Αφηρημένο

Ιστορικό

microRNAs (miRNAs) έχουν εμπλακεί στον έλεγχο πολλών βιολογικών διεργασιών και την απορρύθμιση τους έχει συσχετιστεί με πολλούς καρκίνους. Τα τελευταία χρόνια, ο καρκίνος των βλαστικών κυττάρων (CSC) έννοια έχει εφαρμοστεί σε πολλούς καρκίνους συμπεριλαμβανομένων παιδιατρικών. Υποθέσαμε ότι μια κοινή υπογραφή της απελευθερωμένης miRNAs στο κλάσμα ΚΕΠ μπορεί να εξηγήσει τις διαταράσσεται μονοπάτια σηματοδότησης σε ΚΕΠ.

Χρησιμοποιώντας μια qPCR προσέγγιση υψηλής απόδοσης εντοπίσαμε 26 CSC συσχετισμένη διαφορικά εκφρασμένων

Μεθοδολογία /Αποτελέσματα

miRNAs (DEmiRs). Χρησιμοποιώντας BCmicrO αλγόριθμο ελήφθησαν 865 πιθανούς CSC συνδέονται στόχους Demir. Αυτοί οι δυνητικοί στόχοι υποβλήθηκαν σε μονοπάτι και βιολογικών διαδικασιών ανάλυσης KEGG, Biocarta και Gene Ontology. Τέσσερις σχολιασμένη οδοί εμπλουτίστηκαν: κυτταρικού κύκλου, του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, ρ53 και ΤΟΡ-βήτα /BMP. Να χτυπήσει κάτω

HSA-miR-21-5p

,

HSA-miR-181γ-5P

και

HSA-miR-135b-5P

χρησιμοποιώντας αντιπληροφοριακά ολιγονουκλεοτίδια και μικρά παρεμβαλλόμενα RNA σε κυτταρικές σειρές οδήγησε στην εξάντληση του κλάσματος CSC και την απομείωση του σχηματισμού σφαίρας (δοκιμασίες υποκατάστατο CSC).

Συμπέρασμα

τα ευρήματά μας έδειξαν ότι CSC συνδεδεμένων DEmiRs και οι υποθετικές οδούς που ρυθμίζουν μπορεί να έχουν πιθανές θεραπευτικές εφαρμογές σε παιδιατρικούς καρκίνους

Παράθεση:. Sanchez-Diaz PC, Χσιάο Θ, Chang JC, Yue D, Tan MC, ο Τσεν H-IH, et al. (2013) De-Ρυθμιζόμενη Τα microRNAs στον καρκίνο Παιδιατρική Stem Cells Pathways στόχων που εμπλέκονται στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, του κυτταρικού κύκλου και Ανάπτυξης. PLoS ONE 8 (4): e61622. doi: 10.1371 /journal.pone.0061622

Επιμέλεια: Alfons Navarro, Πανεπιστήμιο της Βαρκελώνης, Ισπανία

Ελήφθη: 19 Σεπτεμβρίου, 2012? Αποδεκτές: 11, Μαρ, 2013? Δημοσιεύθηκε: 17 Απριλίου, 2013

Copyright: © 2013 Sanchez Diaz et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Semp Russ Ίδρυση του Ιδρύματος San Antonio Χώρου (απονέμεται σε JYH), την πρόληψη του καρκίνου και Ερευνητικό Ινστιτούτο του Τέξας (CPRIT, RP101195? απονέμεται σε GET και YC), Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας (NIH-NCI P30CA54174? απονέμεται σε CTRC σε UTHSCSA, YC και ΝΙΗ-NCATS UL1TR000149? απονέμεται σε CTSA σε UTHSCSA, YC), η Greehey Graduate Fellowship στην υγεία των παιδιών (απονέμεται σε ΜΣΕ) και των Πρέσβεων Κύκλος Ταμείο Έρευνας Ινστιτούτο Καρκίνου της Greehey Παιδική χρηματοδοτηθεί μέρος αυτού του έργου. FACS έγινε στο Μηχανισμό κυτταρομετρίας ροής κοινόχρηστο πόρο, ο οποίος υποστηρίζεται από το ΝΙΗ-NCI P30CA54174 (CTRC σε UTHSCSA). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

τα microRNAs (miRNA) είναι μια άφθονη κατηγορία των μικρών (-22 νουκλεοτίδια) μη-κωδικοποίησης ενιαίο RNAs σκέλος (ncRNA) που ρυθμίζουν την έκφραση του γονιδίου σε μετα-μεταγραφικό επίπεδο. Αυτά τα ρυθμιστικά ncRNAs παίζουν σημαντικό ρόλο στον έλεγχο πολλών βιολογικών διεργασιών και την απορρύθμιση τους έχει ενοχοποιηθεί σε μια ποικιλία παθολογικών καταστάσεων, συμπεριλαμβανομένων πολλών μορφών καρκίνου.

εμφανιζόμενων αποδείξεων υποστηρίζει την ιδέα ότι οι περισσότεροι καρκίνοι έχουν τη δική τους «βλαστοκύτταρα «, που αναφέρεται ως« καρκινικά βλαστικά κύτταρα «(ΚΕΠ). Αυτή η δεξαμενή των βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν εντός της μάζας του όγκου έχει τη δυνατότητα να αυτο-ανανέωση και τη διατήρηση της αμείλικτη αύξηση της μάζας. Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι τα miRNAs εμπλέκονται στην αυτο-ανανέωση και κυττάρου-μοίρα αποφάσεις των βλαστικών κυττάρων, ο έλεγχος του κυτταρικού κύκλου και τη διατήρηση της ισορροπίας του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, της διαφοροποίησης και της απόπτωσης [1], [2], [3], [ ,,,0],4]. Πρόσφατα, μελέτες έχουν δείξει ότι οι μηχανισμοί που ρυθμίζουν την αυτο-ανανέωση φύση αυτών των κυττάρων είναι δυσλειτουργικά σε καρκινικά βλαστικά κύτταρα [5]. Προτείνουμε ότι τα καθοριστικά χαρακτηριστικά του ΚΕΠ μπορεί να περιγραφεί σε όρους ενός συνεκτικού πρότυπο έκφρασης γονιδίου που ρυθμίζεται από ειδικές, παρεκκλίνοντα εκφράζεται miRNAs συντονίζονται προς την συντήρηση και την αυτο-ανανέωση των καρκινικών βλαστικών κυττάρων. Η ρύθμιση της αυτο-ανανέωσης και την ικανότητα να παράγουν απογόνους βασίζεται σε κοινά γονίδια και μηχανισμούς. Αυτό το υποσύνολο των γονιδίων των οποίων η έκφραση είναι απελευθερωμένη από τα miRNAs μπορεί να εξηγήσει τις διαταραχθεί μονοπάτια σηματοδότησης του ΚΕΠ.

Στη συμβατική γονιδιακή έκφραση ανάλυσης δεδομένων, εμπλουτισμό ανάλυση της διαφορικής έκφρασης γονιδίων έχει χρησιμοποιηθεί με επιτυχία για να εξερευνήσουν τα μονοπάτια που διέπουν τη σηματοδότηση και τις λειτουργίες των γονιδίων οντολογίας [6], [7], [8]. Η στρατηγική προβλέπει μια διαδικασία ερμηνείας από το διαφορικό που εκφράζονται γονίδια σε μονοπάτια ή λειτουργίες μέσω ενός γονιδίου που αλγορίθμων εμπλουτισμού [9]. Πρόσφατα, διάφοροι αλγόριθμοι έχουν αναπτυχθεί για την πρόβλεψη γονιδίων-στόχων miRNA μέσω ομολογίας αλληλουχίας μεταξύ 3 ‘UTR και περιοχή σπόρος miRNA [10], [11], [12]. Μέσα από τις προβλεπόμενες γονιδίων-στόχων των miRNAs [11], αρκετές μελέτες διερεύνησε τις μεθόδους για να σχολιάσετε τις λειτουργίες της miRNAs, όπως η μέθοδος των στόχων της πορείας του εμπλουτισμού διατήρηση ή συν-στόχευση ζεύγη τέτοια ώστε οι κυρίαρχες λειτουργίες ενδέχεται να προκύψουν μέσω του «κόμβου» miRNAs [13 ], μια στατιστική μέθοδος μετάθεση με βάση το ότι οι δοκιμές για την υπερ- ή υπο-εκπροσώπηση των στόχων των miRNAs σε ένα καθορισμένο σύνολο των γονιδίων στόχων [14], [15], [16], [17] και πρόσφατα κυκλοφόρησε mirDIP που συνδυάζονται 12-στόχο αλγόριθμους πρόβλεψης για να σχηματίσουν δίκτυα αλληλεπίδρασης miRNA [18]. Ωστόσο, όλες αυτές οι αλγόριθμοι χρησιμοποιούν μόνο τις πληροφορίες πρόβλεψης στόχος, ανεξάρτητα από τα επίπεδα έκφρασης των miRNAs, σε συνδυασμό με το γεγονός ότι οι στόχοι ενός miRNA πάνω από 100 γονίδια [19], καθιστώντας συμπερασμού σε λειτουργίες ή πορείες από ένα σύνολο miRNAs δεν αναφέρεται σε συγκεκριμένο βιολογική στόχος υπερβολικά περίπλοκο.

Διαφορετικό από προαναφερθείσα αλγορίθμους, προτείναμε ένα νέο αλγόριθμο που συνδύαζε ένα σύνολο miRNA αλγορίθμων πρόβλεψης στόχου με μια Bayesian σύστημα να ενσωματώσει τη δύναμη πρόβλεψης, και στη συνέχεια να οικοδομήσουμε το ζεύγος miRNA-μονοπάτι με περαιτέρω την ενσωμάτωση της έννοιας του συνόλου του γονιδίου εμπλουτισμού με διαφορικά εκφρασμένων miRNAs (DEmiRs). Το βήμα εμπλουτισμός επιτυγχάνεται με την έκφραση πρώτη miRNAs χαρτογράφηση »σε γονίδια στόχους τους υπολογιστεί από τη δύναμή τους πρόβλεψη, τότε και οι δύο εμπλουτισμό βαθμολογίας (ES) και το ακριβές τεστ του Fisher πραγματοποιήθηκαν πάνω από ένα γονίδιο που ή μονοπάτι για να εξερευνήσετε το υποτιθέμενο κανονισμό ασκείται από DEmiRs έχουν.

ΚΕΠ έχουν περιγραφεί σε πολλές συμπαγείς όγκους της παιδικής ηλικίας. Οι όγκοι αυτοί θεωρούνται ως ομάδα ετερογενών όγκων, αλλά με παρόμοια και μοναδικά γενετικά χαρακτηριστικά. Πρόσφατα στοιχεία δείχνουν ότι η διαταραχή των κανονικών διαδικασιών ανάπτυξης είναι ένας σημαντικός παράγοντας στην παιδική ηλικία στερεά παθογένεση όγκων. Η βιολογία των περισσότερων καρκίνων παιδιά διαφέρει από ενήλικα καρκίνους, για το μεγαλύτερο μέρος, οφείλεται στην βλάστωμα καταγωγή τους. Τα παιδιά με συγγενή γενετική διαταραχές αναπτύσσουν συχνά πολλαπλούς τύπους συμπαγών όγκων της παιδικής ηλικίας. Αυτές οι παρατηρήσεις υποδεικνύουν ότι μπορεί να υπάρχουν ορισμένα μονοπάτια που είναι κοινές σε μια ποικιλία διαφορετικών στερεών όγκων παιδικής ηλικίας [20].

Σε αυτή τη μελέτη, αναγνωρίσαμε κοινή CSCs συνδέονται DEmiRs σε 6 παιδιατρικούς κυτταρικών σειρών συμπαγών όγκων. Χρησιμοποιήσαμε ένα υψηλής απόδοσης προσέγγιση qRT-PCR για να ερευνήσει την παγκόσμια έκφραση των miRNAs σε κλάσμα τους CSC. Στη συνέχεια εφαρμόστηκε νέο αλγόριθμο σύνδεσης miRNA-μονοπάτι μας για τη διαλεύκανση των χαρακτηριστικών της CSC. Επιπλέον, μελετήσαμε τις πιθανές επιπτώσεις της μερικά από τα DEmiRs στο ΚΕΠ με γονιδιακή σίγηση.

Αποτελέσματα

Ιεραρχική Ομαδοποίηση των Βλαστικών Κυττάρων Καρκίνου miRNAs

Χρησιμοποιώντας το νευρόσφαιρα και ALDEFLUOR® παρένθετης αναλύσεις και στρατηγικές ανάγνωσης που στοχεύουν στον εμπλουτισμό ενός πληθυσμού βλαστικών κυττάρων, όπως ο καρκίνος (CSC), είχαμε αποκαλύφθηκαν συγκεκριμένες DEmiRs που απορυθμίζεται σε αυτόν τον πληθυσμό. Εμείς προφίλ έξι παιδιατρικές κυτταρικές σειρές, Hep293TT, HepG2, MG-63, ΩΑΟΥ, SH-SY5Y, και RD-ES χρησιμοποιώντας TaqMan microRNA Micro υγρών Αναλύσεις Κάρτα και σε πραγματικό χρόνο ανάλυση PCR (Applied Biosystems). Πραγματοποιήσαμε έλεγχοι ποιότητας εξέταση των διαγράμματα διασποράς όλων των επιπέδων έκφρασης miRNA (ΔCt) στις κυτταρικές γραμμές 6 δοκιμάστηκαν (Σχήμα S1 στο File S1). Τα διαγράμματα διασποράς της ΔΟΙ συγκρίνοντας το στέλεχος που μοιάζει με κλάσμα εμπλουτισμένο έναντι μη ομολόγους τους βλαστικών σαν παρουσιάζουν αντιστοιχία (συντελεστής συσχέτισης & gt? 0,75). Όπως περιγράφεται στο τμήμα υλικών και μεθόδων, πήραμε 380 DEmiRs με τα επίπεδα έκφρασης 2.2 φορές επάνω ή κάτω ρυθμίζονται στα κλάσματα CSC σύγκριση με κλάσμα αναφορά βλαστοκυττάρων μη καρκινικό τους. Με αυτά τα 380 DEmiRs, επιλέξαμε τα miRNAs που εκφράζονται διαφορικά σε τουλάχιστον 4 από τις 6 κυτταρικές σειρές μας για να επιτρέψει κάποιο επίπεδο βλάβης ανοχής. Η δυνατότητα επιλογής ενός Demir από τυχαία πιθανότητα ήταν 0.017 (διωνυμική κατανομή). Ιεραρχική συσταδοποίηση διεξήχθη επί αυτών των 380 DEmiRs, όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α. Τα miRNAs των HepG2 και Hep293TT (ηπατοβλάστωμα) και ϋΑΟΥ (μυελοβλάστωμα) ήταν συγκεντρωμένα μαζί, ενώ RD-ES (σάρκωμα Ewing) και MG-63 (οστεοσάρκωμα) και SH-SY5Y (νευροβλάστωμα) ομαδοποιήθηκαν μαζί. Μια ομάδα 26 DEmiRs (23 up-ρυθμίζονται και 3 κάτω-ρυθμιζόμενες) βρέθηκαν (Εικόνα 1Β), συμπεριλαμβανομένων των

HSA-miR-21-5p

,

HSA-miR-148a-5P

,

HSA-miR-181-5P

,

HSA-miR-323-3p

, και

HSA-miR-487b-3ρ

, όπως εκφράζεται έντονα, και

HSA-miR-19a-5P

και

HSA-miR-25-5p

, όπως κάτω-ρυθμίζονται DEmiRs.

(Α). Οι τιμές έκφρασης των 380 DEmiRs μετρήθηκαν και ιεραρχική ομαδοποίηση έγινε. Το προφίλ έκφρασης των HepG2 και Hep293TT συνενώθηκαν με ϋΑΟΥ. RD-ES και MG-63 είναι ομαδοποιημένοι με SH-SY5Y. Διαφορικά εκφραζόμενο miRNAs (Β). Επελέγησαν είκοσι έξι miRNAs με αλλαγή τουλάχιστον 2 φορές σε 4 ή περισσότερα κυτταρικές σειρές. Είκοσι τρεις miRNAs ήταν μέχρι ρυθμίζονται και 3 προς τα κάτω ρύθμιση.

Η

miRNA στόχος Πρόβλεψη

Για τον προσδιορισμό των υποθετικών γονιδίων στόχων των DEmiRs, ο αλγόριθμος πρόβλεψης γονίδιο στόχο, BCmicrO [21 ] που περιγράφεται στην ενότητα Υλικά και Μέθοδοι, εφαρμόστηκε στα DEmiRs. Συνολικά, εντοπίστηκαν 865 υποθετικών γονιδίων στόχων microRNA (630 έως οργανωμένη και 235 κάτω ρυθμιζόμενη) (Εικόνα S2 σε S1 αρχείου). Στην ανάλυσή μας κάθε Demir κατά μέσο όρο είχαν 38 προβλέψει γονιδίων στόχων, με την εξαίρεση του

HSA-miR-138-2-3p

,

HSA-miR-655

, και

HSA -miR-101-3p

, το καθένα με περισσότερες από 100 προβλεπόμενο γονιδίων στόχων. Επιπλέον, βρήκαμε επίσης ότι δύο DEmiRs,

HSA-miR-487b-3ρ

και

HSA-miR-517c-3ρ

, είχε 7 και 25 γονίδια-στόχους, αντίστοιχα, προβλέπεται από TargetScan αλγόριθμος. Ωστόσο, αυτές οι DEmiRs δεν περάσει το κριτήριο επιλογής των BCmicrO (βλέπε Υλικά και Μέθοδοι).

Εμπλουτισμός Οι αναλύσεις των miRNA ρυθμιζόμενα μονοπάτια

Για να προβλέψετε ποια τις οδούς 26ης ΚΕΠ DEmiRs μας θα μπορούσε να ρυθμίζουν μας χρησιμοποιούνται τα ζεύγη miRNA-mRNA που λαμβάνεται όπως περιγράφεται παραπάνω για οδό και αναλύσεις εμπλουτισμού λειτουργία. χρησιμοποιήθηκαν τα σύνολα γονιδίων από KEGG, μονοπάτια Biocarta και την οντολογία γονιδίων (GO) τους όρους της βιολογικής διαδικασίας. Βρήκαμε 8, 12, και 34 αντικείμενα με στατιστική σημαντικότητα σε KEGG μονοπάτι, Biocarta μονοπάτι και Gene Ontology, αντίστοιχα (Πίνακες 1, 2, 3). Έξι από τα 8 εμπλουτισμένα αντικείμενα στο μονοπάτι KEGG ανήκαν σε διαφορετικούς τύπους καρκίνου: μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα, καρκίνο του προστάτη, χρόνια μυελοειδή λευχαιμία, γλοίωμα, μελάνωμα, και καρκίνο του παγκρέατος. Ανάμεσα στα σετ γονιδίων, πολλά κυτταρικού κύκλου και την κυτταρική γονίδια που σχετίζονται πολλαπλασιασμό όπως

CDKN1A

,

CDKN1B

,

E2F1

,

PTEN

και

RB1

ρυθμίζονταν από τα διαφορικά εκφραζόμενα miRNAs (Πίνακας S1 σε File S1), υποδεικνύοντας τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων να είναι μια σημαντική λειτουργία ρυθμίζεται από την CSC συνδεδεμένων DEmiRs. Η οδός ρ53 εμπλουτίζεται αφού το 15% των γονιδίων σε αυτή την οδό (

P

& lt? 0.001,

ES

= 2.18) ήταν οι στόχοι του DEmiRs μας (Πίνακας 1). Η μέθοδός μας προέβλεψε ένα σύνολο 10 γονιδίων που εμπλέκονται στην οδό p53 ως πιθανοί στόχοι για

HSA-miR-21-5p

,

HSA-miR-29b

,

HSA-ΜΙΚ 135b-5P

,

HSA-miR-494

, και

HSA-miR-655

(Εικόνα 2Α). Συγκεκριμένες λειτουργίες της οδού p53 που ενδέχεται να επηρεαστούν από αυτές τις DEmiRs ήταν διακοπή του κυτταρικού κύκλου, απόπτωση, η αναστολή της αγγειογένεσης και της μετάστασης, την επιδιόρθωση του DNA και την πρόληψη των ζημιών, η αναστολή της οδού TGF-1 /mTOR, και p53 αρνητική ανάδραση (Εικόνα 2Α, δείχνεται εγκλωβιστούμε στο κόκκινο).

(Α). Το p53 μονοπάτι που περιλαμβάνει 8 συστατικά σηματοδότηση, όπως ορίζεται από KEGG ήταν άκρως ρυθμίζεται από τις CSC συνδέονται DEmiRs. Πέντε από τα 26 DEmiRs είχαν εμπλακεί σε αυτή την οδό,

HSA-miR-21-5p, HSA-miR-135b, HSA-miR-29, HSA-miR-655, HSA-miR-494

. ΤΟΡ-β οδού του KEGG (Β). Το μονοπάτι TGF-β επίσης ρυθμίζεται από την CSC συνδέονται DEmiRs. Υποδοχέα

TGFBR1

ρυθμιζόταν από

HSA-miR-101-3p

,

και

υποδοχέα

TGFBR2

ρυθμιζόταν από

HSA-ΜΙΚ 21-5p

, και

HSA-miR-519a-3ρ

. Ο υποδοχέας

BMPR2

ρυθμιζόταν από

HSA-miR-101-3p, HSA-miR-21-5p, HSA-miR-181γ-5P και HSA-miR-494

. Κομβικές τύπου II κινάσης του υποδοχέα και του υποδοχέα

ACVR2B

επίσης ρυθμίζεται από το

HSA-miR-101-3p

.

Η

Η

ένα άλλο σημαντικό μονοπάτι στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, TGF-β /ΒΜΡ μονοπάτι, επίσης εμπλουτισμένο (

P =

0.001,

ES

= 2,28? Πίνακας 1). Εννέα γονίδια συμπεριλαμβανομένων 4 υποδοχείς,

TGFBR1

,

TGFBR2

,

ACVR2B

και

BMPR2

και ένα συνδετήρα, TGF-β, ρυθμίζονταν από 8 (

HSA-miR-181γ-5P

,

HSA-miR-21-5p, HSA-miR-101-3p

,

HSA-miR-494, HSA-miR-655 , HSA-mi-519a-3ρ, HSA-miR-29b-3ρ, HSA-miR-132-3p)

της 26ης CSC συνδεδεμένων DEmiRs, όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Β. Όπως προτείνεται στο Σχήμα 2Β, αλλοίωση σε ΤΟΡ-β και οι υποδοχείς ΒΜΡ μπορούν να παρενοχλήσουν Smad-εξαρτώμενη σηματοδότηση σε ΚΕΠ, ίσως σαν αποτέλεσμα διαταραγμένο ανάπτυξη σύλληψη, αποπτωτικών και διαφοροποίηση των προγραμμάτων. Έτσι, η απώλεια της ευαισθησίας ΤΟΡ-β προκαλώντας απορύθμιση των κυκλινών, CDKs και οι αναστολείς CDK, σε συνδυασμό με απορρύθμισης σε μονοπάτια p53 υποστηρίζεται πρόβλεψη μας ότι αυτές οι CSC σχετίζεται DEmiRs μπορεί να έχει κάποιο ρόλο στη ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και κυτταρικού κύκλου. Η ανάλυση εμπλουτισμός των οδών Biocarta, υποστηρίζεται περαιτέρω τα αποτελέσματα που λαμβάνονται από τις οδούς KEGG (Πίνακας 1). Τέσσερις σχολιασμένα μονοπάτια Biocarta, CELLCYCLE, G1, Ρ53, και RACCYCD, επίσης σχετίζονται με τον κυτταρικό κύκλο (Πίνακας 2,

P

& lt? 0,001 για όλες τις 4 οδών). Τα μονοπάτια εικόνες μαζί με γονίδια-στόχους CSC συνδεδεμένων DEmiRs παρέχεται στο Σχήμα S3 Α-Α στην S1 αρχείου. Το ΤΟΡ-β /ΒΜΡ οδού έδειξαν επίσης εμπλουτισμό σε ανάλυση Biocarta (Πίνακας 2,

P

= 0.001), ως εκ τούτου επιβεβαιώνοντας την πρόβλεψη μας μονοπάτι KEGG. Πρόσθετες μονοπάτια που λαμβάνονται στην ανάλυση εμπλουτισμό Biocarta ήταν CTCF, TOB1, ALK και μονοπάτια PTEN (Πίνακας 2,

P

αξία μικρότερη ή ίση με 0.001). Ορισμένα γνωστά γονίδια σε αυτά τα μονοπάτια είναι

TGFBR1

,

TGFBR2

, και

ΤΟΡβ

,

SMAD

οικογένεια και

PTEN

, περαιτέρω υποστηρίζοντας τη συμμετοχή CSC συνδέονται DEmiRs μας στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και του κυτταρικού κύκλου. Οι βιολογικές διεργασίες σε Γονιδιακή Οντολογία εφαρμόστηκαν επίσης στην ανάλυση εμπλουτισμό μας. Τριάντα τέσσερις όρους GO εμπλουτίστηκαν (

P

& lt? 0.01, Πίνακας 3). Βιολογικές διεργασίες που σχετίζονται με τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, όπως η θετική ρύθμιση των μεσεγχυματικών κυττάρων διάδοσης (

P

& lt? 0.007,

ES

= 2,66), αρνητική ρύθμιση των πολλαπλασιασμό των επιθηλιακών κυττάρων (

P

& lt? 0.001,

ES

= 2,44), G1 φάση του κυτταρικού κύκλου Μιτωτικά (

P

& lt? 0.001,

ES

= 2.29), θετική ρύθμιση των ινοβλαστών διάδοση των πυρηνικών όπλων (

P

& lt? 0.001,

ES

= 2,04), θετική ρύθμιση του Β κυτταρικού πολλαπλασιασμού (

P

= 0.001,

ES

= 1.70) , θετική ρύθμιση του πολλαπλασιασμού λείων μυϊκών κυττάρων (

P

& lt? 0.001,

ES

= 1,61) και την ανάπτυξη των κυττάρων (

P

= 0.004,

ES

= 1.53) εμπλουτίστηκαν σε CSC μας συναφείς DEmiRs. Μερικές βιολογικές διεργασίες συσχετίζονται με τη βιολογία του καρκίνου, αγγειογένεση, κυτταρική απόκριση στην υποξία, επούλωση πληγών, και την απόκριση στην ακτινοβολία, εμπλουτίστηκαν, καθώς και (Πίνακας 3). BMP σηματοδότησης και ΤΟΡ-βήτα έδειξε επίσης ως εμπλουτισμένο πορείες στην ανάλυση GO, παρόμοια με KEGG και αναλύσεις Biocarta οδό. Σηματοδότησης οδών όπως, θετική ρύθμιση της πρωτεϊνικής κινάσης Β καταρράκτη σηματοδότησης, την ενεργοποίηση της δραστικότητας της πρωτεΐνης κινάσης Ο από την G-πρωτεΐνη υποδοχέα πρωτεΐνης μονοπατιού σηματοδότησης, έδειξε επίσης σημαντικό εμπλουτισμό στην ανάλυση GO (Πίνακας 3).

Λειτουργική αξιολόγηση της HSA-miR-21-5p, HSA-miR-181γ-5P και HSA-miR-135b-5P In vitro

Για να Investigative την πιθανή λειτουργική συνάφεια σε «βλαστική ικανότητα» των

HSA-miR -21-5p

,

HSA-miR-181γ-5P

και

HSA-miR-135b-5P

, πραγματοποιήσαμε νοκ ντάουν πειράματα σε ϋΑΟΥ και SK-N-BE (2 ) κύτταρα. Κλειδωμένο νουκλεϊνικών οξέων (LNA ™) αντι-νόημα νοκ ντάουν του

HSA-miR-21-5p

μείωσε το κλάσμα του ΑΙ_ϋΗ

κύτταρα BR (υποκατάστατο δείκτη CSC) κατά 50% σε ΩΑΟΥ (Εικόνα 3Α). Δοκιμάσαμε τις επιδράσεις των

HSA-miR-181γ-5P

και

HSA-miR-135b-5P

αναστολή από την ικανότητα να αναπτυχθούν ως νευροσφαίρες στην ϋΑΟΥ και SK-N-BE (2 ) αντιστοίχως. Και στις δύο περιπτώσεις, η ικανότητα να σχηματίζουν σφαίρες (read-out για τον εαυτό ανανέωση) ήταν μειωμένη. Τα αποτελέσματα από

HSA-miR-135b

knockdown σε SK-N-Be (2) δείχνονται στο Σχήμα 3Β. Συνολικά, αυτές οι παρατηρήσεις πρότεινε ένα πιθανό ρόλο του

HSA-miR-21-5p

,

HSA-miR-181γ-5P

και

HSA-miR-135b-5P

στη ρύθμιση της αυτο-ανανέωσης σε ϋΑΟΥ και SK-N-BE (2) ΚΕΠ.

(Α). Περίπου δύο φορές μείωση στο κλάσμα εμπλουτισμένο για βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν παρατηρήθηκε στο

HSA-miR-21-5p

knockdown. Τα δεδομένα που εμφανίζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

HSA-miR-135b-5P

αναστολή από την ικανότητα να σχηματίζουν νευρόσφαιρες σε SK-Ν-ΒΑ (2) (Β). Μια απομείωση του σχηματισμού σφαίρας παρατηρήθηκε στην SK-N-BE (2)

HSA-miR-135b-5P

σταθερά νοκ ντάουν.

HSA-miR-135b-5P

Kd1, Kd2 και KD3 ήταν από τον ίδιο κλώνο. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τρία ανεξάρτητα πειράματα, που παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SEM.

Η

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη εντόπισε μια κοινή υπογραφή του απορυθμισμένη miRNAs που συνδέονται με την ΚΕΠ και προέβλεψε κάποια υποψήφια μονοπάτια επηρεάζονται σε ΚΕΠ από παιδιατρικούς όγκους. Το κλάσμα CSC εντός των έξι κυτταρικές γραμμές συλλέχθηκαν με χρήση διαφορετικών υποκατάστατων δοκιμασίες. Είκοσι-έξι διαφορικά εκφρασμένων miRNAs (DEmiRs) εντοπίστηκαν στο κλάσμα CSC των 4 από 6 κυτταρικές σειρές. Αυτό περιλαμβάνεται miRNAs με γνωστή ρόλο στη λειτουργία των ΚΕΠ (όπως

HSA-miR21-5p

), αλλά και νέες miRNAs (όπως

HSA-miR-487b

και

HSA-ΜΙΚ 323-3p

). Ήταν εντυπωσιακό να βλέπουμε ότι 6 από τα CSC συνδέονται DEmiRs έχουν αναφερθεί από άλλες ομάδες, όπως miRNAs που εμπλέκονται στη λειτουργία του CSC (ες) με τον πυρήνα αναπτυξιακές πορείες [22] – [28]. Να αποκτήσουν γνώσεις σχετικά με την εύλογη ρόλο της 26ης CSC συνδεδεμένων DEmiRs, εμείς γκρέμισε 3 της CSC συνδεδεμένων DEmiRs με τις γνωστές λειτουργίες της ΚΕΠ. Έχουμε αποδείξει ότι

HSA

–

miR-21-5p, HSA-miR-181γ-5P

και

HSA-miR-135b-5P

είχε επίδραση στην CSC κλάσμα μετρήθηκε με τη χρήση ΑΙ_ϋΗ

BR και νευρόσφαιρα σχηματισμό ως υποκατάστατων δεικτών. Τα δεδομένα μας ήταν παρόμοια με μελέτες από άλλες ομάδες που επέδειξε συμμετοχή αυτών των DEmiRs σε μονοπάτια CSC [22] – [28]. Οι παρατηρήσεις αυτές πρότειναν ότι απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για να χαρακτηρίσει αυτά τα CSC συνδεδεμένων DEmiRs σε παιδιατρικούς καρκίνους.

Επίσης, εισαγάγαμε μια μέθοδο η βιολογία συστημάτων για την πρόβλεψη μονοπάτια και τις λειτουργίες αυτών των CSC συνδεδεμένων DEmiRs. Μια Μπεϋζιανή προσέγγιση BCmicrO [21], [29] χρησιμοποιήθηκε ως ολοκληρωτής πολλαπλών αλγορίθμων πρόβλεψης στόχου. Ένα συνοπτικό μαθηματικό μοντέλο (Εξ. 2) παρουσιάστηκε στο χάρτη miRNAs στην οδό κανονισμό ή σε άλλες λειτουργικές ομάδες. Εμπλουτισμός ανάλυση για διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων εφαρμόστηκε με επιτυχία, μαζί με το ακριβές τεστ του Fisher για να καθορίσουν σημαντικές δραστικές οδούς στη μελέτη μας. Η μέθοδος μας παρείχε μια μοναδική ανάλυση εμπλουτισμού που συνδύαζε τις διαφορικές εκφράσεις DEmiRs και τη δύναμη πρόβλεψης στόχο να κατανοήσουν τη ρύθμιση σε ένα μονοπάτι ή λειτουργικό επίπεδο με επίκεντρο τις προβλεπόμενες γονίδια DEmiRs στόχο. Με τη χρήση του επιπέδου διαφορική έκφραση των DEmiRs, περιμέναμε περαιτέρω διορατικότητα ρύθμιση DEmiRs »και τις λειτουργίες τους μέσω της μεθόδου μας.

Αν και το λειτουργικό αποτέλεσμα των πιο miRNAs είναι ακόμα άγνωστη, χρησιμοποιήσαμε τα γονίδια miRNA στοχευμένες προβλέψει

in silico

να ανακαλύψουν τις λειτουργίες του κανονισμού της Demir και πιθανή παρέμβαση. Η μέθοδος μας παρέχει έτσι μια γέφυρα από DEmiRs σε μονοπάτι και ρύθμιση της λειτουργίας. Η υπολογιστική ανάλυση αυτών των 26 CSC συνδεδεμένων DEmiRs αποκάλυψε ότι αυτές θα μπορούσαν να ρυθμίζουν DEmiRs μόνο τέσσερα σχολιασμένα οδούς: τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, του κυτταρικού κύκλου, p53 και ΤΟΡ-βήτα /BMP (Πίνακες 1 και 2). Είναι γνωστό ότι το Notch, Wnt, Hedgehog και ΡΤΕΝ /Akt είναι πυρήνας αναπτυξιακά μονοπάτια σηματοδότησης που ενορχηστρώνουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, του κυτταρικού κύκλου και κυτταρικό πεπρωμένο

in vivo

. De-ρύθμιση σε αυτές τις τέσσερις κύριες οδούς σηματοδότησης έχει εκτενώς αποδειχθεί σε ΚΕΠ. Τα CSC σχετίζεται μας DEmiRs που εμπλέκονται σε αυτές τις βασικές οδούς αναπτυξιακές σηματοδότησης, όπως αναφέρεται ανωτέρω. Έξι από τα 26 CSC συνδέονται DEmiRs:

HSA

–

miR-19a-5P

[22],

HSA

–

miR-25-5p

[23], [24],

HSA-miR-181γ-5P

[25],

HSA-miR-21-5p

αναθεωρηθούν [26],

HSA

–

miR-135b-5P

[27] και

HSA miR-148a-5P-

[28] έχουν γνωστή λειτουργία (ες) σε ΚΕΠ. Σε αυτό το πλαίσιο, βιολογικά επικυρωθεί στόχους του

HSA-miR-21-5p

και

HSA-miR-135b-5P

, όπως παρατίθενται στον Πίνακα 4, έχουν χαρτογραφηθεί με PTEN /Akt, Notch και /ή Wnt οδούς και είναι απαραίτητα για την CSC αυτο-ανανέωση σε διαφορετικά κυτταρικά περιβάλλοντα [26], [27]. υπολογιστική ανάλυση μας χαρτογράφησαν το διαφορικά εκφραζόμενο

miR-181γ-5P

προς Notch μονοπατιού σηματοδότησης (Πίνακας 4) και να μορφογενετική πρωτεΐνη οστού (ΒΜΡ) οδού (Σχήμα 2Β) ένα άλλο CSC μονοπάτι αυτο-ανανέωση, τόσο γνωστό στιχομυθία με Wnt (αναθεωρούνται στο [30]). Ως εκ τούτου, μπορούμε να υποθέσουμε ότι στο μοντέλο μας συστήματα,

HSA-miR-21-5p

,

HSA-miR-135b-5P

και

HSA-miR-181γ-5P

μπορεί να ρυθμίζει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και του κυτταρικού κύκλου πιθανόν επηρεάζοντας PTEN /Akt, Notch ή /και Wnt σηματοδότηση μονοπατιών.

η

Εν κατακλείδι, εμείς που ρωτήθηκαν 6 παιδιατρικό καρκίνο κυτταρικές σειρές για CSC σχετίζονται DEmiRs που θα μπορούσαν να ρυθμίζουν τις λειτουργίες CSC. Χρησιμοποιώντας και τα δύο βαθμολογίες στόχο την πρόβλεψη και την έκφραση διαφορική miRNAs », και ένα νέο αλγόριθμο εμπλουτισμού που έχουν σχεδιαστεί ειδικά για τα προφίλ miRNAs έκφραση είχαμε προβλέψει μονοπάτια που ήταν ο αποδέκτης της DEmiRs στην CSC. Δεδομένης της σημασίας των αναπτυξιακών κλάδων όπως είναι Notch και Wnt, τα ευρήματά μας που παρουσιάζονται στην παρούσα μελέτη προτείνει επιπλέον στόχους για την προγνωστική και θεραπευτική παρέμβαση σε παιδιατρικούς καρκίνους.

Υλικά και Μέθοδοι

τηλέφωνα Γραμμές

Ανθρώπινο παιδικού καρκίνου κυτταρικές σειρές ϋΑΟΥ (μυελοβλάστωμα)? SK-N-BE (2) και SH-SY5Y (νευροβλάστωμα), HepG2 (ηπατοβλάστωμα), RD-ES (σάρκωμα Ewing), και MG-63 (οστεοσάρκωμα) λήφθηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC) και διατηρήθηκε στην ATCC συνιστάται μέσο καλλιέργειας. Όλα τα μέσα καλλιέργειας συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FBS? Atlanta® Biologicals) και 1% αντιβιοτικό-αντιμυκητιασικό, αμφοτερικίνη Β, πενικιλλίνη και στρεπτομυκίνη (Gibco®, Life Technologies ™). HEP 293TT (ηπατοβλάστωμα) είναι μια νέα κυτταρική σειρά ανθρώπινου ήπατος όγκου ιδρύθηκε το εργαστήριο μας παράγονται με τη χρήση πρωτογενών ιστούς όγκων από 5-ετών καυκάσιος θηλυκό παιδί [31]. κύτταρα Hep293TT καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 που περιέχει L-γλουταμίνη και 25 mM HEPES (Mediatech) και συμπληρωμένο με 10% FBS (Atlanta® Biologicals) και 1% αντιβιοτικό-αντιμυκητιασικό, αμφοτερικίνη Β, πενικιλλίνη και στρεπτομυκίνη (Gibco®, Life Technologies ™ ). Οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν σε ένα υγροποιημένο επωαστή στους 37 ° C με 5% διοξείδιο του άνθρακα.

Νευροσφαιρών Δοκιμασία Σχηματισμού

Ένα

in vitro

επιλεκτικό σύστημα καλλιέργειας αναφέρεται ως νευρόσφαιρας δοκιμασία χρησιμοποιήθηκε για να εμπλουτίσουν ΩΑΟΥ, SK-N-BE (2), SH-SY5Y, RD-ES και MG-63 ΚΕΠ. Χρησιμοποιώντας ένα καλά καθορισμένο πρωτόκολλο, και με την παρουσία αυξητικών παραγόντων συμπεριλαμβανομένων των βασικών αυξητικό παράγοντα ινοβλαστών (bFGF) και του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGF), είναι δυνατόν να παραχθεί μια πηγή ανανέωσης των βλαστικών-όπως τα καρκινικά κύτταρα, τα οποία μπορούν να επεκταθούν ως νευροσφαίρες . Τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε 2 × 10

4 κύτταρα /mL μετά καλλιεργήθηκαν σε εξαιρετικά χαμηλής πλάκες στερεώσεως (Corning) σε μέσο συντήρησης χωρίς ορό για τα ανθρώπινα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα (mTeSR ™ 1, Stem τεχνολογίες κυψελών). Μετά από περίπου 2 ημέρες, πρωταρχικός σφαίρες που σχηματίζονται με περίπου 100 κύτταρα ανά σφαίρα. Για την αξιολόγηση της αυτο-ανανέωση, ατομικές σφαίρες συλλέχθηκαν και αναλυτικά σε μονοκύτταρους αναστολές και σειριακά για δύο γενιές.

φθορισμού διαλογή κυττάρων ενεργοποιημένων (FACS) και Δοκιμασία ALDEFLUOR®

Hep293TT και HepG2 κλάσματα στέλεχος-όπως εμπλουτίστηκαν χρησιμοποιώντας FACS για τον εντοπισμό των κυττάρων με υψηλή ενζυματική δραστηριότητα των Αλδεΰδη αφυδρογονάσης (ALDH) χρησιμοποιώντας την δοκιμασία ALDEFLUOR® (Stem τεχνολογίες κυψελών) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Αυτή η δοκιμασία του κυττάρου εμπλουτισμένο κλάσμα με την υψηλή δραστικότητα ALDH ως ένδειξης για το στέλεχος που μοιάζει πληθυσμού. Εν συντομία, ΒΟϋΙΡΥ ™ αμινοακεταλδεΰδης (ΒΑΑΑ), ένα υπόστρωμα για ALDH, προστέθηκε, και όταν διεγείρεται στα 488 nm, τα βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν με υψηλή δραστηριότητα ALDH ανιχνεύθηκαν και οριοθετημένα από πράσινο φθορισμό τους σε 515-545 nm. Αυτός ο καθαρισμός των βλαστικών κυττάρων που ομοιάζουν επιβεβαιώθηκε χρησιμοποιώντας diethylaminobenzaldehyde (ϋΕΑΒ), ένας ειδικός αναστολέας της ΑΙ_ϋΗ, ως αρνητικός έλεγχος. Διαλογή κυττάρων διεξήχθη με ένα FACS Aria (λογισμικό FACS Diva v 6.1.2? Becton Dickinson). Βιώσιμα κύτταρα περιφραγμένη χρησιμοποιώντας ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ).

RNA Εκχύλιση και υψηλής απόδοσης miRNAs Ποσοτικοποίηση

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και το ολικό RNA απομόνωση χρησιμοποιώντας το mirVana miRNA κιτ απομόνωσης (Ambion) σύμφωνα με οδηγίες του κατασκευαστή. ελέγχους ακεραιότητας (μετρούμενη ως RNA Ακεραιότητα Number? RIN) και το δείγμα ποσοτικοποίηση εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας το Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies). miRNA profiling πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας μια ταχεία stem-loop αλυσιδωτή αντίδραση υψηλής απόδοσης ποσοτική πολυμεράσης (qRT-PCR) σε μια μορφή υψηλής απόδοσης 384 φρεάτια (χημεία microRNA Micro Δοκιμασίες Card Fluid »? Applied Biosystems) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή Συνολικά 768 ωριμάσει miRNAs και τους ελέγχους που βρίσκονται στο ανθρώπινο γονιδίωμα, σχολιασμένη στη miRBase μητρώου (https://microrna.sanger.ac.uk) έχουν προφίλ. Στο πρώτο στάδιο, το cDNA μεταγράφηκε ανάστροφα από ολικό RNA δείγματα (αραίωση 2 ng /mL) χρησιμοποιώντας δύο ομάδες ειδικών εναρκτήρων stem-loop RT. Οι μεταγράφεται cDNAs φορτώθηκαν σε δύο σύνολα μικρορευστονικής κάρτες (ομάδα Α και Β), κάθε δεξαμενή που περιέχει τα αποξηραμένα μοναδικές Taqman εκκινητές και ανιχνευτές (375 miRNAs και 9 έλεγχος ομαλοποίηση). qRT-PCR χρησιμοποιήθηκε για να ενισχύσει οϋΝΑ χρησιμοποιώντας ειδικούς εκκινητές προενισχυτή και πραγματοποιήθηκε σε πραγματικό χρόνο σύστημα PCR ΑΒΙ Prism 7900HT σε μορφή 384 και? με πισίνα Α και Β εκτελείται ξεχωριστά. Εδώ, οι δοκιμασίες διεξήχθησαν εις τριπλούν σε δύο ανεξάρτητα πειράματα. qRT-PCR συνθήκες θερμικής κυκλοποίησης περιλαμβάνονται 50 ° C για 2 λεπτά, 95 ° C για 5 λεπτά, στη συνέχεια 40 κύκλους των 95 ° C για 15 δευτερόλεπτα, 58 ° C για 30 δευτερόλεπτα, 72 ° C για 30 δευτερόλεπτα. Τα δεδομένα από τα εμπλουτισμένα κλάσματα στελέχους-όπως και τα μη βλαστικά όπως και οι ομόλογοί τους αναλύθηκε χρησιμοποιώντας το C

T μέθοδο κύκλο κατωφλίου (2

-ΔΔCT) Μέθοδος συγκριτική της σχετικής ποσοτικοποίησης (ΔΔCt = ΔCt δείγματος ΔCt βαθμονομητή? όπου ΔCt δείγματος = Ct βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν-Ct στελέχους-όπως τον έλεγχο του κυτταρικού εξομάλυνση, και ΔΟΙ βαθμονομητή = Ct μη βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν-Ct μη έλεγχο των βλαστικών κυττάρων όπως κανονικοποίηση).

Νοκ ντάουν της HSA-miR -135b-5P

miRZip-135b κατασκεύασμα αντι-miR-135b miRNA αγοράστηκε από το Σύστημα Βιοεπιστημών (SBI). Κατασκευάσματα έφτασε ως βακτηριακή ραβδώσεις. Μία απλή αποικία επιλέχθηκε και αναπτύχθηκε σε LB ζωμό (Fisher Scientific) με 50 μg /ml αμπικιλλίνης (Gibco®, Life Technologies ™). Τα πλασμίδια επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 37 ° C και συλλέχθηκαν την επόμενη ημέρα. Τα πλασμίδια καθαρίστηκαν σύμφωνα με τη PureLink® Quick πλασμίδιο Miniprep Kit (Life Technologies ™) πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Το καθαρισμένο πλασμιδιακό DNA διαμολύνθηκε σε κύτταρα SK-N-BE (2) κύτταρα. Εν συντομία, SK-Ν-ΝΑ (2) κύτταρα σπάρθηκαν σε 6-φρεατίων σε 8 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε αντιβιοτικό ελεύθερη ανάπτυξη μέσο όλη τη νύκτα. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 4 μg του DNA χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Life Technologies ™) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, το DNA και Lipofectamine επωάστηκαν σε ξεχωριστούς σωλήνες που περιέχουν 250 μι OptiMEM (Gibco®, Life Technologies ™). Το πλασμιδικό DNA και Lipofectamine ακολούθως συνδυάστηκαν και επωάστηκαν για 20 λεπτά. Τα κύτταρα πλύθηκαν με OptiMEM και φρέσκο ​​OptiMEM προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο. Το πλασμίδιο DNA και μείγμα Lipofectamine προστέθηκε στη συνέχεια σε κάθε καθορισμένο καλά και επωάστηκαν για 24 ώρες. Μετά από 24 ώρες, η έκφραση GFP μετρήθηκε για να προσδιοριστεί η αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης. Για να παραχθεί μία σταθερή κυτταρική γραμμή, τα κύτταρα ανακαλλιεργήθηκαν και αναπτύχθηκαν σε μέσο ανάπτυξης που περιέχει 1 μg /mL πουρομυκίνης (Gibco®, Life Technologies ™).

εξόντωση

HSA-miR-21-5p

και

HSA-miR-181γ-5P

με αντι-νόημα LNA ™ ολιγονουκλεοτίδια

ϋΑΟΥ κύτταρα σε εκθετική φάση ανάπτυξης καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία 6 φρεατίων (TPP, Techno Plastic Products) σε 8 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο και καλλιεργήθηκαν σε αντιβιοτικά ελεύθερα μέσα ενημέρωσης για ~24hours, που ακολουθείται από επιμόλυνση miRCURY LNA ™ νοκ ντάουν ανιχνευτές για

HSA-miR21-5p

και

HSA-miR181- 5pc

(Exiqon Inc.), με τη χρήση Oligofectamine και OPTIMEM® μέσου χωρίς ορό (Life Technologies ™), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Περίπου 6 ώρες μετά την επιμόλυνση, προστέθηκε μέσα με ορό, τότε 24 ώρες μετά τη διαμόλυνση, τα μέσα ενημέρωσης άλλαξε σε κανονικό μέσο ανάπτυξης (Ελάχιστο Βασικό Μέσο Eagles (Mediatech), 10% FBS (Atlanta® Biologicals) και 1% αντιβιοτικό-αντιμυκητιασικό? αμφοτερικίνη Β, πενικιλλίνη και στρεπτομυκίνη (Gibco®, Life Technologies ™). Δεν καθετήρα (μακέτα) χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός μάρτυρας.

Στατιστική Ανάλυση δεδομένων για miRNA Profiling

έκφραση microRNA ποιοτικού ελέγχου.

microRNA δεδομένα έκφρασης δημιουργούνται με αναλύσεις μικρορευστονικής κάρτες εξετάστηκαν για πρώτη φορά από διαγράμματα διασποράς συγκρίνοντας όλα τα δείγματα (Σχήμα S1 στο αρχείο S1) όπου τα επίπεδα των miRNAs έκφρασης (ΔΟΙ) του εμπλουτισμένα κλάσματα στελέχους-όπως και τα μη βλαστικά όπως και οι ομόλογοί τους ήταν απεικονίζονται. Τα αποτελέσματα θα πρέπει να παρουσιάζει κάποιο επίπεδο της αντιστοιχίας (επιλέγουμε συντελεστής συσχέτισης να είναι μεγαλύτερη από 0,75), διαφορετικά, η αναπαραγωγή θα κληθεί να επιβεβαιώσει το αποτέλεσμα ή να αντικαταστήσει το αποτυχημένο δοκιμασία.

διαφορικά εκφράζονται miRNAs (DEmiRs [33].