EV? Αδειάστε-pcDNA3.1, LV? pcDNA3.1-Livin, 5-FU? 5-φθοριοουρακίλη, 7-AAD? 7-αμινο-ακτινομυκίνη D.

Η

Ο αντίκτυπος των Livin κατά τη σύλληψη του κυτταρικού κύκλου σε ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα

Πραγματοποιήσαμε κυτταρομετρίας ροής αναλύσεις για την ανίχνευση αν Livin θα μπορούσε να αλλάξει τη διανομή του κυτταρικού κύκλου. Livin knockdown οδήγησε σε διακοπή του κυτταρικού κύκλου στην φάση G0 /G1 κυττάρων SW480 και της φάσης S των κυττάρων DKO1 (Σχήμα 3Α). 5-FU που επάγεται θεραπεία διακοπή του κυτταρικού κύκλου στην φάση subG1 των SW480 και G0 /G1 φάση των κυττάρων DKO1. Η υπερέκφραση του Livin ανέστειλε 5-FU-επαγόμενη διακοπή του κυτταρικού κύκλου σε κύτταρα SW480 και είχε μια ελάχιστη επίδραση στα κύτταρα DKO1 (Σχήμα 3Α). Στη συνέχεια, αξιολογήσαμε τις επιδράσεις της Livin σε διάφορες CDK αναστολείς (CDKIs) που συμμετέχουν στην διακοπή του κυτταρικού κύκλου σε ανθρώπινα ορθοκολικού καρκίνου κύτταρα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Β, το επίπεδο της πρωτεΐνης ρ27 αυξήθηκε σημαντικά κατά Livin knockdown, και μειώθηκε κατά υπερέκφραση Livin σε κύτταρα SW480 και DKO1. Ωστόσο, τα επίπεδα ρ21, p57, p15 και p16 πρωτεΐνη δεν μεταβλήθηκαν σε απόκριση προς knockdown και υπερέκφραση του Livin. Οι κυκλίνες και CDKs ρυθμίζονται αρνητικά με CDKIs. Επομένως, εξετάσαμε την επίδραση της Livin επί εκφράζονται επίπεδα κυκλίνης D1, κυκλίνης D3, κυκλίνη Β1, CDK4, και CDK6. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3C, το κυκλίνη D1, κυκλίνη D3, CDK4, και τα επίπεδα πρωτεΐνης CDK6 ήταν σημαντικά μειώθηκαν κατά Livin knockdown, και αύξησε την κυκλίνη D1 και CDK4 από υπερέκφραση Livin σε κύτταρα SW480 και DKO1.

( Α) Livin knockdown οδήγησε σε διακοπή του κυτταρικού κύκλου στην φάση G0 /G1 κυττάρων SW480 και της φάσης S των κυττάρων DKO1. 5-FU που επάγεται θεραπεία διακοπή του κυτταρικού κύκλου στην φάση subG1 του SW480 και η φάση G0 /G1 κυττάρων DKO1. Η υπερέκφραση του Livin ανέστειλε 5-FU-επαγόμενη διακοπή του κυτταρικού κύκλου σε κύτταρα SW480 και είχε μια ελάχιστη επίδραση στα κύτταρα DKO1. Ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα από τα τρία ανεξάρτητα πειράματα. (Β) Έκφραση εξαρτώμενης από κυκλίνη κινάσης (CDK) αναστολέα πρωτεΐνες. Το επίπεδο της πρωτεΐνης ρ27 αυξήθηκε σημαντικά με Livin knockdown και μειώθηκε κατά υπερέκφραση Livin σε κύτταρα SW480 και DKO1. Ωστόσο, τα επίπεδα ρ21, p57, p15 και p16 πρωτεΐνη δεν μεταβλήθηκαν σε απόκριση προς knockdown ή υπερέκφραση του Livin. (Γ) έκφραση των κυκλινών και εξαρτώμενων από κυκλίνη πρωτεΐνες (CDKs) κινάσης. Η κυκλίνη D1, κυκλίνη D3, CDK4 και CDK6 επίπεδα πρωτεΐνης ήταν σημαντικά μειώθηκαν κατά Livin knockdown και αύξησε κυκλίνης D1 και CDK4 από υπερέκφραση Livin σε κύτταρα SW480 και DKO1. SS? αγωνίζομαι siRNA, LS? Livin siRNA, EV? Αδειάστε-pcDNA3.1, LV? pcDNA3.1-Livin.

Η

Ο αντίκτυπος των Livin σε μονοπάτια ενδοκυτταρικής σηματοδότησης που εμπλέκονται στην απόπτωση και τον κυτταρικό κύκλο σύλληψη στο ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα

Μελετήσαμε την επίδραση της Livin στην τόνωση της ενδοκυττάριων οδών σηματοδότησης που οδηγούν στην απόπτωση και τον κυτταρικό κύκλο σύλληψης σε κύτταρα SW480 και DKO1 να διερευνήσει τους πιθανούς μηχανισμούς που εμπλέκονται στην απόπτωση και τον κυτταρικό κύκλο σύλληψης. Τα επίπεδα φωσφορυλίωση των ERK1 /2, JNK και ρ38 ρυθμισμένα προς τα κάτω σε Livin knockdowned SW480 και κύτταρα DKO1 (Σχήμα 4). Αλλά Akt και τα επίπεδα φωσφορυλίωσης p65 παρέμεινε αμετάβλητο από Livin νοκ ντάουν. Επιπλέον, ERK1 /2, JNK, p38, Akt και φωσφορυλίωση p65 επίπεδα παρέμεινε αμετάβλητη από την υπερέκφραση του Livin.

Τα επίπεδα φωσφορυλίωσης των ERK1 /2, JNK και ρ38 μειώθηκε μετά από Livin νοκ ντάουν των κυττάρων SW480 και DKO1. Αλλά Akt και p65 τα επίπεδα φωσφορυλίωσης έδειξαν καμία αλλαγή μετά από Livin νοκ ντάουν. Επιπλέον, ERK1 /2, JNK, ρ38, Akt φωσφορυλίωση και ρ65 επίπεδα δεν είχαν αλλάξει από υπερέκφραση του Livin. SS? αγωνίζομαι siRNA, LS? Livin siRNA, EV? Αδειάστε-pcDNA3.1, LV? pcDNA3.1-Livin.

Η

Livin έκφραση σε ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου και του μεταστατικού ιστούς λεμφαδένων

Για την επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων των μελετών του παχέος κυτταρική σειρά καρκίνου, αξιολογήσαμε Livin έκφραση κατά τη τα επίπεδα RNA και πρωτείνης με RT-PCR, κηλίδωση Western και ανοσοϊστοχημεία σε ανθρώπινους ιστούς παχέος καρκίνο, σε συνδυασμό φυσιολογικό ορθοκολικό βλεννογόνου, και μεταστατικών και μη-μεταστατικών ιστών λεμφαδένα του ίδιου ασθενών που λαμβάνονται από κολονοσκοπική βιοψίας και χειρουργικά δείγματα. Στα κολονοσκοπική δειγμάτων βιοψίας, επιβεβαιώσαμε τα πάνω ρύθμιση του Livin έκφρασης σε καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με εκείνη σε ζεύγη φυσιολογικού βλεννογόνου στα επίπεδα του RNA και της πρωτεΐνης (ρ = 0.035 και ρ = 0.020, αντίστοιχα) (Εικόνα 5Α, Β). Στις τομές ιστού παραφίνης, το Livin πρωτεΐνη έκαναν όχι ή μόνο ασθενώς ανοσοχρώση σε κανονική ορθοκολικό βλεννογόνο (Σχήμα 6Α). Ανοσοκηλίδωση της Livin πρωτεΐνη ήταν κυρίως εντοπίζονται στους πυρήνες των καρκινικών κυττάρων, αλλά δεν ήταν ανιχνεύσιμη στο στρώμα του όγκου (Σχήμα 6Α). Η ανοσοχρώση των Livin στο μεταστατικό ιστούς λεμφαδένα ήταν σημαντικά ισχυρότερη από ότι σε μη μεταστατικό ιστούς λεμφαδένα (Εικόνα 6Β). Η συνολική βαθμολογία για Livin ανοσοχρώση σε μεταστατικούς ιστούς λεμφαδένων ήταν σημαντικά υψηλότερη από ότι σε μη μεταστατικό ιστούς λεμφαδένων (

P

& lt? 0.001) (Σχήμα 6C)

(Α) Livin έκφραση του mRNA. (Β) Livin έκφραση πρωτεΐνης. Η έκφραση του Livin απορυθμίζεται σε καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με ζεύγη φυσιολογικό βλεννογόνο σε επίπεδα mRNA και πρωτεΐνης σε φρέσκο ​​κολονοσκοπική δείγματα βιοψίας. Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει το μέσο ± SE των 20 περιπτώσεων. * P & lt? 0,05 έναντι κανονικής παχέος βλεννογόνο. Τ? ορθοκολικό καρκινικό ιστό, Ν? ζευγαρωμένα φυσιολογικό ορθοκολικό βλεννογόνου.

Η

(Α) Η πρωτεΐνη Livin ήταν κυρίως ανοσοχρωματίστηκε στους πυρήνες των καρκινικών κυττάρων, αλλά όχι ή μόνο ασθενώς έκανε ανοσοχρώση σε κανονικές του παχέως βλεννογόνο (χ 100). (Β) Η ανοσοχρώση Livin στο μεταστατικό ιστούς λεμφαδένα ήταν σημαντικά ισχυρότερη από ότι σε μη μεταστατικό ιστούς λεμφαδένα (× 100). (Γ) Η συνολική βαθμολογία για Livin ανοσοχρώση σε μεταστατικούς ιστούς λεμφαδένων ήταν σημαντικά υψηλότερη από ότι σε μη μεταστατικό ιστούς λεμφαδένων (* p & lt? 0.001). Τ? ορθοκολικό καρκινικό ιστό, Ν? σε συνδυασμό κανονική του παχέος βλεννογόνο, NL? μη μεταστατικό ιστό λεμφαδένα, ML? μεταστατικό ιστό λεμφαδένα.

Η

συσχετίσεις μεταξύ Livin έκφραση και τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και την απόπτωση σε ανθρώπινα ορθοκολικούς καρκίνους

Ki-67 ανοσοαντιδραστικότητα βρέθηκε βασικά στους πυρήνες των καρκινικών κυττάρων (Σχήμα 7Α ). Η ΚΙ για 161 όγκους κυμαίνονταν από 21,9 να 85,6 με μέση ΚΙ 52,8 ± 15,1. Καμία σημαντική διαφορά δεν παρατηρήθηκε μεταξύ Livin έκφρασης και ΚΙ (p = 0,504) (Πίνακας 1). Πρότυπη μορφολογικά κριτήρια για αποπτωτικά κύτταρα χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία TUNEL, είναι η παρουσία γλυφές ή συρρικνωμένα χρωματίνης και αποπτωτικά σώματα με σαφή αλο (Σχήμα 7Β). Η AI για 161 όγκους κυμάνθηκε 0,6 έως 30,0 με μέση AI των 8,8 ± 5,6. Η μέση τιμή της ΑΙ του Livin-θετικούς όγκους ήταν 6,4 ± 3,7, η οποία ήταν σημαντικά χαμηλότερη από την AI του Livin-αρνητικούς όγκους (p = 0,009) (Πίνακας 1).

(Α) Ανοσοβαφή Ki-67 . Ανοσοκηλίδωση του Ki-67 παρουσιάζει ισχυρή πυρηνική θετικότητα στα καρκινικά κύτταρα αλλά είναι σπανίως θετική στην κανονική του παχέος βλεννογόνο (χ 200). (Β) Ανίχνευση των αποπτωτικών κυττάρων (βέλος) με χρώση TUNEL. Τα αποπτωτικά κύτταρα με κλασικά χαρακτηριστικά της συμπύκνωσης του DNA που φαίνεται να έχουν ένα φωτοστέφανο που αποτελείται από πυκνωτικούς πυρήνες και κυτταρόπλασμα συρρικνωμένο (βέλος κεφαλής) σε ορθοκολικό καρκίνο, αλλά ιστούς χρώση TUNEL δεν είναι θετική σε φυσιολογικό ορθοκολικό βλεννογόνο (× 400). TUNEL, τελικής δεοξυνουκλεοτιδυλοτρανσφεράσης (TdT) μεσολάβηση δεοξυουριδίνη τριφωσφορική τέλος επισήμανση (dUTP) nick. Τ? ορθοκολικό καρκινικό ιστό, Ν? σε συνδυασμό κανονική του παχέος βλεννογόνο.

Η Δείκτες

Σύνολο (n = 161)

Livin έκφραση

p-value

Η Αρνητικό (n = 86)

θετική (n = 75)

Η ΚΙ (Μέση τιμή ± SD) 52,8 ± 15.151.1 ± 14.754.3 ± 15.60.504AI (Μέση τιμή ± SD) 8,8 ± 5.611.3 ± 6.46.4 ± 3.70.009Table 1 . Οι συσχετίσεις μεταξύ Livin έκφρασης και τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και την απόπτωση σε καρκίνους του παχέος

ΚΙ, Ki-67 index επισήμανση.? AI, αποπτωτικό δείκτη?