Αφηρημένο

Ιστορικό

Τα microRNAs (miRNAs) έχουν εμπλακεί στην έναρξη και την εξέλιξη του καρκίνου μέσω της ικανότητάς τους να επηρεάζουν την έκφραση των γονιδίων και των πρωτεϊνών που ρυθμίζουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και /ή κυτταρικό θάνατο. Η μεταγραφή των τριών μελών της οικογένειας miRNA miR-34 βρέθηκε πρόσφατα να ρυθμίζεται άμεσα από ρ53. Μεταξύ των πρωτεϊνών στόχων ρυθμίζεται από miR-34 είναι πρωτεΐνες μονοπάτι Notch και Bcl-2, υποδηλώνοντας την πιθανότητα ενός ρόλου για miR-34 για τη συντήρηση και την επιβίωση των καρκινικών βλαστικών κυττάρων.

Μεθοδολογία /Principal Εκτίμηση

Εξετάσαμε τους ρόλους του miR-34 σε ρ53-μεταλλαγμένο ανθρώπινο παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές MIAPaCa2 και BxPC3, και η πιθανή σχέση προς τον καρκίνο του παγκρέατος βλαστικά κύτταρα. Αποκατάσταση miR-34 έκφραση στα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος είτε επιμόλυνση miR-34 μιμείται ή μόλυνση με λεντοϊού miR-34-ΜΙΡ μειωτικά Bcl-2 και Notch 1/2. miR-34 αποκατάσταση ανέστειλε σημαντικά κλωνογονικού ανάπτυξη των κυττάρων και εισβολή, επαγόμενη απόπτωση και G1 και G2 /M συλλήψεως του κυτταρικού κύκλου, και ευαισθητοποιημένα των κυττάρων σε χημειοθεραπεία και ακτινοβολία. Εντοπίσαμε ότι τα κύτταρα CD44 + /CD133 + MIAPaCa2 εμπλουτισμένο με tumorsphere σχηματισμού και ογκογενή κύτταρα ή αρχέγονα καρκίνος /προγονικά κύτταρα με υψηλά επίπεδα του Notch /Bcl-2 και την απώλεια του miR-34. Πιο σημαντικά, miR-34 αποκατάσταση οδήγησε σε μείωση 87% του πληθυσμού των καρκινικών κυττάρων-κίνηση, η οποία συνοδεύεται από σημαντική αναστολή της ανάπτυξης tumorsphere

in vitro

και του όγκου σχηματισμού

in vivo

.

Συμπεράσματα /σημαντικότητα

τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι miR-34 μπορεί να αποκαταστήσει, τουλάχιστον εν μέρει, ο όγκος λειτουργία του ρ53 σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος p53-ανεπαρκή καταστολή. Τα δεδομένα μας υποστηρίζουν την άποψη ότι miR-34 μπορεί να εμπλέκεται σε παγκρεατικού καρκίνου των βλαστικών κυττάρων αυτο-ανανέωση, πιθανώς μέσω της άμεσης διαμόρφωσης των κατάντη στόχοι Bcl-2 και Notch, υπονοώντας ότι miR-34 μπορεί να παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην παγκρεατικού καρκίνου βλαστοκυττάρων αυτο-ανανέωση ή /και την αποφασιστικότητα της κυτταρικής τύχης. Αποκατάσταση του miR-34 μπορεί να κατέχει σημαντική υπόσχεση ως νέο μοριακής θεραπείας για την ανθρώπινη καρκίνο του παγκρέατος με την απώλεια του p53-miR34, πιθανώς μέσω αναστολής της παγκρεατικά καρκινικά βλαστικά κύτταρα

Παράθεση:. Ji Q, Hao Χ, Zhang Μ, Tang W, Γιανγκ M, L Li, et al. (2009) microRNA miR-34 αναστέλλει την ανθρώπινη καρκίνο του παγκρέατος ογκογενή κύτταρα. PLoS ONE 4 (8): e6816. doi: 10.1371 /journal.pone.0006816

Συντάκτης: Eric J. Bernhard, Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 22 Ιανουαρίου 2009? Αποδεκτές: 5 Αυγούστου 2009? Δημοσιεύθηκε: 28 Αυγούστου 2009

Copyright: © 2009 Ji et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε εν μέρει από ΝΙΗ χορηγεί CA121830-01, CA128220-01 και CA134655-01A1 (L. Xu.), και από ΝΙΗ μέσω του Πανεπιστημίου του Cancer Center Επιχορήγηση για τη στήριξη του Μίτσιγκαν (P30 CA46592). JTD είναι ένα Πανεπιστήμιο του Michigan Προπτυχιακό Έρευνας Ευκαιρία Πρόγραμμα (UROP) φοιτητή. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό και τη διεξαγωγή της μελέτης, κατά τη συλλογή δεδομένων, την ανάλυση και την ερμηνεία, και την απόφαση να δημοσιεύσει, αξιολόγηση, έγκριση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δήλωσε ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα.

Εισαγωγή

τα microRNAs (miRNAs) αποτελούν μια συντηρημένη κατηγορία των μη-κωδικοποίησης 20-22 nt μικρά RNA που ρυθμίζουν την γονιδιακή και πρωτεϊνική έκφραση με σύνδεση προς mRNA που οδηγεί σε αποικοδόμηση mRNA ή αναστολή της μετάφρασης [1], [2]. miRNAs πιθανό ρυθμίζουν ποικίλες βιολογικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της διαφοροποίησης και της συντήρησης του ιστού, και έχουν συμβάλλοντας ρόλους στις διεργασίες ποικίλες παθήσεις, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου [2], [3], [4]. Οι αναδυόμενες στοιχεία δείχνουν ότι miRNAs παίζουν επίσης σημαντικό ρόλο στην βλαστικών κυττάρων αυτο-ανανέωση και διαφοροποίηση ρυθμίζοντας αρνητικά την έκφραση ορισμένων βασικών γονιδίων που εμπλέκονται στην αυτο-ανανέωση και την επιβίωση, το λεγόμενο «βλαστικών γονιδίων κύτταρο» [1], [2] , [4], [5]. Πρόσφατα, τα τρία μέλη της οικογένειας miR-34 βρέθηκαν να ρυθμίζεται άμεσα από ρ53 και τη λειτουργική δραστηριότητα του miR-34 ενδείκνυται ένας δυνητικός ρόλος ως καταστολέας όγκου [6], [7], [8], [9] , [10], [11], [12]. Αναφέραμε προηγουμένως ότι η πρωτεΐνη Bcl-2 ρυθμίζεται άμεσα από miR-34 [10]. Η έκθεση του He et al. έδειξε ότι η έκτοπη έκφραση του miR-34 επάγει διακοπή του κυτταρικού κύκλου στις δύο πρωτογενή και προέρχονται από όγκους κυτταρικών σειρών, η οποία είναι συνεπής με την ικανότητα του miR-34 για να ρυθμίζουν προς τα κάτω ένα πρόγραμμα γονιδίων προώθηση προόδου του κυτταρικού κύκλου [11]. Δείξαμε πρόσφατα ότι η έκφραση του miR-34S μειώνεται δραματικά σε γαστρικό καρκινικά κύτταρα p53-μεταλλαγμένο και ότι η αποκατάσταση της miR-34 έκφραση ανέστειλε την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων [6]. Απώλεια miR-34 έχει συνδεθεί με χημειοαντίσταση του καρκίνου [13]. miR-34a έχει αναφερθεί ότι εμπλέκεται σε ρ53 απόπτωση που διαμεσολαβείται σε καρκίνο του παχέος εντέρου και του καρκίνου του παγκρέατος [8], [9]. Chang et al. ανέφεραν ότι το 15 παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές έχουν τουλάχιστον 2-πλάσια μείωση στην έκφραση miR-34a σε σύγκριση με την έκφραση σε φυσιολογικό παγκρεατικού πόρου επιθηλιακές κυτταρικές γραμμές [8]. Στο σύνολό τους, οι δημοσιευμένες μελέτες δείχνουν miR-34 μέλη της οικογένειας μπορεί να έχει όγκο λειτουργία καταστολής κατάντη του p53. Επιπλέον, επειδή πάνω από το 50% των πρωτογενών ανθρώπινων καρκίνων έχουν μεταλλάξεις απενεργοποιήσεως λειτουργία ρ53, τα ευρήματα που παρέχονται ώθηση να διερευνήσει τη λειτουργική αποκατάσταση του miR-34 ως νέα προσέγγιση για την αναστολή των καρκίνων με ρ53 απώλειας λειτουργίας.

ένας άλλος πιθανός ρόλος για το miR-34 στην έναρξη και την εξέλιξη του καρκίνου μπορεί να είναι μια σύνδεση με καρκινικά κύτταρα-έναρξη ή καρκινικά βλαστικά κύτταρα (CSC). Έχει αναφερθεί ότι miR-34 στόχους Notch, c-Met και Bcl-2, τα γονίδια που εμπλέκονται στην αυτο-ανανέωση και την επιβίωση των καρκινικών βλαστικών κυττάρων [10], [11], [14]. Επί του παρόντος, οι δεσμοί μεταξύ ρ53, ο μεταγενέστερος στόχος miR-34 και τεκμαρτή παγκρεατικού καρκίνου βλαστικά κύτταρα είναι άγνωστα. Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε τις επιπτώσεις της λειτουργικής αποκατάστασης του miR-34 με miR-34 μιμείται και λεντοϊού miR-34a σε ανθρώπινα παγκρεατικά κύτταρα καρκίνου MIAPaCa2 p53-μεταλλαγμένο, καθώς και τη δυνατότητα σύνδεσης με το καρκίνο του παγκρέατος βλαστικών κυττάρων αυτο -ανανέωση. Η σκιαγράφηση του ρόλου του miR-34 στη ρύθμιση της κυτταρικής ανάπτυξης και εξέλιξης του όγκου, και πιθανή σχέση της με τα καρκινικά κύτταρα-έναρξη ή καρκινικά βλαστικά κύτταρα μπορεί να παρέχει μια βάση για την εξερεύνηση των δυνατοτήτων του ως νέου στρατηγική θεραπείας.

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταρική καλλιέργεια και αντιδραστήρια

ανθρώπινο παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές και η κανονική ανθρώπινου πνεύμονα κυτταρική γραμμή ινοβλαστών WI-38 αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection και καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ (HyClone, Logan, UT), συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FBS? HyClone, Logan, UT). mi

RIDIAN

miRNA miR34a, β, γ μιμείται και αρνητικό μάρτυρα miRNA μιμούνται (NC μιμούνται), mi

RIDIAN

miR-34 αναστολέων και αρνητικοί μάρτυρες ελήφθησαν από Dharmacon (Chicago, IL) [ ,,,0],6]. Bcl-2 3’UTR ανταποκριτή λουσιφεράσης πλασμίδιο ή μεταλλαγμένο του έχουν αναφερθεί προηγουμένως [10]. Οι qRT-εκκινητές PCR και αντισώματα για στύπωμα Western περιγράφονται στο πρόσφατη δημοσίευση μας [6].

Η επιμόλυνση του miR-34 μιμείται

MIAPaCa2 κύτταρα επιμολύνθηκαν 24 ώρες μετά την σπάρθηκαν σε 6-φρεατίων πλακών. μιμείται miRNA (100 pmol) σε 200 μΙ ελεύθερο ορού, αντιβιοτικό-free, μέσο αναμίχθηκαν με 5 μΐ Lipofectamine αντιδραστηρίου επιμόλυνσης 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) διαλύθηκαν σε 200 μΙ του ίδιου μέσου και αφέθηκε να παραμείνει σε θερμοκρασία δωματίου θερμοκρασία για 20 λεπτά. Τα προκύπτοντα διαλύματα 400 μΐ διαμόλυνσης προστέθηκαν στη συνέχεια σε κάθε φρεάτιο που περιέχει 1,6 ml του μέσου. Έξι ώρες αργότερα, οι καλλιέργειες αντικαταστάθηκαν με 2 ml φρέσκου μέσου συμπληρωμένου με 10% FBS και αντιβιοτικά. Για στύπωμα Western, κύτταρα συλλέχθηκαν μετά από επιπλέον 48 hr.

λεντοϊών miR-34a μόλυνση

Ο ιός ανοσοανεπάρκειας αιλουροειδών (FIV) λεντοϊού σύστημα εκφράζουν miR-34a (MIR-34a-MIF) ή φορέα ελέγχου (ΠΔΠ), καθώς και ένα σύστημα συσκευασίας λεντοϊού, αγοράστηκαν από το σύστημα Βιοεπιστημών (SBI, Mountain View, CA). MIAPaCa2 και BxPC3 κύτταρα μολύνθηκαν με το σύστημα λεντοϊού FIV εκφράζουν miR-34a (MIR-34a-MIF) ή φορέα ελέγχου (MIF), και τα μολυσμένα κύτταρα επιλέχθηκαν μέσω της αντοχής στα αντιβιοτικά (Zeocin 50 μg /mL, Invitrogen), όπως περιέγραψε πρόσφατα [6].

miR-34 Bcl-2-3’UTR ρεπόρτερ

δοκιμασία

MIAPaCa2 κύτταρα επιμολύνθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων με 2 μg του Bcl-2 3’UTR λουσιφεράσης πλασμίδιο αναφοράς ή μεταλλαγμένες της [6], [10], και 2 μg του πλασμιδίου ελέγχου β-γαλακτοσιδάση, ανά φρεάτιο, χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Τα κύτταρα επίσης συν-επιμολύνθηκαν με 100 pmol από κάθε miR-34 μιμούνται ή NC μιμητικό, όπως υποδεικνύεται, χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000. δοκιμασίες λουσιφεράσης έγιναν 24 ώρες μετά την επιμόλυνση με χρήση του συστήματος Δοκιμασία Bright-Glo λουσιφεράσης (Promega). Η δραστικότητα λουσιφεράσης ομαλοποιήθηκε σχετική δραστικότητα με β-γαλακτοσιδάση που ανιχνεύεται από το Σύστημα Προσδιορισμού β-γαλακτοσιδάσης (Promega). Σε κάθε περίπτωση, μεταλλαγμένο Bcl-2 3’UTR υποδεικνύει την εισαγωγή των αλλαγών στις σπόρων συμπληρωματικές θέσεις του Bcl-2 3’UTR [10].

σχηματισμός αποικίας και κλωνογονική δοκιμασία

Προς δοκιμασία σχηματισμού αποικίας, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με miR-34 μιμείται ή NC μιμούνται επί 24 ώρες, και στη συνέχεια σπείρονται σε ένα 6-φρεατίων εις τριπλούν. 0,2 ml FBS προστέθηκαν ανά φρεάτιο την Ημέρα 5. Μετά 9-10 ημέρες επώαση, οι πλάκες ηπίως πλύθηκαν με PBS και χρωματίστηκαν με 0,1% κρυσταλλικό ιώδες. Αποικίες με πάνω από 50 κύτταρα με το χέρι μετρήθηκαν. Επιμετάλλωση αποτελεσματικότητα υπολογίστηκε διαιρώντας τον αριθμό αποικιών που σχηματίζονται στην ομάδα που θεραπεύτηκε με ότι τον έλεγχο. Για τη δοκιμασία κλωνογονική επιβίωση, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με miR-34 μιμείται ή NC μιμούνται επί 24 ώρες, και στη συνέχεια σπείρονται σε πλάκες 6-φρεατίων εις τριπλούν στην επιθυμητή πυκνότητα κυττάρων (200~10,000 κύτταρα /φρεάτιο), ακολουθούμενο από την ακτινοβολία ακτίνων Χ . Οι καμπύλες επιβίωσης των κυττάρων χαράχθηκαν χρησιμοποιώντας μια γραμμική-τετραγωνική μοντέλο και την αναλογία ενίσχυσης ακτινοβολία (ER) υπολογίστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15], [16], [17].

ποσοτική πραγματικού χρόνου RT- PCR (qRT-PCR)

qRT-PCR πραγματοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των επιπέδων έκφρασης των γονιδίων δυναμικού miR-34-στόχου [6]. Είκοσι τέσσερις ώρες μετά την miR-34 μιμούνται επιμόλυνση κυττάρων MIAPaCa2 με miR-34 μιμείται (100 pmol ανά φρεάτιο σε τρυβλία 6 φρεατίων), η έκφραση των πιθανών γονιδίων στόχων μετρήθηκε με qRT-PCR με SYBR Green PCR System (TaqMan) . Εν συντομία, ολικό RNA εκχυλίστηκε από τα επιμολυσμένα κύτταρα χρησιμοποιώντας TRIZOL (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Αντίστροφη μεταγραφή πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ TaqMan Reverse Transcription (Applied Biosystems). Για qRT-PCR, εφαρμόστηκε 1 μΐ του γονιδίου εκκινητές με SYBR Green (Applied Biosystems) σε 20 μΐ όγκου αντίδρασης. Εκκινητές σχεδιάστηκαν ως: Bcl-2, προς τα εμπρός, 5′-CAT GCT GGG GCC GTA CAG-3 ‘, αντίστροφη, 5′-ΟΑΑ CCG GCA ΚΔ GCA CAC-3′? HMGA2, προς τα εμπρός, 5’-ΤΤΤ GTA ATC ΚΔ TCA CAG TCC-3 ‘, αντίστροφη, 5′-ΤΤΤ CTC ACC CGC CCA C-3′? Notch1, προς τα εμπρός, 5’-ATC CAG AGG CAA ACG GAG-3 ‘, αντίστροφη, 5′-CAC ATG GCA ACA TCT AAC CC-3′? Notch2, προς τα εμπρός, 5’-GGA CCC TGT CAT ACC CTC ΤΤ-3 ‘, αντίστροφη, 5′-CAT GCT TAC GCT TTC GTT ΤΤ-3′? Notch3, προς τα εμπρός, 5’-TGA TCG GCT CGG TAG ΤΑΑ TG-3 ‘, αντίστροφη, 5′-CAA ΚΕΔ TCC CAG GTA GTC Α-3′? Notch4, προς τα εμπρός, 5’-TGC GAG GAA GAT ACG GAG TG-3 ‘, αντίστροφη, 5′-CGG GAT CGG ΑΑΤ GTT GG-3′? β-ακτίνη, προς τα εμπρός, 5’-ATG CAG AAG GAG ATC ACT GC-3 ‘, αντίστροφη, 5′-TCA TAG TCC GCC TAG AAG CA-3’. Όλες οι αντιδράσεις με TaqMan PCR καθολική Κύριο Μείγμα (Applied Biosystems) πραγματοποιήθηκαν στην Mastercycler Realplex 2 (Eppendorf, Westbury, ΝΥ). επίπεδα του mRNA του γονιδίου-στόχου κανονικοποιήθηκαν προς ακτίνη mRNA σύμφωνα με τον ακόλουθο τύπο: [2- (C

T

στόχους – C

T

ακτίνη)] χ 100%, όπου Ο

T είναι ο κύκλος κατωφλίου. Η σχετική έκφραση υπολογίστηκε διαιρώντας την κανονικοποιημένη έκφραση του γονιδίου-στόχου του επεξεργασμένου δείγματος με εκείνη του μη επεξεργασμένου ελέγχου, με την τιμή από το NC μιμούνται οριστεί ως 1 αυθαίρετη μονάδα. Για την έκφραση γονιδίων στόχων στα ταξινομημένα κύτταρα, τα δεδομένα κανονικοποιήθηκαν σε εκείνη της ακτίνης (που Actin = 1000 αυθαίρετη μονάδα).

Caspase-3 ενεργοποίησης δοκιμασία

Η ενεργοποίηση της κασπάσης στα επιμολυσμένα κύτταρα MIAPaCa2 προσδιορίστηκε ακολουθώντας τις οδηγίες του κιτ δοκιμασίας κασπάσης-3 ενεργοποίησης (BioVision, Mountain View, CA). Είκοσι τέσσερις ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα λύθηκαν και το σύνολο κυτταρολύματα (20 μ§) επωάστηκαν με 25 μΜ φθορογόνο υπόστρωμα DEVD-AFC σε ένα ρυθμιστικό αντίδρασης (που περιέχει 5 mM DTT) στους 37 ° C για 2 ώρες. Η πρωτεολυτική απελευθέρωση του AFC παρακολουθήθηκε σε λεχ = 405 nm και λem = 500 nm χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη μικροπλακών φθορισμού (BMG LABTECH, Durham, NC). Σχετική ενεργοποίηση της κασπάσης-3 ήταν υπολογίζονται ομαλοποίηση του σήματος φθορισμού σε κάθε επεξεργασία του δείγματος με εκείνη του NC μιμούνται ή πολυμερής διατραπεζική προμήθεια ελέγχου ορίζεται ως 100 αυθαίρετη μονάδα [16].

κυττάρων κυτταροτοξικότητα δοκιμασία

MIAPaCa2 κύτταρα επιμολύνθηκαν με miR-34 μιμούνται ή NC μιμούνται για 24 ώρες, τοποθετούνται σε πλάκες 96 φρεατίων (5000 κύτταρα /φρεάτιο), και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με σειριακά αραιωμένο χημειοθεραπευτικούς παράγοντες, εις τριπλούν. Μετά από 96 ώρες επώασης, 20 μΙ /φρεάτιο CCK-8 αντιδραστήριο προστέθηκαν και επωάστηκαν στους 37 ° C για 1-3 ώρες. Η οπτική πυκνότητα μετρήθηκε στα 450 nm και 650 nm χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη μικροπλακών (BMG LABTECH, Durham, NC). IC

50, η συγκέντρωση του φαρμάκου που αναστέλλει την κυτταρική ανάπτυξη κατά 50% υπολογίστηκε με GraphPad Prism 5.0 (San Diego, CA) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18].

Ανάλυση

κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης

για τον κυτταρικό κύκλο και την ανάλυση απόπτωσης με κυτταρομετρία ροής, τα κύτταρα MIAPaCa2 επιμολύνθηκαν με miR-34 μιμείται ή NC μιμούνται σε πλάκες 6 φρεατίων, σε επεξεργασία με θρυψίνη 24 ώρες αργότερα και πλύθηκε με αλατούχο φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα και σταθεροποιήθηκαν σε 70% αιθανόλη σε πάγο . Μετά τη φυγοκέντρηση, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με 50 μg /ml ιωδιούχου προπιδίου και 0,1 μg /ml RNase Α, και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας ένα FACStar Plus ™. Κάθε ιστόγραμμα κατασκευάστηκε με τα δεδομένα από τουλάχιστον 5.000 γεγονότα. Τα δεδομένα αναλύθηκαν για να υπολογιστεί το ποσοστό του πληθυσμού των κυττάρων σε κάθε φάση χρησιμοποιώντας το λογισμικό CellQuest, καθώς και το% των κυττάρων σε υπο-G1 (Becton Dickinson) [18].

CD44 και CD133 χρώσης και διαλογή κυττάρων

MIAPaCa2 κύτταρα επωάστηκαν με ΡΕ-συζευγμένο αντι-ανθρώπινο CD133 /1 αντίσωμα και APC-συζευγμένο αντίσωμα αντι-ανθρώπινης CD44 (Miltenyi Biotec, Aubum, CA, USA) σε PBS που περιέχει 2% FBS. Που ταιριάζουν στον ισότυπο ανοσοσφαιρίνης ποντικού χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες. Για κυτταρομετρία ροής, τα δείγματα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας κυτταρόμετρο ροής FACSCalibur και το λογισμικό CellQuest (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Για διαλογή κυττάρων με κυτταρομετρία ροής, τα δείγματα αναλύθηκαν και ταξινομούνται σε ένα BD FACSVantage SE (BD Biosciences). Δείγματα του CD133

+ και CD133

– ταξινομημένα κύτταρα αξιολογήθηκαν για καθαρότητα με μια μηχανή και CellQuest λογισμικό FACSCalibur (BD Biosciences), χρησιμοποιώντας ΡΕ-συζευγμένο αντι-ανθρώπινο /αντίσωμα CD133 2 (Miltenyi Biotec) [19].

καλλιέργεια Tumorsphere

Τα ταξινομημένα κύτταρα MIAPaCa2 αιωρήθηκαν σε καλλιέργεια χωρίς ορό μέσο DMEM που περιέχει 1% συμπλήρωμα Ν2, 2% συμπλήρωμα Β27, 1% αντιβιοτικού-αντιμυκητιασικό (Invitrogen), 20 ng /ml ανθρώπινο FGF-2 (Sigma) και 100 ng /ml EGF (Invitrogen), και τοποθετήθηκαν σε 24 φρεατίων εξαιρετικά χαμηλής πλάκες στερεώσεως (Corning) 2000 κύτταρα ανά φρεάτιο. 7-10 ημέρες αργότερα, οι πλάκες αναλύθηκαν για tumorsphere σχηματισμό και ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο (Olympus) στους 100Χ, 200Χ, και 400 × μεγεθύνσεις. Για τις επόμενες ποσοτικοποίηση του αριθμού των κυττάρων ανά tumorsphere, tumorspheres συλλέχθηκαν με ένα κόσκινο των 40 μm (BD Biosciences, San Jose, CA) και διαχωριστεί με θρυψίνη για να κάνει ένα αιώρημα μονών κυττάρων. Τα βιώσιμα κύτταρα μετρήθηκαν στη συνέχεια χρησιμοποιώντας αποκλεισμό trypan blue.

Ζωικό μοντέλο και in vivo σχηματισμό όγκων μελέτη

πέντε έως έξι εβδομάδων σε ηλικία θηλυκών αθυμικών NCr-ηυ /ηυ γυμνοί ποντικοί αγοράστηκαν από NCI. κύτταρα MIAPaCa2 επιμολύνθηκαν με miR-34a μιμούνται ή NC μιμούνται επί 24 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και ενοφθαλμίστηκαν σε γυμνά ποντίκια υποδορίως (s.c.) και στις δύο πλευρές, μετά την παρασκευή αλκοόλης του δέρματος, χρησιμοποιώντας μια αποστειρωμένη βελόνα 22-gauge με 0,2 ml κυτταρικό εναιώρημα 1 × 10

6 κύτταρα, με χειροκίνητη αυτοσυγκράτηση. Τα μεγέθη του όγκου μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα παχύμετρο. Ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον τύπο: (μήκος Χ πλάτος

2) /2. Την Ημέρα 38, όλοι οι όγκοι συλλέχθηκαν για τη μέτρηση των βαρών των όγκων. Όλα τα πειράματα σε ζώα έγιναν σύμφωνα με το πρωτόκολλο που εγκρίθηκε από το Πανεπιστήμιο του Michigan Οδηγίες για τη χρήση και τη φροντίδα των ζώων.

Η στατιστική ανάλυση

Δύο τρόπο ANOVA και δύο-ουρά

t

-ΜΕΛΕΤΕΣ χρησιμοποιήθηκαν για να αναλύσουν το

in vitro

και

in vivo

δεδομένα χρησιμοποιώντας Prism 5.0 λογισμικό (GraphPad, San Diego, CA).

P

& lt?. 0,05 ορίστηκε ως στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

Η έκφραση του miR-34S στην ανθρώπινη παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές σειρές

Εξετάσαμε μια σειρά ανθρώπινου παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές, MIAPaCa2, BxPC3, Capan1, Capan2, Panc-1, και η κανονική ανθρώπινου πνεύμονα κυτταρική γραμμή ινοβλαστών WI-38, για miR-34a, b, c έκφραση. Επίσης αξιολογούνται παράλληλα την έκφραση των πιθανών miR-34-ρυθμιζόμενων γονιδίων στόχων και πρωτεΐνες, χρησιμοποιώντας τους εκκινητές και τις μεθόδους όπως περιγράφηκε πρόσφατα [6]. MIAPaCa2 και BxPC3 κύτταρα έχουν πολύ χαμηλά επίπεδα έκφρασης τόσο στην πρωτοβάθμια όσο και ώριμη miR-34a, b, c, αλλά τα υψηλά επίπεδα των γονιδίων miR-34 TARGET

BCL2

και

Notch1

, και τα διαφορετικά επίπεδα του

Notch2-4

(Σχήμα 1). Έχουν επίσης χαμηλά επίπεδα έκφρασης του ρ21 (Σχήμα 1

C

), ένας άλλος στόχος mRNA της ρ53, σύμφωνα με την κατάσταση της ρ53-μεταλλαγμένη του κυττάρου γραμμής. Με βάση αυτά τα δεδομένα και την παρατήρηση μας ότι είναι πολύ ογκογόνο και επαναλήψιμα αποτελούν tumorspheres

in vitro

, επιλέξαμε τις δύο κυτταρικές σειρές για την παρούσα μελέτη.

Α

, Η ανάλυση στυπώματος Western.

Β

, ανάλυση qRT-PCR των σχετικών επιπέδων έκφρασης του miR-34s.

C

, ανάλυση qRT-PCR των επιπέδων έκφρασης του miR-34 γονιδίων-στόχων σε ανθρώπινο παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές σειρές όπως επίσης και φυσιολογικά ανθρώπινα κύτταρα ινοβλαστών WI-38. Τα κύτταρα λύθηκαν για την εκχύλιση ολικού RNA για qRT-PCR, τα δεδομένα κανονικοποιήθηκαν με εκείνη των ακτίνης και τα σχετικά επίπεδα δείχνονται (Actin = 1000). Σημείωση ρ21 είναι ένα γονίδιο στόχος της p53.

Η

miR-34 αποκατάσταση από επιμόλυνση των κυττάρων MIAPaCa2 με miR-34 μιμείται

Για να διερευνήσουν τις επιπτώσεις των miR-34 αποκατάστασης για τον καρκίνο του παγκρέατος κύτταρα, εμείς επιμολυσμένα τα κύτταρα MIAPaCa2 με miR-34 μιμείται ή μη ειδικό έλεγχο miRNA μιμούνται (NC μιμούνται). Ανάλυση κηλίδας Western (Εικόνα 2

A

) έδειξε ότι η επιμόλυνση του miR-34 μιμείται μειωτικά την έκφραση των γονιδίων στόχων, Bcl-2, Notch 1 και Notch2 στο επίπεδο πρωτεΐνης, αλλά δεν είχε καμία επίδραση στην Bcl-xL και Mcl -1 έκφραση, υποδεικνύοντας το γονίδιο-στόχο knock-down με miR-34 μιμείται επηρεάζει μεταγραφές υπόθαλψη miR-34 θέσεις στόχους. miR-34a, miR-34b και miR-34γ μιμείται όλα είχαν παρόμοιες δραστηριότητες. Το Σχήμα 2

B

δείχνει την ανάλυση qRT-PCR των δυνητικών γονιδίων στόχων? miR-34 μιμείται αναστέλλεται ισχυρά

BCL2

και

Notch1

γονιδιακής έκφρασης, σύμφωνα με τα στοιχεία των Δυτικών κηλίδα. Μπορούν επίσης ανέστειλε την έκφραση του p21 (Σχήμα 2

Β

), ένας άλλος στόχος της p53, αλλά έχουν περιορισμένη επίδραση στην Notch3 και cMet. Είναι ενδιαφέρον ότι η αναστολή της έκφρασης Notch2 στο επίπεδο πρωτεΐνης με miR-34 δεν συνοδεύτηκε από αναστολή στο επίπεδο mRNA, σε συμφωνία με προηγούμενες αναφορές ότι miRNA αναστέλλει την έκφραση του γονιδίου-στόχου μετα-μεταγραφικά, με ή χωρίς υποβάθμιση mRNA [11], [20 ].

Μια

, miR-34 αποκατάσταση ρυθμίζει προς τα κάτω πρωτεϊνών στόχων Bcl-2, Notch1 και Notch2, υπάρχουν επιπτώσεις στην Mcl-1. κύτταρα MIAPaCa2 επιμολύνθηκαν με miR-34 μιμείται ή μη ειδικό έλεγχο miRNA μιμούνται (NC απομίμηση) (100 pmol ανά φρεάτιο σε τρυβλία 6 φρεατίων με Lipofectamine 2000) για 48 ώρες, στη συνέχεια συλλέγονται για ανάλυση στυπώματος Western.

B

, ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR ανάλυση των επιπέδων mRNA των γονιδίων στόχων δυναμικό »μετά miR-34 μιμούνται την επιμόλυνση σε κύτταρα MIAPaCa2. **

P

& lt? 0,01, ***

P

& lt? 0.001, του Student

t-test

, n = 2.

C

, Bcl-2 3’UTR λουσιφεράσης Δοκιμασία Reporter δείχνει ότι τα επιμολυσμένα miR-34 μιμείται είναι λειτουργικές. κύτταρα MIAPaCa2 συν-επιμολύνθηκαν με το Bcl-2 3’UTR Luciferase Reporter ή μεταλλαγμένες του, τον φορέα β-gal, μαζί είτε με miR-34 μιμείται ή NC μιμητικό. Λουσιφεράσης δοκιμασία διεξήχθη 24 ώρες μετά την επιμόλυνση με χρήση Bright-Glo σύστημα προσδιορισμού λουσιφεράσης. Η δραστικότητα λουσιφεράσης ομαλοποιήθηκε ως προς δραστικότητα β-gal. μπαρ σφάλμα υποδηλώνει s.e.m.

Η

Για να αξιολογηθεί κατά πόσον τα επιμολυσμένα miR-34 μιμείται είναι λειτουργικά, θα πραγματοποιηθεί η δοκιμασία ρεπόρτερ Bcl-2 3’UTR όπως περιγράφηκε πρόσφατα [6], [10]. Τα επιμολυσμένα miR-34 μιμείται ανέστειλε την έκφραση του γονιδίου αναφοράς λουσιφεράσης, η οποία ελέγχεται από Bcl-2 3’UTR στην περιοχή προαγωγού (Σχήμα 2

C

). Ωστόσο, μετάλλαξη στην Bcl-2 3’UTR συμπληρωματική προς την αλληλουχία σπόρο miR-34 κατήργησε αυτήν την επίδραση, υποδεικνύοντας ότι η παρατηρούμενη δραστηριότητα είναι αλληλουχία-ειδική. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι τα επιμολυσμένα miR-34S είναι λειτουργική και να επιβεβαιώσει ότι η Bcl-2 είναι ένας άμεσος στόχος του miR-34, σύμφωνα με τις προηγούμενες εκθέσεις [8], [10], [21].

Για την αξιολόγηση οι μακροπρόθεσμες επιπτώσεις της αποκατάστασης miR-34, χρησιμοποιήσαμε επίσης μια λεντοϊού σύστημα για να εκφράσουν miR-34a. Το σύστημα λεντοϊού ιού ανοσοανεπάρκειας των αιλουροειδών που εκφράζουν miR-34a (MIR-34a-MIF), ή φορέα ελέγχου (MIF), χρησιμοποιήθηκε για να μολύνει κύτταρα MIAPaCa2 και BxPC3 και ο πληθυσμός μολυσμένο κύτταρο επιλέχθηκε μέσω αντίστασης Zeocin [6]. Το Σχήμα S1 δείχνει τον χαρακτηρισμό των αλλαγών έκφραση στα κύτταρα miR-34a-MIF. Η ανάλυση στυπώματος Western αποκάλυψε ότι η πρωτεΐνη Bcl-2 ρυθμισμένα προς τα κάτω σε κύτταρα miR-34a-ΜΙΡ σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου φορέα MIF (Εικόνα S1

A

), σύμφωνα με την ανάλυση qRT-PCR του Bcl- 2 επίπεδο mRNA (Σχήμα S1

Β

). Bcl-2 3’UTR Λουσιφεράσης Δοκιμασία Reporter έδειξε ότι το miR-34a είναι λειτουργικό στα κύτταρα miR-34a-ΜΙΡ (Εικόνα S1

C

).

miR-34 αποκατάσταση αναστέλλει MIAPaCa2 κύτταρο κλωνογονική ανάπτυξη και οδηγεί σε κασπάσης-3 ενεργοποίησης και της απόπτωσης

Μετά την επικύρωση ότι τα επιμολυσμένα miR-34 μιμείται ήταν λειτουργικά, πραγματοποιήσαμε μια κλωνογονική δοκιμασία για να εξετάσει τις επιδράσεις των miR-34 αποκατάσταση στην κυτταρική ανάπτυξη. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3

Α-Β

, miR-34 αποκατάσταση ανέστειλε σημαντικά την κλωνογονική ανάπτυξη των κυττάρων, με miR-34a μιμούνται επαγωγής & gt? 80% αναστολή του σχηματισμού αποικιών σε σύγκριση με NC μιμούνται (18,3 ± 3,8 αποικίες /καλά έναντι 95,3 ± 1,8% αποικίες /φρεάτιο). Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν στα κύτταρα miR-34a-ΜΙΡ η οποία αυξήθηκε βραδύτερα από τα κύτταρα ελέγχου MIF, όπως υποδεικνύεται τόσο από τον σημαντικά μειωμένο αριθμό Trypan μπλε-εξαιρουμένων των βιώσιμων κυττάρων στην δοκιμασία κυτταρικής ανάπτυξης (Σχήμα S1

D

) και η μειωμένη σχηματισμού αποικιών (Εικόνα S1

E

). Εξετάσαμε επίσης την επίδραση της αναστολής της ενδογενούς miR-34 για την ανάπτυξη των κυττάρων από mi

RIDIAN

miR-34 αναστολέων. Είναι μονόκλωνα χημικώς ενισχυμένη ολιγονουκλεοτίδια τα οποία μπορούν να αναστείλουν αποτελεσματικά την ενδογενή ώριμη miR-34. miR-34 αναστολέων προκάλεσε μια αύξηση σχεδόν 20% σε κλωνογενείς αύξηση σε σύγκριση με τον έλεγχο (120,3 ± 2,9 αποικίες /και έναντι 95,3 ± 1,8 αποικίες /φρεάτιο) (Σχήμα 3

Α-Β

). Μπορούμε επίσης να διεξαχθεί μια δοκιμασία κυτταρικής εισβολής σε κύτταρα MIAPaCa2 με miR-34 αποκατάσταση τόσο miR-34a μιμούνται και miR-34a-MIF. miR-34 ανέστειλε σημαντικά την πιθανότητα εισβολής των κυττάρων MIAPaCa2 (Εικόνα S2). Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι το miR-34 συμμετέχει στην ανάπτυξη των κυττάρων MIAPaCa2? αποκατάσταση miR-34 αναστέλλει την κλωνογονική ανάπτυξη, και η αναστολή της ενδογενούς miR-34 με miR-34 αναστολέων προωθεί την ανάπτυξη. Τα δεδομένα μας είναι συνεπείς με την αναφερόμενη όγκου λειτουργία καταστολής του miR-34 [6], [8], [9], [11], [22].

MIAPaCa2 κύτταρα επιμολυσμένα με miR-34 μιμείται ή αναστολείς, 24 ώρες αργότερα τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων (200 κύτταρα /φρεάτιο, εις τριπλούν). Μετά από 12-14 ημέρες επώασης, οι πλάκες πλύθηκαν ήπια με PBS και χρωματίστηκαν με 0,1% κρυσταλλικό ιώδες.

Μια

, εκπρόσωπος εικόνες των αποικιών.

Β

, αποικίες με πάνω από 50 κύτταρα μετρήθηκαν.

C

, Αποκατάσταση του miR-34 οδηγεί σε κασπάσης-3 ενεργοποίησης. δοκιμασία ενεργοποίησης κασπάσης-3 διεξήχθη όπως περιγράφεται στο

Υλικά και Μέθοδοι

. Fold αύξηση του σήματος φθορισμού υπολογίστηκε διαιρώντας το κανονικοποιημένο σήμα σε κάθε δείγμα κατεργάζεται με ότι στο μη επεξεργασμένο έλεγχο. **

P

& lt? 0,01, ***

P

& lt? 0.001, του Student

t-test

, n = 3.

D

, κυτταρική κατανομή του κύκλου των κυττάρων MIAPaCa2 επιμολυσμένα με miR-34 μιμείται. Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου εκτελέστηκε 1 ημέρα μετά την επιμόλυνση. Τα κύτταρα βάφτηκαν με ιωδιούχο προπίδιο μετά τη σταθεροποίηση αιθανόλη και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής.

Η

Δεδομένου ότι η λειτουργία καταστολέα όγκου ρ53 διαμεσολαβείται εν μέρει μέσω επαγωγής της απόπτωσης [23], [24], εξετάσαμε την επίδραση της miR-34 αποκατάστασης για απόπτωση επαγωγή σε κύτταρα MIAPaCa2 επιμολυσμένα με miR-34 μιμείται. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3

C

, παροδική επιμόλυνση του miR-34 μιμείται οδήγησε σε αυξημένη σημαντικά την ενεργοποίηση της κασπάσης-3, ένα βασικό ένδειξη των κυττάρων που υφίστανται απόπτωση [25]. Αξιολογήσαμε επίσης την επίδραση του miR-34 μιμείται σε κυτταρικό κύκλο. miR-34 μιμείται οδήγησε σε σημαντική G1 και G2 /M σύλληψη και τη μείωση των κυττάρων στη φάση S (Σχήμα 3

D

), συνάδει με τις άλλες εκθέσεις σχετικά με miR-34 αποκατάστασης σε διάφορα μοντέλα καρκίνου [6], [7], [8], [10], [11], [21], [22], [26]. Αυτή η επίδραση επί του κυτταρικού κύκλου είναι παρόμοια με εκείνη της αποκατάστασης p53 όπως έχουμε αναφερθεί στο παρελθόν [23], [24], [27], [28], υποδεικνύοντας ότι miR-34 αποκατάσταση μπορεί να ασκήσει επιδράσεις παρόμοιες με αποκατάσταση της ρ53 λειτουργία καταστολέα όγκου, τουλάχιστον εν μέρει, στα κύτταρα με την απώλεια ρ53 λειτουργίας.

miR-34 αποκατάσταση ευαισθητοποιεί τα κύτταρα MIAPaCa2 σε χημειοθεραπεία και η ακτινοθεραπεία

στη συνέχεια, εξετάσαμε κατά πόσο miR-34 η αποκατάσταση θα μπορούσε να ευαισθητοποιήσει το παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα με υψηλό επίπεδο έκφρασης ενδογενούς Bcl-2 προς χημειοθεραπεία και η ακτινοθεραπεία. Η δοκιμασία κυτταροτοξικότητας WST-1 με βάση χρησιμοποιήθηκε όπως περιγράφηκε πρόσφατα [6], [18] για την αξιολόγηση απόκριση των κυττάρων σε τρεις χημειοθεραπευτικούς παράγοντες, δοσεταξέλη, η σισπλατίνη και γεμσιταβίνη, τα οποία χρησιμοποιούνται σήμερα για παγκρεατικό χημειοθεραπεία του καρκίνου. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4

A

, miR-34 σε κύτταρα αποκατάσταση MIAPaCa2 κατέστησε τα κύτταρα 2-3 φορές πιο ευαίσθητος στα χημειοθεραπευτικούς παράγοντες, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου φορέα, με βάση τα δεδομένα IC50. Σε προσδιορισμούς απόπτωσης, αποκατάσταση miR-34a αυξηθεί σημαντικά Γεμσιταβίνη ή προκαλείται από την ακτινοβολία της κασπάσης-3 ενεργοποίησης (Εικόνα 4

Β

) και τα κύτταρα υπο-G1 (Σχήμα 4

C

). Έχουμε επίσης διεξαχθεί κλωνογονική δοκιμασία, miR-34a μιμούνται ευαισθητοποιημένα κύτταρα MIAPaCa2 σε ακτινοβολία ακτίνων Χ, με λόγο ενίσχυσης ακτινοβολία (ER) = 1,3 (Σχήμα 4

D

). Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι miR-34 αποκατάσταση μπορεί να ξεπεράσει χημειο- /ραδιοαντοχή των παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων που έχουν υψηλά επίπεδα Bcl-2 και χαμηλά βασικά επίπεδα του miR-34S, και εξαρτώνται από Bcl-2 για την επιβίωση και την αντίσταση στη θεραπεία.

Μια

, miR-34 αποκατάσταση ευαισθητοποιεί τα κύτταρα σε χημειοθεραπευτικούς παράγοντες. Η δοκιμασία κυτταροτοξικότητας ΜΤΤ που βασίζεται διεξήχθη χρησιμοποιώντας τις Zeocin ανθεκτικά σταθερά κύτταρα MIAPaCa2-miR-34a-ΜΙΡ και MIAPaCa2-MIF.

Β

, miR-34 αποκατάσταση αυξάνει κασπάσης-3 ενεργοποίησης που προκαλείται από γκεμσιταμπίνης ή ακτινοβολία ακτίνων Χ σε κύτταρα MIAPaCa2. Σχετική ενεργοποίηση της κασπάσης-3 υπολογίστηκε με κανονικοποίηση του σήματος φθορισμού σε κάθε δείγμα υποβλήθηκε σε επεξεργασία με εκείνη του μιμούνται ή MIF ελέγχου NC ως 100. *

P

& lt? 0,05, ***

P

& lt? 0.001, το

t-test

, n = 3.

C

, miR-34 αποκατάσταση αυξάνει την ακτινοβολία απόπτωση σε κύτταρα MiaPaCa-2 Student. Τα κύτταρα επιμολυσμένα με miR-34a μιμούνται ή NC μιμούνται. 24 ώρες αργότερα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε ακτινοβολία ακτίνων-Χ. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν μετά από ένα άλλο 48 ώρες, χρωματίστηκαν με ιωδιούχο προπίδιο μετά τη σταθεροποίηση αιθανόλη, και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής για την% των κυττάρων σε υπο-G1 φάση. *

P

& lt? 0,05, t-test του Student, η = 2.

D

, miR-34 αποκατάσταση radiosensitized κύτταρα MiaPaCa-2. Η κλωνογονική δοκιμασία διεξήχθη όπως περιγράφεται στο

Τα Υλικά και Μέθοδοι

δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή +/- SD + /CD133 + κυττάρων (η = 3)

Η

CD44. Είναι tumorsphere σχηματίζουν και ογκογενή κύτταρα με υψηλή Bcl-2 και την απώλεια του miR-34 έκφρασης

για να διερευνηθεί η πιθανή επίδραση του miR-34 αποκατάσταση σε καρκινικά κύτταρα-κίνηση στην κυτταρική σειρά MIAPaCa2, εξετάσαμε για πρώτη φορά την από όγκο έναρξη κύτταρο ή πληθυσμό καρκίνο βλαστικών κυττάρων σε κύτταρα MIAPaCa2 με ποικίλους δείκτες κυτταρικής επιφάνειας. Τόσο CD44 [29] και CD133 [19], [30] έχουν χρησιμοποιηθεί σαν δείκτες για τον προσδιορισμό των παγκρεατικά καρκινικά βλαστικά κύτταρα από ανθρώπινους ιστούς όγκου. Ωστόσο, δεν υπάρχει καμία αναφορά επί των καρκινικών βλαστικών κυττάρων σε κύτταρα MIAPaCa2. Αξιολογήσαμε την κατάσταση CD44 και CD133 στα κύτταρα MIAPaCa2 με χρώση ανοσοφθορισμού και διαλογή FACS. Περίπου το 60% των κυττάρων είναι CD44 + και 3-5% κύτταρα είναι CD133 +, ωστόσο, μόνο το 1-2% των κυττάρων είναι CD44 + /CD133 + διπλά θετικά (Q2 στο Σχήμα 5

A

). Να εξετάσει τη δυνατότητα αυτο-ανανέωση των κυττάρων με διαφορετικά προφίλ δείκτη επιφανείας, αναλάβαμε την κουλτούρα tumorsphere των διαλεγμένων κυττάρων σε μια ειδική πλάκα καλλιέργειας εξαιρετικά χαμηλό συνημμένο με μέσο υπό όρους για tumorsphere πολιτισμού [29]. Επτά έως δέκα ημέρες αργότερα, τα CD44 + /CD133 + διπλά θετικών κυττάρων MIAPaCa2 μεγάλωσε τυπικό tumorspheres, αλλά δεν τα CD44- /CD133- διπλά αρνητικά κύτταρα, ενώ CD44 + /CD133- ή CD44- /CD133 + single-θετικά κύτταρα είχαν λιγότερες και μικρότερες σφαίρες (Σχήμα 5

Β-Γ

). Ένα αντιπροσωπευτικό tumorsphere από + + κύτταρα CD44 /CD133 φαίνεται στο Σχήμα 5

B

(το ένθετο). Μπορούμε επίσης να διεξαχθεί μια δοκιμασία αραίωσης περιορισμού του όγκου-έναρξη σε άτριχα ποντίκια χρησιμοποιώντας τα ταξινομημένα κύτταρα, και τα δεδομένα συνοψίζονται στον Πίνακα 1. CD44- /CD133- κύτταρα δεν σχηματίζουν όγκους, ενώ + /CD133 + κυττάρων 1 × 10

4 CD44 σχηματίζεται όγκου σε 4 από τους 4 ποντικούς, 1 × 10

3 CD44 + /CD133 + κυττάρων που σχηματίζεται όγκου σε 2 από τα 4 ποντίκια, και όχι του όγκου που σχηματίζονται με 1 × 10

2 κύτταρα. Έτσι, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η CD44 + /διπλά θετικά κύτταρα MIAPaCa2 CD133 + εμπλουτίζονται με ογκογενή κύτταρα ή καρκινικά βλαστικά /προγονικά κύτταρα ικανά να αυτο-ανανέωση, αλλά ο CD44- /CD133- πληθυσμός διπλό αρνητικό δεν περιέχει τέτοια κύτταρα. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν επίσης ότι το CD44 /CD133 είναι κατάλληλοι δείκτες για τα καρκινικά κύτταρα-κίνηση στην MIAPaCa2 κυτταρική σειρά.

Μια

, CD44 και CD133 χρώση των κυττάρων MIAPaCa2. MIAPaCa2 κύτταρα χρωματίστηκαν με αντι-CD44-APC και αντι-CD133-PE και ταξινομούνται με FACS. Περίπου 1-2% των κυττάρων είναι CD44 + /CD133 + διπλά θετικά (Q2).

Β-Γ

, Tumorsphere πολιτισμό των διαλεγμένων κυττάρων. Τα ταξινομημένα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για tumorsphere καλλιέργεια όπως περιγράφεται στο

Υλικά και Μέθοδοι

. 7-10 ημέρες αργότερα, tumorspheres μετρήθηκαν (

Β

). Το ένθετο δείχνει ένα αντιπροσωπευτικό tumorsphere από CD44 + /CD133 + MIAPaCa2 κύτταρα.

C

.