Αφηρημένο

miRNA ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης σε μετα-μεταγραφικό επίπεδο και να τελειοποιήσουν τις βασικές βιολογικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της εξέλιξης του καρκίνου. Εδώ, έχουμε αποδείξει την εμπλοκή του miR-200b στη μεταστατική εξάπλωση του καρκίνου του προστάτη. Εντοπίσαμε miR-200b ως μεταγενέστερος στόχος των ανδρογόνων υποδοχέων και συνδέεται με την έκφρασή της σε μειωμένη ογκογονικότητα και μεταστατική ικανότητα των καρκινικών κυττάρων του προστάτη. Η υπερέκφραση του miR-200b σε κύτταρα PC-3 ανέστειλε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό τους και το σχηματισμό υποδόριων όγκων. Επιπλέον, σε ένα ορθοτοπικό μοντέλο, miR-200b μπλοκάρει αυθόρμητη μετάσταση και αγγειογένεση με PC-3 κύτταρα. Αυτή η μειωμένη μεταστατικό δυναμικό ήταν πιθανό να οφείλεται στην αναστροφή της μετάβασης επιθηλιακών-to-μεσεγχυματικά, όπως αποδεικνύεται από τις αυξημένες παν-επιθηλιακό δείκτη Ε-καδερίνης και ειδικούς δείκτες του επιθηλίου του προστάτη, κυτοκερατινών 8 και 18. Σε αντίθεση, δείκτες μεσεγχυματικών, ινονεκτίνη και βιμεντίνης, ήταν σημαντικά μειωτικά από miR-200b. Τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν έναν σημαντικό ρόλο για miR-200b στην εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη και υποδεικνύουν δυνητική χρησιμότητα του για τη θεραπεία του καρκίνου του προστάτη

Παράθεση:. Ουίλιαμς LV, Veliceasa D, E Vinokour, Volpert OV (2013) miR-200b Αναστέλλει Καρκίνος του προστάτη EMT, την ανάπτυξη και μετάσταση. PLoS ONE 8 (12): e83991. doi: 10.1371 /journal.pone.0083991

Επιμέλεια: Hari Κ Κοαΐ, Louisiana State University Κέντρο Επιστημών Υγείας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 23 Σεπτεμβρίου 2013? Αποδεκτές: 11 Νοεμ, 2013? Δημοσιεύθηκε: 31 Δεκεμβρίου 2013

Copyright: © 2013 Williams et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Herman L . Kretschmer Ταμείο, μέσω του Τμήματος Ουρολογίας του Πανεπιστημίου Northwestern (OV), η SPORE στον καρκίνο του προστάτη Pilot Βραβείο P50 CA090386 (OV), διαφοροποίηση Τριτοβάθμιας Εκπαίδευσης Σχολή στο Ιλλινόις Fellowship Grant (ΒΑΚ). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

microRNA (miRNA) είναι μικρή, (21-22 νουκλεοτίδια) μη-κωδικοποίησης του RNA που συνδέονται με το mRNA και να καταστέλλουν την έκφραση γονιδίων από mRNA αποικοδόμηση /αποσταθεροποίηση ή μέσω απομείωση της μετάφρασης [1]. MicroRNA πρώτα μεταγράφονται ως 100 bp πρωτογενή miRNA δομές φουρκέτας, τα οποία στη συνέχεια διασπώνται από Drosha σε προ-miRNA και εξάγονται από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα για περαιτέρω επεξεργασία [2], [3]. Διάσπαση του προ-miRNA με πρωτεΐνες Dicer αποδίδει 22 bp διπλής έλικος μόρια, εκ των οποίων ο ένας κλώνος επιλεκτικά φορτώνεται επί των πρωτεϊνών Argonaute, τα οποία διευκολύνουν miRNA σύνδεση προς τις αλληλουχίες-στόχους 3’UTR επί mRNA. MiRNA παίζουν καθοριστικό ρόλο σε πολλές αναπτυξιακές και παθολογικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένων του καρκίνου του μαστού, του δέρματος, του πνεύμονα, του τραχήλου της μήτρας και [4] – [9].

Η miRNA HSA-miR-200b ανήκει σε μια οικογένεια που περιλαμβάνει miR-200a, miR-200c, miR-141 και miR-429. Δυσλειτουργία του mir-200b έχει αποδοθεί ένα κρίσιμο ρόλο στην επιθηλιακή προς μεσεγχυματικά μετάβασης (ΕΜΤ) και μετάστασης σε καρκίνους όπως του μαστού, του γαστρικού, του παγκρέατος και καρκινώματα [10] – [12]. Ανθρώπινα miR-200b συμμετέχει σε ένα διπλό βρόχο ανάδρασης με δύο μεταγραφικούς ρυθμιστές της Ε-καδχερίνη, ZEB1 και ZEB2 [13]. Σε φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα, miR-200b εκφράζεται σε υψηλά επίπεδα? στοχεύοντας τις περιοχές 3’UTR της προ-μεταστατικό μεταγραφικών παραγόντων ZEB1 και ZEB2 αναστέλλει την έκφραση και σταματά EMT [10]. Σε αντίθεση, στα μεσεγχυματικά κύτταρα, όπου η έκφραση ZEB1 /ZEB2 είναι ασυνήθιστα υψηλή, καταστέλλουν την miRNA του miR-200 οικογένεια αναστέλλοντας δραστηριότητα υποκινητή τους [13]. Πολλαπλές μελέτες αξιολογούν miR-200b λειτουργία EMT, αν και υπάρχουν λίγες προσπάθειες για την αντιμετώπιση του ρόλου της στον πρωτογενή ανάπτυξη του όγκου.

Εδώ, έχουμε αποδείξει ότι το miR-200b διαθέτει παρόμοια δραστηριότητα στον καρκίνο του προστάτη. Προσπαθώντας να εντοπίσει miRNA που συμβάλλουν στη μείωση της επιθετικότητας και ογκογένεση του καρκίνου του προστάτη, πραγματοποιήσαμε miRNA προφίλ των κυτταρικών σειρών με επαγόμενη έκφραση του υποδοχέα ανδρογόνων που αναπτύχθηκε προηγουμένως στο εργαστήριο μας. Βρήκαμε ότι miR-200b ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω στα ελάχιστα ογκογονικά κύτταρα PC3 AR-θετικά και ότι η υπερέκφραση του miR-200b οδηγούν σε μειωμένη ανάπτυξη του όγκου. Αυτή η μειωμένη ογκογένεση ήταν πιθανόν να οφείλεται σε μειωμένο πολλαπλασιασμό. Από την άλλη πλευρά, miR-200b απορυθμίζεται έντονα την επιθηλιακών κυττάρων δείκτη Ε-καδερίνης σε κύτταρα PCa, ενώ οι δείκτες μεσεγχυματικά φιμπρονεκτίνη και βιμεντίνης ήταν ταυτόχρονα μειώνεται. Σε συμφωνία με τις αναλύσεις που πραγματοποιήθηκαν σε άλλους τύπους όγκων, ZEB1, ένας μεταγραφικός ρυθμιστής της Ε-καδερίνης μειώθηκε επίσης κατά miR-200b υπερέκφραση. Επιπλέον, miR-200b μειώνεται η επεμβατική δυναμικό των κυττάρων προστάτη

in vitro

και μειωμένη μετάσταση. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι το miR-200b μειώνει την ανάπτυξη του όγκου και αντιστρέφει EMT στον καρκίνο του προστάτη.

Μέθοδοι

Animal Welfare Assurances

Όλες οι μελέτες που αφορούν πειραματόζωα (ποντίκια) εγκρίθηκαν από Πανεπιστήμιο Northwestern Φροντίδα ζώων και Επιτροπή Χρήσης και εκτελούνται σε συμφωνία με τις κατευθυντήριες γραμμές που εγκρίθηκαν και προτείνεται από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας (Animal αριθμός διασφάλιση A3283-01, ημερομηνία λήξης 05.31.2014).

Γραμμές κυττάρων και Θεραπεία προϋποθέσεις

PC3 κύτταρα επιμολυσμένα με επαγώγιμων υποδοχέων άγριου τύπου ανδρογόνων (AR) ή το πλασμίδιο ελέγχου καθορίστηκαν προηγουμένως [14]. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε μέσο RPMI συμπληρωμένο με 10% τετρακυκλίνη χωρίς εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS), 2% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη, 50 μg /ml ζεοκίνη και 1 μg /ml Blasticidin. Για την έκφραση AR, PC3-AR κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για 5 ημέρες με 1 μg /ml του δοξυκυκλίνη και 1 ηΜ μεθυλοτριενολόνης (R1881) σε άνευ ερυθρού φαινόλης μέσο RPMI συμπληρωμένο με 10% απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα FBS, 2% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη, 50 μg /ml ζεοκίνη και 1 μg /ml Blasticidin. Τα γονικά κύτταρα PC3 διατηρήθηκαν σε RPMI με 10% FBS και 2% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη. Όλα τα κύτταρα αναπτύχθηκαν στους 37 ° C και 5% CO

2, σε έναν υγροποιημένο επωαστήρα.

ανοσοαποτύπωσης

Τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε πυκνότητα 100.000 κύτταρα ανά cm τρυβλίο 10. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με απόξεση σε αλατούχο ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (PBS) και φυγοκεντρήθηκαν στις 2500 RPM για 10 λεπτά στους 4 ° C. Το σφαιρίδιο κυττάρου υπέστη λύση σε ρυθμιστικό διάλυμα ΚΙΡΑ (Sigma, St. Louis, ΜΟ) συμπληρωμένο με διάλυμα αναστολέα πρωτεάσης 1Χ /φωσφατάση (Thermo Scientific, Waltham, ΜΑ) και φυγοκεντρήθηκε στις 12.000 rpm για 20 λεπτά στους 4 ° C. Η συγκέντρωση του υπερκειμένου προσδιορίστηκε εις τριπλούν με προσδιορισμό πρωτεΐνης (Protein Assay DC, Biorad, Hercules, CA). Τα προϊόντα λύσης υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση σε 4% -20% πηκτώματα Τπδ HCL πολυακρυλαμιδίου (Biorad, Hercules, CA). Πρωτεΐνη λύμα μεταφέρθηκε διάρκεια της νύχτας σε μεμβράνες PVDF (GE Healthcare Life Sciences, Pittsburg, ΡΑ). Κάθε μεμβράνη ξεπλύθηκε σε 1Χ Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα με 0.1% Tween 20 (TBS-T), αποκλείστηκαν με 5% άπαχο γάλα σε ΤΒδ-Τ και ανιχνεύθηκαν με αντισώματα όπως υποδεικνύεται στον Πίνακα S3.

RNA εξόρυξη

Για την ανίχνευση miRNA, ολικό RNA απομονώθηκε με miRNeasy μίνι κιτ (Qiagen, Valencia, CA). Για την εκχύλιση mRNA, όγκοι καταψύχθηκαν ακαριαία σε υγρό άζωτο και μεταφέρθηκαν σε σταθεροποιητικό διάλυμα RNA (Ambion, Life Technologies, Grand Island, ΝΥ). Οι όγκοι διατηρήθηκαν στους -80 ° C και η εκχύλιση του RNA πραγματοποιήθηκε με τη χρήση miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA). Η συγκέντρωση του RNA και η καθαρότητα μετρήθηκε με NanoVue Plus φασματοφωτόμετρο (GE Healthcare Life Sciences, Pittsburg, ΡΑ).

Real Time RT-PCR

Το RNA μεταγράφηκε αντίστροφα με miScript II RT Kit (Qiagen , Valencia, CA) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το προκύπτον cDNA χρησιμοποιήθηκε για ανάλυση σε πραγματικό χρόνο PCR χρησιμοποιώντας κιτ miScript SYBR Green PCR (Qiagen, Valencia, CA). Για τις μεμονωμένες miRNA ποσοτικοποίηση χρησιμοποιήσαμε miScript Primer Αναλύσεις (Qiagen, Valencia, CA). Για την ανάλυση αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR), εμπρόσθιοι και αντίστροφοι εκκινητές σχεδιάστηκαν και αγοράστηκαν από Integrated DNA Technologies (Coralville, ΙΑ) και οι αντιδράσεις εκτελούνται χρησιμοποιώντας SYBR Green σούπερ μείγμα (Quanta Biosciences, Gaithersburg, MD). Οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν σε ένα θερμικό iCycler (Biorad, Hercules, CA). Κάθε δείγμα εξετάστηκε εις τριπλούν.

miRNA Array Ανάλυση

PC3-AR κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με δοξυκυκλίνη (Dox) και R1881 (όπως περιγράφεται παραπάνω) για την έκφραση και την ενεργοποίηση των ανδρογόνων υποδοχέων (AR) , αντίστοιχα. RNA εκχυλίστηκε όπως περιγράφεται παραπάνω και 5 μg από κάθε δείγμα στάλθηκε στο LC Sciences (Houston, ΤΧ) για ανάλυση της σειράς. Τα δείγματα σημάνθηκαν με Cy

3 ή Cy

5 και η αναλογία έντασης από το καθένα χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των μεταβολών στο επίπεδο έκφρασης miRNA. Μια αλληλουχία ελέγχου RNA 20 νουκλεοτιδίων συμπληρωματική προς πολλαπλούς ανιχνευτές ελέγχου στίγματα σε κάθε τσιπ συμπεριλήφθηκε σε κάθε δείγμα ως εσωτερικό έλεγχο. Οι μικροσυστοιχίες πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν για τις αλληλουχίες ανθρώπου, ποντικού και αρουραίου. Το δυναμικό φάσμα στόχων για επιλεγμένα miRNA ορίστηκε χρησιμοποιώντας Sanger miRBase 11.0. Η στατιστική σημαντικότητα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας T-test του Student για p & lt? 0,10, p & lt? 0,05 και p & lt?. 0.01

miR-200b υπερέκφραση

Μεταφορά φορέα πρόδρομος αλληλουχία που κωδικοποιεί HSA-miR-200b (pMIRNA1 pCDH-CMV-MCS-EF1-copRFP) και του φορέα ελέγχου (pCDH-CMV-MCS-EF1-copRFP) από το Σύστημα Βιοεπιστημών (SBI, Mountain View, CA) διαδόθηκαν σε Luria Broth 50 μg /ml αμπικιλλίνη διάρκεια της νύχτας στους 30 ° C σε ένα περιστροφικό αναδευτήρα. Ελεύθερο ενδοτοξίνης πλασμιδιακό DNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας ενδο-Free Maxi Prep κιτ (Qiagen, Valencia, CA). Λεντοϊών σωματίδια παρήχθησαν για κάθε πλασμίδιο σε κύτταρα ΗΕΚ293Τ με τη χρήση του περιβλήματος pMD2.G και psPAX2 2

nd γενιά πλασμίδια συσκευασίας (AddGene, Cambridge, ΜΑ). Ο τίτλος προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής των μολυσμένων κυττάρων όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15]. Για την επιμόλυνση, τα κύτταρα PC3 σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων σε 10

5 κύτταρα /φρεάτιο. Την επόμενη ημέρα, το μέσο αντικαταστάθηκε με 1 ml 1Χ DMEM που περιέχει την κατάλληλη ΜΟΙ λεντοϊού σωματιδίων για miR-200b και κενός έλεγχος φορέα. Μετά από 6 ώρες επώασης, τα κύτταρα τροφοδοτήθηκαν με RPMI με 10% FBS και 2% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη και επωάστηκαν για επιπλέον 48 ώρες. Τα μετατραπέντα κύτταρα που εκφράζουν υψηλά επίπεδα του δείκτη RFP απομονώθηκαν και κυτταρομετρία ροής σε συνδυασμό με διαλογή κυττάρων και διατηρήθηκαν σε RPMI με 10% FBS, πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη και 1 μg /ml πουρομυκίνη για επιπλέον επιλογή.

Ογκογένεση Δοκιμασίες

(1) υποδόριο εμβολιασμό.

γονικά κύτταρα PC3, PC3 κύτταρα μεταδιεγείρονται με φακοϊό ελέγχου και miR-200b κύτταρα αναπτύχθηκαν όπως περιγράφεται ανωτέρω, συλλέχθηκαν και επανεναιωρήθηκαν σε 2 χ 10

7 κύτταρα /ml σε RPMI ελεύθερο ορού. Εκατό μΐ εναιωρήματος κυττάρων (2 χ 10

6 κύτταρα /ποντικό) εγχύθηκαν υποδορίως στα οπίσθια οπίσθια τεταρτημόρια αθυμικών αρσενικά ποντίκια (ηυ /ηυ, η = 5). Οι όγκοι μετρήθηκαν με microcalipers τρεις φορές την εβδομάδα και τερματίστηκε το πείραμα 29 ημέρες μετά την εμφύτευση. Οι όγκοι καταψύχθηκαν ακαριαία σε υγρό άζωτο και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C για μεταγενέστερη ανάλυση.

(2) ορθοτοπική εμφύτευση των κυττάρων του όγκου πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [16].

Εν συντομία , τομές μέσης γραμμής έγιναν, ανώτερη περιοχή των γεννητικών οργάνων του ύπτια αναισθητοποιημένων αρσενικών αθυμικών ποντικών (ηυ /ηυ). Η ουροδόχος κύστη εξωτερικεύονται και επεκτάθηκε με μια μπατονέτα για να αποκαλύψει τις σπερματοδόχες κύστεις και την ράχη του προστάτη. Όγκου κύτταρα σε 50 μΙ RPMI χωρίς ορό (10

6 ανά ζώο) ενέθηκαν εντός του προστάτη και ο μυς και το δέρμα κλείστηκαν με ράμματα και συνδετήρες μετάλλων, αντίστοιχα. Όλες οι διαδικασίες πραγματοποιήθηκαν σε αποστειρωμένο περιβάλλον. Μεταλλικά κλιπ απομακρύνθηκαν 2 εβδομάδες μετά την ένεση. Η ανάπτυξη του όγκου παρακολουθήθηκε με φθορισμό GFP, χρησιμοποιώντας μικρές OV100 σύστημα απεικόνισης ζώο (Olympus). τερματίστηκε Το πείραμα 20 ημέρες μετά την εμφύτευση. Οι όγκοι αποκόπηκαν και καταψύχθηκαν ταχέως για επακόλουθη ανάλυση. Για την εκτίμηση της μετάστασης, το απομένον φθορισμός μετρήθηκε μετά την αφαίρεση του πρωτογενούς όγκου.

Δοκιμασία Πολλαπλασιασμού

Τα κύτταρα εμβολιάστηκαν εις τριπλούν σε πλάκες 96 φρεατίων στα 3 χ 10

3 κύτταρα /Λοιπόν. Μετά από 24, 48, και 72 ώρες, 10 μΐ WST-1 αντιδραστηρίου (Roche, Indianapolis, ΙΝ) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και επωάζονται για 2 ώρες. Η απορρόφηση μετρήθηκε για κάθε χρονικό σημείο κατά το μήκος κύματος 450 nm χρησιμοποιώντας τον αναγνώστη μικροπλάκας Biorad (Biorad, Hercules, CA).

In Vitro

εισβολή Δοκιμασία

Transwell ένθετα (Corning, Tewksbury, ΜΑ) επικαλύφθηκαν με 100 μΐ 1 mg /ml φαινόλης Red Παράγοντα ελεύθερη ανάπτυξη μειωμένη Matrigel (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) και αφέθηκε να στερεοποιηθεί στους 37 ° C σε επωαστή καλλιέργειας ιστού επί 24 ώρες . Τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε πυκνότητα 10

6 κύτταρα /200 μΙ σε RPMI άνευ ορού, σπάρθηκαν σε διπλότυπα στο πάνω μέρος των επικαλυμμένων ένθετα και επωάστηκαν στους 37 ° C για 24 ώρες, με 700 μΙ 10% FBS προστέθηκε στον κάτω θάλαμο ως χημειοελκτικό. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας DiffQuick Στερεωτικού διαλύματα (Dade Behring, Malvern, ΡΑ) και 6 πεδία απεικονίστηκαν για κάθε πειραματική συνθήκη. Η εισβολή υπολογίστηκε ως ποσοστό εισέβαλαν κύτταρα. Το πείραμα διεξήχθη δυο φορές.

Κυτταρικού Κύκλου Ανάλυση

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 10

6 κύτταρα /ml σε RPMI συμπληρωμένο με 0,2% FBS. Μετά από 48 ώρες τα κύτταρα υπέστησαν κατεργασία τρυψίνης, πλύθηκαν δύο φορές σε ψυχρό PBS, σταθεροποιήθηκαν σε 10 ml 75% παγωμένης αιθανόλης και διατηρούνται επί μία νύκτα στους -20 ° C. Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές σε 1Χ PBS στους 4 ° C, επαναιωρήθηκε σε διάλυμα χρώσης 2,0 ml ϋΑΡΙ (0,1% TritonX 100 σε 10 ml PBS, 100 μΐ 1 mg /ml ϋΑΡΙ) και αναλύθηκαν με FACS.

Στατιστική Ανάλυση

Όλα τα ποσοτικά δεδομένα παρήχθησαν από τουλάχιστον δύο ανεξάρτητα πειράματα ομαδοποιήθηκαν μαζί, με κάθε μεμονωμένο σημείο δεδομένων διεξάγεται εις τριπλούν. Τυπική Απόκλιση (SD) υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Microsoft Excel. Για τον προσδιορισμό στατιστικής σημαντικότητας των παρατηρούμενων difffrences, έχουμε εκτελούνται κατά ζεύγη σύγκριση των συνόλων δεδομένων, χρησιμοποιώντας Τ-τεστ μονόπλευρο του Student. Η στατιστική σημαντικότητα ορίστηκε σε τιμή P δεν υπερβαίνει το 0,05.

Αποτελέσματα

miR-200b απορυθμίζεται από AR

Προηγούμενη δεδομένα από την ομάδα μας έδειξε ότι υποδοχέα ανδρογόνων (AR) αναστέλλει ογκογονικές ιδιότητες του AR-αρνητική κυτταρική σειρά καρκίνου του προστάτη, PC-3 [14]. MicroRNA είναι σημαντικοί τροποποιητές της βιολογικής λειτουργίας, συμπεριλαμβανομένης της ανάπτυξης του όγκου. Αναζητήσαμε το miRNA που ελέγχονται από AR και συμμετέχουν στην αρνητική ρύθμιση της εξέλιξης του καρκίνου του προστάτη. Για το σκοπό αυτό, πραγματοποιήσαμε miRNA προφίλ του προηγουμένως δημιουργείται κυτταρική γραμμή με την έκφραση AR που επάγεται από τετρακυκλίνη ([14], το Σχ. 1α). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με δοξυκυκλίνη (Dox) για την εξασφάλιση της έκφρασης AR και με R1881, για να προκληθεί AR πυρηνική μετατόπιση και μεταγραφική δραστικότητα.

(Α) κηλίδας Western για να επιβεβαιωθεί επαγώγιμη έκφραση AR σε PC3-AR κύτταρα. κύτταρα PC3-AR υποβλήθηκαν σε αγωγή 5 ημέρες με δοξυκυκλίνη για να επαχθεί έκφραση AR και με R1881 για να επάγει την ενεργοποίηση AR και πυρηνικής μετατόπισης. Η σύγκριση είναι να μη επεξεργασμένο έλεγχο. Σύνολο κυτταρολύματα χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση. (ΣΙ). Θερμότητα χάρτη της έκφρασης των miRNAs σε PC3-AR και τον έλεγχο των κυττάρων. Ολικό RNA από κύτταρα σε Α χρησιμοποιήθηκε για ανάλυση μικροσυστοιχιών και κάθε δείγμα αναλύθηκε εις τριπλούν. Η στατιστική σημαντικότητα των αλλαγών έκφρασης που δείχνεται έχει προσδιοριστεί χρησιμοποιώντας Τ-τεστ Student. Ρ τιμές & lt? 0,05 αποδόθηκαν στατιστική σημαντικότητα

Η

ανάλυση μικροσυστοιχιών αποκάλυψε στατιστικά σημαντική διαφορική έκφραση των 837 ατομικών miRNA σε απάντηση στην ενεργοποίηση AR. (P & lt? 0,05, όπως προσδιορίζεται από την T-test Φοιτητές »), της τα οποία 116 έδειξε Ρ-τιμές κάτω από 0,01 (Σχήμα 1β, πίνακες S1 και S2). Επιλέξαμε miRNA που άλλαξαν περισσότερο από 2 φορές και ανέλυσε τις δυνατότητές τους στόχους και τις λειτουργίες χρησιμοποιώντας Sanger miRBase έκδοση 11.0 και Diana Micro T έκδοση 3.0. επέλεξε οκτώ miRNA βασίστηκαν στην ενδεχόμενη εμπλοκή τους στην πρόοδο του καρκίνου, όπως προσδιορίστηκε από το

in silico

ανάλυση και δημοσιευμένες μελέτες. Πέντε από το επιλεγμένο miRNA απορυθμίζεται στις λιγότερο ογκογονικά κύτταρα PC3-AR επίσης σχετίζεται με μειωμένο ογκογένεση σε άλλους καρκίνους (Πίνακας 1). MicroRNA από το σύμπλεγμα miR-200 (MIR-200Α, miR-200b) έχουν δειχθεί ότι δρουν ως καταστολείς όγκων στο γαστρικό, τραχήλου, πνεύμονα, μαστού και καρκίνοι του προστάτη [9], [10], [17], [18] . Αυξημένα επίπεδα miR-200c έχουν συνδεθεί με μειωμένη μετάσταση σε μελάνωμα, καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων, και του καρκίνου του προστάτη [6], [18], [19]. miR-30a και miR 30-d έκφραση μειώνεται σημαντικά σε χρόνια μυελοειδή λευχαιμία, μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα, καρκίνωμα νεφρικών κυττάρων, και του καρκίνου του προστάτη [20] – [23]. Σε αντίθεση, miR-7 και miR-9 επίπεδα μειώθηκαν στα λιγότερο ογκογόνο κυτταρική γραμμή. Σε συμφωνία, miR-7 έχει αναγνωριστεί ως ογκογονίδιο σε καρκίνωμα νεφρικών κυττάρων [24] και miR-9 αποδίδεται ένα ρόλο στην λευχαιμογένεση [25] – [27]. Χαμηλά επίπεδα miR-196a παρατηρήθηκαν σε κακόηθες μελάνωμα [28] (Πίνακας 2).

Η

Έχουμε επικυρωθεί επιλέξτε microRNA που προσδιορίζονται από την ανάλυση πίνακα με χρήση PCR πραγματικού χρόνου. Πράγματι, miR-200b, 30α, και 30d αυξήθηκαν, και miR-9 μειώθηκε, και αυτές οι αλλαγές ήταν στατιστικά σημαντικές (p ≤ 0,05) (Σχήμα 2α). Έχουμε επιλέξει miR-200b για περαιτέρω ανάλυση, δεδομένου ότι έδειξε την υψηλότερη φορές μεταβολής και λόγω των γνωστών ρόλου της στην EMT και μετάσταση [10], [13].

(Α). έκφραση miRNA ομαλοποιήθηκε με εκείνη των κυττάρων ελέγχου (Ctrl). κύτταρα ελέγχου PC3-AR και έλαβαν θεραπεία 5 ημέρες με δοξυκυκλίνη για να επαχθεί έκφραση AR και με R1881 για να επάγει την ενεργοποίηση AR και πυρηνική μετατόπιση και το ολικό RNA συλλέγεται για ανάλυση. Η σύγκριση είναι να μη επεξεργασμένο μάρτυρα και RNU1A_1 μη κωδικοποιητικού RNA χρησιμοποιείται ως εσωτερικός έλεγχος. Η στατιστική σημασία των παρατηρούμενων διαφορών σε σχέση με τον έλεγχο είναι * p ≤ 0,05, και ** p≤0.01 όπως προσδιορίστηκε με μονόπλευρο έλεγχος τ. Οι μέσες τιμές υπολογίζονται για δυο ανεξάρτητα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. (Β) ενεργοποίηση AR απορυθμίζει miR-200b. PC3 κύτταρα-AR (γκρίζες ράβδοι) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία 5 ημέρες με δύο δοξυκυκλίνη για να επαχθεί έκφραση AR και με R1881 για να επάγει την ενεργοποίηση AR και πυρηνικής μετατόπισης. Η σύγκριση είναι να μη επεξεργασμένο έλεγχο. Flutamide προστέθηκε όπου ενδείκνυται για να εμποδίσει δραστηριότητα AR. Ελέγχου των κυττάρων (ctrl) PC3-AR είχαν αφεθεί χωρίς θεραπεία. RNU1A_1 μη κωδικοποιητικό RNA χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. *, P & lt? 0,05? **, Ρ & lt? 0,01, όπως προσδιορίζεται με μαθητές T-test. Οι μέσες τιμές υπολογίστηκαν για δύο ανεξάρτητα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

Η

Μετρήσαμε miR-200b επίπεδα σε κύτταρα PC3-AR υποβάλλεται σε επεξεργασία με τον συνδυασμό δοξυκυκλίνη, ενός συνθετικού ανδρογόνου R1881 και το αντι-ανδρογόνο φλουταμίδιο , ένας ανταγωνιστικός αναστολέας της λειτουργίας AR. MiR-200b ήταν σημαντικά αυξημένη σε απάντηση R1881 και η αύξηση αυτή καταργήθηκε με φλουταμίδη με δοσοεξαρτώμενο τρόπο, προτείνοντας μια άμεση μεταγραφική ρύθμιση από AR (Σχήμα 2β).

miR-200b καταστέλλει την ανάπτυξη του καρκίνου του προστάτη ξενομοσχεύματα

Είμαστε δίπλα ζήτησε την επίδραση του miR-200b έκφραση σε ογκογένεση του καρκίνου του προστάτη. Εμείς υπερεκφράζεται miR-200b σε κύτταρα PC3 με μεταγωγή με υψηλού τίτλου φακοϊό, χρησιμοποιώντας κενό φορέα (pCDH-CMV-MCS-EF1-copRFP) ως αρνητικός έλεγχος, και επιβεβαιώθηκε miR-200b έκφραση με πραγματικού χρόνου RT-PCR (Σχήμα 3α). Οι προκύπτουσες κυτταρικές γραμμές και τα γονικά κύτταρα PC3 εγχύθηκαν υποδορίως σε αρσενικούς αθυμικά γυμνά ποντίκια. Είναι σημαντικό ότι, οι όγκοι που σχηματίζονται από τα κύτταρα που εκφράζουν miR-200b ήταν σημαντικά μικρότερες τότε όγκων που σχηματίζεται από τη γονική PC3 και τα κύτταρα μεταδιεγείρονται με φορέα ελέγχου (σχήμα 3β). Σημαντικά, miR-200b έκφραση διατηρήθηκε για όλη τη διάρκεια του πειράματος, όπως επαληθεύθηκε με πραγματικού χρόνου RT-PCR (Σχήμα 3c). Επειδή αλληλεπιδράσεις όγκου με μικροπεριβάλλον της διαδραματίζουν έναν κρίσιμο ρόλο στην εξέλιξη του όγκου, εκτελέσαμε ορθοτοπική εμφύτευση του PC3-200b και τον έλεγχο κυτταρικές σειρές όπως περιγράφηκε προηγουμένως [16] στην ραχιαία προστάτη αρσενικών αθυμικών ποντικών. Πήραμε πλεονέκτημα του δείκτη RFP ενσωματώνονται στο δισιστρονικό φορέα λεντοϊού να εκτελεί διαμήκη

in vivo

απεικόνισης. Η συνολική φθορισμός προ-ανατομή ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε ποντίκια που φέρουν PC3 miR-200b θετικών όγκων συγκριτικά με την ομάδα ελέγχου φορέα (Σχήμα 3d, ε). Έτσι η έκφραση miR-200b ήταν αρκετή για να μειώσει την ανάπτυξη του όγκου. Επιπλέον, η απεικόνιση της κοιλιακής χώρας μετά την αφαίρεση του όγκου αποκάλυψε σημαντικά μικρότερο φθορισμού οφείλεται σε δευτερογενή βλάβες, γεγονός που υποδηλώνει ότι το miR-200b μειώθηκαν τόσο από την πρωτογενή ανάπτυξη και μετάσταση από τα κύτταρα PC-3 προστάτη (βλέπε παρακάτω).

Α) Αναγκαστική έκφραση του miR-200b στα κύτταρα PC3. PC3 κύτταρα trasduced με ένα δισιστρονικό φορέα λεντοϊού μεταφοράς (pMIRNA1 pCDH-CMV-MCS-EF1-copRFP) κωδικοποίησης HSA-miR-200b και κενό φορέα ελέγχου (ctrl). Ολικό RNA απομονώθηκε και μετρήθηκε η έκφραση ΜΙΚ 200b χρησιμοποιώντας πραγματικού χρόνου RT-PCR. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τρία ανεξάρτητα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. *, P≤0.01. (Β) miR-200b μειώνεται ογκογένεση με PC-3 κύτταρα. Γονικά κύτταρα PC3, PC3 κύτταρα trasduced με miR Control (Ctrl) και miR-200b υποδόρια ένεση στα οπίσθια τεταρτημόρια χωρίς θύμο αδένα αρσενικών ποντικών (n = 5). Το βάρος του όγκου την ημέρα 29 μετά την ένεση παρουσιάζεται. *, P ≤ 0,05? **, P≤0.01. (Γ) Οι όγκοι διατηρήθηκαν miR-200b έκφρασης. Σχετική miR-200b έκφραση μετρήθηκε με πραγματικού χρόνου RT-PCR σε όγκους από τον πίνακα (Β). * P ≤ 0,05. (ΡΕ). miR 200b μειωμένη ανάπτυξη του όγκου σε ένα ορθοτοπικό μοντέλο καρκίνου του προστάτη. RFP-tagged PC3-ctrl και τα κύτταρα PC3-200b ήταν implaned στους προστάτες του θύμο αδένα αρσενικών ποντικών. Ο μέσος φθορισμός μετρήθηκε 20 ημέρες μετά την ένεση. (Ε) φθορισμού ανά ζώο προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ολόκληρο το σώμα απεικόνισης, με το σύστημα της Olympus OV100. *, P ≤ 0,05. (F) Η κυτταρική ανάπτυξη μετρήθηκε με WST-1 προσδιορισμό. PC3-ctrl ή PC3 miR-200b κύτταρα σπάρθηκαν στα 3000 κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκα 96 φρεατίων. Η απορρόφηση μετρήθηκε στα ενδεικνυόμενα χρονικά σημεία χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη μικροπλακών Biorad μοντέλο 680. Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο τριών ανεξάρτητων πειραμάτων που εκτελούνται εις τριπλούν. *, P ≤ 0,05 από την T-test του Student. (G, H) τομές όγκων χρωματίστηκαν για Κί-67, για την αξιολόγηση πολλαπλασιασμού. Σημείωση μια σημαντική μείωση της Ki-67-θετικών πυρήνων παρουσία miR-200b. *, P & lt?. 0.001

Η

miR-200b Καταστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του προστάτη

Αναζητώντας παράγοντες που συμβάλλουν στη μείωση της ανάπτυξης του όγκου, πραγματοποιήσαμε ανάλυση κυτταρικού κύκλου ελέγχου PC3 και PC3 ΜΙΚ 200b κύτταρα και παρατηρείται μια ήπια αύξηση στην φάση G2 /M om miR-200b θετικά κύτταρα υποδηλώνοντας σύλληψη του κυτταρικού κύκλου (Σχήμα S1). Πράγματι, WST-1 προσδιορισμό για βιώσιμων κυττάρων αποκάλυψε μία μικρή αλλά σημαντική μείωση στον αριθμό των κυττάρων στα θετικά κύτταρα miR-200b σε σύγκριση με τον έλεγχο φορέα (Σχήμα 3 g, h). Σε συνδυασμό με σημαντική μείωση της Ki-67 θετικών πυρήνων στα PC-3 όγκους κατά miR-200b έκφρασης (Σχήμα 3F), τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η παρατηρούμενη μείωση στην ανάπτυξη όγκου προκλήθηκε από μειωμένο πολλαπλασιασμό

.

ΜΙΚ 200b αντιστρέφει Τα επιθηλιακά να Mesencymal μετάβαση σε προστάτη κύτταρα

σε προηγούμενες μελέτες, miR-200b έκφρασης του μαστού, του στομάχου και νεφροκυτταρικό καρκίνωμα συσχετίζεται με την πιο διαφοροποιημένη κατάσταση, και την εκ νέου εισαγωγή του miR-200b αντιστρέφει EMT [ ,,,0],10], [11], [29]. Οι αλλαγές αυτές μπορεί τελικά να συμβάλουν τόσο στην μειωμένη ανάπτυξη του όγκου και τη μετάσταση. Ως εκ τούτου, αναλύσαμε τα επίπεδα των γνωστών δεικτών ΕΜΤ και διαφοροποίηση εκφράζεται από τα κύτταρα PC-3 με την παρουσία ή απουσία του miR-200b. Πρώτον, η ανάλυση στυπώματος Western έδειξε σημαντική αύξηση των τυπικών δεικτών διαφοροποίησης του επιθηλίου του προστάτη Cytokeratin Ck8 και CK18 με miR-200b, γεγονός που υποδηλώνει μια περισσότερο διαφοροποιημένη κατάσταση του miR-200b θετικά κύτταρα (Σχήμα 4).

(Α ). CK 8 και CK 18 αναλύθηκαν με western blot της συνολικής πρωτεΐνης λύματα από PC3-ctrl και PC3 miR-200b κύτταρα. (Β) Ποσοτική ανάλυση του πειράματος (Α) με το λογισμικό Image J. Η γραφική παράσταση αντιπροσωπεύει μέση δεδομένα από δύο ανεξάρτητα πειράματα. *, P ≤ 0,05 και **, p & lt?. 0.01 από την T-test του Student

Η

Σε συμφωνία, τα επίπεδα της E-cadherin αυξήθηκαν επίσης (Σχήμα 5α), γεγονός που υποδηλώνει μια στροφή προς τα επιθηλιακά φαινότυπο . Επιπλέον, βιμεντίνη, ένα μεσεγχυματικό δείκτη, υποβλήθηκε σε μια στατιστικά σημαντική μείωση κατά miR-200b έκφρασης. Μια άλλη μεσεγχυματικά δείκτη, φιμπρονεκτίνης (FN) εμφανίζεται μια παρόμοια τάση, αν και η μείωση αυτή δεν ήταν στατιστικά σημαντική (Σχήμα 5β). Επειδή σε προηγούμενες μελέτες miR-200b ελέγχεται Ε-καδερίνης και ΕΜΤ με καταστολή του μεταγραφικού παράγοντα ZEB1, έχουμε εκτιμήθηκε τόσο τα συνολικά επίπεδα πρωτεΐνης και ZEB1 RNA σε miR-200b-θετικών και έλεγχος κύτταρα PC-3. Παρατηρήσαμε μια σημαντική και επαναλήψιμη μείωση στην πρωτεΐνη ZEB1 και mRNA σε απόκριση προς miR-200b (Σχήμα 5c, d). Αυτό το αποτέλεσμα είναι συνεπές με την αυξημένη Ε-καδερίνης έκφρασης (Σχήμα 5α). Τα αποτελέσματά μας αποδεικνύουν σαφώς ότι το miR-200b έκφραση προωθεί τα επιθηλιακά χαρακτηριστικά των κυττάρων και καταστέλλει χαρακτηριστικά μεσεγχυματικά στα κύτταρα PC3.

(Α) Δείκτες επηρεάζονται από miR-200b στα κύτταρα PC-3. E-cadherin, Ινωδονεκτίνης και βιμεντίνης ανιχνεύθηκαν στα κυτταρικά λύματα σύνολό του από PC3 ctrl και PC3 miR-200b κύτταρα με κηλίδα western. (Β) Ποσοτική ανάλυση του πειράματος φαίνεται στο (Α) πραγματοποιήθηκε με λογισμικό Image J. *, Ρ & lt? 0,05 και **, p≤0.01 όπως προσδιορίζεται από την T-test του Student. Δύο ανεξάρτητα πειράματα ομαδοποιήθηκαν μαζί. (C) κηλίδα Western για ZEB1 και ποσοτικοποίηση εκτελέστηκε όπως παραπάνω (ο μέσος όρος δύο πειραμάτων φαίνεται). (D) End-point PCR για ZEB1. (Ε)

In vitro

φρεατίων δοκιμασία εισβολή: η σύγκριση των PC3-ctrl και PC3 miR-200b κύτταρα. 10% FBS χρησιμοποιήθηκε ως χημειοελκυστικό και το πείραμα διεξήχθη εις διπλούν. *, P & lt? 0.05 από την T-test του Student. (F) Οι

in vivo

αυθόρμητες μεταστάσεις από PC3-ctrl και PC3 miR-200b κύτταρα. Τα κύτταρα εμφυτεύθηκαν ορθοτοπικά στις κοιλιακοί προστάτες των αρσενικών γυμνών ποντικών. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε απεικόνιση όλου του σώματος για RFP-θετικά μαζών χρησιμοποιούν επιφανειακό εικόνας. Στο τέλος του πειράματος, τα ζώα θανατώθηκαν, περιτοναϊκή κοιλότητα ανοίγεται και μετάσταση ορατά με απεικόνιση φθορισμού μετά την αφαίρεση ενός πρωτογενούς όγκου στο εσωτερικό της περιτοναϊκής κοιλότητας και στην πρόσθια τοίχωμα της κοιλιάς (περιτοναϊκή κοιλότητα). Φωτεινό οπτικό πεδίο (BF) και φθορισμού (RFP, κόκκινη φθορίζουσα πρωτεΐνη) εμφανίζονται. (G) Ποσοτικοποίηση του πειράματος φαίνονται στο (F). Οι μεταστάσεις μετρήθηκαν και συνολική φθορισμού ανά μετάσταση υπολογίζεται (αριστερά). Μικτό μεταστατικό φορτίο υπολογίστηκε ως το σύνολο φθορισμού ανά ποντίκι. Ctrl υποδεικνύει τον έλεγχο και 200b δείχνει miR-200b. **, P≤0.01 από την T-test του Student.

Η

miR-200b Μειώσεις Εισβολή και Μετάσταση από κύτταρα PC-3

Επειδή miR-200b προκάλεσε αντιστροφή EMT σε προστάτη PC- 3 κύτταρα, ήταν εύλογο να αναμένεται μειωμένη επεμβατική δυναμικό, καθώς και. Χρησιμοποιώντας μια τυποποιημένη διαδικασία για τη μέτρηση της κυτταρικής εισβολής, παρατηρήσαμε μια σημαντική μείωση στο ποσοστό των εισέβαλαν κυττάρων λόγω miR-200b έκφρασης σε σύγκριση με τον έλεγχο (Σχήμα 5e). Αυτή η μειωμένη εισβολή πιθανόν αποτελεί τη βάση της περιφερειακής μειώθηκε μετάσταση με PC3 miR-200b κύτταρα

in vivo

.

ορθοτοπική ένεση γονικών κυττάρων PC-3 και τον έλεγχο των φορέων στη ραχιαία προστάτες αθυμικών αρσενικών ποντικών οδήγησε στην αυθόρμητη μετάσταση, καθώς ανιχνεύθηκε μετά την αφαίρεση των πρωτοπαθών όγκων (Σχ. 5F και το σχήμα S2). Η συνολική φθορισμού λόγω της μετάστασης μειώθηκε δραματικά σε ποντίκια εμφυτεύθηκαν με τα κύτταρα PC-3 που υπερεκφράζουν miR-200b (Σχήμα 5F, g και η Εικόνα S2). Έτσι τα δεδομένα μας υποδηλώνουν ότι το miR-200b μειώνει σημαντικά χαρακτηριστικά μεσεγχυματικά στα καρκινικά κύτταρα του προστάτη και έτσι μειώνει επεμβατική χαρακτηριστικά τους και μεταστατικό δυναμικό.

miR-200b Μειώνει όγκου αγγειογένεση

Ένα άλλο χαρακτηριστικό που μπορεί να δώσει μετάσταση είναι αγγειογένεση και EMT συχνά συνοδεύεται από αυξημένη αγγειογένεση. Η έκφραση του miR-200b φάνηκε να αντιστρέψει αγγειογενετική διακόπτης σε PC-3 κύτταρα, όπως αποδείχθηκε από τη μειωμένη πυκνότητα μικροαγγειακή στους θετικούς όγκους miR-200b σε σχέση με τα πατρικά όγκους ελέγχου PC-3 ή φορέα (Εικ. 6).

τμήματα από τους όγκους που σχηματίζονται από τον έλεγχο και miR-200b θετικά PC-3 όγκων χρωματίστηκαν για την ενδοθηλιακή CD31 δείκτη και τον αριθμό των μικροαγγείων ανά πεδίο καθορίζεται σε δέκα 10 × πεδία. *, P & lt?. 0.01

Η

Συζήτηση

Η οικογένεια miR-200 είναι ένας όγκος-κατασταλτικό της οικογένειας των microRNA που παίζουν κρίσιμο ρόλο στην καταστολή της EMT. Ενώ ο ρόλος της οικογένειας miR-200 σε μαστού και ορισμένες άλλες επιθηλιακών καρκίνων είναι καλά εδραιωμένη, υπάρχουν λίγες ευρήματα συνδέουν miR-200 με καρκίνο του προστάτη. Μια μελέτη μικρής κλίμακας (20 ασθενείς) υποδηλώνει τη σύνδεση μεταξύ της βιοχημικής υποτροπής μετά από ριζική προστατεκτομή και τα χαμηλότερα επίπεδα του miR-200c [30]. Μια μελέτη από τον He

et al.

Καταδεικνύει ότι τα χαμηλά επίπεδα του miR-200b-3ρ σε ανδρογόνα ανεξάρτητο κυττάρων που προκαλείται από μειωμένη έκφραση της ρ-53 που σχετίζονται με πρωτεΐνη ρ73 και συμβάλλουν στην αύξηση του πολλαπλασιασμού [31] . Οι δύο συστάδες που κωδικοποιούν την οικογένεια miR-200 βρίσκονται στα χρωμοσώματα 1 και 12, με miR-200b, miR-200a και miR-429 στο χρωμόσωμα 1 και miR-200c και miR-141 στο χρωμόσωμα 12. microRNA 200c πιστεύεται ότι είναι επιθηλιακά-ειδική και η έκφρασή του καταστέλλεται από υπερμεθυλίωση του εγγύς CpG νησίδα στους ινοβλάστες και σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού [32]. Στο PC-3, αλλά όχι σε LNCaP κύτταρα και DU145 PCa, παρόμοια υπερμεθυλίωση του νησιού CpG συμπίπτει με τα χαμηλά επίπεδα του miR-200c και miR-141 [32]. Συνεπής με τα αποτελέσματά μας, σε αυτή τη μελέτη τα κύτταρα PC3 αρνητικά για miR-200c και miR-141, εμφανίζουν σαφή φαινότυπο μεσεγχυματικά και την ικανότητα για την εισβολή και τη μετάσταση [32]. Δύο μελέτες δείχνουν το ρόλο για miR-200 στην ογκογένεση από τα βλαστικά κύτταρα του προστάτη. Σε βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν PCa η έκφραση του Sox2, Nanog, Oct4, Lin28B ή /και Notch 1 είναι συνεπής με ενισχυμένη κλωνογονική επιβίωση και την ικανότητα να σχηματίζουν σφαιροειδή (prostaspheres). Αυτά τα χαρακτηριστικά του στελέχους-όπως συνδέεται με μειωμένη έκφραση του miR-200b /c ή /και αφήστε-7 οικογένεια όπου επανέκφραση του miR-200 αναστέλλει τον σχηματισμό prostasphere και μειώνει Notch1 και Lin28B, τα προγράμματα οδήγησης της αυτο-ανανέωσης [33] . Σε μια άσχετη μελέτη, οι επεμβατικές ογκογόνο κλώνων που προέρχονται από την καλοήθη υπερπλασία του προστάτη (ΚΥΠ) -1 κυτταρική σειρά χρονίως εκτεθειμένα σε ΤΟΡ-β οθόνη εξέχοντα χαρακτηριστικά EMT με υψηλά επίπεδα SNAI2, ZEB1 και ZEB2, όλων των επιβεβαιωμένων miR-200 στόχους? Ωστόσο, τα βασικά miR-200 επίπεδα σε αυτά τα κύτταρα παραμένουν αναλλοίωτα προτείνοντας μια διαφορετική μηχανισμό [34].

Οι επαυξημένης χαρακτηριστικά στέλεχος-όπως προτείνουν ενισχυμένη καρκινογέννεση. Πράγματι, πολλές ομάδες έχουν δείξει ότι miR-200b μεταβάλλει το ρυθμό αύξησης των πειραματικών όγκων από τα καλλιεργημένα κύτταρα του προστάτη [35]. Τα στοιχεία μας επιβεβαιώνουν με σαφήνεια αυτές τις παρατηρήσεις.