Αφηρημένο

15-δεοξυ-δέλτα-12,14-προσταγλανδίνης -J

2 (15d-PGJ

2), ένα μεταβολίτη αραχιδονικού και ένα φυσικό αγωνιστή ΡΡΑΚγ, είναι γνωστό ότι επάγουν απόπτωση σε κύτταρα όγκου. Σε αυτή τη μελέτη, ερευνήσαμε νέες θεραπευτικές δυνατότητες της 15d-PGJ

2 καθορίζοντας αντικαρκινικές επιδράσεις της στην άγριου τύπου και τα κύτταρα των ωοθηκών καρκίνωμα δοξορουβικίνη-ανθεκτικά. Παρά την υψηλή έκφραση των γονιδίων αντοχής επαγωγής όπως MDR1, Bcl2 και Bcl-XL, 15d-PGJ

2 επάγεται ισχυρά απόπτωση σε κύτταρα δοξορουβικίνη ανθεκτικά (Α2780 /AD) παρόμοια προς την άγριου-τύπου (Α2780). Αυτό βρέθηκε να σχετίζεται με κασπάσης-3 /7- και NF-κΒ οδούς αλλά όχι με αγωνιστική δραστηριότητα του ΡΡΑΡγ. 15d-PGJ

2 ήταν επίσης σε θέση να μειώσει την αντίσταση δοξορουβικίνη των κυττάρων Α2780 /AD και σε χαμηλές δόσεις, όπως επιβεβαιώθηκε από την αναστολή της γονιδιακής έκφρασης του MDR1 (ρ-γλυκοπρωτεΐνη) και SIRT1 (ένα γονίδιο γήρανση φάρμακο). Ερευνήσαμε επίσης επιπτώσεις της 15d-PGJ

2 για τη μετανάστευση των κυττάρων και μετασχηματισμού χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία για επούλωση της πληγής και μορφολογικές αναλύσεις, αντίστοιχα. Βρήκαμε ότι 15d-PGJ

2 ανέστειλαν μετανάστευση πιθανότατα οφείλεται στην αναστολή του ΝΡ-κΒ και επαγόμενη μεταμόρφωση των κυττάρων Α2780 /AD στρογγυλό σχήμα σε επιμήκη επιθηλιακά κύτταρα οφείλεται στην αναστολή HDAC1. Χρησιμοποιώντας ένα

2 αναλογικές 15d-PGJ, βρήκαμε το μηχανισμό δράσης αυτών των νέων δραστηριοτήτων της 15d-PGJ

2 για SIRT1 και γονιδιακή έκφραση HDAC1 και τις δραστηριότητες του ενζύμου. Συμπερασματικά, η παρούσα μελέτη αποδεικνύει ότι 15d-PGJ

2 έχει υψηλό θεραπευτικό δυναμικό για να σκοτώσει τα καρκινικά κύτταρα ανθεκτικά στα φάρμακα και τα πρόσφατα περιγράφεται ανασταλτικές επιδράσεις αυτού του προϊόντος κυκλοοξυγενάσης για SIRT1 και HDAC θα προσφέρει νέες ευκαιρίες για τον καρκίνο θεραπευτική

Παράθεση:. de Jong Ε, Winkel P, Poelstra Κ, Prakash J (2011) αντικαρκινικές δράσεις της 15d-προσταγλανδίνης-J

2 σε αγρίου τύπου και δοξορουβικίνη ανθεκτικά κύτταρα των ωοθηκών Καρκίνος: Μυθιστόρημα δράσεις για SIRT1 και HDAC. PLoS ONE 6 (9): e25192. doi: 10.1371 /journal.pone.0025192

Επιμέλεια: Olivier Gires, Πανεπιστήμιο Ludwig-Maximilians, Γερμανία

Ελήφθη: 26 του Απριλίου, 2011? Αποδεκτές: 29, Αύγ του 2011? Δημοσιεύθηκε: 21 Σεπτέμβρη 2011

Copyright: © 2011 de Jong et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από έργο του Προγράμματος Καινοτόμων Δράσεων Γκρόνινγκεν, στην Ολλανδία, την Ευρωπαϊκή Ένωση και με επιχορήγηση Vici από την Τεχνική ολλανδικό Ίδρυμα (STW). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

οι προσταγλανδίνες (PG) είναι μία οικογένεια βιολογικά ενεργών ενδογενών μεταβολιτών του αραχιδονικού οξέος. Ελέγχουν μια τεράστια ποικιλία από φυσιολογικές λειτουργίες, όπως η ρύθμιση των λείων μυών τόνου, φλεγμονής, κυτταρικής ανάπτυξης και διαφοροποίησης [1]. 15-δεοξυ-Δ

12,14-προσταγλανδίνη J

2 (15d-PGJ

2) είναι ένα παράγωγο αφυδάτωση του PGD

2, η οποία είναι επίσης γνωστή ως φυσική αγωνιστής του πυρηνικού υποδοχέα περοξειζόμης γάμμα υποδοχέας που ενεργοποιείται από πολλαπλασιαστή (PPARγ). 15d-PGJ

2 έχει αναφερθεί ότι εμφανίζουν πολλαπλές φαρμακολογικές δραστηριότητες (αντι-φλεγμονώδη, αντι-ινωτικών και αποπτωτικών δραστηριότητες), είτε μέσω ΡΡΑΚγ-dependent pathways ή PPARγ ανεξάρτητες οδούς όπως πυρηνικού παράγοντα κΒ (ΝΡ-κΒ) – , Keap-Nrf2-, STAT1, και ρ53-εξαρτώμενη οδών [2], [3]. Στην πρόσφατη μελέτη μας, έχουμε δείξει ότι 15d-PGJ

2 ήταν σε θέση να αναστέλλει την εξέλιξη του όγκου σημαντικά

in vivo

σε ποντίκια που φέρουν όγκο. αποτελεσματικότητα του βρέθηκε να ελέγχεται από ισχυρό αλλά αναστρέψιμη λευκωματίνη ορού του δεσμεύουν και από την εν συνεχεία διείσδυση της λευκωματίνης σε όγκων που εξαρτιόταν από την περιοχή αγγείωσης του όγκου [4]. Επίσης άλλες ομάδες έχουν αναφέρει την δραστικότητα κατά του όγκου του 15d-PGJ

2 in vivo σε διάφορα μοντέλα όγκων [5], [6]. Αυτά τα αποτελέσματα προτείνουν ότι μια ενδεχόμενη χρήση 15d-PGJ

2 για θεραπευτικούς σκοπούς ως αντικαρκινικός παράγοντας μπορεί να προβλεφθεί.

Έχουμε δείξει ότι 15d-PGJ

2 επάγει απόπτωση σε διάφορα καρκινικά κύτταρα μέσω ΡΡΑΚγ-ανεξάρτητο NF-κΒ και κασπάσης-dependent pathways [4], όπως φαίνεται και από άλλες μελέτες [7], [8]. Γνωρίζοντας την εμπλοκή του NF-κΒ οδού στη ρύθμιση της αντίστασης σε πολλαπλά φάρμακα (MDR 1) και αντι-αποπτωτικών γονιδίων (Bcl-2 και Bcl-XL) [9], τώρα ως στόχο να διερευνήσει κατά πόσον 15d-PGJ

2 είναι ικανός να επάγει απόπτωση σε δοξορουβικίνη ανθεκτικά καρκινικά κύτταρα σε σύγκριση με τον άγριου-τύπου. Εξετάσαμε περαιτέρω κατά πόσον οι επιπτώσεις που προκαλούνται από 15d-PGJ

2 έγιναν με τη μεσολάβηση PPARγ-εξαρτώμενη ή /και NF-κΒ-εξαρτώμενη μονοπάτια. Chu και συνεργάτες απέδειξαν ότι Silent Πληροφορίες Ρυθμιστής Τύπου 1 (SIRT1), μια κατηγορία III αποακετυλάσης ιστόνης (HDAC), υπερεκφράζεται σε διάφορους χημειοθεραπεία όγκους ασθενών με καρκίνο και την αναστολή της έκφρασης του γονιδίου SIRT1 οδηγεί σε μείωση στην έκφραση MDR1 και αύξηση στην ευαισθησία φαρμάκου [10]. Ως εκ τούτου, συγκρίναμε την έκφραση SIRT1 στην ανθρώπινη άγριου τύπου και δοξορουβικίνη ανθεκτικά καρκίνου των ωοθηκών κύτταρα και εξέτασαν τις επιδράσεις της 15d-PGJ

2 σε αυτή τη γονιδιακή έκφραση SIRT1. Κατά τη διάρκεια αυτών των πειραμάτων, παρατηρήσαμε ότι 15d-PGJ

2-αγωγή δοξορουβικίνη-ανθεκτικά κύτταρα μετασχηματισμένα από στρογγυλό σχήμα κυττάρων σε ένα επίμηκες τύπου. Ερευνήσαμε περαιτέρω αυτή την αλλαγή φαινοτυπική και διαπίστωσε ότι 15d-PGJ

2 που προκαλείται από αυτά τα αποτελέσματα, αναστέλλοντας τα ένζυμα τάξης-Ι HDAC. Πολλές φαρμακολογικές δράσεις των 15d-PGJ

2 π.χ. αναστολή της ΡΡΑΚγ, ΝΡ-κΒ, ρ53 και NRF-keap μονοπάτια επάγονται κάνοντας ένα σταθερό σύμπλοκο με ελεύθερη κυστεϊνη σε αυτές τις πρωτεΐνες μέσω ενός του από τις ηλεκτρόφιλες ατόμων άνθρακα [11]. Προκειμένου να προσδιοριστεί αν ανασταλτικά αποτελέσματα 15d-PGJ

2 για SIRT1 και HDACs επίσης για το τελευταίο αυτό μηχανισμό, πραγματοποιήσαμε πολλές

in vitro

πειράματα χρησιμοποιώντας ένα ανάλογο της 15d-PGJ

2 . Τα αποτελέσματά μας δείχνουν πολλές νέες δραστηριότητες αυτού του ενδογενούς μεταβολίτη του αραχιδονικού οξέος σε καρκινικά κύτταρα και να φωτίσει το μηχανισμό δράσης του προϊόντος αυτού κυκλοοξυγενάσης.

Μέθοδοι

πειράματα τηλέφωνα

Άγρια -τύπου (Α2780) και δοξορουβικίνη ανθεκτικά (Α2780 /AD) ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές καρκινώματος ωοθηκών ελήφθησαν από το Πανεπιστήμιο του Ιατρικού Κέντρου Groningen, The Netherlands. Α2780 και Α2780 /AD (δοξορουβικίνη ανθεκτικές) κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν σε μέσο Dulbecco τροποποιημένο Eagle (ϋΜΕΜ, BioWhittaker, Verviers, Belgium) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FCS) και αντιβιοτικά (πενικιλίνη, 50 μονάδες /ml συν στρεπτομυκίνη, 50 ng /ml) στους 37 ° C σε υγροποιημένο επωαστή που περιέχει 5% CO

2. κύτταρα Α2780 /AD καλλιεργήθηκαν παρουσία δοξορουβικίνη (2 μΜ). Δύο εβδομάδες πριν από τα πειράματα μια ξεχωριστή φιάλη ντοξορουμπικίνης-ανθεκτικών κυττάρων διατηρήθηκε χωρίς δοξορουβικίνη. Αυτά τα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για περαιτέρω πειράματα για να αποφευχθεί η επίδραση της δοξορουβικίνης σε πειράματα μας. Από 15d-PGJ

2 in vitro χάνει δραστικότητα του στην παρουσία του FCS, όλα τα πειράματα διεξήχθησαν σε FCS-ελεύθερο μέσο.

μελέτες βιωσιμότητας κυττάρων.

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε ο πλάκα 96 καθώς και 1 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο σε 200 μΙ μέσο με 10% FCS. Μετά από 48 ώρες, τα κύτταρα πλύθηκαν με μέσο χωρίς ορό και έπειτα επωάστηκαν με διαφορετικές συγκεντρώσεις 15d-PGJ

2 σε μέσο ελεύθερο ορού για 48 ώρες. Σε περίπτωση επεξεργασίας με το μη αναστρέψιμο ανταγωνιστή PPARγ GW9662 (2-χλωρο-5-νιτροβενζανιλιδο, Sigma), τα κύτταρα προ-επωάστηκαν με GW9662 (10 μΜ) για 3 ώρες και στη συνέχεια επωάστηκαν με ένα μίγμα 15d-PGJ

2 (χημικά Cayman, Ann Arbor, MI) και GW9662 για 48 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας Alamar Μπλε χρωστική (Serotec, Oxford, UK) το οποίο μετρά τον αριθμό των κυττάρων με βάση τη δραστηριότητα των μιτοχονδρίων. Μετά από 48 ώρες της επώασης, το μέσο που περιέχει κυανή χρωστική Alamar (αραιωμένο 1:10) προστέθηκαν στα κύτταρα και επωάστηκαν για άλλες 4 ώρες. Στη συνέχεια, ο μεταβολίζεται χρωστική (φθορισμού) ανιχνεύθηκε με φθοριόμετρο σε διέγερση 560 nm και εκπομπή 590 nm.

Caspase 3/7 προσδιορισμούς ενζύμου.

κασπάση-3 και -7 ένζυμα δράση προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας Caspase 3/7 Glo κιτ δοκιμασίας (Promega, Medison, WI). 1 × 10

4 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων σε 200 μλ μέσου καλλιέργειας. Μετά από 48 ώρες, τα κύτταρα πλύθηκαν με μέσο άνευ ορού και επωάστηκαν με διαφορετικές συγκεντρώσεις 15d-PGJ

2 σε 100 μΙ μέσου επί 5,5 ώρες. Ακολούθως, 100 μΐ του κασπάσης 3/7-ανασυσταθέν αντιδραστήριο προστέθηκε στα κύτταρα και επωάστηκε για 30 λεπτά στον επωαστήρα. Η φωταύγεια προσδιορίσθηκε με φωτόμετρο (Lumicount, Packard, Meriden, CT).

χρώση Annexin V.

χρώση αννεξίνης V διεξήχθη στα κύτταρα για να προσδιοριστεί η επαγωγή της απόπτωσης μετά από θεραπεία με 15d-PGJ2. 1 × 10

4 κύτταρα σπάρθηκαν σε μία πλάκα 8 φρεατίων (Lab-Tek, Nunc, Roskilde, Denmark) σε 400 μΙ μέσον καλλιέργειας. Μετά από 72 ώρες, τα κύτταρα πλύθηκαν με μέσο άνευ ορού και επωάστηκαν με διαφορετικές συγκεντρώσεις 15d-PGJ

2 σε 200 μΙ μέσου επί 6 ώρες. Ακολούθως, τα κύτταρα επωάστηκαν με 100 μΙ του αννεξίνης V-FITC (Roche, Mannheim, Germany) για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, πλύθηκαν και σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη. Στη συνέχεια, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν με DAPI διάλυμα που περιέχει τοποθέτησης και χρώση εξετάστηκε κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού.

μελέτη γονιδιακής έκφρασης.

1 × 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο εμβολιάστηκαν σε 12 -Καλά πλάκα και καλλιεργήθηκαν για 48 ώρες και στη συνέχεια επωάστηκαν με διαφορετικές ενώσεις για 48 ώρες. Τα κύτταρα λύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ρυθμιστικό διάλυμα λύσης και το RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας Απολύτως RNA kit microprep (Stratagene, La Jolla, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι συγκεντρώσεις RNA μετρήθηκαν με μία υν φασματοφωτόμετρο (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE). Στη συνέχεια, το cDNA συνετέθη από ίσες ποσότητες RNA χρησιμοποιώντας Superscript III πρώτου κλώνου κιτ σύνθεσης (Invitrogen, Carlsbad, CA). Οι εκκινητές για ανθρώπινα είδη ελήφθησαν από την Sigma-Genosys (Haverhill, UK). Οι αλληλουχίες εκκινητών κατατάσσεται στον Πίνακα 1. επίπεδα έκφρασης γονιδίων για διαφορετικά γονίδια μετρήθηκαν με ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA) χρησιμοποιώντας SYBR Green ως φθορίζοντα ανιχνευτή (Applied Biosystems). Τέλος, οι αριθμοί κύκλος κατωφλίου (Ct) χρησιμοποιήθηκαν για τον υπολογισμό της γονιδιακής έκφρασης για κάθε στόχο με κανονικοποίηση προς το σπίτι διατήρησης γονίδιο GAPDH.

Η

Επιμόλυνση και δοκιμασία λουσιφεράσης για δραστικότητα ΝΡ-κΒ.

δραστικότητα ΝΡ-κΒ προσδιορίζεται δια χρησιμοποιήσεως λουσιφεράσης ανταποκριτή δοκιμασία που βασίζεται, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [4]. Εν συντομία, PNF-κΒ-Luc (Clontech, Mountain View, CA) που περιέχει μια συγκεκριμένη αλληλουχία δέσμευσης για NF-κΒ και ένα άδειο λουσιφεράση πλασμίδιο, pTAL-Luc (ελέγχου) χρησιμοποιήθηκαν για μελέτες επιμόλυνσης. 1 × 104 κύτταρα ανά φρεάτιο εμβολιάστηκαν σε λευκές πλάκες των 96 φρεατίων και η επιμόλυνση των πλασμιδίων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση αντιδραστηρίου επιμόλυνσης FuGENE 6 (Roche) μετά από 24 ώρες. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ένα σύμπλοκο 0.17 μg DNA /0,5 μl Fugene 6 σε 100 μΙ φυσιολογικό μέσο με 10% FCS για 24 ώρες. Ακολούθως, τα κύτταρα πλύθηκαν με μέσο άνευ ορού και επωάστηκαν με 15d-PGJ

2, ΒΑΥ 11-7082 (Sigma), σιγλιταζόνη με ή χωρίς TNF-α (Peprotech, Rocky Hill, NJ) για 4 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και λύθηκαν με 20 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος λύσης κυττάρου, και συμπληρωμένο με 100 μΙ υποστρώματος λουσιφεράσης (Promega). Η δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε με ένα φωτόμετρο (Lumicount, Packard). Η μονάδα φωταύγεια τιμές των PNF-κΒ-Luc εξουδετερώθηκαν αφαιρώντας τις τιμές pTAL-Luc.

πληγή επούλωση δοκιμασία.

1 × 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο σπάρθηκαν σε 12 -Καλά πλάκα και καλλιεργήθηκαν για 48 ώρες σε μέσο καλλιέργειας. Στη συνέχεια, μια γρατσουνιά (πληγή) εισήχθη στο συρροής κυτταρικό στρώμα χρησιμοποιώντας ένα κίτρινο κορυφή τοποθετείται σε ένα ικρίωμα, επιτρέποντας την τυποποίηση του μηδέν. Τα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές με μέσο για να απομακρυνθεί αποσπασμένα κύτταρα. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με διαφορετικές ενώσεις για 48 ώρες και εικόνες ενός καθορισμένου τόπου τραύματος έγιναν με τη βοήθεια υπολογιστή μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης (Olympus) σε t = 0, 24 και 48 ώρες. Η περιοχή του τραύματος στις μικροσκοπικές εικόνες μετρήθηκε χρησιμοποιώντας λογισμικό J εικόνας (National Institutes of Health, MD) σε διαφορετικά χρονικά σημεία. Το ποσοστό επούλωσης τραύματος μετά από 24 ώρες ή 48 ώρες υπολογίστηκε σε σχέση με τη συνολική έκταση του τραύματος σε t = 0 h του στο ίδιο σημείο του τραύματος.

SIRT1 και το ένζυμο HDAC1 δοκιμές δραστικότητας.

SIRT1 και δοκιμασίες αναστολής ενζύμου HDAC1 διεξήχθησαν για να προσδιοριστεί η επίδραση της 15d-PGJ2 στις δραστηριότητές τους με τη χρήση των εμπορικά κιτ από την Cayman Chemicals (Αηη Arbor, ΜΙ). Οι δοκιμασίες του ενζύμου SIRT1 και HDAC1 πραγματοποιήθηκαν σε μικροπλάκες σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Πρώτον, ρυθμιστικό δοκιμασίας, SIRT1 ή HDAC1 ένζυμο και διαλύτη (DMF) ή διάφορες συγκεντρώσεις των θεραπειών (15d-PGJ2 ή CAY-10410 διαλύθηκαν σε DMF) αναμείχθηκαν. CAY-10410 (9,10-διυδρο-15-δεοξυ-Δ

12,14-προσταγλανδίνη J

2), ένα ανάλογο του 15d-PGJ

2, αγοράσθηκε από την Cayman Chemicals. Στη συνέχεια, το υπόστρωμα αποτελείται από την ακολουθία ρ53 Arg-His-Lys-Lys (e-ακετυλο) -AMC πεπτίδιο και συν-υπόστρωμα NAD + για δραστικότητα SIRT1 προστέθηκε στο μίγμα ενζύμου και επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 45 λεπτά. Για τη μέτρηση της δραστικότητας HDAC1, ένα ακετυλιωμένο υπόστρωμα λυσίνη προστέθηκαν στο μίγμα ενζύμου και επωάζονται για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, η στάση του /αναπτυσσόμενες διάλυμα, που περιέχει ένα μίγμα ενός (αναστολέας SIRT1) του έργου και νικοτιναμίδιο ή Τριχοστατίνη Α (αναστολέας HDAC1) προστέθηκαν στο μικροπλάκα και επωάστηκαν για 30 λεπτά και 15 λεπτά, αντίστοιχα σε θερμοκρασία δωματίου. Αποακετυλιωμένο πεπτίδιο αντιδρά με τον κύριο του έργου και απελευθερώνει ένα φθοροφόρο. Τα φθοροφόρα και για τις δύο δοκιμασίες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μήκος κύματος διέγερσης 350 nm και μήκος κύματος εκπομπής 450 nm. 100% δραστικότητα του ενζύμου υπολογίστηκε με επώαση με DMF μόνο και το ποσοστό αναστολής της SIRT1 ή δραστηριότητας HDAC1 υπολογίστηκε σε σχέση με τις αντίστοιχες συγκεντρώσεις διαλύτη.

Στατιστικές Αναλύσεις

Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση ± τυπική μέση σφάλμα (SEM), εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά. Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση t-test unpaired δύο κατεύθυνσης Student με

ρ

& lt? 0,05 ως το ελάχιστο επίπεδο σημαντικότητας. δεδομένων κυτταρικής βιωσιμότητας έχουν τοποθετηθεί σύμφωνα με σιγμοειδή καμπύλη δόσης-απόκρισης για τον υπολογισμό IC

50 χρησιμοποιώντας GraphPad Prism 4 λογισμικού (La Jolla, CA).

Αποτελέσματα

15d-PGJ

2 επάγει απόπτωση στα δύο Α2780 και Α2780 /AD κύτταρα PPARγ-ανεξάρτητα

Εμείς επιβεβαίωσε ότι τα κύτταρα /AD Α2780 είναι ιδιαίτερα ανθεκτικό σε δοξορουβικίνη σε σύγκριση με τα κύτταρα Α2780 άγριου τύπου με το IC

50 δοξορουβικίνης σε Α2780 και Α2780 /AD ήταν 1,3 και 120 μΜ, αντιστοίχως (Εικ. 1Α). Ωστόσο, η θεραπεία με 15d-PGJ

2 προκάλεσε κυτταρικό θάνατο και στις δύο κύτταρα Α2780 (IC

50 = 4.3 μΜ) και Α2780 /AD κυττάρων (IC

50 = 2.6 μΜ) μετά από 48 ώρες επώασης. 15d-PGJ

2 είναι ένας γνωστός αγωνιστής ΡΡΑΚγ αλλά βρήκαμε ότι η επαγωγή κυτταρικού θανάτου στους δύο τύπους κυττάρων ήταν PPARγ-ανεξάρτητος ως προκατεργασία με τη μη αναστρέψιμη PPARγ ανταγωνιστής GW9662 δεν αναστρέψει τα αποτελέσματα της 15d-PGJ

2 ούτε σε άγριου-τύπου (Εικ. 1Β), ούτε σε ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές (Εικ. 1 C). Επιπλέον, βρήκαμε ότι 15d-PGJ

2 επήγαγε απόπτωση στα δύο άγριου τύπου και δοξορουβικίνη-ανθεκτικά κύτταρα μέσω της ενεργοποίησης του μονοπατιού κασπάσης ως κασπάση-3/7 Δραστηριότητα ενζύμου ήταν σημαντικά επάγεται από 15d-PGJ

2 σε Αυτά τα κύτταρα μετά 5.5 ώρες επώασης (Εικ. 1 D). Αν και Α2780 /AD (ανθεκτικά κύτταρα) ήταν ελαφρώς πιο ευαίσθητα στην 15d-PGJ

2 στη δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας, υπήρχε ελαφρώς χαμηλότερη επαγωγή της δραστικότητας κασπάσης σε αυτά τα κύτταρα σε σύγκριση με κύτταρα Α2780, υποδεικνύοντας συμμετοχή προσδιορισμών κασπάσης-ανεξάρτητη. Η επαγωγή της απόπτωσης σε αυτά τα κύτταρα επιβεβαιώθηκε επίσης με χρώση αννεξίνης V, ενός δείκτη για πρώιμη απόπτωση. Βρήκαμε ότι και οι δύο τύποι κυττάρων έγινε θετική για χρώση αννεξίνης V (πράσινο χρώμα) μετά την επεξεργασία με 15d-PGJ

ο αριθμός των θετικών κυττάρων αυξήθηκε σε υψηλότερες συγκεντρώσεις και στις δύο κυτταρικές σειρές (Εικ. 1 Ε) 2 και.

(Α) δοξορουβικίνη σκότωσε κύτταρα Α2780 εντελώς στα 5 μΜ, ενώ Α2780 κύτταρα /AD ήταν ιδιαίτερα ανθεκτικό σε δοξορουβικίνη. Σε αντίθεση, 15d-PGJ

2 επάγεται κυτταρικό θάνατο σε αμφότερα άγριου τύπου Α2780 (Β) και κυτταρικές γραμμές δοξορουβικίνη ανθεκτικές Α2780 /AD (C) δοσοεξαρτώμενο μετά από 48 ώρες. Αυτά τα αποτελέσματα δεν ήταν PPARγ εξαρτάται ως προ-επώαση με μια μη αναστρέψιμη ανταγωνιστή PPARγ GW9662 (10 μΜ) δεν μπλοκάρουν αυτά τα αποτελέσματα. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως% του ελέγχου που ήταν υπολογίζονται υποθέτοντας μη επεξεργασμένα κύτταρα 100% βιώσιμα όπως προσδιορίστηκε με την ανάλυση Alamar Blue. (D) 15d-PGJ

2 ενισχυμένη κασπάσης δραστηριότητα 3/7 ένζυμα (σε t = 5.5 ώρες) και στους δύο τύπους κυττάρων σε εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SEM του μέσου όρου των 3 τουλάχιστον ξεχωριστά πειράματα. Οι διαφορές σε σχέση με τους ελέγχους που φαίνεται σαν *

σ

& lt? 0,05, **

σ

& lt? 0,01. (Ε) Εκπρόσωπος μικροφωτογραφίες που δείχνουν χρώση αννεξίνης V (πράσινο χρώμα), ένας δείκτης της επαγωγής απόπτωσης, στο Α2780 και Α2780 /AD κυτταρικές σειρές μετά τη θεραπεία με 15d-PGJ

2 εξάρτηση από τη συγκέντρωση. χρώση ϋΑΡΙ (μπλε χρώμα) δείχνει το συνολικό αριθμό των κυττάρων. Μεγέθυνσης, 200 ×. Τα κουτιά δείχνουν τις εικόνες σε μεγαλύτερη μεγέθυνση 480 ×.

Η

15d-PGJ

2 επάγει την απόπτωση με την αναστολή της NF-κΒ οδού

Από την απόπτωση που προκαλείται από 15d-PGJ

2 ήταν PPARγ-ανεξάρτητη, διερευνήσαμε την εμπλοκή του μονοπατιού ΝΡ-κΒ, έναν σημαντικό ρυθμιστή της κυτταρικής επιβίωσης και του πολλαπλασιασμού, σε κύτταρα Α2780 και Α2780 /AD χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ανταποκριτή λουσιφεράσης NF-κΒ. Εμείς προκάλεσε την δραστικότητα ΝΡ-κΒ στα κύτταρα αυτά με ανθρώπινο ανασυνδυασμένο TNF-α, που είναι μια άμεση ενεργοποιητής του μονοπατιού ΝΡ-κΒ. Βρήκαμε ότι η θεραπεία με TNF-α (100 ng /ml) ενίσχυσε σημαντικά την δραστικότητα ΝΡ-κΒ σε δύο τύπους κυττάρων, αλλά ταχύτερα παρά σε Α2780 (13-φορές) σε σύγκριση με Α2780 /AD (6,0 φορές) (Εικ. 2Α) . Η θεραπεία με 15d-PGJ

2 μείωσε σημαντικά την βασική και TNF-α επαγόμενης δραστικότητας ΝΡ-κΒ και στους δύο τύπους κυττάρων σε εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο (Εικόνα 2Β και 2C). Ωστόσο, τα ανασταλτικά αποτελέσματα ήταν ισχυρότερη σε Α2780 /AD από Α2780 όπως μπορεί να παρατηρήσει στα 2,5 και 5,0 μΜ συγκεντρώσεις. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η απόπτωση που επάγει επιδράσεις της 15d-PGJ

2 είχαν προκαλούνται μέσω NF-κΒ οδό. Επιπλέον, η σιγλιταζόνη αγωνιστής ΡΡΑΚγ δεν ανέστειλε την βασική δραστικότητα του ΝΡ-κΒ σε συγκέντρωση 10 μΜ, αλλά μόνο σε υψηλότερες συγκεντρώσεις. Σε περαιτέρω πειράματα με σιγλιταζόνη εμείς επομένως χρησιμοποιούνται συγκεντρώσεις οι οποίες επάγουν μόνο PPARγ-ειδικές επιδράσεις (ΕΚ

50 = 3.0 μΜ) [12] και δεν ΝΡ-κΒ-προκαλούμενα αποτελέσματα. Ένα πολύ γνωστό ΝΡ-κΒ-ειδικό αναστολέα, δηλαδή ΒΑΥ-11-7082 ανέστειλε την δραστικότητα ΝΡ-κΒ σε δύο τύπους κυττάρων παρομοίως και αυτός ο αναστολέας χρησιμοποιήθηκε σε περαιτέρω πειράματα για να προσδιοριστεί η επίδραση της αναστολής του ΝΡ-κΒ στα κύτταρα αυτά.

για να μετρηθεί η δραστικότητα του ΝΡ-κΒ, και τα δύο κύτταρα Α2780 και Α2780 /AD επιμολύνθηκαν παροδικά με ένα πλασμίδιο που περιέχει τον προαγωγό του ΝΡ-κΒ με ένα στοιχείο αναφοράς της λουσιφεράσης (PNF-κΒ-Luc) για 24 ώρες. Μετά από 24 ώρες, 15d-PGJ

2, κιγλιταζόνη ή ΒΑΥ-11-7082 επωάστηκαν με και χωρίς ΤΝΡ-α επί 4 ώρες και, στη συνέχεια, η δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία φωταύγειας για τον προσδιορισμό της δραστικότητας του ΝΡ-κΒ. (Α) Το NF-κΒ μονοπάτι ενεργοποιητή, TNF-α (100 ng /ml), που προκαλείται από την δραστικότητα ΝΡ-κΒ σε δύο τύπους κυττάρων αν και η αύξηση ήταν υψηλότερη σε Α2780 κύτταρα. Η θεραπεία με 15d-PGJ

2 ανέστειλε σημαντικά δραστικότητα ΝΡ-κΒ σε τόσο Α2780 (Β) και κύτταρα Α2780 /AD (C) το οποίο ήταν περισσότερο έντονη σε ΤΝΡ-α-ενεργοποιημένα κύτταρα. Η ciglitazone ανέστειλε ΝΡ-κΒ μόνο σε υψηλότερες συγκεντρώσεις ή σε κύτταρα Α2780 /AD ΤΝΡ-α-ενεργοποιημένα. ΒΑΥ-11-7082 ανέστειλε την δραστικότητα ΝΡ-κΒ σε δύο τύπους κυττάρων με παρόμοια αποτελεσματικότητα. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο τουλάχιστον 3 ξεχωριστά πειράματα. Οι στατιστικά σημαντικές διαφορές σε σχέση με τους αντίστοιχους ελέγχους εμφανίζονται ως *

σ

& lt? 0,05 και **

σ

& lt?. 0.01

Η

15d-PGJ

2 μειώνει την έκφραση του mRNA του Bcl-2, Bcl-XL, MDR1 και SIRT1

Μετά αναλύσεις γονιδιακής έκφρασης, βρήκαμε ότι τα κύτταρα /AD Α2780 είχε σημαντική επαγωγή των αντι-αποπτωτικών γονιδίων όπως Bcl-2 (120- fold) και Bcl-XL (2-φορές) σε σύγκριση με μη-ανθεκτικά κύτταρα Α2780 (Εικ. 3Α). Η θεραπεία με χαμηλές συγκεντρώσεις 15d-PGJ2 (1,0 και 2,5 μΜ) για 48 ώρες μείωσε τα επίπεδα έκφρασης Bcl-2 και Bcl-XL στην Α2780 /AD πιο έντονα από ό, τι στα κύτταρα Α2780 (Εικ. 3Α), το οποίο θα μπορούσε επίσης να εξηγήσει την υψηλότερη κυτταροθανατηφόρου ικανότητας στα κύτταρα Α2780 /AD. Αυτές οι επιδράσεις δεν οφείλονταν σε αγωνιστική δραστικότητα ΡΡΑΚγ ή ΝΡ-κΒ ανασταλτικά αποτελέσματα της 15d-PGJ

2, όπως το γνωστό σιγλιταζόνη αγωνιστή ΡΡΑΚγ και επιλεκτική NF-κΒ αναστολέα είχε μόνο μικρή επίδραση σε σύγκριση με 15d-PGJ

2 (Εικ. 3Α).

(Α) κύτταρα Α2780 /AD είχαν υψηλότερα γονιδιακή έκφραση του Bcl-2 και Bcl-XL σύγκριση με τα κύτταρα Α2780. Επιδράσεις της 15d-PGJ

2, κιγλιταζόνη και ΒΑΥ-11-7082 σχετικά με την έκφραση του γονιδίου προσδιορίστηκαν μετά από 48 ώρες επώασης στους δύο τύπους κυττάρων. κύτταρα /AD Α2780 είχαν επίσης υψηλότερη έκφραση του MDR1 (Β) και SIRT1 (C) σε σύγκριση με τα κύτταρα Α2780. έκφραση του γονιδίου MDR1 δεν ήταν ανιχνεύσιμη (ΝΔ) σε Α2780 κύτταρα. Επιδράσεις της 15d-PGJ

2, κιγλιταζόνη και ΒΑΥ-11-7082 στην έκφραση MDR1 προσδιορίστηκαν μόνο σε κύτταρα Α2780 (Β), ενώ τα αποτελέσματα επί της έκφρασης SIRT1 μετρήθηκαν και στους δύο τύπους κυττάρων (C). Δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση ± SEM για τουλάχιστον 3 πειράματα. Οι στατιστικά σημαντικές διαφορές σε σχέση με τους αντίστοιχους ελέγχους εμφανίζονται ως *

σ

& lt? 0,05 και **

σ

& lt?. 0.01

Η

Επιπλέον, διαπιστώσαμε ότι υπάρχει ήταν μια αυξητική ρύθμιση της αντίστασης σε πολλαπλά φάρμακα (MDR 1) και την κατηγορία-ΙΙΙ HDAC sirtuin-2 ομόλογο (SIRT1) έκφραση mRNA σε κύτταρα Α2780 /AD δοξορουβικίνη ανθεκτικά σε σύγκριση με κύτταρα Α2780 άγριου τύπου (σχ. 3Β και 3C). Τα επίπεδα MDR1 σε κύτταρα Α2780 κάτω από τα επίπεδα ανίχνευσης. Είναι ενδιαφέρον ότι, η θεραπεία με 15d-PGJ

2 ανέστειλε σημαντικά την έκφραση MDR1 στα ανθεκτικά κύτταρα και αυτές οι επιδράσεις αυτές πιθανότατα αποδίδεται σε ανασταλτικά αποτελέσματα του ΝΡ-κΒ ως ΒΑΥ-11-7082 επίσης ανέστειλε την έκφραση, ενώ σιγλιταζόνη δεν είχε καμία επίδραση (Σχ. 3Β). 15d-PGJ

2 επίσης ανέστειλε την έκφραση SIRT1 στους δύο τύπους κυττάρων, αλλά αυτά τα ανασταλτικά αποτελέσματα δεν παρατηρήθηκαν με ΒΑΥ-11-7082 (Σχ. 3C). Από την άλλη πλευρά, σιγλιταζόνη μείωσε την έκφραση SIRT1 μόνο σε Α2780 /AD όπου ήταν αυξημένα επίπεδα SIRT1.

15δ-PGJ

2 αναστέλλει την επούλωση τραυμάτων διαδικασία

Από το χημειοθεραπευτικό ανθεκτικά κύτταρα μπορεί έχουν διαφορετική μετανάστευση συμπεριφορά από την έκδοση άγριου τύπου του, εξετάσαμε περαιτέρω την επίδραση της επαγόμενης αντίστασης σε αυτές τις παραμέτρους με

in vitro

τραύματος δοκιμασία επούλωσης. Η δοκιμασία μετρά τυπικά μετανάστευση των κυττάρων μέσω μέτρησης της κλείσιμο ενός προτύπου το μηδέν στο χρόνο. Βρήκαμε ότι τα κύτταρα Α2780 /AD είχαν σημαντικά βραδύτερη μετανάστευση από Α2780 κύτταρα (Σχ. 4Α και 4Β). 15d-PGJ

2 μείωσε την μετανάστευση των δύο κυτταρικών τύπων με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Εικ. 4C). Αν και 15d-PGJ

2 μείωσε την κυτταρική βιωσιμότητα σε Α2780 κύτταρα /AD σε 2,5 μΜ συγκέντρωση (Σχ. 1 C), δεν είδαμε κυτταρικό θάνατο σε αυτά τα πειράματα που θα μπορούσε να οφείλεται σε συρρέουσα στιβάδα κυττάρων που χρησιμοποιούνται σε αυτά τα πειράματα. Βρήκαμε ότι νωρίτερα σε κυτταρικό στρώμα συρροής 15d-PGJ

2 δεν είχε καμία επίδραση στην κυτταρική βιωσιμότητα του Α2780 /AD (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Απουσία του κυτταρικού θανάτου σε αυτά τα πειράματα είναι επίσης εμφανής στις αντιπροσωπεύονται εικόνες (Σχ. 4Α). Οι ανασταλτικές επιδράσεις στην επούλωση τραυμάτων παρατηρήθηκαν επίσης με ΒΑΥ-11-7082, αλλά όχι με σιγλιταζόνη αναφέροντας τις επιδράσεις της 15d-PGJ2 μπορεί να οφείλεται σε ανασταλτικά αποτελέσματα του ΝΡ-κΒ.

Για να προσδιοριστούν τα αποτελέσματα της 15d- PGJ

2 για τη μετανάστευση των κυττάρων, μία δοκιμασία επούλωσης πληγών εκτελέστηκε σε Α2780 και Α2780 κύτταρα /AD όπως περιγράφεται στα υλικά και μεθόδους. (Α) Εκπρόσωπος εικόνες που δείχνουν το μηδέν (πληγή) σε t = 0 h και t = 48 h με /χωρίς διαφορετικές θεραπείες. Ένα σημάδι (οπτικοποιείται σε αυτές τις εικόνες στο άνω ή κάτω πλευρά) τοποθετήθηκε για να εντοπίσετε την ίδια περιοχή στο μηδέν, εικόνες έγιναν χρησιμοποιώντας ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο και η ανοιχτή περιοχή υπολογίζεται στα υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία. Μεγέθυνσης, 40 ×. (Β) Το γράφημα δείχνει% επούλωση των πληγών στο Α2780 και Α2780 /AD κύτταρα χωρίς θεραπείες. Α2780 κύτταρα είχαν υψηλότερο ποσοστό μετανάστευσης σε σύγκριση με κύτταρα /AD Α2780. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SEM για 3 διαφορετικά πειράματα. **

σ

& lt? 0,01 έναντι Α2780 /AD. (Γ) Η θεραπεία με 15d-PGJ

2 και ΒΑΥ-11-7082 ανέστειλε την πληγή ανταπόκριση μετά από 48 ώρες επωάσεων επούλωση ενώ σιγλιταζόνη δεν έδειξαν καμία ανασταλτική δράση. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SEM για 3 διαφορετικά πειράματα. *

σ

& lt? 0,05 και **

σ

& lt?. 0.01 έναντι τιμών σε t = 0 h

Η

Επίδραση της 15d-PGJ

2 στην κυτταρική μορφολογία

Κατά τη διάρκεια των επωάσεων με 15d-PGJ

2, παρατηρήσαμε ότι τα κύτταρα είχαν μετατραπεί σε διευρυμένη και επιμήκη κύτταρα. Αυτή η φαινοτυπική αλλαγή ήταν πιο ευδιάκριτα ορατή στα κύτταρα Α2780 /AD DOX-ανθεκτικά. Αυτά τα κύτταρα αρχικά στρογγυλοποιείται και συρρικνώθηκε αλλά μετά τον μετασχηματισμό που επιτυγχάνεται περισσότερο κυτταρόπλασμα με διακριτές κυτταρικές όρια και εμφανίζεται μια εμφάνιση του επιθηλιακού-όπως δομή (Εικ. 5Α). Η θεραπεία με κιγλιταζόνη ή ΒΑΥ-11-7082 επάγεται καμία αλλαγή στην κυτταρική μορφολογία υποδεικνύει κανένα ρόλο των οδών PPARγ και NF-κΒ. Δεδομένου ότι αναφέρονται στη βιβλιογραφία ότι ο αναστολέας HDAC τριχοστατίνη Α θα μπορούσε να μετατρέψει τα κύτταρα καρκινώματος ωοθηκών [13], μπορούμε κατεργασμένα κύτταρα με τριχοστατίνη Α και βρέθηκε ότι τα κύτταρα πήρε μετασχηματίζονται με παρόμοιο τρόπο όπως με 15dPGJ

2 (Σχ. 5Α ). Αν και Α2780 κύτταρα και έμοιαζε περισσότερο τεντωμένο με 15d-PGJ

2 και τριχοστατίνη Α, οι διαφορές σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου δεν ήταν μεγάλη (Εικ. 5Β).

(Α) Εκπρόσωπος εικόνες που δείχνουν την αλλαγή στη μορφολογία των κυττάρων του Α2780 /AD μετά από επώαση με 15d-PGJ

2 (2,5 μΜ) και η τριχοστατίνη Α (70 ηΜ). Αντίθετα, άλλες θεραπείες, όπως κιγλιταζόνη και ΒΑΥ-11-7082 δεν επηρέασε την μορφολογία. Τα βέλη επισημαίνουν τα μετασχηματισμένα κύτταρα που είχαν περισσότερα δομή κυτταρόπλασμα και επιθηλιακά κύτταρα. Μεγέθυνσης, 200 × (Β) Εκπρόσωπος εικόνες των κυττάρων Α2780 μετά από επώαση με διαφορετικές θεραπείες. Η θεραπεία με 15d-PGJ

2 (2,5 μΜ) και τριχοστατίνη Α (70 ηΜ) οδήγησε σε σαφή αύξηση στο κυτταρόπλασμα. Μεγέθυνσης, 200 × (C) Αναλογία σαλιγκάρι στο e-cadherin γονιδιακής έκφρασης σε Α2780 και Α2780 /AD κύτταρα. Δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση ± SEM για 3 πειράματα.

Η

Δεδομένου ότι ο μετασχηματισμός των κυττάρων μπορεί να σχετίζεται με επιθηλιακά μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) διαδικασία, εξετάσαμε την έκφραση του σαλιγκάρι και Ε-καδερίνης μεταγραφές και διαπίστωσε ότι η αναλογία των σαλιγκάρι στο e-cadherin αυξήθηκε στους δύο τύπους κυττάρων μετά από την έκθεση των 2,5 μΜ 15d-PGJ

2 αν και οι διαφορές δεν ήταν στατιστικά σημαντικές. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η αλλαγή στην μορφολογία κυττάρων που προκαλείται από 15d-PGJ

2 μπορεί να οφείλεται στην επαγωγή της διαδικασίας ΕΜΤ

15δ-PGJ

2 αναστέλλει την έκφραση HDAC 1, 2 και 3 mRNA.

Δεδομένου ότι τα αποτελέσματα μετασχηματισμού κυττάρων του 15d-PGJ

2 επίσης επάγονται από τον αναστολέα HDAC, εξετάσαμε την επίδραση της 15d-PGJ

2 για HDAC στους δύο τύπους κυττάρων. Πρώτον, συγκρίναμε τα επίπεδα mRNA του HDAC1, 2 και 3 σε Α2780 και Α2780 /AD κύτταρα και βρήκαν ότι HDAC2 σημαντικά κατιούσα ρύθμιση στα ανθεκτικά κύτταρα συγκριτικά με κύτταρα άγριου τύπου (σχ. 6Α). Η θεραπεία με 15d-PGJ

2 ανέστειλε την HDAC1, 2 και 3 εκφράσεις mRNA σε δύο τύπους κυττάρων με δοσοεξαρτώμενο τρόπο (Εικ. 6Β και 6C). Τα αποτελέσματα ήταν πιο έντονη σε ανθεκτικά κύτταρα. Αυτές οι αναστολές δεν βρέθηκαν με κιγλιταζόνη και BAY-11-7082, αλλά υπήρξε μια αύξηση στην έκφραση HDAC1 μετά από NF-κΒ αναστολή με BAY-117082.

(Α) σε πραγματικό χρόνο δεδομένων qPCR δείχνουν τις διαφορές μεταξύ τα βασικά επίπεδα έκφρασης γονιδίου του HDAC 1, 2, και 3 σε Α2780 και Α2780 /AD κύτταρα. **

σ

& lt? 0,05 έναντι Α2780 κύτταρα. Επίδραση διαφορετικές θεραπείες σε γονίδια HDAC προσδιορίστηκαν σε Α2780 (Β) και κύτταρα Α2780 /AD (C) μετά από 48 ώρες επώασης. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SEM για 3 χωριστά πειράματα. Οι στατιστικά σημαντικές διαφορές σε σχέση με τους αντίστοιχους ελέγχους εμφανίζονται ως *

σ

& lt? 0,05 και **

σ

& lt?. 0.01

Η

15d-PGJ

2 αναστέλλει SIRT1 και HDAC ένζυμα δραστηριότητες λόγω ηλεκτρονιόφιλη άτομα άνθρακα της

από τη στιγμή που διαπίστωσε ότι 15d-PGJ

2 θα μπορούσε να αναστείλει την γονιδιακή έκφραση της SIRT1 και άλλες HDACs, αναρωτηθήκαμε αν 15d-PGJ

2 ήταν σε θέση να αναστέλλουν άμεσα αυτές τις δραστηριότητες ενζύμου. Χρησιμοποιήσαμε ένα υπόστρωμα ρ53 αλληλουχία που βασίζεται σε (Arg-His-Lys-Lys (e-ακετυλο) -AMC) δοκιμασία για να προσδιοριστεί δραστικότητα SIRT1 και για HDAC1 χρησιμοποιήσαμε ένα ακετυλιωμένο δοκιμασία λυσίνης υπόστρωμα που βασίζεται. Προκειμένου να βρεθεί αν η C9 ηλεκτρόφιλο άτομο άνθρακα είναι υπεύθυνο για τη δραστηριότητα, συμπεριλάβαμε το 15d-PGJ

2 ανάλογο CAY-10410 που δεν έχει την ηλεκτροφιλικότητα σε C9 (Σχ. 7Α). Βρήκαμε ότι η 15d-PGJ

2 ανέστειλε την δραστηριότητα SIRT1 δοσο-εξαρτώμενο τρόπο με έως και 71% αναστολή, ενώ CAY-10410 έδειξε μόνο μέτρια αναστολή του 23%, ενώ κιγλιταζόνη δεν έδειξε αναστολή καθόλου (Σχ. 7Β). Στην δοκιμασία ένζυμο HDAC1, 15d-PGJ

2 οδήγησε σε 40% αναστολή αλλά CAY-10410 και κιγλιταζόνη δεν έδειξαν καμία αναστολή (σχ. 7C).

(Α) Χημική δομές 15d-PGJ

2 (15-δεοξυ-Δ

12,14-προσταγλανδίνη J

2) και το ανάλογο του CAY-10410 (9,10-διυδρο-15-δεοξυ-Δ

12,14-προσταγλανδίνης J

2). Αστερίσκος δεικνύει το ηλεκτρόφιλο άτομα άνθρακα η οποία μπορεί να εμπλέκεται σε αντίδραση προσθήκης Michael. Πάνελ (Α) και (Β) δείχνουν τις εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση επιδράσεις της 15d-PGJ

2, CAY-10410 και κιγλιταζόνη στην δραστικότητα αποακετυλάσης του SIRT1 και HDAC1, αντίστοιχα χρησιμοποιώντας

in vitro δοκιμασίες

ενζύμου.

# P & lt? 0,01 έναντι κιγλιταζόνη,

† p & lt? 0,05 και

†† p & lt? 0,01 έναντι CAY-10410. (D) Επίδραση των CAY-10410 στην κυτταρική βιωσιμότητα Α2780 και Α2780 /AD κύτταρα όπως μετράται με ένα μπλε δοκιμασία Alamar. (Ε) Η θεραπεία με CAY-10410 (2,5 μΜ) δεν προκάλεσε μετασχηματισμό κυττάρων μετά από 48 ώρες επώασης. Μεγέθυνσης, 200 ×.

Η

εξετασθεί περαιτέρω κατά πόσον οι επιπτώσεις της 15d-PGJ

2 εμφανίστηκαν λόγω της ηλεκτρονιόφιλη άτομο C9, εξετάσαμε τις επιδράσεις της CAY-10410, λείπει ηλεκτροφιλία σε C9 άτομο άνθρακα, στη βιωσιμότητα των κυττάρων και μετασχηματισμού. Βρήκαμε ότι CAY-10410 έκαναν ούτε να προκαλέσει οποιαδήποτε κυτταρικό θάνατο, ούτε ο μετασχηματισμός των κυττάρων (Σχ. 7D και 7Ε).

Συζήτηση

Στην παρούσα μελέτη, έχουμε δείξει τις συνέπειες της 15d -PGJ

2, ένα προϊόν της δραστηριότητας κυκλοοξυγενάσης και ως ενδογενής αγωνιστής ΡΡΑΚγ, στην απόπτωση, αντοχή φαρμάκου, η μετανάστευση των κυττάρων και μετασχηματισμού των καρκινικών κυττάρων. Εξετάσαμε επιπτώσεις της στην άγριου τύπου καθώς και δοξορουβικίνη ανθεκτικά καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών.