Abstract

υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR), ενός υποδοχέα κινάσης τυροσίνης το οποίο προάγει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την επιβίωση, είναι αφύσικα υπερεκφράζεται σε πολλούς όγκους του επιθηλιακής προέλευσης, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του παχέος (CRC). Οι EGFR μονοκλωνικά αντισώματα έχουν αποδειχθεί ότι αυξάνουν την μέση επιβίωση και έχουν εγκριθεί για τη θεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου. αποακετυλασών ιστόνης (HDACs), συχνά υπερεκφράζεται σε καρκίνο του παχέος εντέρου και πολλές κακοήθειες, είναι ένα άλλο ελκυστικούς στόχους για τη θεραπεία του καρκίνου. Αρκετοί αναστολείς των HDAC (HDACi) ανέπτυξε και παρουσιάζει ισχυρές ικανότητες κατά του όγκου. Σε αυτή τη μελέτη, τα ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παχέος σε επεξεργασία με HDACi παρουσίασαν μειωμένη έκφραση EGFR, έτσι διαταράσσεται EGF-επαγόμενη φωσφορυλίωση ERK και Akt. HDACi μείωσε επίσης την έκφραση του SGLT1, ενός ενεργού μεταφορέα γλυκόζης βρέθηκε να σταθεροποιηθεί με EGFR, και κατέστειλε την πρόσληψη της γλυκόζης από τα καρκινικά κύτταρα. HDACi κατέστειλε την μεταγραφή του EGFR και HDACs κατηγορίας Ι αποδείχθηκαν να συμμετέχουν σε αυτή την εκδήλωση. Χρωματίνης ανάλυση ανοσοκαθίζησης έδειξαν ότι HDACi προκάλεσε τον διαχωρισμό του SP1, HDAC3 και CBP από υποκινητή EGFR. Τα στοιχεία μας πρότεινε ότι HDACi θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως μονοθεραπεία για να εμποδίσει τόσο EGFR και HDAC, και μπορεί να φέρει περισσότερα οφέλη για την ανάπτυξη της θεραπείας CRC

Παράθεση:. Chou CW, Wu MS, Huang WC, Chen CC ( 2011) HDAC αναστολή Μειώνει την έκφραση του EGFR σε κύτταρα του καρκίνου του παχέος εντέρου. PLoS ONE 6 (3): e18087. doi: 10.1371 /journal.pone.0018087

Επιμέλεια: Chris Chan, Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: 23 Αυγούστου 2010? Αποδεκτές: 24, Φεβρουαρίου, 2011? Δημοσιεύθηκε: 25 Μαρτίου, 2011

Copyright: © 2011 Chou et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από μια ερευνητική επιχορήγηση από το Εθνικό Επιστημονικό Συμβούλιο της Ταϊβάν. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

EGFR (επίσης γνωστή ως ErbB-1 /HER1), η οποία ανήκει στην οικογένεια ErbB υποδοχέων-κινασών τυροσίνης, περιλαμβάνει μία εξωκυτταρική περιοχή σύνδεσης συνδετήρα, ένα ενιαίο υδρόφοβο διαμεμβρανική περιοχή και μια περιοχή κινάσης που περιέχει κυτταροπλασματική τυροσίνη [1]. επάγει σύνδεσης συνδετήρα ομο- ή ετερο-διμερισμό του υποδοχέα και την επακόλουθη ενεργοποίηση των οδών συμπεριλαμβανομένων των Ras /Raf /MEK /ERK και PI3K /ΡϋΚ1 /Akt [1]. Οι περισσότεροι από ορθοκολικό καρκίνο (CRC) χαρακτηρίζεται με υπερέκφραση του υποδοχέα επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) και προβλεπόμενη με υψηλό κίνδυνο μετάστασης και της επανάληψης [2]. Στόχευση EGFR φαίνεται να είναι μια πολλά υποσχόμενη προσέγγιση για την θεραπεία CRC. Πράγματι, το cetuximab, ένα αντίσωμα χιμαιρική IgG1 ανθρώπου-ποντικού δεσμεύεται με την εξωτερική περιοχή του EGFR, έχει εγκριθεί από το FDA το 2004 για τη θεραπεία του μεταστατικού καρκίνου του παχέος εντέρου [3]. Μετά από αυτό, ένα πλήρως εξανθρωπισμένο αντίσωμα, panitumumab, έχει επίσης εγκριθεί για τη θεραπεία της CRC [4]. Ωστόσο, συσσωρεύονται ενδείξεις δείχνουν ότι οι επιπτώσεις της στόχευσης EGFR σε καρκίνο του παχέος εντέρου περιορίζεται σε μεγάλο βαθμό λόγω της κατάστασης της μετάλλαξης του KRAS [5]. Οι μεταλλάξεις KRAS παρακάμψει EGFR να ενεργοποιήσει τα σήματα Ras /Raf /MEK /ERK, και σημαντικά αποδυναμώσει το θεραπευτικό αποτέλεσμα του cetuximab [6]. Εξέταση της κατάστασης KRAS αποτελεί πλέον προϋπόθεση για τη χρήση του cetuximab [7]. Παρά το γεγονός ότι περίπου 60% των ασθενών με CRC εξέφρασε άγριου τύπου KRAS, αλλά μόνο οι μισοί από αυτούς επωφελείται από cetuximab. Ως εκ τούτου, η κατάσταση KRAS δεν είναι το μόνο καθοριστικό παράγοντα για την αποτελεσματικότητα της θεραπείας με στόχο EGFR [8]. Επομένως, η θεραπεία με ένα ευρύ φάσμα γενετικών υποβάθρων χρειάζεται επειγόντως και θα επωφεληθούν οι περισσότεροι ασθενείς irresponsive σε θεραπείες που βασίζονται cetuximab.

Αν και EGFR είναι μία κινάση τυροσίνης υποδοχέα και παραδίδει τα σήματα μετά τη σύζευξη συνδετήρα, prosurvival αποτέλεσμα της μπορεί να είναι ανεξάρτητη για να κινάσης. Για παράδειγμα, ποντικοί που έχουν έλλειψη του EGFR είναι εμβρυϊκά θανατηφόρες αλλά αυτές που φιλοξενεί μεταλλάξεις κινάση ανενεργού εμφανίζουν μόνο μερικά επιθηλιακά ελαττώματα [9], [10]. Επιπλέον, η απώλεια της δράσης της κινάσης του EGFR φρενάρει κύτταρο proliferaiton αλλά η απώλεια της έκφρασης του καταστρέφει την πρόσληψη γλυκόζης και οδηγεί σε κυτταρικό θάνατο [11] – [13]. Ως εκ τούτου, η αναστολή της έκφρασης του EGFR μπορεί να είναι μια καλύτερη στρατηγική για τη θεραπεία CRC.

αποακετυλάσες ιστόνης (HDACs), η οποία απομακρύνει τις ακετυλομάδες από ιστόνης να φιμώσουν τη μεταγραφή του γονιδίου είναι ιδιαίτερα εκφράζονται σε διάφορους όγκους [14], [15 ]. HDACs έχουν καταστεί μία από τις αναδυόμενες στόχων για τη θεραπεία του καρκίνου, και αναστολείς HDAC (HDACi) δείχνουν ελπιδοφόρα αντικαρκινική δραστηριότητα [15]. Μεταξύ των διαφόρων HDACi, SAHA (Vorinostat) είχε επιτυχώς εγκριθεί για τη θεραπεία του λεμφώματος δερματικών κυττάρων Τ (CTCL). οικογένεια HDAC μπορούν να υποδιαιρεθούν σε τέσσερις κατηγορίες και ο κατηγορίας Ι HDACs, το οποίο περιλαμβάνει HDAC1, HDAC2, HDAC3 και HDAC8, έχουν αναφερθεί ότι είναι άκρως εκφρασμένη σε καρκίνο του παχέος εντέρου [16]. Τα προ-πολλαπλασιαστικά αποτελέσματα της HDACs συνδέονται με τη μεταγραφική καταστολή των cdk-αναστολέα, ρ21, και knockdown του HDAC 1, 2 και 3 μείωσε την ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου αρκετών κυττάρων [17]. Ως εκ τούτου, HDAC μπορεί να χρησιμεύσει ως ένας πιθανός στόχος για θεραπεία CRC, και SAHA είχε τεθεί κλινικές δοκιμές για τη θεραπεία της CRC [18].

Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι η σηματοδότηση EGF σε μεταλλαγμένες κυτταρικές σειρές KRAS, HCT116 και SW480, διαταράχθηκε με HDACi μέσω μεταγραφικής καταστολής της έκφρασης EGFR, υποδεικνύοντας ότι HDACi χρησίμευσε ως μονοθεραπεία για να εμποδίσει EGFR και HDAC ταυτοχρόνως. Απώλεια EGFR συνέβαλε εν μέρει στην κυτταροτοξική δράση των αναστολέων HDAC. Επιπλέον, η έκφραση του SGLT1, μιας δραστικής μεταφορέα γλυκόζης η οποία σταθεροποιείται από EGFR, επίσης μειώθηκε κατά HDACi και οδήγησε στην μείωση της πρόσληψης γλυκόζης σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου. Ο μηχανισμός βασίζεται η μεταγραφική καταστολή του EGFR με HDACi ενεπλάκη με την ιστόνες υποακετυλίωση και τη διάσταση του SP1, HDAC3 και CBP από υποκινητή EGFR. Τα στοιχεία μας πρότεινε ότι HDACi θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως μονοθεραπεία για να εμποδίσει ταυτόχρονα τόσο EGFR και HDAC, και μπορεί να αποφέρει οφέλη στους ασθενείς CRC με ένα ευρύτερο φάσμα γενετικό υπόβαθρο.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Όλα τα δείγματα που λαμβάνονται από ασθενή συλλέχθηκαν και αρχειοθετούνται σύμφωνα με τα πρωτόκολλα έχουν εγκριθεί από Θεσμική Επιτροπή για την Έρευνα του Εθνικού Ταϊβάν Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο και υποστηρίζεται από το Εθνικό Επιστημονικό Συμβούλιο, την Ταϊβάν. Μια πλήρης προφορική εξήγηση της μελέτης δόθηκε σε όλους τους συμμετέχοντες. Θα συναινέσει να συμμετάσχουν σε εθελοντική βάση.

Υλικά |

TSA αγοράστηκε από Sigma και SAHA ελήφθησαν από τη Merck. Οι Μγο-tagged HDAC1, 2 και 3, δόθηκαν από τον Dr. WM Yang (NCHU, Ταϊβάν). Αντισώματα ειδικά για EGFR, p21, HDAC3, και ακτίνης αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology. Anti-Ac-ιστόνης αντισώματα Η3, Η4, και Sp1 λήφθηκαν από Upstate. Αντι-SGLT1 αντίσωμα αγοράστηκε από Abcam.

Κυτταρική καλλιέργεια

HCT-116 (από Van Dyke MW, MD Anderson) και SW480 (από Θ Leu, NCKU) ανθρώπινα κύτταρα του παχέος εντέρου καρκίνωμα καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό? Α431 (κύτταρα ανθρώπινου επιδερμοειδούς καρκινώματος) και MDA-MB-468 (κύτταρα αδενοκαρκινώματος ανθρώπινου μαστού) που ελήφθη από την ATCC διατηρήθηκαν σε RPMI συμπληρωμένο με 10% FCS.

απομόνωση RNA, RT-PCR και PCR σε πραγματικό χρόνο

Το ολικό RNA απομονώθηκε από την κυτταρική HCT116 χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Technology Life). Η αντίστροφη αντίδραση μεταγραφής διεξήχθη χρησιμοποιώντας 2 μg του συνολικού RNA, αντίστροφη μεταγραφή σε cDNA χρησιμοποιώντας ολίγο dT εναρκτήρα. cDNA υποβλήθηκε σε RT-PCR και ενισχύθηκαν 30 κύκλους χρησιμοποιώντας δύο ολιγονουκλεοτιδικούς εκκινητές που προέρχονται από δημοσιευμένες EGFR ή αλληλουχία GAPDH, συμπεριλαμβανομένων 5′- TGGAGCTACGGGGTGACCGT-3 ‘και 5′-GGTTCAGAGGCTGATTGTGAT-3′ (EGFR), 5’-AAGCCCATCACCATCTTC-CAG- 3 ‘και 5′-AGGGGCCATCCACA-GTCTTCT-3′ (GAPDH) και 5’-TGAC-GGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA-3 ‘και 5′-CTAGAAGCATTTGCG-GGGACGATGGAGGG-3′ (ακτίνη). Τα προϊόντα της PCR υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 1.2% και οπτικοποιήθηκαν με χρώση βρωμιούχου αιθιδίου. Πραγματικού χρόνου PCR διεξήχθη με δείγματα cDNA χρησιμοποιώντας την ΑΒΙ Prism 7900 Σύστημα Ανίχνευσης Αλληλουχίας (Applied Biosystems, Foster City, CA). Οι εκκινητές ήταν ως ακολούθως: EGFR (εμπρόσθιος εκκινητής, 5’-TTCCTCCCAGTGCCTGAAT-3 ‘ανάστροφος εναρκτήρας, 5′-GGTTCAGAGGCTGAT-TGTGAT-3′)? Ακτίνης (εμπρόσθιος εκκινητής, 5’-CCAACCG-CGAGAAGATGA-3 ‘? Αντίστροφος εκκινητής, 5′-TCCATCACGATGCCAGTG-3’). Τα δεδομένα κανονικοποιήθηκαν από την ακτίνη ανίχνευση γονιδίου καθαριότητας.

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων

Για την ανάλυση αναστολής ανάπτυξης, τα κύτταρα HCT116 σπάρθηκαν σε πυκνότητα 3 × 10

3 κύτταρα ανά φρεάτιο σε 96 -Καλά πλάκες. Μετά τη σπορά, το μέσο ανάπτυξης αντικαταστάθηκε με μέσο που περιείχε υποδεικνύεται συγκέντρωση TSA. Μετά από 3 ημέρες, η ανάπτυξη των κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας 3- βρωμίδιο (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου (Sigma, St. Louis, ΜΟ) χρωματομετρική μέθοδο. κυτταρικού κύκλου προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας ένα ρυθμιστικό ιωδιούχου προπιδίου λεκέ και αναλύθηκαν σε FACS Calibur BD κυτταρόμετρο με το λογισμικό Cellquest.

Μέτρηση της γλυκόζης Ενδοκυττάρια

πριν από τη συγκομιδή, προσκολλημένες καλλιέργειες ελέγχου και TSA-επεξεργασμένα κύτταρα σε DMEM που περιέχει 1 ή 4,5 mg /ml γλυκόζη πλύθηκαν δύο φορές με ψυχρό φωσφορικά ρυθμισμένο αλατούχο διάλυμα (PBS) και στη συνέχεια λύθηκαν με ιόντα Freeh

2O για 5 λεπτά σε πάγο. Η περιεκτικότητα σε γλυκόζη μετρήθηκε με κιτ μέτρησης D-γλυκόζη (GAHK-20, Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

Παροδική επιμόλυνση και δραστικότητα λουσιφεράσης δοκιμασία

Το πλασμίδιο υποκινητής EGFR που περιέχει μια λουσιφεράση πυγολαμπίδας διαμολύνθηκε παροδικά σε HCT116 κύτταρα με το αντιδραστήριο διαμόλυνσης αρρεστίνης. Εν συντομία, 0,9 μg DNA πλασμιδίου, 0.1 μ§ της λουσιφεράσης της Renilla, και 5 υί αντιδραστήρια επιμόλυνσης αναμίχθηκαν, και το πρωτόκολλο διαμόλυνσης διεξήχθη σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Promega). Έξι ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν κατά τον συνήθη πλήρες μέσο για άλλες 16 ώρες. Στη συνέχεια, τα επιμολυσμένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε δοκιμασία λουσιφεράσης. Η δραστηριότητα της λουσιφεράσης της πυγολαμπίδας κανονικοποιήθηκε προς εκείνη της λουσιφεράσης Renilla.

Παρασκευή και μόλυνση του shHDAC εκφράζουν lentivirus

Εν συντομία, 6 μg ρΟΜν-dR8.91, 3 μg pMD2.G, και 9 μg pLKO-shLuciferase, pLKO-shHDAC1, pLKO-shHDAC2 ή pLKO-shHDAC3 διαμολύνθηκαν ταυτόχρονα σε κύτταρα ΗΕΚ293Τ χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen). Τα υπερκείμενα που περιέχουν μολυσματικές shLuciferase, shHDAC1, shHDAC2 ή shHDAC3 φακοϊό συλλέχθηκαν την ημέρα 3 μετά την επιμόλυνση και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C. Για φακοϊού λοίμωξη, 2 × 10

5 κύτταρα HCT116 μολύνθηκαν με shLuciferase, shHDAC1, shHDAC2 ή shHDAC3 φακοϊού σε μια πολλαπλότητα μόλυνσης (ΜΟΙ) 1.

Ασθενείς και δείγμα της προετοιμασίας

Δείγματα ιστού του όγκου και παρακείμενο φυσιολογικό ιστό του παχέως εντέρου ελήφθησαν από 14 ασθενείς οι οποίοι έχουν διαγνωσθεί παθολογικά καρκίνο του παχέος εντέρου και υποβλήθηκε σε χειρουργική εκτομή στο Εθνικό Πανεπιστήμιο της Ταϊβάν Hospital. Δείγματα ιστού αλέστηκαν και στη συνέχεια επεξεργασία με υπερήχους σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (50 mM Tris-HCl, ρΗ 7.4, 1 mM EGTA, 150 mM NaCl, 5% Triton Χ-100) με αναστολείς πρωτεάσης. Τα δείγματα μικροφυγοκέντρηση για να απομακρυνθεί το μεγαλύτερο συντρίμμια και υποβλήθηκαν σε ανάλυση Western.

χρωματίνης δοκιμασία ανοσοκαταβύθισης

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 μΜ SAHA επί 6 ώρες και διασυνδεδεμένη με 1,42% φορμαλδεΰδη για 15 min. Τα κύτταρα σε δύο τρυβλία 10 cm αποξέστηκαν σε 1 ml ψυχρού PBS, φυγοκεντρήθηκαν και λύθηκαν σε 1 ml ρυθμιστικού διαλύματος ΙΡ (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, ρΗ 7,5, 5 mM EDTA, 0,5% Nonidet Ρ-40 και 1% Triton Χ-100) που περιέχει αναστολείς πρωτεάσης (1 mM φαινυλομεθυλοσουλφονυλοφθορίδιο, 1 μΜ λευπεπτίνη και 1 μΜ απροτινίνη). Το πυρηνικό δισκίο εναιωρείται εκ νέου σε ρυθμιστικό διάλυμα ΙΡ και υπερηχήθηκε σε διάτμηση χρωματίνης. Τα προϊόντα λύσης σε επεξεργασία με υπερήχους immunoprecipited με αντισώματα έναντι SP1, AcH3, AcH4, H3K4Me2, CBP και HDAC3, αντίστοιχα, και τα ανοσοσύμπλοκα ανακτήθηκαν με πρωτεΐνη A-Sepharose (Roche). Το ανοσοκαταβυθισμένο DNA και εισαγωγής DNA εκχυλίστηκαν με επώαση με 100 μΙ 10% Chelex (Bio-Rad), το βράσιμο για να αντιστραφεί η διασταυρούμενη σύνδεση, και φυγοκέντρηση για την απομάκρυνση πολτού Chelex. Real-time PCR πραγματοποιήθηκε με το καθαρισμένο DNA χρησιμοποιώντας τους ακόλουθους εκκινητές: Α: 5′- GTGAAAAACCCCACCGTTC-3 ‘και 5′-TCTGAAGGGGAGCAACCTTA-3′? Β: 5’-AAGCTTCCGCGAGTTTCC-3 ‘και 5′-GAGGCTAAGTGTCCCACTGC-3′? C: 5’-ACCCTGGCACAGATTTGG-3 ‘και 5′-TGAGGAGTTAATTTCCGAGAGG-3′? D: 5’-CCAGTATTGATCGGGAGAGC-3 ‘και 5′-TTCCTCCAGAGCCCGACT-3′? Ε:. 5’-CTGAGGAAGGAACCCAAAAA-3 ‘και 5′-AGC GGGAGGTCCTCTCAGAA-3’

Στατιστική ανάλυση

εις τριπλούν πειράματα διεξήχθησαν και τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SE. t τεστ δύο tailed Student χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό της στατιστικής σημαντικότητας μεταξύ των ομάδων

Αποτελέσματα

αναστολείς HDAC διαταράξει το ΕΤΠ σηματοδότηση μέσω φίμωση υποδοχέα EGF (EGFR) έκφραση

Για να εξετάσει την αντικαρκινική δράση του HDACi σε καρκίνο του παχέος εντέρου, KRAS άγριου τύπου (WiDr και ΗΤ29) και των μεταλλαγμένων κυττάρων KRAS (HCT116 και SW480) υποβλήθηκαν σε θεραπεία με SAHA ή cetuximab για 48 ώρες, και η κυτταρική βιωσιμότητα μετρήθηκε. SAHA μείωσε την επιβίωση αυτών των κυττάρων με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Εικ. 1Α), γεγονός που υποδηλώνει την ανεξαρτησία της κατάστασης KRAS σχετικά με την αντικαρκινική δράση του HDACi. Σε αντίθεση, το cetuximab είχε μικρή επίδραση επί της κυτταρικής βιωσιμότητας (Σχ. 1Α). Αυτό το αποτέλεσμα είναι συνεπές με την προηγούμενη μελέτη ότι ορθοκολικού καρκίνου κύτταρα κατεργασμένα με cetuximab σκοτώθηκαν πιο αποτελεσματικά από εξαρτώμενη από αντίσωμα κυτταρική κυτταροτοξικότητα (ADCC), η οποία είναι απούσα σε

in vitro

σύστημα [19]. Από EGFR διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην CRC, η ικανότητα του συνδέτη της για να τεθεί ο μεταγενέστερος σήματος σε μεταλλαγμένα κύτταρα KRAS εξετάστηκε. EGF προκάλεσε Akt και ERK φωσφορυλίωση τόσο σε κύτταρα HCT116 και επαγόμενη ενεργοποίηση ERK σε κύτταρα SW480 (Εικ. 1Β), υποδεικνύοντας ότι KRAS μετάλλαξη δεν λαμβάνει πλήρως κατά τη διάρκεια της ενεργοποίησης ERK που προκαλούνται από συνδετήρα και επίσης impling τη σημασία του EGFR σε μεταλλαγμένα κύτταρα KRAS . Επιπλέον, η προθεραπεία με αναστολείς HDAC, TSA και SAHA, διαταράσσεται η EGF-διεγερμένα ERK και φωσφορυλίωση της Akt σε κύτταρα HCT116 και φωσφορυλίωση ERK σε κύτταρα SW480 (Εικ. 1 C). Δεδομένου ότι οι αναστολείς HDAC μπλοκάρει τόσο Akt και ERK φωσφορυλιώσεις, το πολύ εγγύς συστατικό της σηματοδότησης του ΕΤΠ θα μπορούσε να στοχεύσει η HDACi. Ως εκ τούτου, Αρχικά εξετάστηκε η έκφραση του υποδοχέα EGF. Μετά τη θεραπεία με TSA, η έκφραση του EGFR ήταν μειωμένη σε HCT116, SW480 και κύτταρα ΗΤ29. Για να προσδιοριστεί εάν αυτό είναι ένα κοινό φαινόμενο, χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα προέρχονταν από διαφορετικά όργανα. Μετά τη θεραπεία με TSA, η μειωμένη έκφραση EGFR παρατηρήθηκε επίσης στο ανθρώπινο δέρμα (Α431) και μαστού (MDA-ΜΒ468) καρκινικών κυττάρων (εικόνα 1δ).

(Α) HCT116, SW480, WiDr και κύτταρα ΗΤ29 διατηρήθηκαν σε DMEM με 1 mg /ml γλυκόζης και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 0,1, 1, 10 μg /ml cetuximab ή 1, 3, 5 μΜ SAHA η επιβίωση των κυττάρων μετρήθηκε με δοκιμασία ΜΤΤ μετά από 48 ώρες θεραπείας (Β) HCT116 και SW480 κύτταρα ήταν τον ορό επί 24 ώρες και στη συνέχεια διεγέρθηκαν με 1 μΜ EGF επί 1, 5, 15, 30 και 60 λεπτά. (Γ) HCT116 και SW480 κύτταρα προ-επωάστηκαν με 0.5, 1 μΜ TSA ή 5 μΜ SAHA για 24 ώρες και στη συνέχεια διεγέρθηκαν με EGF για 5 λεπτά. (D) HCT116, SW480, Α431 και MDA-ΜΒ468 κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με 1 μΜ TSA επί 24 και από 36 ώρες ολόκληρου κυτταρόλυμα παρασκευάστηκε και υποβλήθηκε σε ανάλυση στυπώματος Western με αντισώματα ειδικά για φωσφο-Akt, φωσφόρου ΕΚΚ, Akt και ERK .

η

HDAC αναστολείς μειώνουν την έκφραση της SGLT1 και να μειώσει το

ενδοκυτταρικής γλυκόζης

Εκτός από τη σηματοδότηση EGF, EGFR έχει αναφερθεί ότι εμπλέκεται στη μεταφορά της γλυκόζης από τη συμμετοχή και τη σταθεροποίηση του ενεργός μεταφορέας γλυκόζης, SGLT1 [13], [20]. Δεδομένου ότι η έκφραση του EGFR μειώθηκε κατά HDACi σε CRC κύτταρα, εξετάστηκαν επίσης τα επίπεδα έκφρασης SGLT1 και ενδοκυτταρική γλυκόζη σε απόκριση HDACi. Όπως ήταν αναμενόμενο, TSA μείωσε την έκφραση SGLT1 (Σχήμα 2Α) και την ενδοκυτταρική συγκέντρωση γλυκόζης (Σχ. 2Β). Γλυκόζη αναπλήρωση διατήρησε την ενδοκυτταρική γλυκόζης (Σχ. 2C) και διασώθηκε κύτταρα από την TSA-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο (Σχ. 2D). Αυτά τα δεδομένα πρότειναν ότι η απώλεια του EGFR και τον εταίρο της, SGLT1, μπορεί να εμπλέκεται στην κυτταροτοξική δράση των αναστολέων HDAC.

(Α) κύτταρα HCT116 υποβλήθηκαν σε αγωγή με 1 μΜ TSA για 24, 36 ή 48 ώρες. Ολόκληρα λύμα κυττάρων παρασκευάστηκαν και υποβλήθηκαν σε ανάλυση κηλίδος Western με αντισώματα ειδικά για SGLT1, EGFR και ακτίνη. (Β) Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε DMEM με 1 mg /ml και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 1 μΜ TSA για 24 ώρες. Η περιεκτικότητα σε γλυκόζη μετρήθηκε όπως περιγράφεται στα υλικά και στην μέθοδο (δείγματα εις τριπλούν χρησιμοποιήθηκαν σε κάθε ομάδα Ο αστερίσκος υποδεικνύει σημαντική διαφορά με ρ & lt?… 0.05 ράβδοι σφάλματος δείχνουν μέση ± SE) (C) Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε DMEM με 1 mg /ml ή 4,5 mg /ml γλυκόζης και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 1, 3 ή 5 μΜ TSA για 24 ώρες. Η περιεκτικότητα σε γλυκόζη μετρήθηκε. (D) Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε DMEM με 1 mg /ml γλυκόζης και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 1 ή 3 μΜ TSA. Μετά από 24 ή 48 ώρες κατεργασίας, ο γλυκόζη ρυθμίστηκε σε 4,5 mg /ml. Η επιβίωση των κυττάρων μετρήθηκε με δοκιμασία ΜΤΤ μετά από 72 ώρες αγωγή με TSA. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SE από τρία ανεξάρτητα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

Η

απώλεια του EGFR έχει εμπλακεί σε HDAC αναστολέα κυτταροτοξικότητα

Οι αναστολείς HDAC δειχθεί ότι ασκούν δραστικότητα κατά του όγκου με συλλαμβάνοντας τον κυτταρικό κύκλο και την ενεργοποίηση της απόπτωσης [15]. Σταθερά, SAHA αύξηση του πληθυσμού υπο-G1 από 7,72% έως 17,23% και G2 /M του πληθυσμού από 16,6% σε 24,4% (Σχήμα 3Α). Για να διευκρινιστεί ο ρόλος του EGFR στην αντικαρκινική δράση της HDACi, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με myc-EGFR και στη συνέχεια κατεργάζεται με SAHA για 24 ώρες. Η υπερέκφραση του myc-tagged EGFR μείωσε τον πληθυσμό υπο-G1 και G2 /M του πληθυσμού (Σχήμα 3Α). SAHA επαγόμενη έκφραση ρ21 επίσης εξασθενίζει από την έκτοπη έκφραση του EGFR (Σχήμα 3Β). Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι το SAHA μειωμένη έκφραση EGFR συνέβαλαν στην SAHA επαγόμενη απόπτωση και κύκλου κυττάρου.

(Α) κύτταρα HCT116 διαμολύνθηκαν με Myc-EGFR, καθώς και τον έλεγχο των φορέων της και επιμολυσμένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 μΜ SAHA για 24 ώρες. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 70% αιθανόλη και χρωματίστηκαν με ιωδιούχο προπίδιο, και το κλάσμα του κυτταρικού κύκλου αναλύθηκε με κυτταρόμετρο ροής. (Β) κύτταρα HCT116 διαμολύνθηκαν με Myc-EGFR, καθώς και τον έλεγχο των φορέων της και τα διαμολυσμένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 μΜ SAHA για 24 ώρες. Ολόκληρα λύμα κυττάρων παρασκευάστηκαν και υποβλήθηκαν σε στύπωμα western χρησιμοποιώντας Ab ειδικά για EGFR, Myc, ρ21 και τουμπουλίνης.

Η είναι

HDACs εμπλέκονται στην μεταγραφή του EGFR

Δεδομένου ότι το ποσό του EGFR πρωτεΐνη είναι μειωμένη μετά την επεξεργασία με HDACi, εξετάστηκε η μεταγραφή του γονιδίου EGFR. Το επίπεδο του mRNA του EGFR μειώθηκε δραματικά μετά τη θεραπεία με TSA και SAHA (Σχήμα 4Α), γεγονός που υποδηλώνει HDACi ρυθμίζουν προς τα κάτω μεταγραφικά την έκφραση του EGFR. Το αποτέλεσμα αυτό επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με προσδιορισμούς δημοσιογράφος EGFR. αποτέλεσμα μας έδειξε ότι η TSA και SAHA μείωσε σημαντικά την δράση του υποκινητή EGFR (Σχήμα 4Β άνω πάνελ). Έχει αναφερθεί ότι HDACi μείωσε την σταθερότητα EGFR mRNA σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του μαστού ER-αρνητική [21]. Συνεπώς, εξετάστηκε η σταθερότητα του EGFR mRNA. Η

de novo

μεταγραφή σταμάτησε με ακτινομυκίνη D και το mRNA EGFR μετρήθηκε με PCR πραγματικού χρόνου. Η κλίση της αποικοδόμησης EGFR mRNA δεν έδειξε σημαντική διαφορά μεταξύ των βασικών και θεραπεία TSA (σχ. 4Β κάτω πλαίσιο), υποδεικνύοντας ότι HDACi δεν επηρέασε την αποικοδόμηση του EGFR mRNA σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα. Για να διευκρινιστεί περαιτέρω η εμπλοκή των HDACs στην μεταγραφή του EGFR, myc-tagged HDAC1, HDAC2 ή HDAC3 ήταν εκτοπικά εκφραζόμενη σε κύτταρα HCT116 και EGFR mRNA μετρήθηκε με RT-PCR. Μια αύξηση του EGFR mRNA βρέθηκε σε όλα αυτά τα κύτταρα που εκφράζουν HDAC-(Σχ. 4C ανώτερο πλαίσιο). Αντιστρόφως, knockdown του HDAC1, HDAC2 ή HDAC3 με shRNA μείωσε την έκφραση της πρωτεΐνης EGFR (4Γ κάτω πίνακας). Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι κατηγορίας Ι HDACs είναι ζωτικής σημασίας για την έκφραση EGFR. Η θετική συσχέτιση μεταξύ EGFR και έκφραση HDAC3 παρατηρήθηκε επίσης σε δεκατέσσερα ζεύγη ανθρώπινων καρκινικών κόλον και παρακείμενων φυσιολογικών ιστών (Εικ. 4D).

(Α) κύτταρα HCT116 υποβλήθηκαν σε αγωγή με 1 μΜ TSA ή 5 μΜ SAHA για 1 και 8 ωρών. Ολικό RNA (2 μα) χρησιμοποιήθηκε για RT-PCR και PCR πραγματικού χρόνου, όπως περιγράφεται. (Β, άνω πίνακας) κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με 1 μΜ TSA ή 5 μΜ SAHA για 6 ώρα, στη συνέχεια επιμολύνθηκαν με EGFR-Luc. Λουσιφεράσης δραστηριότητες μετρήθηκαν όπως περιγράφεται στο «Υλικά και Μέθοδος». (Β, κάτω πίνακας) κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με 1 μΜ TSA για 4 ώρες πριν τη σύνθεση του RNA διεκόπη με ακτινομυκίνη D (5 μg /ml) για 0, 2, 4 ή 6 ώρες. RNA παρασκευάστηκε σε υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία μετά την προσθήκη ακτινομυκίνης D και τα επίπεδα του EGFR mRNA μετρήθηκαν με πραγματικού χρόνου PCR. (C, άνω πάνελ) Κύτταρα διαμολύνθηκαν παροδικά με Myc-tagged HDAC1, 2 ή 3, αντίστοιχα, και το ολικό RNA (2 μα) χρησιμοποιήθηκε για RT-PCR για την ανίχνευση του επιπέδου EGFR mRNA. (C, κάτω πίνακας) κύτταρα επιμολύνθηκαν με shLuc, shHDAC1, shHDAC2 ή shHDAC3 από φακοϊό όπως περιγράφεται στο «Υλικά και Μέθοδος». Κυτταρολύματα συλλέχθηκαν την ημέρα 5 μετά την επιμόλυνση και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε ανάλυση κηλίδος Western με αντισώματα ειδικά για EGFR, HDAC1, HDAC2 και HDAC3. (D) Κυτταρολύματα ζεύγη ανθρωπίνων κανονικών και κακοηθών ιστών κόλου υποβλήθηκαν σε κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας αντι-ΕΟΡΚ, αντι-HDAC3 και αντι-ακτίνης αντισώματα. Η συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων του EGFR και της έκφρασης HDAC3 αξιολογήθηκε με συντελεστές συσχέτισης.

Η

SP1 είναι απαραίτητη για την μεταγραφή EGFR και αναστολέα HDAC διαταράσσει τη σύνδεση του SP1 με την υποστηρικτής EGFR

Υπάρχουν αρκετές SP1 θέσεις σύνδεσης επί των υποκινητών EGFR και προηγούμενες μελέτες μας έδειξαν ότι HDACi επηρεάζει την πρόσδεση του SP1 να ADAMTS1or ρ21 υποκινητές [22], [23]. Ως εκ τούτου, SP1 μπορεί να συμμετέχει στην έκφραση EGFR HDACs μεσολάβηση. Πράγματι, η αναστολή της SP1 με μιθραμυκίνη Α (ΜΤΜ) και siRNA μείωσε σημαντικά την έκφραση EGFR (Σχ.5 Α). Επιπλέον, ΜΤΜ μείωσε δραστικά την δραστηριότητα υποκινητή EGFR (ΕΙΚΟΝΑ 5Β), υποδεικνύοντας τον κρίσιμο ρόλο της SP1 σε γονιδίου EGFR μεταγραφής. Η σύνδεση του SP1 για τον υποκινητή EGFR εξετάζεται περαιτέρω από χρωματίνης ανοσοκατακρήμνιση (μάρκας). Πέντε ζεύγη εκκινητών (Α, Β, C, D και E) είχαν σχεδιαστεί για να καλύψει ομοιόμορφα τις περιοχές (-1.200 έως 1.000 bps) γύρω από το site έναρξης της μεταγραφής (Fig.6A). Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι η πρόσδεση του SP1 σε περιοχές C και D, μειώθηκε σημαντικά μετά την αγωγή με SAHA (Εικόνα 6Β). Επιπλέον, η ακετυλίωση της ιστόνης Η3 και Η4 με υποκινητή EGFR ήταν σε μεγάλο βαθμό μειωμένη, ιδιαίτερα στην κοντινή θέση έναρξης μεταγραφής περιοχές (Εικόνα 6Β). Εξετάστηκε επίσης η κατάσταση των ιστονών μεθυλίωσης όπως H3K4Me2, H3K9Me3 και H3K27Me3. SAHA δεν άλλαξε την κατοικία αυτών των δεικτών μεθυλίωσης με υποκινητή EGFR, παρά εμπλουτισμένου H3K4Me2 βρέθηκε (Εικόνα 6Β και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Δεδομένου ότι η ακετυλίωση των ιστονών Η3 και Η4 μειωθεί δραματικά μετά την αναστολή HDAC, εξετάστηκε η πληρότητα της ακετυλοτρανσφεράσης ιστόνης (HAT) ή HDAC με υποκινητή EGFR. αποτέλεσμα μας έδειξε ότι η πρόσληψη της CBP με την περιοχή D μειώθηκε σημαντικά από SAHA (Εικόνα 6Β). Είναι ενδιαφέρον ότι, η σύνδεση του HDAC3 στην D περιοχή ήταν εξασθενημένος, πολύ (Εικόνα 6Β). Αυτά τα δεδομένα έδειξαν την διάσταση του SP1, CBP και HDAC3 από υποκινητή EGFR συγχρόνως (Σχήμα 7), υπονοώντας ότι αυτές οι πρωτεΐνες μπορούν να επηρεάσουν το ένα το άλλο και επηρεάζουν την σύνδεση τους με τον προαγωγό EGFR.

(Α) τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με 1 μΜ Μιθραμυκίνη A (ΜΤΜ) για 18 ή 36 ώρες, τότε το συνολικό προϊόν λύσης κυττάρου παρασκευάστηκαν. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 0, 400 ή 800 pmole SP1 siRNA, τότε οι συνολικές κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν και υποβλήθηκαν σε ανάλυση κηλίδος Western με αντισώματα ειδικά για EGFR και SP1. (Β) Τα κύτταρα διαμολύνθηκαν με EGFR-Luc και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 0,1, 1 ή 5 μΜ Μιθραμυκίνη A (ΜΤΜ) για 16 ώρες. Λουσιφεράσης δραστηριότητες μετρήθηκαν όπως περιγράφεται στο «Υλικά και Μέθοδος». Τα αποτελέσματα κανονικοποιήθηκαν ως προς τη δραστηριότητα της λουσιφεράσης της Renilla και εκφράζονται ως μέσος όρος ± SE. Για τρία ανεξάρτητα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

Η

(Α) Απεικόνιση του υποκινητή EGFR και τον εκκινητή chip. (Β) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με SAHA για 8 ώρες, στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν, επεξεργασία με υπερήχους και υποβλήθηκαν σε ανοσοκατακρήμνιση χρωματίνης χρησιμοποιώντας Ab ειδικά κατά SP1 και ακετυλιωμένης ιστόνης Η3. Ιστόνης Η4 ακετυλίωση H3K4 διμεθυλίωση, CBP και HDAC3 με υποκινητή EGFR μετρήθηκε με δοκιμασίες ChIP όπως περιγράφεται στην ενότητα «Υλικό και Μέθοδος».

Η

Στη βασική κατάσταση, HDAC3, CBP και το SP1 ήταν τόσο προσληφθεί για να το περιοχή υποκινητή και υπεύθυνος για τη μεταγραφή του EGFR (Α).