Abstract

Capan-1 είναι ένα καλά χαρακτηρισμένο

BRCA2

ελλιπή ως ανθρώπινη κυτταρική σειρά απομονώθηκε από μία μετάσταση στο ήπαρ ενός παγκρεατικού αδενοκαρκινώματος. Εδώ αναφέρουμε ένα γονιδίωμα-ευρεία αξιολόγηση των διαρθρωτικών μεταβολών και υψηλής βάθος χαρακτηρισμός exome του ενιαίου παραλλαγές νουκλεοτιδίων και μικρή εισαγωγή /διαγραφές στο Capan-1. Για τον εντοπισμό πιθανών σωματικών και παραλλαγές που σχετίζονται με όγκους σε απουσία ενός συμφωνημένα-φυσιολογική κυτταρική σειρά, έχουμε επινοήσει μια νέα μέθοδο με βάση την ανάλυση των δειγμάτων HapMap. Έχουμε αποδείξει ότι Capan-1 έχει μια από τις πιο αναδιατάσσεται γονιδιώματα αλληλουχία μέχρι σήμερα. Επιπλέον, οι μικρές εισαγωγές και διαγραφές ανιχνεύεται συχνότερα στο πλαίσιο σύντομη ακολουθία επαναλαμβάνεται ό, τι σε άλλα γονιδιώματα. Εντοπίζουμε επίσης μια σειρά νέων μεταλλάξεων που μπορεί να αντιπροσωπεύουν γενετικές αλλαγές που συνέβαλαν στην εξέλιξη του όγκου. Αυτά τα δεδομένα παρέχουν πληροφορίες για τις γονιδιωματική επιπτώσεις της απώλειας της λειτουργίας του BRCA2

Παράθεση:. Κομμωτήριο LJ, Rosa Rosa JM, Kozarewa Ι, Fenwick Κ, Ασσιώτης Ι, Μητσόπουλος C, et al. (2011) Περιεκτική Γονιδιωματική ανάλυση ενός

BRCA2

Ελλιπή Ανθρωπίνων καρκίνο του παγκρέατος. PLoS ONE 6 (7): e21639. doi: 10.1371 /journal.pone.0021639

Συντάκτης: Robert Oshima, Sanford-Burnham Medical Research Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 17 Μαρτίου του 2011? Αποδεκτές: 3 Ιουνίου του 2011? Δημοσιεύθηκε: 5 Ιουλ 2011

Copyright: © 2011 Barber et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς ευχαριστώ τον Καρκίνο του μαστού Θεαματική, Cancer Research UK, και η αμερικανική Ένωση για την Έρευνα του Καρκίνου /Stand Up για τον Καρκίνο για τη χρηματοδότηση αυτού του έργου. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

τα άτομα ετερόζυγα για την απώλεια των μεταλλάξεων λειτουργίας στο ογκοκατασταλτικό γονίδιο

BRCA2

είναι ιδιαίτερα προδιάθεση σε μια σειρά διαφορετικών καρκίνων. Οι γυναίκες που κληρονομούν ένα μεταλλαγμένο

BRCA2

αλληλόμορφο έχουν σημαντικά ιδιαίτερα αυξημένο κίνδυνο της ζωής της ανάπτυξης του μαστού και των ωοθηκών [1]. Επιπλέον, αρσενικό καρκίνους του μαστού και του προστάτη συνδέονται στενά με το

BRCA2

γονιδιακές μεταλλάξεις [2]. Σε αμφότερα τα φύλα,

BRCA2

ανεπάρκεια αυξάνει τον κίνδυνο ανάπτυξης καρκίνων του παγκρέατος, του στομάχου, της χοληδόχου κύστης, και χοληδόχου πόρου, καθώς και μελάνωμα [3]. Η θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος παρουσιάζει σημαντικές προκλήσεις, όπως οι περισσότεροι ασθενείς παρουσιάζουν με τοπικά προχωρημένο ή μεταστατικό καρκίνο και συμβατικών αντικαρκινικών θεραπειών δείξει περιορισμένη αποτελεσματικότητα? μόνο το 5% των ασθενών με καρκίνο του παγκρέατος επιβιώνουν πέραν των πέντε ετών από την αρχική διάγνωση [4], [5].

BRCA2 διαδραματίζει καίριο ρόλο στη διατήρηση της γονιδιωματικής ακεραιότητας, ιδίως μέσω της ρύθμισης της επιδιόρθωσης του DNA με ομόλογο επισκευή ανασυνδυασμού (HR) [6] μια διαδικασία που επίσης ελέγχεται από μία άλλη πρωτεΐνη καταστολέα όγκου, BRCA1 [7]. HR είναι μια διαδικασία σε μεγάλο βαθμό χωρίς σφάλματα που αποκαθιστά την αρχική ακολουθία στην θέση ενός DNA δίκλωνα σπασίματα (DSBs) [8]. DSBs προκύψουν σχετικά συχνά και μπορεί να προκληθεί από φυσιολογική κυτταρική αναπαραγωγή, καθώς και εξωγενή στρες, όπως η έκθεση σε ιοντίζουσα ακτινοβολία [9]. Σε περίπτωση απουσίας του HR, για παράδειγμα λόγω της απώλειας της λειτουργίας του BRCA2, DSBs εμφανίζονται να επισκευαστεί από περισσότερες διεργασίες επιρρεπής σε λάθη που τελικά οδηγούν στη συσσώρευση του ακαθάριστου χρωμοσωματικών αναδιατάξεων [10]. Πιστεύεται ότι η χρήση των διεργασιών επιδιόρθωσης DNA επιρρεπής σε λάθη στην απουσία της λειτουργίας του BRCA2 πιθανότατα ευνοεί ογκογένεση [10]. Στο πλαίσιο του ρόλου της στην ΥΕ, BRCA2 ελέγχει τη φόρτωση και την αφαίρεση του RAD51 ανασυνδυάση DNA σε DSBs. Η προκύπτουσα RAD51-ssDNA πυράκτωσης προκαλεί την αναζήτηση για μια ομόλογη αλληλουχία DNA στο πρότυπο της επισκευής του ΟΕΔ [11].

Παρά το μεγάλο ενδιαφέρον για τη λειτουργία BRCA2 και ο ρόλος της στην ογκογένεσης και επιδιόρθωση του DNA, υπάρχουν λίγες κυττάρου όγκου μοντέλα της ανεπάρκειας BRCA2 που μπορούν να χρησιμοποιηθούν παραγωγικά στο εργαστήριο. Από αυτά Capan-1 είναι το πιο καλά χαρακτηριστεί. Capan-1 προήλθε από μια μετάσταση ήπατος σε ένα 40-year-old καυκάσιος αρσενικό με ένα πρωτεύον παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα [12], [13]. Αυτά τα κύτταρα στερούνται ένα λειτουργικό

BRCA2

αλληλόμορφο και αντί να φέρει ένα

c.6174delT

αλληλόμορφο. Η ενιαία διαγραφή βάσης σε

c.6174

προκαλεί μια μετατόπιση πλαισίου, (p.S1982fs * 22) με αποτέλεσμα την απώλεια των Ο-τερματικών 1416 αμινοξέα της πρωτεΐνης [14], [15]. Η προκύπτουσα κομμένη πρωτεΐνη στερείται δύο BRC μοτίβα που εμπλέκονται στην αλληλεπίδραση μεταξύ BRCA2 με RAD51 και ssDNA [16], καθώς επίσης και C-τερματικές αλληλουχίες πιστεύεται ότι απαιτείται για πυρηνικό εντοπισμό του BRCA2 και RAD51 /αποσυναρμολόγηση του DNA [17], [18] . Αυτή η κολοβωμένη ισομορφή BRCA2 έχει δειχθεί ότι είναι τόσο κυτταροπλασματική και δυσλειτουργικές σε HR [19], [20]. Σύμφωνα με την έννοια ότι η δυσλειτουργία BRCA2 οδηγεί σε γενωμική αστάθεια, η ανάλυση καρυότυπου SKY απέδειξε ότι Capan-1 διαθέτει ένα υποτριπλοειδές γονιδιώματος, με 36 ορίζεται δομικές αναδιατάξεις κατανεμημένα σε ολόκληρο το γονιδίωμα [21]. Η πλειοψηφία αυτών των αναδιατάξεων είναι πιθανό πολύ πολύπλοκες και φαίνεται να περιλαμβάνουν περισσότερα από τρία τμήματα χρωμοσωμάτων, αν και δύο αμοιβαία μετατοπίσεις (t (6? 15) και t (7? 10)) έχουν περιγραφεί (www.path.cam.ac. uk /~ pawefish).

Δεδομένης της σημαντικής χρήση της κυτταρικής γραμμής Capan-1 ως πρότυπο όχι μόνο της στυτικής BRCA2, αλλά και του καρκίνου του παγκρέατος, χρησιμοποιήσαμε τεχνολογία επόμενης γενιάς αλληλούχιση για να μελετηθεί η γονιδιωματική αλληλουχία αυτού κυτταρική σειρά.

Αποτελέσματα

στρατηγική της αλληλουχίας του DNA

Για τον εντοπισμό υποψήφιων διαρθρωτικές ανακατατάξεις που δημιουργείται για πρώτη φορά ένα μέσο βάθος ακολουθία ολόκληρο το γονιδίωμα του Capan-1. Απομονώσαμε DNA από κύτταρα Capan-1, και δημιουργείται μια βιβλιοθήκη DNA θραύσμα 500 bp χρησιμοποιώντας μια προσέγγιση PCR χωρίς που βελτιώνει την πολυπλοκότητα της βιβλιοθήκης [22]. Αυτή η βιβλιοθήκη DNA αλληλουχήθηκε χρησιμοποιώντας μια αντιστοιχισμένη-end στρατηγική για την Illumina GAIIx Γονιδιώματος αναλυτή, αποδίδοντας 365 811 868 πρώτων 76 bp σύντροφο-ζεύγη διαβάζει (27,8 Gb). Μετά την ευθυγράμμιση σε έναν άνθρωπο αναφοράς γονιδιώματος (hg19 /build37) και την επακόλουθη διαδικασία διήθησης για την απομάκρυνση διπλότυπα PCR και κακής ποιότητας διαβάζει, αυτά τα δεδομένα έδωσαν επαρκή κάλυψη γονιδιώματος (90,09%) για τη μελέτη των δομικών αναδιατάξεων, σε διάμεσο βάθος 8,55 φορές σε (Πίνακας 1? Πίνακας S1).

η

για να διερευνηθεί η αλληλουχία κωδικοποίησης της Capan-1 σε μεγαλύτερο βάθος, χρησιμοποιήσαμε μια στοχευμένη στρατηγική εμπλουτισμού με βάση την Agilent SureSelect σε λύση για την σύλληψη. Χρησιμοποιήσαμε το κιτ SureSelect Ανθρώπινα Όλα εξόνιο, σχεδιασμένο για να συλλάβει μεγαλύτερη από 38 Mb του ανθρώπινου γενωμικού DNA που αντιστοιχεί στο NCBI βάση δεδομένων Consensus CDS. Δύο ανεξάρτητοι υβριδισμοί σύλληψη διεξήχθησαν σε θραύσματα περίπου 200 bp του Capan-1 γονιδιωματικό DNA. Οι προκύπτουσες βιβλιοθήκες exome αλληλουχήθηκαν επί Illumina GAIIx χρησιμοποιώντας ζεύγη-άκρο 2 × 76 τρεξίματα αλληλούχιση bp. Αυτό έδωσε 130.310.847 πρώτες διαβάζει (9.9 Gb). Παρομοίως με το σύνολο ανάλυση του γονιδιώματος, αλληλουχία διαβάζει από τη διαδικασία σύλληψης ήταν ευθυγραμμισμένες σε ένα ανθρώπινο γονιδίωμα αναφοράς (hg19 /build37) χρησιμοποιώντας Burrows-Wheeler Aligner (BWA, [23]) και στη συνέχεια διηθείται για την απομάκρυνση διπλότυπα PCR και κακής ποιότητας διαβάζει. Το ποσοστό των διαβάζει στο στόχο ήταν 65%, φθάνοντας σε τελική κάλυψη του 98,51% για τα δολωμένα περιοχές με μεσαίο βάθος 89 φορές (Πίνακας 1? Πίνακας S2), ξεπερνώντας κατά πολύ το 30 φορές το βάθος που απαιτείται για τον εντοπισμό γενετικών παραλλαγών στην δείγματα όγκων [24].

Για τις στρατηγικές τόσο το σύνολο του γονιδιώματος και αλληλούχιση exome, περισσότερο από το 80% των διαβάζει ευθυγραμμίστηκαν σε συνδυασμό με τις αντίστοιχες σύντροφο ζεύγους τους (Πίνακας 1). Στην περίπτωση του συνόλου του γονιδιώματος εκ νέου προσδιορισμό της αλληλουχίας, 5,63% των διαβάζει αντιστοιχίζονται σε ένα διαφορετικό χρωμόσωμα σε σύγκριση με το σύντροφο ζεύγους τους, και ένα επιπλέον 10,31% του διαβάζει τα ορφανά, δηλαδή όταν η σύντροφος ζεύγος απέτυχε να ευθυγραμμίσει λόγω της υπερβολικής Ν ή αναντιστοιχίες /indels (Πίνακας 1). Αυτό υποστηρίζει προηγούμενη χαμηλής ανάλυσης φασματικές αναλύσεις καρυότυπο (SKY) της Capan-1 που υποδηλώνουν μια εξαιρετικά αναδιατάσσονται γονιδίωμα [21]. Για την αλληλουχία exome, ελαφρώς λιγότερες διαβάζει ήταν ευθυγραμμισμένα ανεξάρτητα από τους σύντροφο ζεύγους ό, τι για αλληλούχιση ολόκληρου exome, ίσως υποδηλώνει ότι αναδιατάξεις μέσα στην περιοχή κωδικοποίησης εμφανίστηκαν λιγότερο συχνά σε Capan-1 από ότι σε μη-γονιδιακός περιοχές (Πίνακας 1).

βάθος Ακολουθία σε ολόκληρη την γονιδιώματος σύγκριση με τα δεδομένα που παράγονται από την ποικιλία συγκριτική γονιδιωματική υβριδισμού (aCGH) (Εικ. S1, Πίνακας S1). Γενικά το μεσαίο βάθος για κάθε χρωμόσωμα που προσδιορίζονται με αλληλούχιση ταυτοποίησε το προφίλ αριθμού αντιγράφων που δημιουργούνται από aCGH (Εικ. S1). Για παράδειγμα, χρωμοσώματα όπως 4 και 6, ότι με aCGH φάνηκε να είναι παρούσα σε δύο αντίγραφα, έδειξαν κυρίως ακόμη και βάθος απέναντι όλο το μήκος τους. Επιπλέον, το χρωμόσωμα Χ μόνο αντίγραφο επέστρεψε περίπου το ήμισυ του αριθμού των διαβάζει των χρωμοσωμάτων 4 και 6. Η προηγουμένως αναφερθεί [21], [25] ομόζυγη διαγραφή του 9p21 περιλαμβάνουν

CDKN2A

, και απώλεια της πλειοψηφίας των χρωμόσωμα Υ, επιβεβαιώθηκαν επίσης με προσδιορισμό της αλληλουχίας. (Εικόνα 1Α? Εικ. S1, Πίνακας S1)

Α. Γονιδίωμα-ευρύ Circos οικόπεδο των αναδιατάξεων που προσδιορίζονται στο Capan-1 με ανάλυση breakdancer. Ένα ιδεόγραμμα ενός φυσιολογικού καρυότυπου εμφανίζεται στον εξωτερικό δακτύλιο, και αριθμό αντιγράφων αντιπροσωπεύεται από το μπλε γραμμή στη μέση δακτυλίους. Η σχετική θέση και την κατηγορία του κάθε αναδιάταξη απεικονίζεται εντός του εσωτερικού κύκλου, όπως περιγράφεται στη λεζάντα. B. Η σύγκριση του συνολικού αριθμού των δια- και ενδο-χρωμοσωματικών αναδιατάξεων ανιχνεύεται με ανάλυση breakdancer σε ένα πίνακα του

BRCA2

,

BRCA1

, και μη

BRCA

μεταλλαγμένα κυτταρικές σειρές και πρωτογενείς όγκους. C. Τα δείγματα ταξινομήθηκαν ως

BRCA

-mutated (mut) ή BRCA άγριου τύπου (wt), και τον αριθμό των διεθνών, ενδο-χρωμοσωμικές και συνολική αναδιατάξεις συγκρίθηκαν. σ τιμές αναφέρονται στην ανάλυση Mann Whitney με Gaussian προσέγγιση. Δ Σύγκριση του ποσοστού κάθε κατηγορία αναδιάταξη σε κάθε δείγμα. Τα δείγματα ταξινομούνται ως

BRCA2

,

BRCA1

, και μη

BRCA

μεταλλαχθεί, όπως στο Β

Η

Διαρθρωτικά παραλλαγή

Για τον εντοπισμό υποψήφιων διαρθρωτικές ανακατατάξεις, αναλύσαμε ολόκληρη την αλληλουχία του γονιδιώματος του Capan-1 χρησιμοποιώντας breakdancer [26]. Χρησιμοποιήσαμε μια αυστηρή μέθοδο φιλτραρίσματος που μόνο εντοπίστηκαν ανακατατάξεις που υποστηρίζεται από τουλάχιστον δέκα διαβάζει (το μεσαίο βάθος κατά μήκος του γονιδιώματος ήταν 8.55x). Η προσέγγιση αυτή προσδιορίζεται 354 μεγάλες δομικές παραλλαγές σε Capan-1, οι οποίες ήταν υπο-ταξινομούνται ως ενδοχρωμοσωμική εξαλείψεις, ενθέσεις, αναστροφές, ή δια-χρωμοσωμικές άμεση ή ανεστραμμένη μετατοπίσεις (Εικ. 1Α). Δεν ενθέσεις ανιχνεύθηκαν στην ανάλυση αυτή, όπως όλοι έπεσαν μέσα στα όρια της κανονικής κατανομής μεγέθους θραύσματος (1-1000 bp).

Δεδομένου ότι Capan-1 είναι ένα ανεπαρκές μοντέλο BRCA2, ερευνήσαμε την πιθανότητα ότι μεσοπρόθεσμα βάθος, αλληλούχιση ολόκληρο το γονιδίωμα θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για τη διάκριση BRCA1 και BRCA2 με ανεπάρκεια όγκων από μη οικογενείς μορφές. Μέχρι σήμερα, δύο με ανεπάρκεια όγκους BRCA2, δύο με ανεπάρκεια όγκους BRCA1, και δύο BRCA1 ανεπάρκεια κυτταρικές σειρές έχουν επίσης υποβληθεί σε μέσο βάθος αλληλούχιση ολόκληρο το γονιδίωμα, ως μέρος μιας ευρύτερης μελέτης των πρωτογενών όγκων του μαστού και κυτταρικές γραμμές [27]. Έχουμε λάβει τα ανεπεξέργαστα δεδομένα από αυτή τη μελέτη [27], και υποβάλλονται σε επεξεργασία μέσω δική μας αγωγού, η οποία περιελάμβανε την ανάλυση με breakdancer. Με αυτόν τον τρόπο, ήμασταν σε θέση να συγκρίνει άμεσα τη συχνότητα και τον τύπο των διαρθρωτικών αναδιατάξεων που προσδιορίζονται στο Capan-1 και με τα δύο BRCA όγκους με ανεπάρκεια και κατέχουν πρωτογενές μαστού και κυτταρικές σειρές (Σχ. 1 Β-D). Από όλα τα γονιδιώματα που μελετήθηκαν, Capan-1 παρουσίασαν τις πιο διαρθρωτικές ανακατατάξεις, τόσο διεθνείς και ενδοχρωμοσωμική (Εικ. 1Β). Αν και ο αριθμός του δείγματος υπό μελέτη ήταν σχετικά χαμηλή (n = 7

BRCA

όγκους μεταλλαγμένου έναντι n = 15 μη

BRCA

όγκους μεταλλαγμένου) σύγκριση των Capan-1 δεδομένων με στοιχεία από

BRCA2

όγκους μεταλλαγμένου πρωτογενή μαστού και

BRCA1

όγκους μεταλλαγμένου πρωτογενή μαστού και κυτταρικές σειρές έκανε δείχνουν μια τάση για BRCA ανεπαρκή δείγματα να εμφανίζουν μεγαλύτερο αριθμό των διαρθρωτικών ανακατατάξεων, (διάμεσος αριθμός για

BRCA

όγκους μεταλλαγμένου = 72 αναδιατάξεις, μεσαίο αριθμό για μη

BRCA

όγκους μεταλλαγμένου = 41? Εικ. 1Γ), σύμφωνα με τους ρόλους των γονιδίων BRCA1 και BRCA2 στη διατήρηση της γονιδιωματικής σταθερότητας. Αν και αυτή η παρατήρηση δεν ήταν στατιστικά σημαντική (ρ = 0,1368, Mann Whitney), αυτό θα μπορούσε να αποδοθεί στο μικρό μέγεθος του δείγματος. Επιπλέον, όπως μεταλλάξεις σε γονίδια, εκτός από

BRCA1

και

BRCA2

επηρεάζουν ΥΕ, είναι απολύτως πιθανό ότι κάποια από τα δείγματα που ταξινομούνται ως «μη

BRCA

» θα μπορούσε επίσης να έχουν μια παρόμοια έλλειψη ανθρώπινου δυναμικού για να

BRCA1 /2

όγκους μεταλλαγμένου. Το ποσοστό της συνολικής ανακατατάξεις σε κάθε τάξη συγκρίθηκε επίσης σε όλη την

BRCA

μεταλλαγμένου και μη μεταλλαγμένο ομάδες (Εικ. 1D). Σε Capan-1, όπως και στην πλειονότητα των άλλων γονιδιωμάτων, ενδοχρωμοσωμική διαγραφές ήταν η πιο συχνή τάξη του αναδιάταξης. Ωστόσο, δεν υπήρχε σαφής τύπο ή τη μέθοδο των αναδιατάξεων που ήταν ειδικά για

BRCA

μεταλλαγμένου κύτταρα, με βάση αυτό το μικρό σύνολο των δειγμάτων.

Μια σειρά από μεγάλες δομικές αναδιατάξεις έχουν προηγουμένως εντοπιστεί σε Capan-1 χρησιμοποιώντας φασματική καρυότυπο (SKY) ανάλυση [21]. Ωστόσο, η ανάλυση της ανάλυσης SKY είναι σχετικά χαμηλό και σε πολλές περιπτώσεις η θέση πολλών από τις υποθετικές αναδιατάξεις ταυτιστεί με αυτή τη μορφή της ανάλυσης δεν μπορεί να προβλεφθεί με οποιαδήποτε μεγάλη εμπιστοσύνη συντεταγμένων. Με δεδομένο αυτό, προσπαθήσαμε μόνο μια συγκριτική ανάλυση των δεδομένων NGS με δεδομένα SKY όπου οι συντονίσουν τις θέσεις του SKY προέβλεψε ανακατατάξεις θα μπορούσε να γίνει μέσα σε ~ 10 Mb. Αυτή η συγκριτική ανάλυση πρότεινε ότι έξι από τις προηγουμένως εντοπιστεί αναδιατάξεις θα μπορούσαν επίσης να ταυτοποιηθούν χρησιμοποιώντας ολόκληρα αλληλούχιση του γονιδιώματος, αλλά σε υψηλότερη ανάλυση (Πίνακας 2). Μια περαιτέρω συγκρότημα αναδιάταξη των χρωμοσωμάτων 6, 8, και 17 είχαν προηγουμένως προταθεί από την ανάλυση SKY, αν και όχι με επαρκείς λεπτομέρειες για να διαφωτίσει τις ακριβείς περιοχές του κάθε χρωμοσώματος που εμπλέκονται. Η ανάλυσή μας πρότεινε επίσης περίπλοκη μετατοπίσεις μεταξύ των χρωμοσωμάτων 6 και 8, καθώς και μεταξύ 8 και 17 (Πίνακας 2).

Η

Είναι ενδιαφέρον, έντεκα από τις προσδιοριζόμενες interchromosomal ανακατατάξεις που προσδιορίζονται στο Capan-1 φαίνεται να συμπίπτει με γενετικά περιοχές και στα δύο σημεία διακοπής, ενδεχομένως υποδηλώνει εκδηλώσεις γονίδιο σύντηξης (Πίνακας 3). Καμία από αυτές τις συντήξεις έχουν αναφερθεί παλαιότερα στη Cancer Genome Απογραφή [28]. 42 επιπλέον αναδιατάξεις βρέθηκαν μέσα σε ένα γονίδιο ή ανάντη ρυθμιστικές περιοχές σε ένα σημείο διακοπής, το οποίο θα μπορούσε επίσης να έχει επιβλαβή αποτελέσματα (Πίνακας S3). Μία από αυτές τις ανακατατάξεις είχε ένα σημείο διακοπής σε ένα γονίδιο,

ZNF521

, που πρόσφατα αναγνωρίστηκε ως το αντικείμενο των χρωμοσωμικών μετατοπίσεων στην οξεία λεμφοβλαστική λευχαιμία [29]. Ένα επιπλέον 118 γονίδια φάνηκε να επηρεάζεται από ενδοχρωμοσωμική αναδιατάξεις (Πίνακας S4).

Η

παραλλαγή exome μοναδικού νουκλεοτιδίου (SNV) και Indel ανακάλυψη

Για τον εντοπισμό SNVs και μικρή εισαγωγή /διαγραφή ( Indel) γεγονότα στην αλληλουχία κωδικοποίησης του Capan-1, χρησιμοποιήσαμε SAMtools [30] για την ανάλυση συσσώρευση της αλληλουχίας exome υψηλής βάθος και την επακόλουθη κλήση SNV. Μικρές indels (1-6 bp) ταυτοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα προσαρμοσμένο αγωγό (βλέπε Μέθοδοι). Μεγαλύτερες ανακάλυψη Indel επιτεύχθηκε με τη χρήση Pindel [31]. Στην πρώτη περίπτωση, οι παραλλαγές διηθούνται ώστε να αποκλείονται εκείνοι ανιχνεύεται σε βάθος λιγότερο από δέκα διαβάζει ανά αντίτυπο. SNVs και indels αναφέρεται ως πολυμορφισμοί γενικό πληθυσμό σε dbSNP επίσης υπόψη, όπως μας ενδιαφέρει σε μεγάλο βαθμό στην αναγνώριση των πιθανών καρκίνο συγκεκριμένες αλλαγές.

Όπως η πλειονότητα των όγκων που προέρχονται από κυτταρικές γραμμές, Capan-1 δεν έχουν μια συμφωνημένα φυσιολογική κυτταρική γραμμή από τον ίδιο ασθενή που θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για να βοηθήσουν στον προσδιορισμό του καρκίνου συγκεκριμένες αλλαγές και αφαιρέστε αντικείμενα που προκύπτουν από την παραγωγή τόσο του δείγματος και την ευθυγράμμιση. Υπό το πρίσμα αυτό, έχουμε αναπτύξει μια διαδικασία φιλτραρίσματος για exome επανεύρεση της αλληλουχίας, με βάση σχετικά με την πολλαπλή σύγκριση με δεδομένα που λαμβάνονται από την προετοιμασία ανάλογων δειγμάτων και την ανάλυση των τεσσάρων φυσιολογικά δείγματα γονιδιώματος HapMap (NA11881 (αρσενικό)? NA12761, NA12813 και NA12892 (θηλυκό )) (Πίνακας S5). Χρησιμοποιώντας αυτές τις HapMap δείγματα, ήμασταν σε θέση να αφαιρέσει αντικείμενα που προκύπτουν τόσο από την παραγωγή του δείγματος (π.χ. διακύμανση στην αποτελεσματικότητα υβριδισμού) και ευθυγράμμισης (π.χ. ομόλογες περιοχές).

Η ανάλυση των δεδομένων που λαμβάνονται από exome επανεύρεση της αλληλουχίας των δειγμάτων HapMap ενεργοποιημένη να θέσουμε όρια για ομοζυγωτία (παραλλαγή διαβάζει & gt? 88% ή & lt? 10% συνολικά) και ετεροζυγωτία (παραλλαγή διαβάζει 33-67% συνολικά) από τις παραλλαγές. Τα όρια αυτά χρησιμοποιήθηκαν για να φιλτράρετε τα εντοπίστηκαν SNVs και indels στο γονιδίωμα Capan-1. Επιπλέον, όπως ήμασταν ενδιαφέρονται για τον εντοπισμό υποψήφιων μεταλλάξεων όγκου-ειδικά, έχουμε υπόψη όλες τις μεταλλάξεις που ανιχνεύθηκαν επίσης στα δείγματα HapMap, ως προσέγγιση κανονικοποίησης για πιθανή διακύμανση βλαστικής σειράς.

Ως ένα ακόμη επίπεδο αυστηρότητας μπορούμε επίσης μελετημένη αριθμός αντιγράφων αλλάζει κατά μήκος του γονιδιώματος Capan-1, όπως ορίζεται από την ανάλυση aCGH. Αυτό είναι ιδιαίτερα σημαντικό για εξαιρετικά αναδιατάσσονται και ανευπλοειδικών γονιδιώματα, όπως Capan-1. Με βάση την εμπειρία μας, η χρήση φίλτρων συγκεκριμένη περιοχή για το βάθος αλληλουχίας διευκολύνει την πιο αξιόπιστη ταυτοποίηση παραλλαγή. Σαφώς, ετερόζυγη παραλλαγές που ονομάζεται σε περιοχές μοναδικό αντίγραφο είναι πιθανό να είναι ψευδή (πιθανότατα οφείλεται σε κακή ευθυγράμμιση), και αλλού, ο αριθμός των διαβάζει φέρουν το αλληλόμορφο παραλλαγής μπορεί να κυμαίνονται με διαφορετικό τρόπο ανάλογα με την κατάσταση αριθμό αντιγράφων. Ως εκ τούτου, τα κατώτατα όρια εμπιστοσύνης εφαρμόστηκαν τόσο SNV και Indel ανακάλυψη, απαιτεί ένα ελάχιστο των 10 διαβάζει ανά γενωμική αντιγραφή. Επιπλέον, τουλάχιστον τρεις παραλλαγή διαβάζει όφειλαν να καλέσετε έναν SNV και τουλάχιστον επτά παραλλαγή διαβάζει για indels, ανά γενωμική αντιγραφή. Η προκύπτουσα κατάλογος των SNVs και indels προσδιορίζονται στο Capan-1 περιγράφονται λεπτομερώς στους πίνακες S6 και S8, αντίστοιχα.

Χαρακτηρισμός της κωδικοποίησης SNVs

μελέτες αλληλουχίας χαμηλή απόδοση υποψήφιο γονίδιο σε Capan-1 έχουν προηγουμένως προσδιόρισε τρεις ομόζυγη SNVs στο

KRAS

,

Smad4

και

MAP2K4

. Χρησιμοποιώντας αλληλουχίας exome, ήμασταν σε θέση να ανιχνεύει κάθε τρεις από αυτές τις αλλαγές: το

KRAS

c.35G & gt? T μετάλλαξη που προκαλεί την κλινικά σημαντική υποκατάσταση p.G12V αμινοξύ [32], [33], το c .1028C & gt? G SNV σε

Smad4

ότι καταλήγει σε ένα κωδικόνιο πρόωρης διακοπής [34] και το

MAP2K4

c.661G & gt? Τ μετάλλαξη στο Capan-1, η οποία οδηγεί σε ένα καρκινο-συναφές πρωτεΐνη κολόβωση [35]. Η εμφάνιση και των τριών αυτών των μεταλλάξεων στην τελική φιλτραρισμένη λίστα των παραλλαγών exome, έδωσε αυτοπεποίθηση στους αγωγούς ανάλυσή μας (Πίνακας S6).

Χρησιμοποιώντας αλληλουχίας exome υψηλής βάθος, εντοπίσαμε συνολικά 608 SNVs σε Capan -1 που επηρεάζουν 1.270 διαφορετικές μεταγραφές (Πίνακας 4). Οι περισσότεροι μεταλλάξεις (61%) βρέθηκαν σε μη κωδικοποιητικές περιοχές (μη-κωδικοποίησης γονιδίων ή ιντρόνια), ή ήταν συνώνυμες παραλλαγές. Είκοσι τέσσερα τοις εκατό των προσβεβλημένων μεταγραφές τροποποιήθηκαν με μη συνώνυμες κωδικοποίησης αλλαγές. Συνολικά, μη συνώνυμες SNVs ανιχνεύθηκαν σε 206 διαφορετικά γονίδια, 56 από τα οποία ήταν ομόζυγα (Πίνακας S6). Δώδεκα γονίδια που αποκτήθηκε πρόωρα κωδικόνια στοπ, τέσσερα από τα οποία ήταν ομόζυγα (

GRIA3

,

GRM1

,

MAP2K4

,

Smad4

). Σημαντικά, ο αριθμός των πιθανών σωματικών κωδικοποίησης μεταλλάξεις που ανιχνεύονται για Capan-1 σε αυτή τη μελέτη συγκριτικά πολύ ευνοϊκά με αυτές που φαίνονται σε προηγούμενες μελέτες που εξετάζουν τις κυτταρικές γραμμές όγκου COLO-829 (172 μη συνώνυμες SNV) [36] και ΝΟΙ-Η209 (94 μη συνώνυμες SNV) [24]. Και οι δύο αυτές προγενέστερες μελέτες που προσδιορίζονται σωματικές μεταλλάξεις σε σύγκριση με μια αντίστοιχη κανονικό έλεγχο DNA του αίματος από τον ίδιο ασθενή, γεγονός που υποδηλώνει ότι η χρήση μας του HapMap exomes είναι μια αποτελεσματική εναλλακτική λύση για την αναγνώριση των σωματικών μεταλλάξεων σε Capan-1, και άλλες κυτταρικές «ορφανά» γραμμές

η

Τρεις του μυθιστορήματος δυναμικό περικοπή μεταλλάξεις επιλέχθηκαν για την επικύρωση από αλληλουχίας Sanger:.

GRM1

(

c.C1458A

, p.Y486 *),

SMAP2

(

c.C764G

, p.S255 *), και

GLT6D1

(

c.G593A

, p.W198 *). Και οι τρεις είχαν αποδειχθεί για να είναι αληθινό SNVs, και η ζυγωτίας ανιχνεύεται από την αλληλούχιση exome επιβεβαιώθηκε επίσης με ανάλυση της αλληλουχίας Sanger: ομόζυγο για

GRM1

, ετερόζυγο για

SMAP2

και

GLT6D1

(Σχ. 2Α-C).

GRM1

κωδικοποιεί έναν μεταβοτροπικό υποδοχέα γλουταμινικού, των οποίων παρεκκλίνουσα έκφραση έχει προταθεί ότι παίζει ένα ρόλο στην ανάπτυξη του μελανώματος [37]. SMAP2 είναι ένα ARF1 ειδικό ΘΤΡάσης-ενεργοποίηση πρωτεϊνών που εμπλέκονται στη διακίνηση μεμβράνη clathrin-εξαρτώμενη [38]. Η

GLT6D1

γονίδιο κωδικοποιεί μια όπως-ακόμα μη χαρακτηρισμένα γλυκοζυλοτρανσφεράσης-6-περιοχή που περιέχουν πρωτεΐνη.

Α. Χρωματογράφημα που απεικονίζει το stop-κέρδος SNV στο

GRM1

ανιχνευθεί για Capan-1. Οι αλληλουχίες πρωτεΐνης και γονιδιωματική αναφοράς που παρουσιάζονται πάνω από το χρωματογράφημα. Το SNV επισημαίνεται με μπλε χρώμα στην ακολουθία αναφοράς, και το επηρεάζεται υπόλειμμα υπογράμμισε. Β Ως Α, για

SMAP2

. C. Όπως Α, για

GLT6D1

. Δ Η σύγκριση των συχνοτήτων απλή υποκατάσταση βάσης στο Capan-1, βασικοκυτταρικό-όπως όγκων του μαστού, NCI-Η209, Colo-829 και U87 MG γονιδιώματα. Ε Σύγκριση του συνόλου του γονιδιώματος και οι συχνότητες υποκατάστασης βάσης exome ειδικά παρατηρείται σε Capan-1.

Η

Όλα τα νέα SNVs εντοπιστεί εδώ ήταν διασταυρώνονται σε μια σειρά από online βάσεις δεδομένων (SIFT [39 ], [40], η μετάλλαξη Δοκιμαστής [41], [42], DAVID [43], [44], ΚΕΔ [28], [45]) για να προβλέψει την ικανότητά τους να τροποποιούν τη λειτουργία της πρωτεΐνης. Ένα από τα πιο ενδιαφέροντα υποψηφίους ήταν μια ομόζυγη γ.

C162A

μετάλλαξη στο

FZD10

, μέλος της περμανάντ οικογένεια γονιδίων που κωδικοποιούν τους υποδοχείς σύνδεσης συνδετήρα Wnt [46]. Το ομόζυγο

c.C162A

παραλλαγή ανιχνεύεται σε αυτή τη μελέτη οδηγεί σε μια υποκατάσταση μη συνώνυμων αμινοξέων (p.N54K) σε μια άκρως συντηρημένο υπόλειμμα εντός του υποθετικού Wnt θέση σύνδεσης-συνδετήρα (FZ τομέα) [47] , [48]. FZD10 είναι ένας θετικός ρυθμιστής του μονοπατιού σηματοδότησης Wnt-βCatenin-TCF, έχει δειχθεί ότι είναι προς τα πάνω ρυθμισμένα σε πρωτογενείς όγκους του παχέως εντέρου [49], και Wnt-βήτα Catenin σηματοδότηση είναι γνωστό ότι είναι παρεκκλίνουσα σε ορισμένες παγκρεατικά αδενοκαρκινώματα [50].

Τρεις ομόζυγο ήταν παρόντες στο ογκοκατασταλτικό

DCC

(

Διαγράφεται ορθοκολικό καρκίνωμα)

, το οποίο κωδικοποιεί ένα υποδοχέα νετρίνης που απαιτούνται για την κυτταρική διαφοροποίηση [51], καθώς επίσης και η επαγωγή της απόπτωσης σε απουσία συνδέτη [52]. Μεταλλάξεις και η απώλεια του

DCC

έχουν προηγουμένως εμπλακεί σε καρκίνο του παγκρέατος, καθώς και μια σειρά άλλων τύπων όγκου [52], [53]. Μία από τις τρεις νέες παραλλαγές ανιχνεύθηκαν σε Capan-1 ήταν τοποθετημένος στη θέση ματίσματος του δότη του ιντρονίου 20-21, τέσσερις βάσεις καθοδικά του κρίσιμου GT μοτίβο. Οι άλλες δύο παραλλαγές οδήγησαν σε μη συνώνυμες μεταλλάξεις της πρωτεΐνης (p.L1042 Μ και p.K1411T). Αν και κανένα από αυτά τα τελευταία μη συνώνυμες μεταλλάξεις έχουν αναφερθεί στο παρελθόν, και οι δύο βρίσκονται κοντά στα υπολείμματα ενδιαφέροντος: p.F1039S, μεταλλάσσεται σε αδενοκαρκίνωμα [54]? και p.Y1418, ένα κρίσιμο κατάλοιπο φωσφορυλιώνεται από Fyn, και που απαιτούνται για την DCC λειτουργία [55].

Cross-αναφορά των SNVs ανιχνεύθηκε σε Capan-1 με το γονίδιο Συναίνεση Καρκίνο (ΚΕΔ) [28], [45] προσδιορίζονται δώδεκα γονιδίων που έχουν προηγουμένως δειχθεί να μεταλλαχθεί σε άλλα υπολείμματα σε κυτταρικές σειρές καρκίνου ή πρωτογενών όγκων. Καμία από τις παραλλαγές που προσδιορίζονται στο Capan-1 σε αυτή τη μελέτη έχουν περιγραφεί προηγουμένως. Ωστόσο, η πλειονότητα αυτών των αλλαγών ήταν μη-κωδικοποίησης ή συνώνυμη αλλαγές (Πίνακας S7). Μια ετερόζυγο μη-συνώνυμη μετάλλαξη παρατηρήθηκε στον παράγοντα σημείο ελέγχου σταθερότητας γονιδιώματος

Αταξία Τελαγγειεκτασίας Μεταλλαγμένα

(

ATM

). Ωστόσο, το υπόλειμμα παραλλαγή (p.R1585S) βρίσκεται εκτός των γνωστών λειτουργικών πεδίων και συνεπώς είναι δύσκολο να προβλεφθούν οι λειτουργικές συνέπειες αυτής της αλλαγής. Ένα δεύτερο νέο ετερόζυγο μη συνώνυμες μετάλλαξη ταυτοποιήθηκε σε

TPR

(

μετατοπίζεται Promoter Region

), το οποίο κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη που αλληλεπιδρά με το σύμπλοκο πυρηνικού πόρου. Αυτή η μετάλλαξη (p.V779I) περιλαμβάνει ένα διατηρημένο υπόλειμμα εντός γνωστού μοτίβου κοινή σε πρωτεΐνες χρωμόσωμα διαχωρισμού, αν και η βαλίνη σε ισολευκίνη υποκατάσταση προσδιορίζονται εδώ είναι πιθανό να είναι ουδέτερη.

Μοτίβα βάσης υποκατάσταση

θέλαμε να αξιολογήσει κατά πόσον το σχέδιο του ενιαίου υποκαταστάσεις βάσεων σε Capan-1 αντανακλούσε εκείνη των άλλων γονιδιωμάτων καρκίνο. Τα προηγουμένως δημοσιευθεί γονιδιώματα ανθρώπινη κυτταρική σειρά, COLO-829 [36], και ΝΟΙ-Η209 [24] κάθε παρουσιάζουν ένα χαρακτηριστικό πρότυπο υποκαταστάσεις βάσεων, αντιπροσωπευτικό της υν και καρκινογόνο καπνό έκθεσης, αντίστοιχα. Έχουμε λάβει τα δεδομένα από αυτές τις μελέτες, εκτός από εκείνη του γλοιοβλαστώματος κυτταρική γραμμή U87 MG [56], και μια βασική-σαν όγκου μαστού [57], για σύγκριση με Capan-1. Συγκριτική ανάλυση αυτών των αλληλουχιών πρότεινε ότι Capan-1 δεν εμφανίζουν προφανή μοτίβο υποκαταστάσεις βάσεων ή μια μοναδική υπογραφή αντιπροσωπευτικό μιας συγκεκριμένης μεταλλαξιογόνο. Η πλειοψηφία των κωδικοποίησης αντικαταστάσεις (-45%) σε Capan-1 ήταν C & gt? T /G & gt? Α, αν και αυτά δεν ήταν τόσο κυρίαρχη όπως παρατηρήθηκε σε COLO-829 κύτταρα, όπου C & gt? T μεταβάσεις σε χώρους dipyrimidine, ενδεικτικό της έκθεση στην υπεριώδη ακτινοβολία , κυριαρχούν [36] (Σχ. 2D). Με βάση τον περιορισμένο αριθμό των γονιδιωμάτων καρκίνου που έχουν αλληλουχία μέχρι σήμερα, το μοτίβο των αντικαταστάσεων βάσεως που παρατηρείται για Capan-1 μοιάζει περισσότερο με εκείνη των U87 MG και της βασικής-όπως ο καρκίνος του μαστού, μόνο που διαφέρουν σημαντικά στο ποσοστό των Α & gt? G /T & gt?. C μεταλλάξεις (Εικ. 2D)

Συγκρίναμε επίσης το πρότυπο των υποκαταστάσεις βάσεων σε Capan-1 σε ολόκληρο το γονιδίωμα σε σχέση με το exome. Παρατηρήσαμε ότι το σχέδιο ήταν σε μεγάλο βαθμό η ίδια σε κωδικοποίηση και μη κωδικές περιοχές, εκτός από το ότι η C & gt? T /G & gt? Ένα μεταλλάξεις εκπροσωπήθηκαν σε υψηλότερη συχνότητα στο exome, με ταυτόχρονη χαμηλότερα νούμερα της A & gt? C /T & gt? G αντικαταστάσεις (Σχ. 2Ε).

Χαρακτηρισμός κωδικοποίησης indels

Όσον αφορά την SNVs, μυθιστόρημα indels εντοπίζονται στην κυτταρική γραμμή Capan-1 διηθήθηκαν σύμφωνα με τον αριθμό αντιγράφων. Σημειώσαμε ότι το 93 γονίδια είχαν επηρεαστεί από μικρό indels, που κυμαίνονται από ένα έως έξι ζεύγη βάσεων (Πίνακας S8). Περισσότερες απαλοιφές ταυτοποιήθηκαν σε σύγκριση με ενθέσεις (Πίνακας 5), όπως θα αναμενόταν από τη χρήση μεθόδων gapped-ευθυγράμμισης. 18 από τα indels (εννέα προσθήκες, εννέα διαγραφές) ήταν ομοζυγώτες παραλλαγές, ενώ 62 ήταν ετερόζυγο (27 εισαγωγές, 35 διαγραφές). Παρομοίως με την SNVs, εφέ παραλλαγή ταξινομήθηκαν σύμφωνα με μεταγραφή (163 κατά μήκος των 93 γονίδια), και η πλειοψηφία των indels (72%) ανιχνεύθηκαν σε μη-κωδικοποιητικές περιοχές. Μόλις το 13% των indels προκάλεσε πλαισιοτροποποιήσεων και 15% επηρεάζονται συρραφής-sites. Το σήμα κατατεθέν

BRCA2 c.6174delT

μετάλλαξη στο Capan-1 [14], [15] ήταν ένα από τα 15 γονίδια που σκόραρε όπως επηρεάζεται από πλαισίου κωδικοποίησης διαγραφές.

Η

Ένα υποσύνολο των κωδικοποίησης πλαισιοτροποποιήσεων υψηλής αξιοπιστίας ελέγχθηκε με PCR και αλληλούχιση συμβατικά Sanger, χρησιμοποιώντας ένα δείγμα γονιδιωματικού DNA βιολογική αντιγραφή. Οκτώ νέα πλαισιοτροποποιήσεις (ομόζυγη:

PAPLN

? Ετερόζυγος:

ΕΡΗΒ2

,

LRRC7

,

DDIT4L

,

ADD3

,

SF1

,

C17orf57

, και

ZNF599

) που υπάρχει σε Capan-1 αλλά δεν ανιχνευθεί στα γονιδιώματα HapMap επιβεβαιώθηκαν με αλληλούχιση Sanger, εκτός από μια περαιτέρω 17 πλαισιοτροποποιήσεις και 10 τρεις indels ζευγών βάσεων που είναι κοινές στα δύο Capan-1 και HapMap. Όλα τα νέα μετατοπίσεις πλαισίου, καθώς και τα indels εντός πλαισίου, οι επικυρώνονται από αλληλούχιση Sanger (Σχ. 3A-D και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Πέντε από τις πλαισιοτροποποιήσεων χαμηλό επιτόκιο που απέτυχε να περάσει τα αυστηρά φίλτρα δεν μπορούσε να επιβεβαιωθεί, υποστηρίζοντας την εγκυρότητα της ανάλυσης μας. Μερικά από τα γονίδια που επηρεάζονται από μετατοπίσεις πλαισίου, όπως

ΕΡΗΒ2

, έχουν στο παρελθόν που σχετίζονται με ογκογένεση σε άλλα όργανα [58], αυξάνοντας την πιθανότητα ότι ένας αριθμός από αυτά μπορεί να αντιπροσωπεύουν νέες μεταλλάξεις οδηγού.

Α. Χρωματογράφημα που απεικονίζει τη διαγραφή της C (επισημαίνονται με μπλε χρώμα) στο

PAPLN

ανιχνευθεί για Capan-1. Η γονιδιωματική αλληλουχία αναφοράς φαίνεται πάνω από την χρωματογράφημα. Το βέλος δείχνει την θέση της διαγραφής. Β Ως Α, για τη διαγραφή των C σε

ΕΡΗΒ2

. C. Όπως Α, Τ & gt? C SNV και τη διαγραφή των T στο

DDIT4L

. D. Όπως Α, διαγραφή AG στο

ZNF599

. Ε σύγκριση του ποσοστού των indels των 1, 2, 3, ή & gt? 4 bp μήκους που πλαισιώνονται από ομολογία σε Capan-1, COLO-829, COLO-829BL, PD3689a, και PD3690a. Η ομολογία ορίζεται ως έχον την ίδια αλληλουχία με τις εισαχθεί ή διαγραφεί βάσεις είτε αμέσως 5 ‘ή 3’ της Indel, όπως αντιπροσωπεύεται από τα παραδείγματα.

Η

πλαίσιο Ακολουθία indels

έχει υποτεθεί ότι οι ατέλειες σε ομόλογο ανασυνδυασμό, όπως αυτές που προκύπτουν από την απώλεια της λειτουργίας του BRCA2, μπορεί να οδηγήσει σε αύξηση μικρές διαγραφές [10], [59]. Αυτά μπορεί να συνοδεύεται από επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες, εάν οι εναλλακτικές διαδικασίες του DNA διπλό σκέλος επισκευή διάλειμμα, όπως μη ομόλογες τέλος ενώνει ή μονόκλωνης ανόπτησης που εμπλέκονται στην αποκατάσταση [10], [15], [59]. Σε αυτή τη βάση, εξετάσαμε το άμεσο πλαίσιο αλληλουχία των μικρών indels ανιχνεύονται στο γονιδίωμα Capan-1, και σε σύγκριση αυτών με τα δύο

BRCA2

ελλιπή ως όγκοι αλληλουχία στο σύνολο δεδομένων Stephens [27], εκτός από το

BRCA

-proficient COLO-829 και COLO-829BL ζεύγος [36]. Indels σε κατηγορίες ανάλογα με το μήκος (1, 2, 3, ή 4+ bp), και βαθμολογήθηκαν για το εάν η πλευρική αλληλουχία είτε 5 ‘ή 3’ της Indel ήταν πανομοιότυπη με την αλληλουχία εισάγεται /διαγραφή (Σχ. 3Ε). Στη σύγκριση /HapMap Capan-1, περισσότερο από το 60% των indels ανιχνεύονται σε Capan-1 ήταν ταυτόσημη με την πλευρική αλληλουχία. Αυτό είναι σημαντικά περισσότερο από ό, τι θα αναμενόταν από την τύχη και μόνο (50, 12.5, 3 και 0,8% αντίστοιχα για 1, 2, 3, και 4 bp Indel) και ήταν σημαντικά μεγαλύτερη από αυτή που παρατηρήθηκε στην in COLO-829 /Colo- 829Bl σύγκρισης, όπου προφανώς HR είναι ενεργός. Capan-1 παρουσιάζει μια μεγαλύτερη συχνότητα indels συνδέεται με ομολογία από COLO829 παρά το πολύ υψηλότερο βάθος γονιδιωματικής αλληλουχίας που παράγονται για COLO829. Ως εκ τούτου, οι παρατηρήσεις που διατυπώθηκαν για Capan-1 είναι απίθανο να είναι ένα τεχνούργημα που προκύπτουν από τις διαφορές σε βάθος αλληλουχίας. Περαιτέρω, η σύνδεση μεταξύ indels και πλευρικές ομολογία παραμένει υψηλή για όλα τα μήκη των indels σε Capan-1, η οποία έρχεται σε αντίθεση με τις άλλες κυτταρικές γραμμές (Σχ. 3Ε). Οι

BRCA2

ελλιπή ως δείγματα όγκων PD3689a και PD3690a έχουν χαμηλότερες συχνότητες της indels πλαισιώνεται από την ομολογία, αν και είναι πιθανό ότι τα ποσοστά αυτά υποεκπροσωπούνται λόγω του χαμηλού βάθους αλληλουχία που χρησιμοποιείται στην ανάλυση τους (Εικ. 3Ε) . Στο σύνολό τους, η παρατήρηση αυτή υποδηλώνει ότι

BRCA2

ελλιπή ως καρκινικά κύτταρα μπορεί να έχουν προδιάθεση σε μια πιο συχνή εμφάνιση της indels σε σύντομο επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες.

Συζήτηση

Εδώ έχουμε παράγονται η πρώτη ολοκληρωμένη ανάλυση της αλληλουχίας του γονιδιώματος του

BRCA2

ελλιπή ως κυτταρική σειρά. Αντιπροσωπεύει επίσης την πρώτη τέτοια αλληλουχία ενός ευρέως χρησιμοποιούμενη κυτταρική γραμμή που λαμβάνεται από παγκρεατικό όγκο.