Αφηρημένο

Υπόβαθρο

Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν να καταδείξει τον καρκίνο αντι-δέρματος και chemopreventive δυναμικό των 1,1-δις (3′-ινδολυλ) -1- (ρ-χλωροφαινυλ μεθάνιο) (DIM-D) χρησιμοποιώντας ένα in vitro μοντέλο.

Μέθοδοι

In vitro κυτταροτοξικότητα και οι δοκιμασίες βιωσιμότητας διεξήχθησαν σε κύτταρο επιδερμοειδούς καρκινώματος Α431 ανθρώπινη σειρά και με φυσιολογικά ανθρώπινα επιδερμικά κερατινοκύτταρα (ΝΗΕΚ) αντίστοιχα με χρώση κρυσταλλικού ιώδους. επαγωγή απόπτωσης σε κύτταρα Α431 (DIM-D θεραπεία) και τα κύτταρα προκατεργάστηκαν με ΝΗΕΚ DIM-D (2 ώρες) πριν από την ακτινοβολία UVB, αξιολογήθηκαν. Η συσσώρευση δραστικών μορφών οξυγόνου (ROS) σε DIM-D προκατεργασμένο κύτταρα ΝΗΕΚ (2 ώρες) πριν από την έκθεση UVB προσδιορίστηκε επίσης. Η ανοσοκυτταροχημεία και η ανάλυση στυπώματος Western για να προσδιοριστεί διασπασμένης κασπάσης 3 και του DNA δείκτες ζημιές σε DIM-D επεξεργασμένα κύτταρα Α431 και σε DIM-D προκατεργάστηκαν κύτταρα ΝΗΕΚ πριν την ακτινοβόληση UVB.

Αποτελέσματα

Η οι τιμές IC50 του DIM-D ήταν 68,7 ± 7,3, 48,3 ± 10,1 και 11,5 ± 3,1 μΜ ενώ για Επιγαλλοκατεχίνη (EGCG) ήταν 419,1 ± 8,3, 186,1 ± 5,2 και 56,7 ± 3,1 μΜ για θεραπείες 24, 48 και 72 ώρες αντίστοιχα. DIM-D εμφάνισαν σημαντικά (ρ & lt? 0,05) μεγαλύτερη επαγωγή της κατάτμησης του DNA σε κύτταρα Α431 σε σύγκριση με EGCG με ποσοστό κυτταρικού θανάτου του 38,9. Επιπλέον, DIM-D προκαλούμενη υψηλότερη έκφραση σε κύτταρα Α431 σε σύγκριση με EGCG της διασπασμένης κασπάσης 3 (3.0-φορές έναντι 2,4 φορές μεταβολές), Nurr1 (2.7-φορές έναντι 1,7 φορές μεταβολές) και ΝΡκΒ (1,3 φορές vs . αλλαγές 1,1 φορές). DIM-D παρουσίασε επίσης χημειοπροληπτική δραστηριότητα στην UVB-ακτινοβολημένα κύτταρα ΝΗΕΚ από σημαντικά (p & lt? 0,05) μείωση της UVB που προκαλείται από το σχηματισμό ROS και την απόπτωση σε σύγκριση με EGCG. Επιπλέον, DIM-D επαγόμενη έκφραση Nurr1 αλλά μειωμένη έκφραση των 8-OHdG σημαντικά στην UVB-ακτινοβολημένα κύτταρα ΝΗΕΚ σε σύγκριση με EGCG και UV μόνο. ​​

Συμπέρασμα

Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η DIM-D παρουσιάζει Nurr1-εξαρτώμενη τρανσενεργοποίηση στην επαγωγή της απόπτωσης σε κύτταρα Α431 και προστατεύει τα κύτταρα ΝΗΕΚ κατά του σχηματισμού και βλάβες στο DNA ROS UVB που προκαλείται

Παράθεση:. Boakye CHA, Doddapaneni R, Shah PP, Patel AR, Godugu C , Ασφαλής S, et al. (2013) Χημειοπρόληψη του καρκίνου του δέρματος με 1,1-δις (3′-ινδολυλ) -1- (Αρωματικό) Μεθάνιο Αναλογική μέσω της επαγωγής της ορφανών πυρηνικών υποδοχέων, NR4A2 (Nurr1). PLoS ONE 8 (8): e69519. doi: 10.1371 /journal.pone.0069519

Επιμέλεια: Rajvir Dahiya, UCSF /VA Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 8 Μαΐου του 2013? Αποδεκτές: 11, Ιουν, 2013? Δημοσιεύθηκε: 7, Αυγούστου 2013

Copyright: © 2013 Boakye et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Κέντρο για Μειονοτικά υγείας και της υγείας ανισότητες επιχορήγηση P20 MD 006738-01 και SC-1 επιχορήγηση 5SC1CA161676-03 από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

εμφάνισης καρκίνου του δέρματος έχει αυξηθεί και πάνω από 2 εκατομμύρια νέες περιπτώσεις διαγιγνώσκονται κάθε χρόνο στις Ηνωμένες Πολιτείες [1]. Έχει υπολογιστεί ότι ένα στα πέντε Καυκάσου Αμερικανοί θα αναπτύξει καρκίνο του δέρματος, τουλάχιστον μία φορά κατά τη διάρκεια της ζωής του /της [2]. Το μελάνωμα είναι η πιο σοβαρή μορφή καρκίνου του δέρματος και αντιπροσωπεύει το 5% του συνόλου των περιπτώσεων καρκίνου του δέρματος στην Αμερική, είναι υπεύθυνη για το μεγαλύτερο μέρος των θανάτων από καρκίνο του δέρματος [3], [4], με επίπτωση εκτιμάται σε 2,36 δισεκατομμύρια $ το 2010 [5]. Η αυξανόμενη συχνότητα εμφάνισης καρκίνου του δέρματος αναμένεται να συνεχιστεί καθώς ο πληθυσμός γερνάει, μεγαλύτερες ποσότητες υπεριώδους ακτινοβολίας φτάνουν στην επιφάνεια της γης λόγω της καταστροφής της στιβάδας του όζοντος, καθώς και η συνεχής χρήση του μαυρίσματος συσκευές [6], [7], [ ,,,0],8].

οι μελέτες έχουν δείξει ότι η επίμονη έκθεση στο ηλιακό φως είναι ένας σημαντικός παράγοντας κινδύνου για την ανάπτυξη τόσο του καρκίνου του δέρματος nonmelanoma (NMSC) και το μελάνωμα οφείλεται σε ζημιογόνες επιπτώσεις της ακτινοβολίας UVB που παραβιάζει το επιδερμικό στρώμα του δέρματος [ ,,,0],9], [10]. Η έναρξη και την πρόοδο της καρκινογένεσης του δέρματος εμπλέκει μία σύνθετη αλληλουχία κυτταρικών και μοριακών γεγονότων που προκύπτουν από την αρχική παραγωγή δραστικών ειδών οξυγόνου (ROS) από την ακτινοβολία UVB [11], [12], [13] και τα αποτελέσματα σε βλάβη των κερατινοκυττάρων DNA και μετάλλαξης συμπεριλαμβανομένου του σχηματισμού διμερών κυκλοβουτανίου πυριμιδίνης (CPD). Μελέτες έχουν δείξει ότι υπάρχει επίσης σημαντική ζημία που προκλήθηκε στα λιπίδια του δέρματος και των πρωτεϊνών κατά την έκθεση UVB [14], [15].

Πολλά φυτοχημικά και τα συνθετικά ανάλογα έχουν τη δυνατότητα να ανατρέψει ή /και να μειώσει την εμφάνιση και εξέλιξης της καρκινογένεσης του δέρματος και την αγγειογένεση [16], [17]. Αυτά τα φυτοχημικά είναι κυρίως πολυφαινόλες, οι οποίες περιλαμβάνουν αλλά δεν περιορίζονται σε σιλυμαρίνη, επιγαλλοκατεχίνη 3-gallate (EGCG), η κουρκουμίνη, μυρικετίνη, quercetin και εσπεριτίνη. EGCG είναι μια πλούσια σε πολυφαινόλες που υπάρχουν στο εκχύλισμα πράσινου τσαγιού και είναι ένα ισχυρό αντιοξειδωτικό φλαβονοειδές που έχει χημειοπροληπτικές δυναμικό [18]. EGCG μπορεί να επάγει διακοπή του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης σε κύτταρα ηπατώματος με επαγωγή ρ53 και Fas /FasL αποπτωτικό μονοπάτι αντίστοιχα [19]. Η κυτταροτοξικότητα του EGCG in vitro απαιτεί σχετικά υψηλές συγκεντρώσεις [20] τα οποία δεν επιτυγχάνονται εύκολα στον ορό και οι δύο από το στόμα και τοπικά σκευάσματα του EGCG επιδεικνύουν ελάχιστη προστασία κατά της φωτογήρανσης και UV-επαγόμενης φλεγμονωδών αποκρίσεων στο δέρμα [21], [22] , [23].

3,3′-Diindolylmethane (DIM) (Εικ. S1) είναι ένα φυσικό προϊόν που προέρχεται από ινδόλη-3-καρβινόλη (I3C), η οποία είναι παρούσα σε σταυρανθή λαχανικά, όπως τα λαχανάκια Βρυξελλών, το μπρόκολο και το κουνουπίδι. DIM έχει προκαλέσει μεγάλο ενδιαφέρον στην έρευνα του καρκίνου λόγω της χαμηλής τοξικότητάς της και κυτταροτοξικά αποτελέσματα επί καρκινικών κυττάρων in vitro και αναστολή της ανάπτυξης του όγκου in vivo [24]. Για παράδειγμα, DIM επαγόμενη έκφραση του αναστολείς του κυτταρικού κύκλου, όπως ρ21 και ρ27 και ρυθμίζεται προς τα κάτω-κυκλίνης πρωτεΐνες που περιλαμβάνουν κυκλίνη D1 και μειώθηκε επίσης έκφραση της επιβίωσης και αντιαποπτωτικών πρωτεΐνες συμπεριλαμβανομένων survivin, bcl-2, Βαχ και επαγόμενη πολυ (ADP-ριβόζη) πολυμεράσης ( PARP) διάσπαση, μιτοχονδριακή απελευθέρωση του κυτοχρώματος c και προκασπάσης διάσπασης [25], [26], [27]. Μια σειρά νέων συνθετικών 1,1-δις (3′-ινδολυλ) -1- (ρ-υποκατεστημένο φαινύλιο) αναλόγων μεθάνιο (C-των DIM), είναι επίσης ισχυροί αντικαρκινικοί παράγοντες [25], [28], [29] και δραστηριότητές τους είναι δομή-εξαρτώμενη. Τα παράγωγα ρ-τ-βουτυλφαινυλ και ρ-διφαινυλο ενεργοποιούν υπεροξυσωμάτων υποδοχέα γ που ενεργοποιείται από πολλαπλασιαστή (ΡΡΑΚγ), ενώ οι μη υποκατεστημένες ρ-φαινύλιο και ρ-μεθοξυφαινύλιο αναλόγων ενεργοποιούν το NR4A1 ορφανό υποδοχέα (Nurr77 /TR3) [30]. Μελέτες στο εργαστήριο μας έχουν αναφέρει μια συνεργική επίδραση μεταξύ 1,1-δις (3′-ινδολυλ) -1- (ρ-διφαινυλ) μεθάνιο (DIM-C-pPhC6H5) και Docetaxel σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων μέσω ενισχυμένης επαγωγής της διασπασμένης ΡΑΚΡ, bax και Ν-καντερίνης και της αναστολής της φωσφο-Ακί, κυκλίνη D1, survivin, NF-kB, Mcl-1 και φωσφο JNK2 [29], [31].

Ένα μέλος του νεύρου αυξητικός παράγοντας IB Nurr1 (NR4A2) είναι ένας άλλος υποδοχέας NR4A, η οποία έχει εμπλακεί σε διάφορες ορμονικές, φυσιολογικές και παθοφυσιολογικές διεργασίες συμπεριλαμβανομένης καρδιαγγειακές, νευρολογικές και μεταβολικές ασθένειες, φλεγμονή και ογκογένεση. Nurr1 παίζει ρόλο στη λειτουργία του εγκεφάλου και ως εκ τούτου έχει συνδεθεί με τη νόσο του Αλτσχάιμερ, η νόσος Σχιζοφρένεια και του Parkinson [32]. Nurr1 εκφράζεται υψηλά σε PANC1 και Pan28 παγκρεατική και μερικές ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου της ουροδόχου κύστης [28], [33]. Σε αυτή τη μελέτη, απεικονίζουν τη σημασία της Nurr1 στην χημειοπροληπτική δυναμικό της 1,1-δις (3′-ινδολυλ) -1- (ρ-χλωροφαινυλ μεθάνιο) (DIM-D) στον καρκίνο του δέρματος χρησιμοποιώντας ένα in vitro UVB επαγόμενη δέρμα μοντέλο καρκίνου. DIM-D έχει δειχθεί ότι επάγει Nurr1 εξαρτώμενη τρανσενεργοποίηση και τα αποτελέσματα της μελέτης μας δείχνουν ένα πιθανό ρόλο για DIM-D /Nurr1 στην χημειοπροφύλαξη του καρκίνου του δέρματος.

Υλικά και Μέθοδοι

1. Υλικά |

p-Υποκατεστημένες C-ΔΗΜ ανάλογα (DIM-C-pPhCl? DIM-D), (DIM-C-pPhCN? DIM-Β) και (DIM-C-pPhBr? DIM-C) ήταν συντέθηκε όπως περιγράφεται [36]. EGCG αγοράστηκε από Σέλεκ Χημικών Προϊόντων (Houston, TX, USA). Α431 ανθρώπινων κυττάρων επιδερμοειδούς καρκινώματος γραμμή και φυσιολογικά ανθρώπινα επιδερμικά κερατινοκύτταρα (ΝΗΕΚ) αποκτήθηκαν από την Invitrogen (Grand Island, ΝΥ, USA). Φωσφορικό ρυθμισμένο αλατούχο διάλυμα (PBS) αγοράστηκε από την Invitrogen. Η (Nurr 1) αντίσωμα NR4A2 ελήφθη από την Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). Τα αντισώματα που κατευθύνονται έναντι 8-υδροξυ deguanosine (8-OHdG), CCAAT /-enhancer- δεσμευτική πρωτεΐνη ομόλογη πρωτεΐνη (CHOP), πυρηνικό παράγοντα κάππα-ελαφριάς αλυσίδας-ενισχυτής των ενεργοποιημένων Β κυττάρων (ΝΡ-κΒ) και διασπασμένη κασπάση 3 ήταν επίσης, λαμβάνονται από την Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA).

2. Οι κυτταρικές σειρές και κυτταρικές καλλιέργειες

κύτταρα Α431 διατηρήθηκαν σε μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco (DMEM? Sigma Aldrich, St Louis, ΜΟ) θρεπτικό μείγμα συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) από την Invitrogen (Grand Island, ΝΥ ) και αντιβιοτικό-αντιμυκητιασικό μίγματος που περιλαμβάνει πενικιλλίνη (5000 U /ml), στρεπτομυκίνη (0.1 mg /mL), και νεομυκίνη (0.2 mg /mL) από την Sigma Aldrich (St Louis, ΜΟ, USA) στους 37 ° C παρουσία του 5% CO

2 και 95% σχετική υγρασία. κύτταρα ΝΗΕΚ διατηρήθηκαν σε μέσο Epilife (Invitrogen, Grand Island, ΝΥ, USA) και διατηρήθηκαν από οποιοδήποτε συμπλήρωμα του επιδερμικού αυξητικού (EDGS) ή ανθρώπινο κερατινοκυττάρων συμπλήρωμα ανάπτυξης (HKGS) από την Invitrogen (Grand Island, ΝΥ) και αντιβιοτικό-αντιμυκητιασικό μίγματος που περιλαμβάνει πενικιλλίνη (5000 U /mL), στρεπτομυκίνη (0.1 mg /mL), και νεομυκίνη (0.2 mg /mL) από την Sigma Aldrich (St Louis, ΜΟ) στους 37 ° C. Και οι δύο γραμμές κυττάρων ήταν υπο καλλιεργήθηκαν όταν περίπου 80-90% συρρέοντα με 0,25% θρυψίνη-ΕϋΤΑ (Invitrogen? Grand Island, ΝΥ). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν επί 1,12 cm

2 0.4 μm πόρου από πολυανθρακικό ένθετα μεμβράνης σε 12 mm × 12 διαπερατό-transwell πλακών στήριξης (Corning, ΝΥ).

3.

In vitro

κυτταροτοξικότητα και Βιωσιμότητας Δοκιμασίες

κυτταροτοξικότητα και οι δοκιμασίες κυτταρικής βιωσιμότητας διεξήχθησαν σε Α431 και κύτταρα ΝΗΕΚ αντίστοιχα χρησιμοποιώντας το συμβατικό προσδιορισμό χρώσης με κρυσταλλικό ιώδες. Τα κύτταρα Α431 και ΝΗΕΚ ήταν και οι δύο εμβολιάστηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων (10

4 κύτταρα /φρεάτιο) και επωάστηκαν όλη τη νύκτα σε 5% CO

2 στους 37 ° C. Τα κύτταρα Α431 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τον έλεγχο διαλύτη (DMSO) και διάφορες συγκεντρώσεις DIM-Β, DIM-C και DIM-D και EGCG, ενώ τα κύτταρα ΝΗΕΚ εκτέθηκαν σε UVB ακτινοβολία (150 J /m

2) 2 ώρες μετά την αγωγή και στη συνέχεια επωάστηκαν για 24 ώρες σε μέσο ανάπτυξης. Τα κύτταρα Α431 σε μίγμα φαρμάκου και των μέσων ενημέρωσης επωάστηκαν για 24, 48 και 72 ώρες. Τα βιώσιμα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με γλουταραλδεΰδη και χρωματίζονται με κρυσταλλικό ιώδες επί 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Το κρυσταλλικό ιώδες πλύθηκε? Το υπόλειμμα διαλυτοποιήθηκε με όξινο φωσφορικό νάτριο και η απορρόφηση μετρήθηκε με φασματοφωτόμετρο σε μήκος κύματος 462 nm. Η βιωσιμότητα των κυττάρων ΝΗΕΚ σε επεξεργασία με C-Αυξάνει ή μειώνει EGCG εκφράστηκαν ως ποσοστά της απορρόφησης των κυττάρων ελέγχου, τα οποία θεωρήθηκαν ως 100% βιώσιμα και IC50 τιμές προσδιορίστηκαν με τον ακόλουθο τύπο, [(50- χαμηλότερη kill) /(υψηλότερη kill – χαμηλότερη kill) * (υψηλότερη πυκνό -. χαμηλότερη πυκνό)] + χαμηλότερη πυκνό

4… TUNEL Δοκιμασία

κύτταρα Α431 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 34,4 μΜ DIM-D (50 τοις εκατό της αξίας IC50) και επωάστηκαν για 24 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα PBS και μονιμοποιήθηκαν σε 10% φορμαλδεΰδη σε μικροσκοπική πλευρές. Η ApoTag Red

In Situ

kit® ανίχνευσης απόπτωσης (Millipore, Billerica, ΜΑ) χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση της απόπτωσης σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα σταθεροποιημένα κύτταρα επωάστηκαν σε διάλυμα πρωτεϊνάσης Κ 20 μg /mL για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, που ακολουθείται από επώαση με ρυθμιστικό διάλυμα εξισορρόπησης για 10 δευτερόλεπτα. Τα κύτταρα πλύθηκαν σε PBS και επωάστηκαν με ένζυμο TdT στους 37 ° C για 1 ώρα σε υγροποιημένο θάλαμο για ενσωμάτωση συζευγμένων νουκλεοτιδίων στο 3′-ΟΗ άκρα του DNA. Τα σταθερά κύτταρα πλύθηκαν σε PBS και επωάστηκαν με διάλυμα συζυγούς αντι-διγοξιγενίνης (Rhodamine Αντίσωμα) και αντίθετα με DAPI. Οι μικροσκοπικές εικόνες των σταθερών κυττάρων στις πλάκες οπτικοποιούνται με ένα οπτικό μικροσκόπιο της Olympus BX40 εξοπλισμένο με μια ψηφιακή φωτογραφική μηχανή που ελέγχεται από υπολογιστή (DP71, Κοιλάδα του Ολύμπου Κέντρο, PA, USA). κατάτμηση DNA υποδείχθηκε από ροδαμίνη θετική χρώση (κόκκινο). Τα μη επεξεργασμένα κύτταρα διατηρήθηκαν ως μάρτυρες.

5. Ακριδίνης πορτοκαλί /βρωμιούχου αιθιδίου χρώση

Μορφολογικές αλλαγές σε πυρήνες κυττάρων ΝΗΕΚ μετά από έκθεση σε ακτινοβολία UVB προσδιορίστηκε για την αξιολόγηση των προστατευτικά αποτελέσματα των DIM-D και EGCG στα εκτεθειμένα κύτταρα. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 96 φρεατίων πλάκα (10

4 κύτταρα /φρεάτιο) και υποβλήθηκε σε επεξεργασία για 2 ώρες με διαφορετικές συγκεντρώσεις διαλυμάτων DIM-D και EGCG σε DMSO πριν από την έκθεση στην ακτινοβολία UVB κατά δόση των 150 mJ για 30 δευτερόλεπτα. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν σε μέσο ανάπτυξης για 24 ώρες και χρώση διεξήχθη με πορτοκαλί της ακριδίνης /βρωμιούχο αιθίδιο (AO /EB), όπως περιγράφεται [34] και αναλύθηκε με μικροσκοπία φθορισμού. Εν συντομία, η διαφορική πρόσληψη των δύο χρωστικές χρησιμοποιήθηκε για να εξακριβωθεί κύτταρα βιωσιμότητα. Μετά από επώαση για 24 ώρες, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS (2Χ) και βάφτηκαν με ένα μίγμα ακριδίνης πορτοκαλί και βρωμιούχο αιθίδιο.

6. Προσδιορισμός των ενδοκυττάριων αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS)

Η φθορίζουσα χρωστική, 2 ‘, 7’-διχλωρο διοξεικό (DCF-DA) χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογηθεί η συσσώρευση των ROS στα κύτταρα μετά από έκθεση ΝΗΕΚ UVB. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 24 φρεατίων πλάκα με πυκνότητα 0,05 × 10

6 κύτταρα /φρεάτιο, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις DIM-D και EGCG σε DMSO επί 2 ώρες, αναρροφάται ένα λεπτό υμένιο του PBS προστέθηκε και τα κύτταρα Στη συνέχεια εκτίθενται σε ακτινοβολία UVB δόση ακτινοβολίας των 150 mJ για 30 δευτερόλεπτα. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν για 24 ώρες σε μέσο ανάπτυξης μόνο. διάλυμα DCF-DA (10 μΜ) προστέθηκε στα κύτταρα (0,05 χ 10

6 /mL) και το μίγμα επωάζεται στους 37 ° C για 1 ώρα στο σκοτάδι. Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS (2Χ) και η ένταση του φθορισμού των κυττάρων προσδιορίσθηκε με μικροσκοπία φθορισμού.

7. Η ανοσοκυτταροχημική ανάλυση

Τόσο Α431 και κύτταρα ΝΗΕΚ υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DIM-D και EGCG (34,4 μΜ και 210,0 μΜ αντιστοίχως) και επωάστηκαν για 24 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν σε 10% φορμαλδεΰδη και κυτταρόνημα σε μικροσκοπικές διαφάνειες. Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε ακολουθώντας το πρωτόκολλο που ορίζεται στην SignalStain

TM IHC σετ (Cell Signaling, Beverly, ΜΑ). Σταθερή κύτταρα ενυδατώνονται με ποικίλες συγκεντρώσεις αλκοόλης και PBS (3Χ), επωάστηκαν με τα πρωτογενή αντισώματα εναντίον διασπασμένη κασπάση 3, Nurr1 και 8-OHdG όλη τη νύκτα στους 4 ° C και ανιχνεύθηκαν με συζευγμένο με HRP δευτερογενές αντίσωμα. Τα κύτταρα βάφτηκαν με Nova Red λεκέ και αντίθετα με αιματοξυλίνη. Μικροσκοπική ανάλυση των σταθερών κυττάρων πραγματοποιήθηκε με οπτικό μικροσκόπιο της Olympus BX40 εξοπλισμένο με ψηφιακή φωτογραφική μηχανή που ελέγχεται από υπολογιστή (DP71, Κοιλάδα του Ολύμπου Κέντρο, PA, USA).

8. Western blot ανάλυση

Οι πρωτεΐνες συλλέχθηκαν τόσο από Α431 και ΝΗΕΚ κύτταρα όπως περιγράφεται [33]. Εν συντομία, μετά από 24 ώρες κατεργασίας με DIM-D (17,2 μΜ) και EGCG (104,8 μΜ), τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ρυθμιστικό διάλυμα RIPA (50 ηΜ Tris-HCl, ρΗ 8.0, με 150 mM χλωριούχο νάτριο, 1,0% Igepal CA-630 ( ΝΡ-40), 0,5% deoxychlorate νάτριο, και 0,1% δωδεκυλοθειικό νάτριο) με αναστολέα πρωτεάσης (500 mM φαινυλομεθυλοσουλφονυλοφθορίδιο). Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν σύμφωνα με BCA πρωτόκολλο αντιδραστήριο δοκιμασίας πρωτεΐνης (Pierce, Rockford, IL) και η τυπική πλοκή δημιουργήθηκε με χρήση λευκωματίνης βόειου ορού, 50 μg του υπερκειμένου πρωτεΐνης από την ομάδα ελέγχου και όλα τα διαφορετικά δείγματα μεταχείριση μετουσιώθηκαν με βρασμό σε 100 ° C για 5 λεπτά σε ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος SDS και στη συνέχεια σε ηλεκτροφόρηση σε 10% πήκτωμα SDS-PAGE, μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης, αποκλείστηκαν με 5% αποβουτυρωμένο γάλα σε ισοτονικό ρυθμιστικό διάλυμα Τπδ με Tween 20 (10 mM Tris-HCl (ρΗ 7.6 ), 150 mM NaCl, και 0.5% Tween), και ανιχνεύθηκαν με αντισώματα έναντι Nurr1 (1:400), ΝΡκΒ (1:500) και διασπασμένη κασπάση 3 (1:1000) για τα κύτταρα Α431. Πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν με συζευγμένο με HRP δεύτερα αντισώματα χρησιμοποιώντας SuperSignal West Pico διαλύματος χημιφωταύγειας (Pierce, Rockford, IL). Ποσοτικοποίηση και ανάλυση των αποτελεσμάτων διεξήχθησαν με λογισμικό J εικόνας (v1.33u, ΝΙΗ, USA). Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως ποσοστό αναλογίες της πρωτεϊνικής έκφρασης σε β-ακτίνη (οριστεί σε 100%).

9. Στατιστική ανάλυση

Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± Τ.Α για τουλάχιστον τρεις επαναλήψεις και συγκρίσεις μεταξύ πολλαπλών ομάδων ιδρύθηκε από μια μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) και μεταξύ δύο ομάδων με ανάλυση t δοκιμή Student. Μια τιμή p & lt? 0,05 θεωρήθηκε σημαντική

Αποτελέσματα

1.. Αντικαρκινική δράση του DIM αναλόγων

1.1 Επίδραση των αναλόγων DIM στο Α431 καρκινικών κυττάρων του δέρματος.

κύτταρα Α431 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τρία διαφορετικά ανάλογα DIM, τα οποία διαφέρουν δομικώς στη θέση ρ-φαινύλιο (Σχ. S1). Κύτταρα Α431 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DIM-Β για 24, 48 και 72 ώρες και οι τιμές IC50 για την κυτταροτοξικότητα ήταν 56,8 ± 10,7, 30,8 ± 6,6 και 7,2 ± 1,2 μΜ αντιστοίχως (Εικ. 1Α). Οι τιμές IC50 για DIM-C μετά τη θεραπεία για 24, 48 και 72 ώρες ήταν 78,3 ± 16, 50,2 ± 12,2 και 7,2 ± 1,5 μΜ αντιστοίχως και οι αντίστοιχες τιμές IC50 για DIM-D ήταν 68,7 ± 27,3, 48,3 ± 11,5 ± 10.1and 3.1 μΜ μετά τη θεραπεία για 24, 48 και 72 ώρες. Αντίθετα, οι τιμές IC50 για EGCG μετά τη θεραπεία για 24, 48 και 72 ώρες ήταν 419.1 ± 8.3, 186.1 ± 5.2 και 56.7 ± 3.1 μΜ, αντίστοιχα (Εικ. 1Β), οι οποίες ήταν σημαντικά υψηλότερα από αυτά που παρατηρήθηκαν για το C-των DIM (Πίνακας 1) . Και οι τρεις ΔΗΜ παράγωγα έδειξαν μεγαλύτερη δραστικότητα από την EGCG με μικρές παραλλαγές μεταξύ τους ικανότητες. DIM-Δ ωστόσο επιλέγονται για περαιτέρω μελέτες ως ένα μοντέλο φαρμάκου, επειδή εμφάνισε περισσότερο από φωτοσταθερότητα DIM-Β και DIM-C.

(Α) προφίλ κυτταροτοξικότητα (Οικόπεδο% κυτταρικό θάνατο vs συγκέντρωση του φαρμάκου στο Α ) 24 ώρες, Β) 48 ώρες και C) 72 ώρες, όπου, DIM-Β = DIM-C-pPhCN, DIM-C = DIM-C-pPhBr και DIM-D = DIM-C-pPhCl). Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD. (Β) προφίλ κυτταροτοξικότητα (Οικόπεδο% κυτταρικό θάνατο vs συγκέντρωση του φαρμάκου) σε A) 24 ώρες, Β) 48 ώρες, C) 72 ώρες για EGCG σε κύτταρα Α431.

Η

1.2 αποπτωτική δραστηριότητα της DIM-D εναντίον κυττάρων Α431.

Τα αποτελέσματα της DIM-D σε απόπτωση σε κύτταρα Α431 εξετάστηκαν με τη μέθοδο TUNEL χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής. Κύτταρα Α431 σε επεξεργασία με DIM-D (34,4 μΜ) για 24 hr σημαντικά επαγόμενο κυτταρικό θάνατο (38,9%) σε σύγκριση με τον έλεγχο DMSO (Εικ. 2Α). Ερευνήσαμε επίσης τα αποτελέσματα της DIM-D και EGCG στο DNA κατακερματισμό των Α431 κυττάρων χρησιμοποιώντας τη μέθοδο TUNEL με μικροσκοπική ανάλυση (Σχ. 2Β). Σε κύτταρα ελέγχου που έλαβαν θεραπεία με PBS, ελάχιστη κατακερματισμού του DNA παρατηρήθηκε ενώ DIM-D σημαντικά αυξημένη κατάτμηση του DNA, όπως αποδεικνύεται από την αυξημένη κόκκινο φθορισμό. Ομοίως, EGCG (104,8 μΜ) αύξησε επίσης τον κατακερματισμό του DNA, αλλά συγκριτικά λιγότερο χρόνο σε σύγκριση με DIM-D (Σχ. 2Β).

(Α) Ανίχνευση των αποπτωτικών κυττάρων με τη μέθοδο TUNEL χρησιμοποιώντας ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Κύτταρα Α431 χρωματίστηκαν για αποπτωτικά κύτταρα με FITC με την μέθοδο TUNEL πριν και μετά τη θεραπεία 24 ώρες. (I) οικόπεδο Dot απεικονίζει FSC έναντι SSC προφίλ των κυττάρων μετά τη θεραπεία. (Ii) Dot οικόπεδο που απεικονίζει το προφίλ του FITC φθορισμού έναντι FSC για τα κύτταρα μετά τη θεραπεία. Οι περισσότερες από τις TUNEL-χρώση αποπτωτικών κυττάρων είναι ελαφρώς μικρότερα από μη χρωματισμένα ζωντανά κύτταρα. (Iii) Ιστόγραμμα που απεικονίζει κύτταρα πριν από τη θεραπεία στην πύλη R1. Πολύ λίγες αποπτωτικά κύτταρα ανιχνεύθηκαν. (Iv) Ιστόγραμμα που απεικονίζει κύτταρα μετά την επεξεργασία με DIM-D (DIM-C-pPhCl) στην πύλη R1. Τα αποπτωτικά κύτταρα (έντονα χρωματισμένο με TUNEL) ανιχνευθεί. (Β) Ανίχνευση των αποπτωτικών κυττάρων με τη μέθοδο TUNEL χρησιμοποιώντας μικροσκοπική ανάλυση. Κύτταρα Α431 χρωματίστηκαν για αποπτωτικά κύτταρα με ροδαμίνη με την μέθοδο TUNEL για θεραπεία 24 ώρες. Τα κύτταρα αντίθετα με χρωστική Hoechst (DAPI).

Η

1.3 Επίδραση της DIM-D για αποπτωτικών πρωτεϊνών και Nurr1.

κύτταρα Α431 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 34,4 μΜ DIM-D και 104,8 μΜ EGCG επί 24 ώρες και ολόκληρο κυτταρολύματα αναλύθηκαν με κηλίδες Western (Εικ. 3Α). DIM-D σημαντικά επαγόμενη έκφραση διασπαστεί (ενεργοποιημένης) πρωτεΐνες κασπάσης-3 και Nurr1 και παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν για EGCG. Η ποσοτικοποίηση αυτών των αποτελεσμάτων (Σχ. 3Β) έδειξαν ότι DIM-D ήταν πιο ισχυρό ότι EGCG ως επαγωγέα της διασπασμένης κασπάσης-3 (3,0 φορές έναντι 2,4 φορές) και Nurr1 (2,7 φορές έναντι 1,7 φορές), ενώ αποτελέσματα επί ΝΡκΒ (ρ65) ήταν ελάχιστες (1,3 φορές έναντι 1,1 φορές). Έκφραση διασπασμένης κασπάσης-3 και Nurr1 σημαντικά επάγεται από DIM-D και EGCG (ρ & lt? 0,05). DIM-D (34,4 μΜ) και EGCG (104,8 μΜ) επίσης επαγόμενη έκφραση CHOP όπως υποδεικνύεται από ανοσοχρώση των κυττάρων Α431 μετά από θεραπεία για 24 ώρες (Σχ. 3C). Η ποσοτικοποίηση αυτών των αποτελεσμάτων έδειξαν σημαντική αύξηση του CHOP θετικώς χρωματισμένων κυττάρων (79%) σε κύτταρα κατεργασμένα DIM-D, σε σύγκριση με το 67% των κυττάρων βάφονται θετικά μετά τη θεραπεία EGCG. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι το αντι-δέρμα καρκινογόνο δυνατότητα DIM-D είναι μεγαλύτερο από EGCG υπό ταυτόσημες συνθήκες.

(Α) Εκφραση διασπασμένης κασπάσης 3, Nurr1 και ΝΡκΒ σε σύγκριση με τον έλεγχο β-ακτίνης σε Dim -D και EGCG επεξεργασμένα κύτταρα Α431 με κηλίδα western. Τα μη επεξεργασμένα κύτταρα διατηρήθηκαν ως έλεγχος. (Β) ανάλυση κηλίδας Western της έκφρασης διαφορετικών πρωτεϊνών αυξήθηκε σημαντικά σε κύτταρα κατεργασμένα DIM-D. (Γ) ICC χρώση υπεροξειδάσης κυττάρων Α431 σε επεξεργασία με DIM-D και EGCG, αντίστοιχα, για την προ-αποπτωτική πρωτεΐνη, CHOP. χρώση καφέ θεωρήθηκε θετικό αποτέλεσμα. Τα μη επεξεργασμένα κύτταρα διατηρήθηκαν ως έλεγχος. Τα δεδομένα υπολογίζονται από πειράματα εις τριπλούν και παρουσιάζονται ως μέσος όρος, και οι ράβδοι σφάλματος αναφέρονται σε SD, * P & lt? 0.05, ** P & lt? 0,01 σε σύγκριση με τον έλεγχο

Η

2.. Χημειοπροληπτική δραστηριότητα της DIM-D σε φυσιολογικά ανθρώπινα επιδερμικά κερατινοκύτταρα (ΝΗΕΚ) κύτταρα

2.1 κυτταροτοξική δράση της DIM-D στα κύτταρα ΝΗΕΚ.

Για να διερευνήσει τις επιπτώσεις της DIM-D κατά την κανονική τα κύτταρα του δέρματος, τα κύτταρα ΝΗΕΚ υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις DIM-D (15 έως 140 μΜ) για 24 ώρες και τα αποτελέσματα έδειξαν ότι DIM-D ήταν ελάχιστα τοξικές για τα κύτταρα ΝΗΕΚ (Σχ. 4Α). Κατά τη μέγιστη συγκέντρωση 140 μΜ, το ποσοστό κυτταρικού θανάτου ήταν 56,2 ± 1,3 ενώ στη συγκέντρωση IC50 (68,7 ± 7,3 μΜ) παρατηρήθηκε σε κύτταρα Α431, κυτταρικός θάνατος ΝΗΕΚ μειώθηκε σε 48,7 ± 2,1%. Ως εκ τούτου, η συγκέντρωση της DIM-D 68,7 ± 7,3 μΜ χρησιμοποιήθηκε για όλες τις μετέπειτα έρευνες. Από την άλλη πλευρά, η έκθεση των προεπεξεργασμένων κυττάρων ΝΗΕΚ στην υπεριώδη ακτινοβολία, η μειωμένη βιωσιμότητα των κυττάρων περαιτέρω. Αυτό, ωστόσο, δεν ήταν σημαντική, με αύξηση σε ποσοστό κυτταρικού θανάτου σε 67,5 ± 2,6 και 65,9 ± 3,1 για 140 μΜ και 68,7 μΜ, αντίστοιχα (Σχ. 4Α).

(Α) Γραμμή γράφημα του προφίλ κυτταροτοξικότητας (Οικόπεδο% κυτταρικό θάνατο vs συγκέντρωση του φαρμάκου) κυττάρων ΝΗΕΚ σε επεξεργασία με DIM-D (DIM-C-pPhCl) σε διάφορες συγκεντρώσεις με και χωρίς ακτινοβολία UVB. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD. (Β) η παραγωγή δραστικών μορφών οξυγόνου (ROS) με DIM-D και θεραπεία EGCG πριν από την έκθεση UVB. Κάθε τιμή εκφράζεται ως η μέση ± τυπική απόκλιση. (C) υδροξυλομάδα ριζών σε μία in vitro θεραπεία σύστημα ελεύθερο κυττάρων με DIM-D. Τα δεδομένα εκφράζονται σε όρους ποσοστού ελέγχου, στην οποία το ελεύθερο κυττάρων σύστημα δεν υποβλήθηκε σε επεξεργασία με DIM-D. (Δ) προσδιορισμός απόπτωση σε κύτταρα ΝΗΕΚ αντιμετωπίζονται με DIM-D (DIM-C-pPhCl) και EGCG σε διαφορετικές συγκεντρώσεις.

Η

2.2 Αντι-οξειδωτικό δυναμικό και αποπτωτική δράση της DIM-D στα κύτταρα ΝΗΕΚ .

Η αντιοξειδωτική δράση της DIM-D και την προστασία από την υπεριώδη προκαλείται από ROS διερευνήθηκε επίσης σε κύτταρα ΝΗΕΚ αντιμετωπίζονται με 34,4 μΜ DIM-D και 209,6 μΜ EGCG για 24 ώρες. Οι UVB που προκαλείται από τα επίπεδα ROS στα κύτταρα ΝΗΕΚ προεπεξεργασία με DIM-D ήταν σημαντικά μειωμένη σε σύγκριση με EGCG? αυτό αποδεικνύει ότι DIM-D έχει πιο ισχυρή αντιοξειδωτική δράση από EGCG (σχ. 4Β). Επιπλέον, η ικανότητα των DIM-D σε σκουπίζω υδροξυλίου (-ΟΗ) ριζών σε ένα ελεύθερο κυττάρων in vitro σύστημα χρησιμοποιήθηκε για να επιβεβαιώσει την ενισχυμένη αντι-οξειδωτικό δυναμικό της DIM-D σε σύγκριση με EGCG. Τα αποτελέσματα στο Σχήμα 4C αποκάλυψε ότι σε συγκεντρώσεις 34,4 μΜ έως 280 μΜ, DIM-D ήταν σε θέση να σβήσουν περίπου 30% έως 90% των ριζών υδροξυλίου.

Στη συνέχεια, αποπτωτική δραστικότητα αναλύθηκε σε κύτταρα ΝΗΕΚ, που ήταν προ-θεραπεία με EGCG (17,2 μΜ και 68,7 μΜ) και DIM-D (8,6 και 34,4 μΜ) πριν από την έκθεση UVB. Για την αποτελεσματική σύγκριση μεταξύ EGCG και DIM-D σε σχέση με την προστασία έναντι της απόπτωσης, το IC50 και ένα τέταρτο οι συγκεντρώσεις IC50 της DIM-D χρησιμοποιήθηκαν για EGCG προεπεξεργασία των κυττάρων, ενώ το ήμισυ των αντίστοιχων συγκεντρώσεων χρησιμοποιήθηκαν για DIM-D προεπεξεργασία. Το πορτοκαλί βρωμιούχου αιθιδίου διπλή χρώση /ακριδίνη χρησιμοποιήθηκε για την αποπτωτική δοκιμασία, επειδή το πορτοκαλί ακριδίνης βαφή έχει την ικανότητα να βάφει τους πυρήνες των βιώσιμων κυττάρων πράσινο, ενώ η βαφή αιθίδιο, ένας παράγοντας παρεμβολής διαπέρασε αποπτωτικών ή νεκρωτικών κυττάρων για τη χρώση των πυρήνων πορτοκαλί τους. Δείξαμε ότι σε κύτταρα, τα οποία υποβλήθηκαν σε αγωγή με DIM-D, υπήρχε μία σημαντική μείωση αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο (ερυθρά χρώση) σε σύγκριση με κύτταρα κατεργασμένα με EGCG (Εικ. 4D). Αριθ αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο παρατηρήθηκε στα κύτταρα ελέγχου, τα οποία υποβλήθηκαν σε αγωγή είτε με PBS ή όχημα μόνο. θεραπεία DIM-D προκάλεσε σημαντική μείωση στην επαγωγή απόπτωσης από UVB ακτινοβολία σε κύτταρα ΝΗΕΚ. EGCG, ωστόσο, έδειξε ελάχιστη προστασία των κυττάρων ενάντια σε απόπτωση. Τα κύτταρα προκατεργάστηκαν με EGCG πριν από UVB ακτινοβόληση ήταν αξιοσημείωτα χρωματίστηκαν κόκκινα με βρωμιούχο αιθίδιο. Συνολικά, τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι αν και δεν υπήρχε μείωση στην βιωσιμότητα των κυττάρων σε κύτταρα κατεργασμένα UV DIM-D + σε σύγκριση με DIM-D κύτταρα μόνο σε επεξεργασία (όπως φαίνεται στο σχήμα 4Α.)? DIM-D θεραπεία σχετικά αποτρέπει την επαγωγή της απόπτωσης από την ακτινοβολία UVB και ως εκ τούτου ενισχύει τη βιωσιμότητα των κυττάρων πιο σημαντικά από EGCG.

2.3 Επίδραση της DIM-D σε UVB επαγόμενη-οξειδωτικό στρες.

Για να διερευνηθεί περαιτέρω η DIM-D αναστέλλει UV οξειδωτικό στρες και φλεγμονή που προκαλείται από ακτινοβολία μέσω της βελτίωσης των Nurr1 στα κύτταρα του δέρματος UV-εκτεθειμένη, εξετάσαμε την έκφραση του Nurr1 και 8-OHdG σε κύτταρα ΝΗΕΚ (Εικ. 5). Μετά την ακτινοβολία UVB, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DIM-D (34,4 μΜ) και EGCG (209,6 μΜ) επί 24 ώρες και το σχηματισμό των 8-OHdG προσδιορίστηκε με ανοσοχρώση (Εικ. 5Α). UVB αυξήθηκε σημαντικά 8-OHdG αλλά και οι δύο DIM-D και EGCG μείωσε σημαντικά την UVB επαγόμενη απόκριση επιβεβαιώνοντας έτσι την αντιοξειδωτική δράση των δύο ενώσεων. σχετική ισχύς τους ήταν εμφανής με ανοσοχρώση. Μόνο το 3,6% των κυττάρων ήταν θετικά βάφονται σε θεραπεία DIM-D σε σύγκριση με EGCG επεξεργασμένα κύτταρα (20% των κυττάρων).

(Α) Ανοσοκυτοχημική χρώση υπεροξειδάσης της Nurr1 και 8-OHdG στα κύτταρα ΝΗΕΚ αντιμετωπίζονται με DIM- Α και EGCG. Παρουσία του καφέ κηλίδα υποδεικνύεται θετική χρώση για το πρωτογενές αντίσωμα. (Β) & amp? (Γ) Ανάλυση Western blot της έκφρασης του Nurr1 σε σύγκριση με τον έλεγχο β-ακτίνης σε Dim-D και EGCG επεξεργασμένα κύτταρα ΝΗΕΚ. Τα μη επεξεργασμένα κύτταρα διατηρήθηκαν ως έλεγχος. Τα δεδομένα υπολογίζονται από πειράματα εις τριπλούν και παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD, * P & lt? 0.05, ** P & lt? 0,01 σε σύγκριση με τον έλεγχο

Η

Ανοσοκυτοχημική ανάλυση αποκάλυψε ότι, η έκφραση Nurr1 ήταν σημαντικά ισχυρότερη σε σύγκριση με. EGCG και UV μόνο (Εικ. 5Α). Η ποσοτικοποίηση των αποτελεσμάτων αυτών έδειξε ότι περίπου 83% των κυττάρων ήταν θετικά για χρώση Nurr1 σε κύτταρα κατεργασμένα DIM-D σε σύγκριση με EGCG κατεργασμένα κύτταρα (66%). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν σαφώς ότι η DIM-D ήταν πιο ισχυρό ότι EGCG ως επαγωγέα της Nurr1. Περαιτέρω αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν με ανάλυση Western blot. Για το σκοπό αυτό, τα κύτταρα ΝΗΕΚ υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DIM-D (34,4 μΜ) και EGCG (209,6 μΜ) επί 24 ώρες και τα προϊόντα λύσης ολικού κυττάρου αναλύθηκαν (Σχ. 5Β). κύτταρα ΝΗΕΚ σε επεξεργασία με DIM-D έδειξε έκφραση Nurr1 αυξήθηκε σημαντικά περισσότερο σε κύτταρα κατεργασμένα DIM-D (1,8 φορές) σε σύγκριση με EGCG (1,4 φορές) (Εικ. 5C).

Συζήτηση

Κακή κλινική έκβαση των τρεχουσών λεωφόρους θεραπεία προκάλεσε την ανάγκη για την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών στρατηγικών για τη θεραπεία του καρκίνου του δέρματος. Υπάρχει επείγουσα ανάγκη να εντοπιστούν μοριακούς στόχους χρησιμοποιώντας τις διατροφικές ενώσεις, οι οποίες έχουν τόσο θεραπευτικά όσο και χημειοπροληπτική δραστηριότητα. Nurr1 είναι ένας ορφανός πυρηνικός υποδοχέας και προκαταρκτικές εκθέσεις προτείνουν ένα ρόλο για Nurr1 στη ρευματοειδή αρθρίτιδα και στον καρκίνο μέσω διαμόρφωσης της απόπτωσης. Περαιτέρω έχει επίσης καταδειχθεί ότι DIM ανάλογα ενεργοποιεί τον πυρηνικό υποδοχέα ορφανό Nurr1 και αναστέλλει την ανάπτυξη του καρκίνου της ουροδόχου κύστης. [28] Ωστόσο, δεν υπάρχουν αναφορές σχετικά με την χημειοπροληπτικές δυναμικό της DIM-D ενεργοποιείται Nurr1 στον καρκίνο του δέρματος. Ως εκ τούτου, στο πρώτο μέρος της παρούσας μελέτης εστιάσαμε στην αντικαρκινική ή θεραπευτική δραστικότητα του DIM-D χρησιμοποιώντας Α431 κύτταρα καρκίνου του δέρματος. Στο δεύτερο μέρος της μελέτης μας ερευνήσαμε τη δράση χημειοπροληπτικές της DIM-D μέσω Nurr1 μεσολάβηση σηματοδότηση χρησιμοποιώντας ΝΗΕΚ.

Στο πρώτο μέρος της μελέτης μας, εκτιμήσαμε την κυτταροτοξική δράση της DIM-D σε κύτταρα Α431 δέρματος. Είναι σημαντικό να επισημάνουμε ότι DIM-D έδειξε κυτταροτοξική επίδραση σε αυτά τα κύτταρα και κυτταροτοξική δράση της ήταν μεγαλύτερη από EGCG. Παρόμοια με EGCG, προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι DIM αναστέλλει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων που προέρχονται από όγκους του προστάτη, του μαστού, του παχέος εντέρου, του τραχήλου και του παγκρέατος [34]. Ο ρόλος της απόπτωσης ερευνήθηκε περαιτέρω με προσδιορισμό της έκφρασης αποπτωτικών πρωτεϊνών, όπως διασπασμένη κασπάση-3 σε κύτταρα Α431. Η ανάλυση κηλίδας Western έδειξε σημαντική αύξηση στην έκφραση της κασπάσης-3 μετά από θεραπεία DIM-D σε κύτταρα Α431. Μελετήσαμε επίσης τον κατακερματισμό του DNA στα κύτταρα Α431 μετά την επεξεργασία DIM-D, λόγω του κατακερματισμού του DNA είναι ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα της απόπτωσης, η οποία δεσμεύει τα κύτταρα να πεθάνουν. κατάτμηση DNA ήταν ιδιαίτερα επάγεται από DIM-D σε σύγκριση με EGCG, επιβεβαιώνοντας έτσι ότι η απόπτωση είναι ένα σημαντικό μονοπάτι που συνδέονται με την αντικαρκινική δράση αυτών των ενώσεων. Αυτό συσχετίζεται καλά με την προηγούμενη μελέτη μας της ενίσχυσης της αντικαρκινικής δραστηριότητας από ένα αμυδρό ένωσης σε ανθρώπινο μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων [29]. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η DIM-D ενεργοποιεί ενδοπλασματικό δίκτυο στρες σε παγκρεατικά και ωοθηκών καρκινικά κύτταρα [35], [36]. DIM-D επαγόμενη έκφραση του ενδοπλασματικού δικτυώματος πρωτεΐνης στρες GRP78 μέσω της ενισχυμένης έκφρασης του CHOP και αυτό συνοδεύτηκε από την αναστολή της ανάπτυξης του όγκου [37]. Παρομοίως, οι μελέτες μας ανοσοκυτταροχημική έδειξαν ότι DIM-D αύξησε την έκφραση του CHOP σε κύτταρα Α431 μετά την επεξεργασία επί 24 ώρες. Αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι DIM-D ασκεί αντικαρκινικές επιδράσεις της μέσω στόχευσης πολλαπλών μοριακών στόχων που σχετίζονται με την επιβίωση των κυττάρων και την απόπτωση.

Η υπερέκφραση του Nurr1 μειώνεται φλεγμονωδών μεσολαβητών, έκφραση υποδοχέα καθαριστή και μειώνει τη συσσώρευση της LDL στα μακροφάγα [38] , [39]. Στη μελέτη μας, η έκφραση της διασπασμένης κασπάσης-3 ήταν αυξημένη σε κύτταρα Α431 μετά την επεξεργασία DIM-D.