Abstract

έχουν παραλλαγές εναλλακτικού ματίσματος του αρκετά ογκογονίδια και κατασταλτικά όγκων έχει δειχθεί ότι είναι σημαντική για την ογκογονικότητα τους. Στην παρούσα μελέτη έχουμε εξετάσει κατά πόσον πρωτεϊνική κινάση σερίνης-αργινίνης 1 (SRPK1), ένα κύριος ρυθμιστής των παραγόντων ματίσματος, εμπλέκεται στην εξέλιξη του καρκίνου των ωοθηκών και παίζει ένα ρόλο στην χημειο-ευαισθησία. Με αναλύσεις στυπώματος Western, η πρωτεΐνη SRPK1 βρέθηκε να υπερεκφράζεται σε 4 από τις 6 ωοθηκών καρκινικές κυτταρικές σειρές σε σύγκριση με μια αθανατοποιημένη κυτταρική σειρά επιθηλιακών κυττάρων των ωοθηκών επιφάνεια? και στο 55% των δειγμάτων όγκου ωοθήκης σε σύγκριση με μη νεοπλασματικά δείγματα ωοθηκικού ιστού. Μείωση της έκφρασης SRPK1 χρήση μικρών RNA παρεμβολής (siRNA) που κωδικοποιεί μικρό φουρκέτα RNA σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών οδήγησε στην (i) μειωμένο ποσοστό κυτταρικού πολλαπλασιασμού, βραδύτερη πρόοδο του κυτταρικού κύκλου και σε κίνδυνο ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη και μετανάστευση ικανότητα

in vitro

(ii) μειώθηκε επίπεδο φωσφορυλίωσης πολλαπλών πρωτεϊνών σερίνης-αργινίνης, και Ρ44 /42MAPK και πρωτεΐνες ΑΚΤ, και (iii) αυξημένη ευαισθησία σε σισπλατίνη. Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η αυξημένη έκφραση SRPK1 μπορεί να παίζει κάποιο ρόλο στην ογκογένεση ωοθηκών και SRPK1 μπορεί να είναι ένας πιθανός στόχος για θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών

Παράθεση:. Odunsi Κ, Mhawech-Fauceglia Ρ, Andrews C, Beck Α, Amuwo O, Lele S, et al. (2012) αυξημένη έκφραση της πρωτεΐνης σερίνης-αργινίνης κινάση 1 Gene στον καρκίνο των ωοθηκών και ο ρόλος του Cisplatin κυτταροτοξικότητα

In Vitro

. PLoS ONE 7 (12): e51030. doi: 10.1371 /journal.pone.0051030

Επιμέλεια: Sandra Orsulic, Cedars-Sinai Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 4η Σεπτεμβρίου 2012? Αποδεκτές: 23η Οκτωβρίου 2012? Δημοσιεύθηκε: 7 Δεκεμβρίου 2012

Copyright: © 2012 Odunsi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας επιχορηγήσεις CA 107303 (RH), γυναικολογική Cancer Foundation (RH), DK60632 (JDB), και CA16056 (RPCI Πυρήνας Grant)? Cancer Research Institute /Ludwig Institute for Cancer Research καρκίνο του εμβολίου Συνεργατική Grant (KO)? και Hilton-Ludwig Cancer Μετάσταση επιχορήγησης του Ludwig Institute for Cancer Research (KO). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

έχει εκτιμηθεί ότι 35-59% των ανθρώπινων γονιδίων εναλλακτικά ματισμένες, η οποία συμβάλλει σημαντικά στην πολυπλοκότητα της ανθρώπινης κυτταρικών λειτουργιών [1], [2]. Επομένως, δεν είναι έκπληξη το γεγονός ότι οι δραστηριότητες ορισμένων ογκογονιδίων και γονιδίων καταστολής όγκων διαμορφώνεται με εναλλακτικό μάτισμα [3], [4]. Για παράδειγμα, παρεκκλίνουσα εναλλακτικό μάτισμα ορισμένων καταστολείς όγκων, όπως ο καρκίνος του μαστού 1 και 2 (BRCA1 /2) [5], όγκο Wilms 1 (WT1) [6], και αδενωματώδη πολυποδίαση coli (APC) [3], έχει ως αποτέλεσμα μεταλλάξεις που ευθύνονται για κληρονόμησε και σποραδικές ευαισθησία σε καρκίνο. Επιπλέον, ορισμένοι παράγοντες ματίσματος βρέθηκε ότι υπερεκφράζεται σε όγκους και έχουν ενοχοποιηθεί ως ογκο-πρωτείνες [7], [8].

SRPK1 (σερίνη-αργινίνη πρωτεΐνη κινάση 1) ανήκει στην SR κινάσης οικογένεια πρωτεϊνών και ρυθμίζει την SR οικογένεια των παραγόντων ματίσματος. Οι παράγοντες SR μάτισμα είναι μερικές από τις βοηθητικές πρωτεΐνες που απαιτούνται για μάτισμα προ-mRNA σε κύτταρα θηλαστικών. Οι πρωτεΐνες SR χαρακτηρίζονται από ένα ή δύο μοτίβα αναγνώρισης RNA στο Ν άκρο και ένα SR-πλούσια περιοχή στο άκρο C [9], [10], [11]. Ο τομέας SR πιστεύεται ότι προάγουν αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-πρωτεΐνης κατά τη διάρκεια της συναρμολόγησης [12]. Οι πρωτεΐνες SR ρυθμίζονται από αντιστρεπτή φωσφορυλίωση που προκαλείται από SRPK1. Ενώ οι φωσφορυλιωμένες πρωτεΐνες SR που απαιτούνται για την έναρξη της συναρμολόγησης σωμάτια συναρμογής το νωρίτερο στάδιο, αποφωσφορυλίωση είναι απαραίτητη για μάτισμα να λάβει χώρα στο σωμάτια συναρμογής [13], [14]. Στοιχεία έχουν δείξει ότι και οι δύο υπο- και υπερ-φωσφορυλίωση των πρωτεϊνών SR είναι επιζήμια για μάτισμα [14], [15]. Έτσι, το επίπεδο της SRPK1 είναι ζωτικής σημασίας για τη διατήρηση της σωστής ισορροπίας μεταξύ φωσφορυλιωμένη και αποφωσφορυλιωμένο πρωτεΐνες SR. Η υπερέκφραση πρωτεΐνης SRPK1 έχει τεκμηριωθεί σε οξεία τύπος λευχαιμίας ενηλίκων Τ-κυττάρων [16], χρόνια μυελογενή λευχαιμία [17] του παγκρέατος, του μαστού, του παχέος εντέρου και του καρκίνου [18], [19], [20]. Είναι ενδιαφέρον, SRPK1 εκφράζεται σε ενήλικα αρσενικά γεννητικά κύτταρα, αλλά γενικά όχι σε περισσότερους άλλους φυσιολογικούς ιστούς ενηλίκων, γεγονός που υποδηλώνει καρκίνο /όρχεων που μοιάζει διανομής [16], [21]. Μαζί, αυτές οι μελέτες δείχνουν ότι η SRPK1 είναι πιθανό να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του καρκίνου.

[22] και άλλοι [23] έχουν διαπιστώσει προηγουμένως ότι η απενεργοποίηση του

Ουρανού1

, το ομόλογο μαγιά του παράγοντα SRPK1 ματίσματος, ενισχύει την αντίσταση των κυττάρων ζύμης σε σισπλατίνη (cDDP). Ωστόσο, αν παίζει έκφραση SRPK1 ένα ρόλο στον καθορισμό της ευαισθησίας ή της αντίστασης των ανθρώπινων όγκων στη χημειοθεραπεία παραμένει ασαφές για τους ακόλουθους λόγους. Πρώτον, το χαμηλότερο επίπεδο της έκφρασης SRPK1 έχει δειχθεί ότι συσχετίζεται με την αντίσταση της ωοθηκικής [23], των όρχεων [20] και ΗΤ29 [24] καρκινικές κυτταρικές σειρές σε θεραπευτικά σχήματα που περιέχουν λευκόχρυσο. Δεύτερον, έχει δειχθεί πρόσφατα ότι διαταραχή της έκφρασης SRPK1 με siRNA αυξάνει την απόπτωση που προκαλείται από cDDP σε κυτταρικές σειρές του παγκρέατος, του παχέος εντέρου και του καρκίνου του μαστού [18], [19].

Στην παρούσα μελέτη επιδιώξαμε να εξετάσουμε εάν η έκφραση SRPK1 σχετίζεται με την εξέλιξη του καρκίνου των ωοθηκών, αν το πρότυπο έκφρασης των SRPK1 συσχετίζεται με την κλινική ανταπόκριση στη θεραπεία που περιλαμβάνει cDDP και αν η αναστολή της SRPK1 μεταβάλλει την ευαισθησία των ωοθηκών καρκινικά κύτταρα για να cDDP. Πρώτον, βρήκαμε ότι αυξημένα επίπεδα πρωτεΐνης SRPK1 ήταν παρούσα σε περίπου 55% των δειγμάτων όγκου ωοθήκης σε σύγκριση με μη νεοπλασματικά δείγματα ωοθηκικού ιστού. Δεύτερον, siRNA μεσολάβηση αναστολή της SRPK1 οδήγησε στη μείωση OVCA ρυθμός πολλαπλασιασμού των κυττάρων,

in vitro

κυτταρική μετανάστευση, ογκογόνο δυναμικό και πιο αργή εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου. Αυτές οι φαινότυποι συνδέθηκαν με SRPK1 μεσολάβηση μεταβολές του ΜΑΡΚ /ΑΚΤ μονοπατιών σηματοδότησης, δεδομένου ότι τα επίπεδα του φωσφορυλιωμένη πρωτεΐνη (ενεργοποιημένης) ΜΑΡΚ /ΑΚΤ μειώθηκαν στα SRPK1 knockdown κυττάρων. Τέλος, σε αντίθεση με το σύστημα ζύμης, κάναμε την εκπληκτική παρατήρηση ότι η αναστολή της SRPK1 αυξημένη ευαισθησία σε θεραπεία cDDP, γεγονός που υποδηλώνει ότι SRPK1 μπορεί να είναι ένας στόχος για θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Η μελέτη σε ανθρώπους διεξήχθη υπό ένα πρωτόκολλο που εγκρίθηκε από το Διοικητικό συμβούλιο αναθεώρηση RPCI Θεσμική (CIC0215). Όλα τα δείγματα ιστού συλλέχθηκαν από ασθενείς οι οποίοι παρείχαν έγγραφη ενημερωμένη συγκατάθεση.

Ασθενείς και ωοθηκών όγκου Δείγματα

δείγματα κατεψυγμένου ιστού

Flash (n = 47) ελήφθησαν από ασθενείς που υποβάλλονται σε χειρουργική επέμβαση για debulking επιθηλιακού καρκίνου των ωοθηκών στο Roswell Park Cancer Institute (RPCI), Buffalo, ΝΥ μεταξύ Normal δείγματα 1995 και 2006. ωοθηκών (n = 9) ελήφθησαν από ασθενείς που υποβάλλονται σε υστερεκτομή για καλοήθεις καταστάσεις, όπως λειομύωμα. Κλινικοπαθολογικοί πληροφορίες για ολόκληρη την ομάδα, συμπεριλαμβανομένων απόκριση σε χημειοθεραπεία, να διατηρείται σε μια βάση δεδομένων στο Τμήμα Γυναικολογικής Ογκολογίας.

Cell Culture

κυτταρικές σειρές καρκίνος των ωοθηκών SKOV3 και OVCAR3 ελήφθησαν από την Αμερικανική Συλλογή τύπου Καλλιέργειας (ATCC? Manassas, VA). Α2780 και τα κύτταρα A2008 και cDDP ανθεκτικά ομολόγους τους Α2780 /CP [25] και A2008 /C13 [26] κύτταρα ελήφθησαν από τον Dr. Steven Howell (University of California, San Diego). Αυτά τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε μέσο RPMI1640 συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS). Ένα μη-μετασχηματισμένα επιθηλιακά κυτταρική σειρά επιφάνεια των ωοθηκών (IOSE-385, στο εξής ορίζεται ως IOSE) αποθανάτισε με τα πρώτα γονίδια SV40 [27] και έλαβε από τον Δρ Nelly Auersperg (University of British Columbia, Καναδάς). κύτταρα IOSE διατηρήθηκαν σε Μ199 /MCDB 105 μέσο (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ) συμπληρωμένο με 5% FBS και γενταμυκίνη (Invitrogen, Carlsbad, CA).

shRNA και διάσωσης-SRPK1 κατασκευάσματα

shSRPK1-1 και shSRPK1-2, κωδικοποίηση shRNA στόχευση νουκλεοτίδια 288 – 308 (CAAGAAGATCCTAATGATTA) και 1423-1443 (GGTCAGTCATTCAGTGAACAA), αντίστοιχα, του mRNA SRPK1, αγοράστηκαν από την Open Biosystems (Huntsville, AL). Για την επιμόλυνση, SKOV3 και Α2780 /κύτταρα CP σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων μέχρι 80% συρροή και επιμολύνθηκαν με 3-4 μg DNA πλασμιδίου χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). RNA και πρωτεϊνών από τον έλεγχο ή shSRPK1-επιμολυσμένα κύτταρα αναλύθηκαν 3 ημέρες μετά την επιμόλυνση. Σταθεροί κλώνοι shSRPK1 επελέγησαν με τη χρήση 2 μg /ml του Πουρομυκίνης για 3 εβδομάδες. Για πλασμίδιο SRPK1-διάσωση, ένας εκκινητής που περιέχει 3 silenct μεταλλάξεις (GCAAGAAGATCCTAATGATTA, υπογράμμιση νουκλεοτίδια αλλάχθηκαν σε G, G, C, αντίστοιχα) εντός των αλληλουχιών στόχων shSRPK1-1 εισήχθη εντός του πλασμιδίου ρ-CMV-flag-SRPK1 (ένα δώρο από Ο Δρ Xiang-Dong Fu, Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνια, Σαν Ντιέγκο) χρησιμοποιώντας ασύμμετρη PCR [28]. Η επιμόλυνση διεξήχθη όπως περιγράφεται ανωτέρω και επιλέγονται σταθερά κώνοι χρησιμοποιούσαν G418 (Invitrogen, Carlsbad, CA).

Χημεία

Cisplatin (cDDP,

cis

-diammine-διχλωρο- πλατίνα II) και ΜΤΤ {3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου} αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ). Μητρικό διάλυμα cDDP παρασκευάστηκε σε DMSO (330 mM), αποθηκεύονται ως κλάσματα στους -20 ° C και χρησιμοποιήθηκε μέσα σε 2 εβδομάδες. cDDP αραιώθηκε περαιτέρω σε μέσο πριν από την προσθήκη στα κύτταρα.

Ανάλυση Western Blot

Είκοσι έως τριάντα χιλιοστόγραμμα κατεψυγμένου ιστού όγκου ομογενοποιήθηκε με ένα γουδί και γουδοχέρι σε ρυθμιστικό δείγμα ιστού (10% SDS , 5% β-μερκαπτοαιθανόλη, 50 mM Tris-HCl, ρΗ 8,0, 10% γλυκερίνη) για την εκχύλιση των πρωτεϊνών. Κυτταρολύματα εκχυλίστηκαν χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό RIPA (150 mM NaCl, 1% ΝΡ-40, 0.5% δεοξυχολικό οξύ, 0.1% SDS, 50 mM Tris-HCl, ρΗ 8,0). Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με 10% SDS-PAGE, μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη PVDF (Milipore, Billerica, ΜΑ) και αποκλείστηκαν σε TBS που περιέχει 0.05% Tween-20 και 5% ξηρό γάλα για όλη τη νύχτα στους 4 ° C. Οι κηλίδες επωάστηκαν με πρωτογενές αντίσωμα επί 1-2 ώρες, και στη συνέχεια με δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά την επώαση, οι μεμβράνες πλύθηκαν επανειλημμένως και οι πρωτεΐνες οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ ECL (ενισχυμένη chemiluminescense) (Pierce, Rockford, IL). Σήμα ήταν ψηφιακό φωτογραφημένο και ποσοτικά με τη χρήση πυκνότητας με την Alpha σύστημα απεικόνισης (Η Alpha Innotech, San Leandro, CA). Αντισώματα που χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση της SRPK1 ήταν από την BD Biosciences (San Jose, CA), φωσφορυλιωμένων πρωτεϊνών SR ήταν mAB104 [29] απομονώνεται από κύτταρα υβριδώματος (ATCC, Manassas, Virginia), το συνολικό ρ44 /42 ΜΑΡΚ και ΑΚΤ (ΑΚΤ1 /2/3 , sc-8312) ήταν από τη Cell Signaling (Danvers, ΜΑ) και Santa Cruz, αντίστοιχα, φωσφορυλιωμένη MAPKp42 /44 (Thr

202 /Tyr

204) και AKT (Ser

473 /Thr

308) ήταν από τη Cell Signaling (Danvers, ΜΑ), αντισώματα έναντι Upf1 ήταν ένα δώρο από τον Δρ Harry Dietz (Johns Hopkins University). Αντι-ακτίνη ήταν από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ). Τα δεδομένα εκφράστηκαν ως σχετική έκφραση φορές πάνω ακτίνης.

ανοσοϊστοχημική χρώση

Τομείς (πάχους 4 μm) από, κανονικό ιστό ωοθήκης και του όγκου εγκλεισμένα σε παραφίνη σταθεροποιημένα με φορμαλίνη υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για IHC όπως περιγράφεται προηγουμένως [30]. Η ενδογενής υπεροξειδάση αποκλείσθηκε με υπεροξειδάση υδρογόνου 0.3% για 30 λεπτά. Το αντιγόνο ανάκτηση διεξήχθη σε υψηλό ρΗ σε ένα ατμόπλοιο για SRPK1 αντισώματος (BD Biosciences). Για αρνητικό έλεγχο, ο IgG ποντικού χρησιμοποιήθηκε.

Αντίστροφη μεταγραφή-αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (RT-PCR) Ανάλυση

Ολικό RNA εκχυλίσθηκε από δέκα εκατομμύρια κύτταρα χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen) σύμφωνα με με τις οδηγίες του κατασκευαστή. cDNA συντέθηκε από 2 μg ολικού RNA σε 20 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος αντίδρασης χρησιμοποιώντας Μ-ΜυΙ_ν αντίστροφης μεταγραφάσης, Ribolock ριβονουκλεάση Αναστολέας (Fermentas Life Science, Glen Burnie, MD) και τυχαία εξαμερή εκκινητήρια μόρια μετά την πέψη DNaseI. Τα προϊόντα cDNA χρησιμοποιήθηκαν για ημι-ποσοτική PCR χρησιμοποιώντας Taq DNA πολυμεράση (Fermentas Life Science, Glen Burnie, MD) οι εκκινητές για SRPK1 (SRPK1-R, 5′-TGTTGTCCAGTGGTCCGTTA, και SRPK1-exon10, 5′- CAAGAAAAACTTGAAGAGTC) σχεδιάστηκαν σύμφωνα με τις αλληλουχίες αναφοράς NCBI. GAPDH (γλυκεραλδεϋδη 3-φωσφορική αφυδρογονάση) χρησιμοποιήθηκε ως αλληλουχία στόχο αναφοράς (εκκινητές: 5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC και 5′- GAAGATGGTGATGGGATTTC).

κλωνογονική δοκιμασία επιβίωσης

Τα κύτταρα (3 χ 10

2) σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων όλη τη νύκτα και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με cDDP για 24 ώρες. Μετά την απομάκρυνση του φαρμάκου, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και επανα-τροφοδοτήθηκαν με μέσο χωρίς φάρμακο και επωάστηκαν για 10-14 ημέρες. Οι αποικίες βάφτηκαν με 0.1% κρυσταλλικό ιώδες και μετρήθηκαν. επιβίωση Ποσοστό κυττάρων εκφράζεται σε σχέση με μη κατεργασμένο έλεγχο.

ΜΤΤ Δοκιμασία

Κύτταρα (5 × 10

3) σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων εις τριπλούν επί μία νύκτα και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με cDDP για 72 hr, ΜΤΤ προστέθηκε για 4 ώρες, και ο χρωστικής φορμαζάνης διαλύθηκε με DMSO και αναγνώστηκε στα 540 nm σε ένα αναγνώστη μικροπλάκας FL6000 (ΒΙΟ-ΤΕΚ Instruments, Winooski, VT). επιβίωση Ποσοστό κυττάρων εκφράζεται σε σχέση με μη κατεργασμένο έλεγχο.

Anchorage-ανεξάρτητη ανάπτυξη Δοκιμασία

Κύτταρα (5 × 10

3) σπάρθηκαν εις τριπλούν σε πλάκες 6 φρεατίων που περιέχει ένα ανώτερο στρώμα από 0,3% μαλακό άγαρ και μία βάση άγαρ 0,5%. Είκοσι τέσσερις ώρες αργότερα, ο μέσος αριθμός κυττάρων σπάρθηκε ανά πεδίο προσδιορίστηκε με μέτρηση των κυττάρων σε 5 διαφορετικά πεδία κάτω από το μικροσκόπιο φωτός. Οι αποικίες που σχηματίζονται (& gt? 0,1 mm σε διάμετρο) μετά από 3 εβδομάδες ανάπτυξης σε μαλακό άγαρ μετρήθηκαν? 10 διαφορετικά πεδία προσδιορίστηκαν ποσοτικά ανά φρεάτιο και υπολογίστηκε ο μέσος αριθμός των αποικιών ανά πεδίο. Ο δείκτης (ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη) AIG εκφράστηκε σε σχέση με τον αριθμό των κυττάρων σπάρθηκε.

Επούλωση (ξυστό) Δοκιμασία

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 60-mm έως συρροή και το κύτταρο μονοστοιβάδα ξύστηκε σε τρεις ευθείες γραμμές με ένα ρύγχος πιπέτας 200 μl για τη δημιουργία «γρατσουνιές». Θραύσματα απομακρύνθηκαν με PBS και στη συνέχεια η καλλιέργεια επανατροφοδοτούνται με φρέσκο ​​μέσο. Photohgraphs της περιοχής του τραύματος ελήφθησαν στις 0 και 28 ώρες μετά την γρατσουνιές για τον υπολογισμό του ρυθμού κυτταρικής μετανάστευσης. Είκοσι τυχαίες μετρήσεις ελήφθησαν για κάθε χρονικό σημείο. Οι σχετικές αποστάσεις που μεταναστεύουν από τις περιοχές τραύματος μετρήθηκαν στις εικόνες.

Κύκλου Κυττάρου Ανάλυση

Τα κύτταρα συγχρονίστηκαν σε φάση G2 /M με κατεργασία με νοκοδαζόλη (600 ng /ml) για 12 hr , πλύθηκαν δύο φορές με PBS και στη συνέχεια απελευθερώνεται εντός μέσου χωρίς φάρμακο. Τα κύτταρα συγχρονίζονται επίσης σε G0 /G1 με τοποθέτηση σε μέσο ελεύθερο ορού για 48 ώρες. Τα αδρανή κύτταρα διεγέρθηκαν για να εισέλθει εκ νέου στον κυτταρικό κύκλο με προσθήκη 10% FBS. Σε κάθε χρονικό σημείο αναφέρεται, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και πλύθηκαν με ψυχρό PBS (αλατούχο φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα και σταθεροποιήθηκαν σε 70% αιθανόλη για περισσότερο από 15 λεπτά). Τα κύτταρα στη συνέχεια σε επεξεργασία με RNase (50 μg /ml) σε 1.0% κιτρικό νάτριο στους 37 ° C για 30 λεπτά και στη συνέχεια χρωματίζονται με προπίδιο ιώδιο (50 μg /ml) για 15 λεπτά. περιεκτικότητα DNA μετρήθηκε με έναν αναλυτή φθορισμού κυττάρου που ενεργοποιείται (κυτταρόμετρο ροής ΡΑΟδοαη, Becton Dickson, San Jose, CA). Το ποσοστό των κυττάρων σε κάθε φάση του κυτταρικού κύκλου προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τα προγράμματα WinList και ModFit (Verity Software House, Topsham, ΜΕ).

Στατιστική Ανάλυση

Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση GraphPad Prism V4.03 Λογισμικό και το R V2.7.0 Στατιστική Computing Environment. Ένα

σ

-τιμή μικρότερη από 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. Μαθητή

t-test

χρησιμοποιήθηκε για τις περισσότερες συγκρίσεις των SRPK1 RNA και της πρωτεϊνικής έκφρασης vs κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους. Οι μέθοδοι των Kaplan και Meier και του Cox χρησιμοποιήθηκαν για να εκτιμηθεί ο διάμεσος χρόνος επιβίωσης και κινδύνου αναλογίες.

Αποτελέσματα

Έκφραση SRPK1 είναι αυξημένη σε ορισμένες γραμμές κυττάρων καρκινώματος των ωοθηκών και των ωοθηκών όγκοι

Έχουμε βρει προηγουμένως ότι η απενεργοποίηση της κινάσης πρωτεΐνης SR ζυμομύκητα Sky1p προσδίδει αντοχή στη σισπλατίνη [22]. Ωστόσο, το επίπεδο του ανθρώπινου γονιδίου SRPK1 έχει και θετικά και αρνητικά με την αντίσταση των καρκινικών κυττάρων σε θεραπευτικά σχήματα που περιέχουν πλατίνα [18], [19], [20], [23]. Ξεκινήσαμε να εξεταστεί περαιτέρω η σχέση μεταξύ του επιπέδου έκφρασης του γονιδίου που SRPK1 και αντοχή cDDP στον ανθρώπινο καρκίνο των ωοθηκών (OVCA). Χρησιμοποιήσαμε πρώτα μια ημι-ποσοτική RT-PCR (αντίστροφης μεταγραφάσης αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης) ανάλυση για έκφραση SRPK1 RNA σε 6 κυτταρικές γραμμές OVCA με διαφορική ευαισθησία cDDP (Σχήμα 1Α, κάτω πλαίσιο). Μερικά από τα οποία ήταν τουλάχιστον 6 φορές μεγαλύτερη αντίσταση στην cDDP από ένα μη-μετασχηματισμένο επιφάνεια των ωοθηκών επιθηλιακής κυτταρικής γραμμής (IOSE) το οποίο είχε αθανατοποιούνται με τα πρώιμα γονίδια SV 40 [27]. Τα δεδομένα δείχνουν ότι δεν υπάρχει σαφής συσχετισμός μεταξύ φαινοτύπου αντίστασης cDDP και τα επίπεδα RNA αυτών των γονιδίων μεταξύ αυτών των κυτταρικών σειρών. Ωστόσο, το επίπεδο SRPK1 mRNA ανυψώθηκε σε 4 από τις 6 κυτταρικές σειρές, σε σύγκριση με εκείνη των κυττάρων IOSE (Σχήμα 1Α). Εμείς επόμενη αξιολόγησε την έκφραση πρωτεΐνης SRPK1 στις προαναφερόμενες κυτταρικές σειρές χρησιμοποιώντας ανάλυση κηλίδος Western. Το σχετικό επίπεδο της SRPK1 πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με κανονικοποίηση με εκείνη του γονιδίου housekeeping ακτίνης. Η Εικόνα 1Β δείχνει ότι SRPK1 πρωτεΐνη είναι επίσης αυξημένη σε 4 από τις 6 κυτταρικές γραμμές καρκινώματος των ωοθηκών (που ορίζεται ως & gt? 2-φορές πάνω από την μέση τιμή του δείγματος IOSE), αν και με ελαφρώς διαφορετικό πρότυπο από αυτό του RNA. Παρατηρήσαμε ότι τα αθάνατα κύτταρα IOSE εκφράζουν επίσης ορισμένο επίπεδο της SRPK1. Αυτό δεν αποτελεί έκπληξη δεδομένου ότι άλλοι έχουν επίσης καταδείξει ότι αθανατοποίηση των επιθηλιακών κυττάρων των ωοθηκών, σε σύγκριση με τα μη-αθανατοποιημένη φυσιολογικά ανθρώπινα κύτταρα ΟΣΕ, αυξάνει την έκφραση του παράγοντα ματίσματος, πολυπυριμιδίνης πρωτεΐνη οδού δέσμευσης [8]. Παρόμοια με την έκφραση του mRNA, βρήκαμε καμία σαφή συσχέτιση μεταξύ φαινοτύπου αντίστασης cDDP και το επίπεδο πρωτεΐνης SRPK1 μεταξύ αυτών των κυτταρικών σειρών. Επειδή μπορεί να τροποποιηθεί επίπεδα του γονιδίου σε μακροπρόθεσμη καλλιεργημένες κυτταρικές γραμμές, εξετάσαμε έπειτα SRPK1 έκφραση σε αρχειοθετημένα δείγματα όγκων OVCA από OVCA ασθενείς οι οποίοι υποβλήθηκαν σε θεραπεία με πλατίνα-αγωγές μετά την επέμβαση. Για να εκτιμηθεί η ειδική έκφραση της SRPK1 πρωτεΐνης σε επιθήλιο όγκου σε κυτταρικό επίπεδο, πραγματοποιήσαμε ανοσοϊστοχημική χρώση (IHC) σε τομές ιστών εγκλεισμένα σε παραφίνη. Το Σχήμα 2Α δείχνει ότι η χρώση SRPK1 ήταν σχεδόν ανύπαρκτο σε φυσιολογικό επιθήλιο των ωοθηκών. Αντίθετα, η χρώση SRPK1 ανιχνεύθηκε εύκολα σε όγκους των ωοθηκών, με ένταση χρώσης που κυμαίνονται από αδύναμη να ισχυρή, και να παρουσιάσει κυρίως στο κυτταρόπλασμα των επιθηλιακών κυττάρων. Η κυτταροπλασματική εντόπιση της SRPK1 σε δείγματα ΕΗΦ όγκου είναι παρόμοια με τα ευρήματα σε κύτταρα καλλιέργειας ιστού [15]. Δεδομένου ότι οι όγκοι των ωοθηκών αποτελούνται ως επί το πλείστον των επιθηλιακών κυττάρων, το επίπεδο της SRPK1 σε ομογενοποιήματα πρωτεΐνης από 47 κατεψυγμένων όγκων και 9 δείγματα μη νεοπλασματικού ιστού ερευνήθηκε χρησιμοποιώντας ανάλυση κηλίδος Western. Το Σχήμα 2Β δείχνει τα αποτελέσματα ανοσοκηλίδωση από 21 όγκων και 9 δείγματα μη-νεοπλασματικό ιστό. Η πυκνομετρική ανάλυση των SRPK1 και επιπέδων ακτίνης διεξήχθη και το σχετικό επίπεδο έκφρασης των SRPK1 κανονικοποιήθηκε με το επίπεδο της ακτίνης. Βρήκαμε ότι 26 από τους 47 (55%) περιπτώσεις υπερεκφράζεται SRPK1 (που ορίζεται ως μεγαλύτερο από δύο φορές πάνω από τη μέση τιμή των εννέα φυσιολογικά δείγματα).

(Α) Ποσοτική πραγματικού χρόνου αντίστροφης μεταγραφής αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (RT-PCR) ανάλυση του επιπέδου RNA SRPK1 σε 6 κύτταρα OVCA και τα κύτταρα IOSE. GAPDH χρησιμοποιήθηκε για τους ελέγχους φόρτωσης και εξομάλυνση. Πενήντα τοις εκατό συγκέντρωση αναστολή της ανάπτυξης (IC

50, μΜ) του CDDP για τα κύτταρα OVCA υποδείχθηκε κάτω πίνακα). (Β) Ανάλυση στυπώματος Western της πρωτεΐνης SRPK1 σε 6 κύτταρα OVCA και τα κύτταρα IOSE. Η κατώτερη ζώνη στην κηλίδα ανιχνεύθηκε με αντίσωμα αντι-SRPK1 είναι πιθανώς πρωτεολυτικό θραύσμα της SRPK1. Τα στυπώματα ανιχνεύθηκαν πάλι με ακτίνη το οποίο χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης και για ομαλοποίηση. Γράφημα αντιπροσωπεύει σχετική έκφραση προσδιορίζεται με πυκνομετρική μέτρηση των ζωνών και εκφράζεται σε σχέση με την ακτίνη. Bar-γράφημα που παρουσιάζεται είναι ο μέσος όρος 4 πειραμάτων. Η υπερέκφραση του SRPK1 σε OVCA ορίστηκε ως μεγαλύτερο από 2 φορές πάνω από τη μέση τιμή των δειγμάτων IOSE και είναι σημειωμένα με αστερίσκους.

Η

(Α) Ανοσοϊστοχημική χρώση για έκφραση πρωτεΐνης SRPK1 σε φυσιολογικά και καρκινικά κύτταρα ωοθήκης τομές ιστού . Τα κύτταρα που χρωματίζονται θετικά για αντισώματα SRPK1 είναι καφέ. Για αρνητικό έλεγχο, ο ξενιστής-IgG Χρησιμοποιήθηκε (δεν φαίνεται). Ε, επιθήλιο? S, στρώμα. (Β) Ανάλυση στυπώματος Western της πρωτεΐνης SRPK1 σε 21 δείγματα των ωοθηκών όγκου (Τ), και 9 μη νεοπλασματικά δείγματα ωοθηκικού ιστού (Ν). Οι φυσιολογικών και καρκινικών δειγμάτων στο χαμηλότερο πάνελ είχαν περικοπεί από δύο διαφορετικά στυπώματα για το σκοπό της παρουσίασης. Οι χαμηλότερες ζώνες στο στύπωμα ανιχνεύθηκε με αντίσωμα αντι-SRPK1 είναι πιθανώς πρωτεολυτικά θραύσματα της SRPK1. οικόπεδο (C) Box-Whisker με SRPK1 /ακτίνης φορές η έκφραση προέρχεται από πυκνομετρική ανάλυση των ζωνών σε ανάλυση Western blot. Μουστάκια περιλαμβάνει όλες οι όγκοι (n = 47) ή τα φυσιολογικά δείγματα (n = 9), κουτιά περιέχουν 50% των δεδομένων, καθώς και οι κεντρικές γραμμές στα κουτιά δείχνουν διαμέσους. Η μέση έκφραση συγκρίθηκε με Μαθητή

t-test

(p = 0.03).

Η

Η πλειοψηφία των 47 ασθενών που εξετάστηκαν παρουσιάζονται με βαθμού 3 όγκους (91%), στο στάδιο IIIC (76%), και με ορώδες ιστολογία (85%). Η διάμεση επιβίωση για όλους τους ασθενείς ήταν 39,7 μήνες {διάστημα εμπιστοσύνης (CI), 26,5-∞ μήνες}, ενώ η μέση ελεύθερη νόσου επιβίωση, με εξαίρεση τους ασθενείς με επίμονη /προοδευτική ασθένεια μετά την αρχική θεραπεία, ήταν 17,5 μήνες (CI, 14,4 – 35,9 μήνες). Χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο παλινδρόμησης Cox εμείς δεν παρατηρούμε μια σαφή συσχέτιση μεταξύ του επιπέδου SRPK1 και συνολικά (p = 0,26) ή χωρίς (p = 0.62) την επιβίωση των ασθενών με καρκίνο ωοθηκών. επίπεδα SRPK1 δεν συσχετίστηκαν με ιστολογία, βαθμός, ή κλινική απόκριση σε cDDP περιέχουν σχήμα χημειοθεραπείας. Ωστόσο, η μέση σχετική έκφραση φορές της πρωτεΐνης SRPK1 ήταν σημαντικά διαφορετική μεταξύ των δειγμάτων όγκου και κανονικά δείγματα (Σχήμα 2C? Ανεξάρτητα δείγματα t-test, ρ-τιμή = 0,03). Έτσι, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι τα αυξημένα επίπεδα της πρωτεϊνικής έκφρασης SRPK1 είναι ένα συχνό συμβάν σε επιθηλιακά κακοήθειες των ωοθηκών.

Η μείωση του επιπέδου των SRPK1 από Short φουρκέτα RNA Βελτιώνει cDDP κυτταροτοξικότητα

Έχει αποδειχθεί ότι διαταραχή της έκφρασης SRPK1 από μικρό παρεμβαλλόμενο RNA αυξάνει την απόπτωση που προκαλείται από cDDP σε κυτταρικές σειρές του παγκρέατος, του παχέος εντέρου και του καρκίνου του μαστού [18], [19]. Για να ελεγχθεί αν knockdown του γονιδίου SRPK1 σε OVCA κύτταρα επηρεάζει την ευαισθησία τους σε cDDP, εμείς στοχεύουν το γονίδιο αυτό σε δύο θέσεις στο πεδίο κινάσης με δύο διαφορετικά κατασκευάσματα του μικρού φουρκέτας RNA (sh-SRPK1-1 και SH-SRPK1-2) σε SKOV3 και Α2780 /CP κύτταρα, τα οποία αμφότερα είναι σχετικά πιο ανθεκτικά στην cDDP από τα κύτταρα IOSE και ορισμένες άλλες OVCA κυτταρικές σειρές (Σχήμα 1Α). Ως έλεγχοι, ο φορέας pSM2-EV επίσης επιμολυσμένα στις δύο κυτταρικές σειρές. Παροδική διαμόλυνση (48 ώρες), είτε κατασκευάζουν μειωμένη ειδικά το mRNA SRPK1 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται) και στο επίπεδο της πρωτεΐνης, όπως επιβεβαιώνεται από της ανιχνεύσεως των Western blots με αντίσωμα έναντι ενός μη σχετική πρωτεΐνη, Upf1 και ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης (Σχήμα 3Α). Η ανασταλτική δράση της shSRPK1-2 κατασκεύασμα είναι πιο σημαντική από αυτήν του shSRPK1-1. Χρησιμοποιώντας τον προσδιορισμό φορμαζάνης χρωμάτων (ΜΤΤ), το Σχήμα 3Β δείχνει ότι η μείωση της πρωτεΐνης SRPK1 σε κύτταρα SKOV3 οδήγησε σε αυξημένη ευαισθησία στην θεραπεία cDDP (paired t-test και * υποδηλώνει Ρ & lt? 0,05). Για να μελετηθεί περαιτέρω η χημειο-ευαισθητοποίηση των αποτέλεσμα αναστολής SRPK1, δημιουργήσαμε σταθερών κλώνων με διαφορετικές ισχείς shRNA σε κύτταρα SKOV3. Έχουμε λάβει αρκετοί κλώνοι με μειωμένη mRNA SRPK1 και πρωτεΐνης όπως εκτιμήθηκε με RT-PCR και ανάλυση στυπώματος Western, αντιστοίχως. Δύο από αυτές απεικονίζονται στο Σχήμα 3C, όπου το επίπεδο πρωτεΐνης SRPK1 μειώθηκε σε περίπου 60% (pshSRPK1-C4, στοχεύονται από SH-SRPK1-2) ή 20% (pshSRPK1-C5, στοχεύονται από sh-SRPK1-1) του ελέγχου κύτταρα pSM2-EV. SRPK1 επίπεδα σε αυτούς τους κλώνους συσχετίζονται αντιστρόφως ανάλογα με την ευαισθησία τους cDDP όπως προσδιορίζεται με δοκιμασία σχηματισμού αποικίας (Σχήμα 3D). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι SRPK1 παίζει ένα ρόλο στη ρύθμιση cDDP κυτταροτοξικότητα

in vitro

και ότι η στόχευση νουκλεοτίδια 288 να 308 του mRNA SRPK1 οδήγησε σε μια ισχυρότερη σιγαστήρα αποτέλεσμα.

Ο καρκίνος των ωοθηκών κύτταρα ήταν παροδικά ( Α) ή σταθερά (C) διαμολύνθηκαν είτε με το siRNA που κωδικοποιεί shSRPK1 πλασμιδίου ή τον κενό φορέα (pSM2-EV). Τα επίπεδα πρωτεΐνης της SRPK1, UPF1 και ακτίνης προσδιορίστηκαν με ανάλυση κηλίδας Western. Αντιπροσωπευτικά κηλίδες από τρία ανεξάρτητα πειράματα που δείχνονται. (Β) και (Δ) SRPK1 knockdown ενισχύει σισπλατίνη κυτταροτοξικότητα. (Β) Κύτταρα (5 × 10

4) επανεμβολιάζονται 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις σισπλατίνης για 48 ώρες και ο αριθμός των επιζώντων κυττάρων αναλύθηκε με ανάλυση ΜΤΤ. Επιβίωση (%) εκφράζεται σε σχέση με μη κατεργασμένα κύτταρα pSM2-EV. (D) Σταθερά επιμολυσμένα (3 χ 10

2) σπάρθηκαν εις τριπλούν, έλαβαν θεραπεία με σισπλατίνη για hr και αποικία σχηματισμός 24 εκτιμήθηκε μετά από 10-14 ημέρες. Τα στοιχεία αναλύθηκαν με έναν τρόπο ANOVA και * υποδηλώνει Ρ & lt? 0,05? μπαρ, SD.

Η

Νοκ ντάουν της έκφρασης SRPK1 Μειωμένη κυτταρικού πολλαπλασιασμού και

in vitro

ογκογόνο δυναμικό των SKOV3 κύτταρα

Τα στοιχεία που παρουσιάζονται στο Σχήμα 3D δείχνουν επίσης ότι τα κύτταρα με μειωμένη έκφραση SRPK1 από shRNA αυξήθηκαν πιο αργά από ό, τι τα κύτταρα ελέγχου pSM2-EV. Σχηματίστηκαν λιγότερες αποικίες από την ομάδα χωρίς θεραπεία ελέγχου με την απουσία της θεραπείας cDDP. Για να ελέγξετε περαιτέρω κατά πόσον η μείωση της έκφρασης SRPK1 αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των ωοθηκών καρκινικών κυττάρων, ο χρόνος διπλασιασμού των pSM2-EV και pshSRPK1-C5 κύτταρα συγκρίθηκε. ρυθμός πολλαπλασιασμού των κυττάρων προσδιορίστηκε σε εκθετικά αναπτυσσόμενα κύτταρα με θρυψινοποίηση και αποκλεισμό trypan blue χρωστικής σε 24, 48, 72, και 96 ώρες μετά την επιμετάλλωση. Το Σχήμα 4Α δείχνει ότι ο χρόνος διπλασιασμού του pshSRPK1-C5 είναι περίπου 1,4 φορές των κυττάρων ελέγχου pSM2-EV (31 ώρες έναντι 22 ωρών). Αυτό επιβεβαιώθηκε με δοκιμασία ΜΤΤ (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Στη συνέχεια ερευνήσαμε την ογκογόνο δυναμικό των SRPK1 χρησιμοποιώντας τον προσδιορισμό ανεξάρτητη από προσκόλληση-ανάπτυξη (AIG). SRPK1 knockdown και ελέγχου κύτταρα σπάρθηκαν σε μαλακό άγαρ και αφέθηκαν να αναπτυχθούν για 3 εβδομάδες. Το Σχήμα 4Β δείχνει ότι και οι δύο κλώνοι shSRPK1 παράγονται λιγότερες και μικρότερες αποικίες σε μαλακό άγαρ, γεγονός που υποδηλώνει μια μείωση σε ποσοστό

in vitro

ογκογονικότητας. Η κυτταρική κινητικότητα είναι ένας από τους παράγοντες που συμβάλλουν στην εισβολή των καρκινικών κυττάρων. Για να ελεγχθεί αν η ικανότητα κυτταρικής μετανάστευσης διακυβεύεται στα SRPK1 knockdown κυττάρων, μία δοκιμασία

in vitro

μετανάστευση κυττάρων (επούλωση τραύματος) διεξήχθη. Εικόνα 4C δείχνει ότι το μέσο ποσοστό μετανάστευσης για τα κύτταρα shSRPK1-C5 (5,8 ± 0,81 μονάδα) ήταν περίπου 60% του ότι για τα κύτταρα ελέγχου pSM2-EV (9.9 ± 1.5 μονάδα). Μαζί, τα στοιχεία μας δείχνουν ότι η SRPK1 συμβάλλει στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων,

in vitro

μετανάστευση των κυττάρων και ογκογόνο δυναμικό των κυττάρων SKOV.

(Α) δοκιμασία πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Κύτταρα (1 χ 10

4) σπάρθηκαν εις τριπλούν σε μία πλάκα 24 φρεατίων, σε επεξεργασία με θρυψίνη και μετρήθηκαν σε παρουσία κυανού τρυπανίου στους υποδεικνυόμενους χρόνους. (Β) Anchorage-ανεξάρτητη δοκιμασία ανάπτυξης. Κύτταρα (5 × 10

3) σπάρθηκαν σε μαλακό άγαρ και ο αριθμός των αποικιών προσδιορίζεται 21 ημέρες αργότερα. Αντιπροσωπευτικά πεδία από τις αποικίες σε πλάκες μαλακού άγαρ παρουσιάζονται επίσης. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι ο μέσος όρος τριών ανεξάρτητων πειραμάτων και αναλύθηκαν με paired t-test? * Υποδηλώνει P & lt? 0,05, μπαρ, SD. κύτταρα SKOV3 σπάρθηκαν ως θετικός έλεγχος. (C)

In vitro

πληγή δοκιμασία επούλωσης. Συρρέοντα κύτταρα ήταν γδαρμένο με 200 μλ-tip για να δημιουργήσει ευθεία γραμμή-κενά. Εικόνες από τα κενά πάρθηκαν στα 0 και 28 hr και το πλάτος των κενών (λευκό διακεκομμένες γραμμές) μετρήθηκε υπό μικροσκόπιο φωτός για τον υπολογισμό του ρυθμού της κυτταρικής μετανάστευσης. Αντιπροσωπευτικά εικόνες που εμφανίζονται στην αριστερή και σχετικές αποστάσεις μεταναστεύουν (κλείσιμο της πληγής) φαίνεται στα δεξιά υπολογίστηκαν από τις 20 περιοχές από κάθε πλάκα. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι από τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Οι αστερίσκοι

παρουσιάζουν σημαντικές διαφορές σε σύγκριση με τον έλεγχο (

P

& lt? 0,05).

Η

Νοκ ντάουν της έκφρασης SRPK1 μειωμένη φωσφορυλίωση συγκεκριμένων πρωτεϊνών SR και ΜΑΡΚ /AKT Πρωτεΐνες πρωτεΐνες SR

είναι οι άμεσοι στόχοι της SRPK1 [15]. Το πρότυπο φωσφορυλίωσης αυτών SR παράγοντες ματίσματος αναμένεται να επηρεαστεί σε SRPK1 νοκ ντάουν κύτταρα. Για να ελεγχθεί αυτή την πρόβλεψη, την ανάλυση στυπώματος Western χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα που αναγνωρίζει τηγάνι ένα φωσφο-ειδικό επιτόπιο κοινά σε πολλαπλές πρωτεΐνες SR [29] εκτελέστηκε. Όπως αναμενόταν, μειωμένη έκφραση SRPK1 οδήγησε σε μειωμένα επίπεδα φωσφορυλίωσης συγκεκριμένων SR πρωτεϊνών σε κύτταρα SKOV3 (Σχήμα 5, μεσαίο πλαίσιο). Είναι ενδιαφέρον να σημειωθεί ότι οι διαφορετικές πρωτεΐνες SR επηρεάζονται μεταξύ shSRPK1-C4 και shSRPK1-C5 κλώνους. Για παράδειγμα, το επίπεδο της SRp55 μειώθηκε πολύ περισσότερο σε shSRPK1c5 από εκείνο στο shSRPK1-c4 κύτταρα. Το αντίθετο ισχύει για το SRp40 και SRp20. Η διαφορική knockdown του SRPK1 παρατηρήθηκε σε αυτές τις δύο κλώνους (Σχήμα 5, άνω πλαίσιο) μπορεί να ευθύνεται για τις διαφορές στην φωσφορυλίωση του υποστρώματος. Το επίπεδο του ενζύμου SRPK1 μπορεί να καθορίσει την αναγνώριση υποστρώματος και καταλυτική δράση. Οι διαφορές του επιπέδου SRPK1 μεταξύ shSRPK1-C4 και shSRPK1-C5 κλώνοι αντικατοπτρίζονται επίσης στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την ευαισθησία στην σισπλατίνη (βλέπε παρακάτω) που επηρεάζονται από SRPK1 ρύθμιση προς τα κάτω.

ανάλυση Western blot πραγματοποιήθηκε σε λύματα που παρασκευάζονται από SKOV3 προερχόμενη κύτταρα pSM2-EV και δύο σταθερές SRPK1-νοκ ντάουν κλώνους. Αντισώματα χρησιμοποιούνται για να ανιχνεύσουν τις φωσφορυλιωμένες πρωτεΐνες SR (mAB104), MAPK42 /44 (Thr

202 /Tyr

204), και AKT (Ser

473 /Thr

308), καθώς και της συνολικής πρωτεΐνης επίπεδα MAPK42 /44, και ΑΚΤ.

η

είναι γνωστό ότι η ενεργοποίηση, δηλαδή αυξημένα επίπεδα της φωσφορυλίωσης, της ΜΑΡΚ (ενεργοποιημένη από μιτογόνο πρωτεΐνη κινάση) και ΑΚΤ μονοπατιών σηματοδότησης εμπλέκεται σε πολλές κακοήθειες ( 29, 30) και ότι αυτές οι οδοί ρυθμίζουν την επεξεργασία προ-πιΚΝΑ [31], [32]. Το πρότυπο φωσφορυλίωσης των δύο βασικών μετατροπείς σημάτων πολλαπλασιασμού, ρ44 /42 ΜΑΡΚ (ΕΚΚ1 και ERK2) και AKT αναλύθηκε στα SRPK1 νοκ ντάουν κύτταρα. Το Σχήμα 5 δείχνει ότι pshSRPK1-C4 και C5-pshSRPK1 κύτταρα είχαν μειωμένα επίπεδα /42-ΜΑΡΚ (ρ-ΜΑΡΚ) και ΑΚΤ πρωτεΐνες (π-ΑΚΤ) φωσφορυλιωμένη ρ44. Αντίθετα, η συνολική ποσότητα των πρωτεϊνών ΜΑΡΚ και ΑΚΤ δεν επηρεάστηκε από την αναστολή της έκφρασης SRPK1. Τα μειωμένα επίπεδα φωσφορυλιωμένης ρ44 /42 ΜΑΡΚ-και ΑΚΤ συσχετίζεται με πιο αργή ανάπτυξη των SRPK1 knockdown κυττάρων (Σχήμα 4). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι SRPK1 παίζει ένα ρόλο στη ρύθμιση του επιπέδου των ενεργοποιημένων μορφών των ΜΑΡΚ ή /και πρωτεΐνες ΑΚΤ.

SRPK1-knockdown κύτταρα εμφανίζουν βραδύτερη κυτταρικού κύκλου Progression

Δεδομένα που περιγράφονται παραπάνω δείχνουν ότι η αναστολή της SRPK1 οδηγεί σε επιβράδυνση της ανάπτυξης των κυττάρων και μειωμένη φωσφορυλίωση ορισμένων ΜΑΡ κινασών, οι οποίες είναι σημαντικές ρυθμιστές της προόδου του κυτταρικού κύκλου.