Αφηρημένο

μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (SCLC) είναι επιθετική, με ταχεία ανάπτυξη και συχνές μετάσταση στα οστά? Ωστόσο, οι λεπτομερείς μοριακός μηχανισμός του παραμένει ελάχιστα κατανοητή. Εδώ, αναφέρουμε τον κρίσιμο ρόλο της πρώιμης ανάπτυξης παράγοντα 4 (EGR4), ένα, ψευδαργύρου-δακτύλου παράγοντα μεταγραφής δέσμευσης DNA, σε κυτταρικό πολλαπλασιασμό των SCLC. EGR4 υπερέκφραση σε κύτταρα ΗΕΚ293Τ ανατεθεί σημαντική προς τα πάνω ρύθμιση των ειδικών παραλλαγών ματίσματος του παραθυρεοειδούς ορμόνης-πρωτεΐνης που σχετίζονται με (

PTHrP

) γονίδιο, με αποτέλεσμα την ενίσχυση της έκκρισης της PTHrP πρωτεΐνης, ενός γνωστού μεσολαβητής του οστεολυτική μετάσταση στα οστά. Το πιο σημαντικό, η εξάντληση των

EGR4

έκφραση με siRNA κατέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη των SCLC κυτταρικές σειρές, SBC-5, SBC-3 και NCI-H1048. Από την άλλη πλευρά, η εισαγωγή του

EGR4

σε κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 σημαντικά ενισχυμένη κυτταρική ανάπτυξη. Έχουμε προσδιορίσει τέσσερις

EGR4

γονιδίων στόχων,

SAMD5

,

RAB15

,

SYNPO

και

DLX5

, η οποία ήταν η πιο σημαντική μειωτικά γονίδια μετά την εξάντληση του

EGR4

έκφραση σε όλα τα SCLC κύτταρα που εξετάστηκαν, και απέδειξε την άμεση πρόσληψη EGR4 να υποστηρικτές τους από chip και ανάλυση αναφοράς της λουσιφεράσης. Αξιοσημείωτα, knockdown της έκφρασης αυτών των γονιδίων με siRNA κατέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη όλων των SCLC κυττάρων. Στο σύνολό τους, τα ευρήματά μας υποδεικνύουν ότι EGR4 πιθανό ρυθμίζει την μετάσταση στα οστά και τον πολλαπλασιασμό των SCLC κυττάρων μέσω μεταγραφικής ρύθμισης αρκετών γονιδίων στόχων, και μπορεί επομένως να είναι ένα υποσχόμενο στόχο για την ανάπτυξη αντικαρκινικών φαρμάκων για ασθενείς με SCLC.

Citation : Matsuo T, Dat LT, Komatsu Μ, Yoshimaru Τ, Daizumoto K, Sone S, et al. (2014) Early Growth Response 4 εμπλέκεται στην κυτταρικού πολλαπλασιασμού μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα μέσω ενεργοποίησης της μεταγραφής μεταγενέστεροι γονίδιά του. PLoS ONE 9 (11): e113606. doi: 10.1371 /journal.pone.0113606

Συντάκτης: John D. Minna, Πολυτεχνείου της Texas Southwestern Medical Center στο Ντάλας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 4 Αυγ, 2014? Αποδεκτές: 27 Οκτωβρίου, 2014? Δημοσιεύθηκε: 20 Νοέμβρη του 2014

Copyright: © 2014 Matsuo et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από το μέλλον προηγμένη έρευνα από το Πανεπιστήμιο της Τοκουσίμα. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του πνεύμονα είναι μία από τις πιο κοινές μορφές καρκίνου, και η συχνότητα εμφάνισης της αυξάνεται παγκοσμίως [1]. Η υψηλή θνησιμότητα και κακή πρόγνωση του καρκίνου του πνεύμονα είναι αποτέλεσμα δυσκολίες στην έγκαιρη διάγνωση και υψηλού μεταστατικού δυναμικού της. Ο καρκίνος του πνεύμονα ταξινομούνται σε δύο κύριους τύπους, μικροκυτταρικό καρκίνο πνεύμονα (SCLC) και μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC), οι οποίες αντιπροσωπεύουν περίπου το 25% και 75% των περιπτώσεων, αντιστοίχως. SCLC δώρα με την επιθετική κλινική συμπεριφορά χαρακτηρίζεται από την ταχεία ανάπτυξη και συχνές μεταστάσεις στον εγκέφαλο, πνεύμονα, ήπαρ και οστά [2]. Ειδικότερα, μετάσταση στα οστά προκαλεί σοβαρή επιπλοκές σε SCLC και μπορεί να οδηγήσει σε πόνο στα οστά, παθολογικά κατάγματα, υπερασβεστιαιμία, συμπίεση του νωτιαίου μυελού και άλλα σύνδρομα συμπίεσης νεύρων [3], [4], και συνδέεται συχνά με υψηλή νοσηρότητα και κακή πρόγνωση. Τρέχουσες θεραπείες είναι γενικά παρηγορητική. Ως εκ τούτου, είναι πολύ σημαντικό για την πρόληψη και τη θεραπεία οστεολυτικές οστικές μεταστάσεις

Bone μετάσταση έχει γενικά ταξινομούνται ως οστεολυτικές, που οδηγεί στην καταστροφή των οστών.? οστεοβλαστική, που οδηγεί σε σχηματισμό νέου οστού? ή αναμεμιγμένο με βάση την πρωτογενή μηχανισμό παρεμβολής με κανονική ανάπλαση οστού. Η ισορροπημένη δραστηριότητα των οστεολυτικές και οστεοβλαστικές παράγοντες θεωρείται ότι ρυθμίζει μετάσταση στα οστά [4], [5]. Πρόσφατα, πολλά μόρια έχει αναφερθεί ότι παίζουν σημαντικό ρόλο ως παράγοντες που εμπλέκονται στην οστεοβλαστική osteoformation [4] – [6]. Ωστόσο, οι ακριβείς μηχανισμοί που είναι υπεύθυνοι για την ανάπτυξη των όγκων στα οστά παραμένουν ανεξερεύνητες.

Ολοκληρωμένη transcriptomics παρέχουν ακριβή χαρακτηρισμό των μεμονωμένων καρκίνων που θα συμβάλει στη βελτίωση των κλινικών στρατηγικών για νεοπλασματικές ασθένειες μέσω της ανάπτυξης νέων φαρμάκων. Ως εκ τούτου, «-ωματικής» τεχνολογία προσεγγίσεις είναι αποτελεσματικές για τον εντοπισμό μορίων-στόχων που συμμετέχουν στην καρκινογόνο και μεταστατικό οδούς, συμπεριλαμβανομένων των οστικών μεταστάσεων. Για το σκοπό αυτό, το γονιδίωμα κλίμακα transcriptomics ανθρώπινης SCLC που ασχολούνται με την μετάσταση οργάνου προτιμησιακής σε ποντικούς αναλύθηκε, και αρκετά γονίδια δυνητικά εμπλέκονται στην μετάσταση στα οστά βρέθηκαν [7]. Σε αυτή τη μελέτη, επικεντρώθηκε στην πρώιμη απόκριση ανάπτυξης 4 (

EGR4

), η οποία είναι σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω σε μεταστατικούς όγκους των οστών σε σύγκριση με άλλες μεταστάσεις όργανο (πνεύμονα, νεφρό και το ήπαρ) που προέρχεται από ανθρώπινα κύτταρα SCLC [7].

το

EGR4

γονίδιο ανήκει στην οικογένεια πρώιμη απόκριση ανάπτυξης των άμεσων πρώιμων γονιδίων που κωδικοποιούν τέσσερις παράγοντες μεταγραφής ψευδαργύρου-δακτύλου, δέσμευσης DNA (

EGR1

να

EGR4

) [8]. Αυτό το γονίδιο (

pAT133

,

NGFI-C

) αναγνωρίστηκε για πρώτη φορά ως μια πρωτεΐνη δακτύλου ψευδαργύρου που προκαλείται άμεσα από μιτογόνο διέγερση σε Τ λεμφοκύτταρα και ινοβλάστες [9], [10]. Έχει αναφερθεί ότι

EGR4

-null ποντίκια έχουν ανδρική στειρότητα εξαιτίας συνελήφθησαν σπερματογένεσης αλλά δεν παρατηρείται γυναικείας υπογονιμότητας [11], [12], υποδηλώνοντας ότι EGR4 διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο σε ορισμένους τύπους ανθρώπινων ιδιοπαθούς ανδρικής αγονία. Επιπλέον, EGR4 είναι γνωστό ότι έχει ένα πρότυπο έκφρασης νευρωνικά ειδική σε αρουραίους [13] και ρυθμίζουν νευροτροφικό παράγοντα προερχόμενο από τον εγκέφαλο (BDNF) μεσολάβηση νευρώνα-ειδική χλωριούχο κάλιο συμμεταφορέα 2 (KCC2) μεταγραφή μέσω της οδού σηματοδότησης ERK1 /2 σε ανώριμα νευρώνες [14]. Ωστόσο, ο ρόλος του παθοφυσιολογικός EGR4 στην καρκινογένεση σε SCLC, δεν έχει διευκρινισθεί. Σε αυτή τη μελέτη, αναφέρουμε ότι EGR4 δρα ως μεταγραφικός ενεργοποιητής μέσω της ρύθμισης των συγκεκριμένων κατάντη γονιδίων στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων SCLC.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές

Το ανθρώπινο μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κυτταρικές σειρές SBC-3 και SBC-5 ήταν ευγενική προσφορά από τους Drs. Μ Tanimoto και Κ Kiura του Πανεπιστημίου Okayama [15]. Ο NSCLC κυτταρική σειρά PC14PE6 παρασχέθηκε ευγενώς από τον Dr. Ι J. Fidler του M. D. Anderson Κέντρο Καρκίνου [16]. Η ανθρώπινη κυτταρική γραμμή SCLC ΝΟΙ-H1048 και ανθρώπινες κυτταρικές σειρές NSCLC Α549 και ΝΟΙ-H1048 αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). Το ανθρώπινο ACC-LC319 /bone2 κυτταρική σειρά ιδρύθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17]. Η ποντικού οστεοβλαστική υποκλώνο 4 κυτταρική σειρά MC3T3-E1 παρασχέθηκε ευγενώς από τον Chugai Pharmaceutical Co., Ltd. (Tokyo, Japan). Το ανθρώπινο μικρό επιθηλιακών αεραγωγών κυτταρική γραμμή (SAEC) αγοράστηκε από την Lonza (Walkersville, MD, USA). Όλα τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν υπό τις κατάλληλες συνθήκες.

Το πλασμίδιο κατασκευάσματα

Η πλήρης κωδικοποιητική αλληλουχία του ανθρώπινου

EGR4

(NM_001965) ενισχύθηκε με PCR χρησιμοποιώντας ΚΩΔ συν DNA πολυμεράση (Toyobo, Osaka, Japan). Το PCR προϊόν εισήχθη εντός του

Eco RI και

Xho

θέσεις Ι του φορέα pCAGGSn3FH η οποία περιέχει μία Ν-τερματική FLAG ετικέτα. Για πλασμίδια αναφοράς λουσιφεράσης, θραύσματα DNA από το 5 ‘πλευρικές περιοχές του

PTHrP-V3

και

V4

(NM_198964.1 και NM_198966.1, αντίστοιχα),

SAMD5

(NM_001030060.2),

RAB15

(NM_198686.2),

SYNPO

(NM_007286.5) και

DLX5

(NM_005221.5), τα οποία περιλαμβάνουν το δυναμικό EGR θέσεις σύνδεσης όπως προβλέπεται από το πρόγραμμα MatInspector (Genomatix, https://www.genomatix.de/matinspector.html), ενισχύθηκαν με PCR και εισάγεται στις κατάλληλες θέσεις περιοριστικών ενζύμων στον φορέα pGL3-ενισχυτή (Promega, Madison, WI , ΗΠΑ). Τα σετ εκκινητή PCR που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη φαίνονται στον Πίνακα S1. Οι αλληλουχίες DNA όλων των κατασκευασμάτων επιβεβαιώθηκαν με αλληλούχιση του DNA (ΑΒΙ 3500xL sequencer? Life Technologies, Foster City, CA, USA).

εξαγωγή RNA, αντίστροφη μεταγραφή, ημι-ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνο PCR

Σύνολο εξαγωγή RNA, αντίστροφη μεταγραφή, ημι-ποσοτική RT-PCR και Real-time PCR πειράματα διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18]. Τα επίπεδα έκφρασης σε κάθε δείγμα κανονικοποιείται στη

β-ακτίνης

περιεχόμενο mRNA. Οι αλληλουχίες του κάθε σετ εναρκτήρα που παρατίθενται στον Πίνακα S2.

ανάλυση Western ανάλυση κηλίδος

Western blot πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18]. Μετά SDS-PAGE, οι μεμβράνες κηλιδώθηκαν με πρωτεΐνες επωάστηκαν με αντι-FLAG Μ2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ, USA, F3165) ή αντι-β-ακτίνης (AC-15, Sigma-Aldrich, Α-5441) μονοκλωνικά αντισώματα ποντικού αραιωμένο σε 1:5000. Οι μεμβράνες στη συνέχεια επωάστηκαν με υπεροξειδάση (HRP) δευτερογενές αντίσωμα για 1 ώρα, και η πρωτεΐνη ζώνες έγιναν ορατές με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια αντιδραστήρια (ECL) ανίχνευση (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA).

Μέτρηση της PTHrP έκκριση

κύτταρα ΗΕΚ293Τ (1,5 × 10

5 κύτταρα /πλάκα 12 φρεατίων) επιμολύνθηκαν με την μακέτα (χωρίς ένθετο) πλασμίδια χρησιμοποιώντας Fugene 6 (Promega) pCAGGSn3FH-EGR4 ή. Στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, το μέσο καλλιέργειας συλλέχθηκε και φυγοκεντρήθηκε στους 4 ° C στις 15.000 rpm. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης PTHrP στο ρυθμισμένο μέσο προσδιορίστηκε με μία ανοσοραδιομετρική (IRMA) δοκιμασία (SRL Inc., Tokyo, Japan).

Επίδραση του ρυθμισμένου μέσου που προέρχονται από κύτταρα ΗΕΚ293Τ EGR4 υπερεκφράζουν στο

RANLK

,

IL-6

και

IL-8

έκφραση

ΗΕΚ293Τ κύτταρα (2.6 × 10

6 κύτταρα /10 cm τρυβλίο) διαμολύνθηκαν παροδικά με το pCAGGSn3FH-EGR4 ή ψευδο φορέα για 48 ώρες, και το μέσο καλλιέργειας στη συνέχεια αντικαταστάθηκε με DMEM συν 0,1% FBS για επιπλέον 48 ώρες. Το μέσο καλλιέργειας στη συνέχεια συλλέχθηκε, και το ρυθμισμένο μέσο μεταφέρθηκε σε κύτταρα ποντικού οστεοβλαστών MC3T3-E1 που είχαν προ-καλλιεργήθηκαν με μέσο διαφοροποίησης που περιείχε ασκορβικό οξύ (100 μg /ml) για 5 ημέρες. Μετά από 48 ώρες, τα επίπεδα έκφρασης του ποντικού

RANKL

,

IL-6

, και

IL-8

αναλύθηκε με πραγματικού χρόνου PCR όπως περιγράφεται ανωτέρω.

χρωματίνης ανοσοκαταβύθιση (μάρκας) δοκιμασία

κύτταρα ΗΕΚ293Τ (2.5 × 10

6 κύτταρα /10 cm τρυβλίου) διαμολύνθηκαν με 8 μα του pCAGGSn3FH-EGR4 ή ψευδο φορέα για 48 ώρες και στη συνέχεια δοκιμασίες ChIP διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας το κιτ ΕΖ-chip (Millipore, Billerica, ΜΑ, USA) όπως περιγράφεται προηγουμένως [19]. Το PCR εκκινητής θέτει για την ανίχνευση των θέσεων EGR πρόσδεσης χρησιμοποιήθηκαν παρατίθενται στον Πίνακα S3.

δοκιμασία Λουσιφεράσης

κύτταρα ΗΕΚ293Τ (2.5 × 10

4 κύτταρα /48 φρεατίων τρυβλίο) ήταν συν-επιμολυσμένα είτε με 100 ng του φορέα προαγωγέα pGL3-ενισχυτή όπως περιγράφεται παραπάνω ή την ψευδο φορέα σε συνδυασμό με 100 ng του pCAGGSn3FH-EGR4 ή ψευδο φορέα (100 ng). ρΡΙ_-ΤΚ χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Μετά από 48 ώρες, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν για

Firefly

λουσιφεράσης και

Renilla

δραστικότητα λουσιφεράσης χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ανταποκριτή λουσιφεράσης διπλή (Promega) όπως περιγράφεται προηγουμένως [19]. Τα δεδομένα εκφράστηκαν ως η πολλαπλάσια αύξηση πάνω από ψευδο-επιμολυσμένα κύτταρα (που ορίστηκε σε 1.0) και παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SE από δύο ανεξάρτητα πειράματα.

ΝΙΗ3Τ3 κυτταρικό πολλαπλασιασμό δοκιμασία

ΝΙΗ3Τ3 κύτταρα (0.5 × 10

5 κύτταρα /6 φρεατίων τρυβλίο) διαμολύνθηκαν παροδικά με 3 μg pCAGGSn3FH-EGR4 ή ψευδο φορέα χρησιμοποιώντας FuGENE 6 (Promega). δοκιμασίες πολλαπλασιασμού κυττάρων πραγματοποιήθηκαν στις 48, 72 και 96 ώρες μετά την επιμόλυνση, αντίστοιχα, χρησιμοποιώντας κυτταρικές Μετρώντας Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18]. Αυτά τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. ανάλυση κηλίδος Western έγινε όπως περιγράφεται παραπάνω.

γονιδιακή σίγηση αποτελέσματα από τη θεραπεία siRNA

χρησιμοποιείται siRNA ολιγονουκλεοτίδια (Sigma-Aldrich Japan KK, Ιαπωνία) να γκρεμίσουμε

EGR4

,

DLX5, SYNPO SAMD5

και

RAB15

έκφραση στο SBC-5, SBC-3, NCI-H1048 ή PC14PE6. Οι αλληλουχίες στόχευσης κάθε γονίδιο που παρατίθενται στον Πίνακα S4. Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε 12-φρεατίων (SBC-5 και PC14PE6? 1.5 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο, SBC-3? 2.5 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο, NCI-H1048? 5.0 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο). Διαμόλυνση 100 ηΜ siRNA να SBC-5 και κύτταρα PC14PE6 διεξήχθη χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Lipofectamine 2000 (Life Technologies) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [20]. SBC-3 και ΝΟΙ-H1048 κύτταρα επιμολύνθηκαν με 50 ηΜ siRNAs χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο διαμόλυνσης Lipofectamine RNAi Max (Life Technologies) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Στις 48, 96 ή 120 ώρες μετά την επιμόλυνση, συνολική εκχύλιση RNA, PCR πραγματικού χρόνου και του πολλαπλασιασμού των κυττάρων δοκιμασίες διεξήχθησαν όπως περιγράφεται παραπάνω.

Ταυτοποίηση EGR4 κατάντη γονιδίων με DNA μικροσυστοιχία

SBC- 5 κύτταρα (1 χ 10

6 κύτταρα /35 mm δίσκου για 24 ώρες) διαμολύνθηκαν με 10 ηΜ siRNA που κατευθύνεται έναντι EGR4 (EGR4-2) ή EGFP (siEGFP? α ελέγχου) χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο επιμόλυνσης Lipofectamine RNAi Max (Life Technologies ). Ολικό RNA εξήχθη από κάθε δείγμα στις 48 και 72 ώρες μετά την επιμόλυνση του siRNA. Οι αναλύσεις μικροσυστοιχιών DNA και δεδομένα διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας το Agilent Σύνολο Ανθρώπινου Γονιδιώματος Microarray (4 × 44K, G4110F? Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) και λογισμικό GeneSpring (έκδοση 11.5? Agilent Technologies) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [21]. Μια διορθωμένη

P

αξία υπολογίστηκε με Benjamini Hochberg ποσοστό εσφαλμένης ανακάλυψη ανάλυση (FDR), και

P

& lt? 0,05 θεωρήθηκε σημαντική. Η έκταση και η κατεύθυνση της διαφορικής έκφρασης μεταξύ χρονικά σημεία (48 και 72 ώρες) προσδιορίζεται με υπολογισμό φορές τιμών μεταβολής. Τα δεδομένα της ανάλυσης μικροσυστοιχιών DNA έχουν υποβληθεί για την Έκφραση NCBI Gene Omnibus (GEO) της βάσης δεδομένων ως σειρές GSE40558.

RNAseq ανάλυση δεδομένων των καρκίνων του πνεύμονα

Δημοσίως διαθέσιμα δεδομένα γονιδιακής έκφρασης (κανονικοποιημένες τιμές από Illumina RNAseq v2, επίπεδο 3, LUAD και LUSC) από τον καρκίνο Genome Atlas (TCGA? https://cancergenome.nih.gov/) είχαν κατεβάσει από μήτρα TCGA. Η διαφορική έκφραση (μέσω δίπλωσης τιμή μεταβολής) μεταξύ ιστών καρκίνου και του παρακείμενου φυσιολογικού πνεύμονα υπολογίσθηκε σύμφωνα με την κανονικοποιημένη τιμή γονιδιακής έκφρασης του κάθε δείγματος.

Στατιστική ανάλυση

Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του Student

t-test

.

P

& lt? 0,05 θεωρήθηκε σημαντική

Αποτελέσματα

EGR4 ρυθμίζει άμεσα την μεταγραφική δραστηριότητα του

PTHrP

γονίδιο

Ανάλυση. του προφίλ γονιδιακής έκφρασης του γονιδιώματος σε επίπεδο της μετάστασης οργάνου προτιμησιακού της ανθρώπινης κυτταρικής σειράς SCLC SBC-5 σε ποντίκια εντοπίζονται έγκαιρα απάντηση αύξησης 4 (

EGR4

), η οποία ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω σε μεταστατικούς όγκους των οστών (

ρ

& lt? 0.001, αναλογία? 2,22) σε σύγκριση με άλλες μεταστάσεις όργανο (πνεύμονα, νεφρό και ήπαρ) [7]. Κατ ‘αρχάς, να διευκρινιστεί ο ρόλος της EGR4 ως παράγοντας μεταγραφής που εμπλέκονται στην μετάσταση στα οστά, εστιάσαμε στην παραθυρεοειδούς ορμόνης-πρωτεΐνης που σχετίζονται με (

PTHrP

) γονίδιο ως υποψήφιος κατάντη στόχος της EGR4 επειδή η

PTHrP

γονίδιο είναι γνωστό ότι είναι ένας ισχυρός ενεργοποιητής της οστεοκλαστικής επαναρρόφησης [4] και κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη που εκκρίνεται από SBC-5 κύτταρα [22], [23]. Επιπλέον, έχει αναφερθεί ότι η θεραπεία με ένα εξουδετερωτικό αντίσωμα αντι-PTHrP αναστέλλει την παραγωγή του SBC5 μετάσταση στα οστά κύτταρο στο μοντέλο SCID ποντικού [22], [23].

Στην National Center for Biotechnology Information ( NCBI βάση δεδομένων), η

PTHrP

γονίδιο φέρεται να διαθέτει τέσσερις μεταγραφικές παραλλαγές, που ορίζεται

PTHrP

παραλλαγή 1 (ένταξη PTHrP-V1, GenBank αρ. NM_198965.1), παραλλαγή 2 (PTHrP- V2, NM_002820.2), παραλλαγή 3 (PTHrP-V3, NM_198964.1) και την παραλλαγή 4 (PTHrP-V4, NM_198966.1). Τα cDNA πλήρους μήκους του

PTHrP-V1

,

V2

,

V3

και

V4

αποτελούνται από 1331, 1881, 1862 και 1312 νουκλεοτίδια, τα οποία κωδικοποιούν 177, 175, 175 και 177 αμινοξέα, αντίστοιχα, και αποτελούνται από 5, 4, 3, και 4 εξώνια, αντίστοιχα. Η παραλλαγή V1 στερείται το εξόνιο 3, και με την παραλλαγή V2 στερείται το εξόνιο 3 και κατέχει εξόνιο 5β, το οποίο είναι 1027 bp πλέον στο άκρο 3 ‘από το εξόνιο 5α. Η V3 και V4 των παραλλαγών που συνήθως στερούνται τα εξόνια 1 και 2 και κατέχουν το εξόνιο 3, το οποίο βρίσκεται εντός ιντρόνιο 2 με μήκος 281 bp. Η παραλλαγή V3 περαιτέρω στερείται το εξόνιο 6, και διαθέτει εξόνιο 5β και παραλλαγή V2. Η παραλλαγή V4 διαθέτει εξόνιο 5α και το εξόνιο 6, υποδεικνύοντας ότι η

PTHrP-V1 /V2

και

V3 /V4

παραλλαγές έχουν διαφορετικές περιοχές υποκινητή (Εικόνα 1Α). Μεταγενέστερες πραγματικού χρόνου RT-PCR ανάλυση επιβεβαίωσε ότι η

PTHrP-V3

και

V4

παραλλαγές ματίσματος ήταν κυρίως προς τα πάνω ρυθμισμένη στο μεταγραφικό επίπεδο σε κύτταρα ΗΕΚ293Τ EGR4 υπερεκφράζουν σύγκριση με ψευδο-διαμολυσμένα κύτταρα ( Εικόνα 1Β). Κατά συνέπεια, για να αποκτήσετε άμεση απόδειξη για την ρύθμιση προς τα άνω του

PTHrP-V3

και

V4

από EGR4, ψάξαμε πρώτα για υποθετικό μοτίβα πρόσδεσης EGR DNA με το πρόγραμμα MatInspector (που περιγράφεται παραπάνω), επειδή έχει αναφερθεί ότι η οικογένεια EGR, συμπεριλαμβανομένης της πρωτεΐνης EGR4, δεσμεύεται κατά προτίμηση σε ένα EGR συναινετικό μοτίβο (5′-GCGG /TGGGCG-3 ‘) [24] – [27]. Βρήκαμε ένα δυναμικό μοτίβο δέσμευσης EGR DNA μέσα στο

PTHrP-V3

και

V4

περιοχής του υποκινητή (-515 έως -499). Στη συνέχεια, εξετάσαμε την μεταγραφική δραστικότητα EGR4 με δοκιμασία λουσιφεράσης χρησιμοποιώντας μία λουσιφεράση πλασμίδιο pGL3 που περιέχει το περίγραμμα σύνδεσης EGR4 στο

PTHrP-V3 /V4

υποκινητή. Μια σημαντική αύξηση στη δραστηριότητα λουσιφεράσης παρατηρήθηκε με FLAG-EGR4 διαμόλυνση σε σύγκριση με τον φορέα ελέγχου mock σε κύτταρα ΗΕΚ293Τ (Σχήμα 1 C). Για να διερευνήσουν περαιτέρω αν EGR4 θα μπορούσε να συνδεθεί με μια πιθανή

PTHrP-V3

και

V4

EGR μοτίβο δέσμευσης, πραγματοποιήσαμε μια ανάλυση chip. Το γονιδιωματικό θραύσμα συμπεριλαμβανομένης της πιθανής μοτίβο δέσμευσης EGR (-515 να -499) του

PTHrP-V3

και

V4

ειδικώς δεσμεύονται από EGR4 πρωτεΐνης σε προϊόντα ανοσοκατακρημνίσθηκαν με ένα αντίσωμα αντι-FLAG, υποδηλώνοντας ότι EGR4 δεσμεύονται άμεσα με την περιοχή προαγωγέα του

PTHrP-V3

και

V4

παραλλαγές (Σχήμα 1 D). Στο σύνολό τους, τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η EGR4 μπορεί να αυξάνουν άμεσα το

PTHrP-V3

και

V4

παραλλαγές σε SCLC κύτταρα

Α:. Γονιδιωματική δομές από τις τέσσερις παραλλαγές ματίσματος του

PTHrP

. Οι γκρι και λευκά κουτιά υποδεικνύουν κωδικοποίησης και μη-κωδικοποιητικές περιοχές, αντίστοιχα. Τα βέλη δείχνουν τις ομάδες εναρκτών που χρησιμοποιούνται για την εκτέλεση RT-PCR για κάθε μεταγράφημα. Οι αριθμοί στις παρενθέσεις δείχνουν το μήκος κάθε εξόνιο. Β: Πάνω πίνακας: Ανάλυση στυπώματος Western των κυττάρων ΗΕΚ293Τ που εκφράζουν εξωγενή FLAG-tagged EGR4 (FLAG-EGR4) ή κύτταρα επιμολυσμένα με τον ψευδο φορέα. Κάτω πίνακας: real-time RT-PCR ανάλυση των

PTHrP

παραλλαγές ματίσματος (

V1 /V2

και

V3 /V4

) σε κύτταρα ΗΕΚ293Τ EGR4 υπερεκφράζουν. C: λουσιφεράσης δοκιμασία του

PTHrP-V3

και

-V4

(

V3 /V4

) περιοχές υποκινητή (n = 2, *

P

& lt? 0,05). Αυτό το πείραμα εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας ένα μέρος των προϊόντων λύσης από κύτταρα που εκφράζουν εξωγενή FLAG-EGR4 ή εκείνα επιμολυσμένα με τον φορέα που χρησιμοποιείται mock στο Β D: Δοκιμασία πλινθίο του

PTHrP-V3 /V4

περιοχή υποκινητή. δοκιμασίες ChIP χρησιμοποιήθηκαν για να προσδιοριστεί απευθείας σύνδεση με το

PTHrP-V3 V4

προαγωγού /EGR4. Το προϊόν PCR ήταν από την -620 -318 να της ανοδικής περιοχής του 5 ‘άκρο του εξονίου 3 του

PTHrP-V3 /V4

, η οποία ορίζεται ως η θέση 1.

Η

παρακρινή αποτελέσματα της PTHrP που εκκρίνεται από τα κύτταρα που υπερεκφράζουν EGR4-

έχει αναφερθεί ότι PTHrP πρωτεΐνη που εκκρίνεται από τα καρκινικά κύτταρα ρυθμίζει την έκφραση του

RANKL

,

IL-6

και

IL-8

γονιδίων, τα οποία έχουν ενοχοποιηθεί ως παράγοντες που ενισχύουν τον σχηματισμό οστεοκλαστών και την καταστροφή των οστών σε κακοήθεις νόσους [28] – [30] σε οστεοβλάστη κύτταρα. Σύμφωνα με αυτά τα δεδομένα και τα ευρήματά μας, όπως φαίνεται στο Σχήμα 1, υποθέσαμε ότι PTHrP πρωτεΐνη εκκρίνεται από τα κύτταρα EGR4 υπερεκφράζουν. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η συγκέντρωση πρωτεΐνης PTHrP ήταν σημαντικά αυξημένη σε μέσα ρυθμισμένα από κύτταρα ΗΕΚ293Τ EGR4 υπερεκφράζουν (14,43 ± 1,04 pmol /L) σε σύγκριση με ρυθμισμένα μέσα από ψευδο-επιμολυσμένα κύτταρα (11,83 ± 0,15 pmol /L,

P

& lt? 0,05? Σχήμα 2Α)

Α:. η έκκριση της πρωτεΐνης από PTHrP EGR4 υπερεκφράζουν ΗΕΚ293Τ κυττάρων (η = 3, *

P

& lt? 0,05). Β: Μέτρηση καθεστώς για τις παρακρινείς επιδράσεις της μέσα από κύτταρα EGR4-υπερεκφράζουν. C: Real-time PCR ανάλυση των παρακρινούς επιδράσεις στην έκφραση του

RANKL, IL-6

και

IL-8

γονιδίων όταν μέσο από κύτταρα ΗΕΚ293Τ EGR4 υπερεκφράζουν καλλιεργήθηκε με το ποντίκι κύτταρα οστεοβλαστών MC3T3-E1 (n = 2, *,

P

& lt? 0,05, **,

P

& lt? 0,01).

Η

Στη συνέχεια, αξιολόγησαν τις επιδράσεις παρακρινή ρυθμισμένου μέσου από EGR4 υπερεκφράζουν ΗΕΚ293Τ κύτταρα σε κύτταρα οστεοβλαστών. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Β, μεταφέραμε ρυθμισμένο μέσο από κύτταρα ΗΕΚ293Τ που μορφομετατρέπονται με το FLAG-EGR4 κατασκεύασμα να MC3T3-E1 κύτταρα ποντικού οστεοβλαστών και στη συνέχεια διεξήχθη PCR πραγματικού χρόνου για να εξετασθούν τα αποτελέσματα του ρυθμισμένου μέσου με το επίπεδο έκφρασης του

RANKL

,

IL-6

και

IL-8

γονίδια. Και τα τρία γονίδια ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω σε κύτταρα οστεοβλάστη σε επεξεργασία με ρυθμισμένο μέσο από κύτταρα ΗΕΚ293Τ εκτοπικά εκφράζουν FLAG-EGR4 σύγκριση με ψευδο-διαμολυσμένα κύτταρα (Σχήμα 2C). Συλλογικά, αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι η αύξηση της έκκρισης από τα κύτταρα PTHrP EGR4 υπερεκφράζουν μπορεί να ενισχύσει την έκφραση του

RANKL

,

IL-6

και

IL-8

γονίδια στα κύτταρα των οστεοβλαστών.

Επίδραση του

EGR4

στην ανάπτυξη των κυττάρων

Θα εξεταστεί πρώτο

EGR4

έκφραση σε SCLC κύτταρα με ημι-ποσοτική RT-PCR και βρέθηκε ότι

EGR4

ήταν εντόνως εκφρασμένο σε SBC-3, SBC-5 και κύτταρα ΝΟΙ-H1048 αλλά όχι στο μικρό επιθηλιακών αεραγωγών κυτταρική γραμμή SAEC (Σχήμα 3Α). Στη συνέχεια, για να αξιολογηθεί κατά πόσο EGR4 είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη του SBC-5 κύτταρα, χρησιμοποιήσαμε μια προσέγγιση παρεμβολή RNA με δύο διαφορετικά siRNA ολιγονουκλεοτίδια. Real-time PCR ανάλυση έδειξε ότι

EGR4

-ειδικές siRNAs (siEGR4-1 και siEGR4-2) κατέστειλε σημαντικά την έκφραση του EGR4 σύγκριση με siEGFP ως μάρτυρας (Σχήμα 3Β). ΜΤΤ δοκιμασία έδειξε ότι η εισαγωγή του siEGR4s (siEGR4-1 και siEGR4-2) κατέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη του SBC-5 κύτταρα (Σχήμα 3C), η οποία είναι σύμφωνα με τις EGR4 knockdown αποτελέσματα. Επιβεβαιώσαμε επίσης ανασταλτικές επιδράσεις σημαντική αύξηση του

EGR4

νοκ ντάουν σε άλλες SCLC κυτταρικές σειρές SBC-3 και NCI-H1048 υπερεκφράζουν

EGR4

(Σχήμα S1). Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω η προώθηση της ανάπτυξης επίδραση του

EGR4

, FLAG-EGR4 κατασκεύασμα ή ψευδο φορέα διαμολύνθηκε παροδικά σε κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 και ΜΤΤ δοκιμασία διεξήχθη όπως περιγράφεται παραπάνω. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3D, FLAG-EGR4-επιμολυσμένα κύτταρα αναπτύχθηκαν σημαντικά ταχύτερα από ό, τι εκείνοι που επιμολύνθηκαν με mock φορέα. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η υπερέκφραση του

EGR4

μπορεί να εμπλέκεται στην ανάπτυξη του SCLC κυττάρων

Α:. Έκφραση του

EGR4

σε κυτταρικές σειρές SCLC και NSCLC καθορίστηκε με ημι -ποσοτική RT-PCR. Β: Συνέπειες της

EGR4

νοκ ντάουν στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων στο SBC-5 κύτταρα. Real-time PCR του

EGR4

σε siEGFP- ή siEGR4 (siEGR4-1, siEGR4-2) κύτταρα κατεργασμένα σε 5 ημέρες μετά τη θεραπεία siRNA (n = 2, *

P

& lt? 0.05).

ACTB

χρησιμοποιήθηκε ως ποσοτικό έλεγχο σε πραγματικό χρόνο RT-PCR. C: Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε με ανάλυση ΜΤΤ σε 5 ημέρες μετά τη θεραπεία siRNA (n = 3, ***

P

& lt? 0.005). (Si-1? SiEGR4-1, si-2? SiEGR4-2). D: Η ανάπτυξη που προάγουν την επίδραση εξωγενών EGR4 σε κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 (*

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0,01,

NS

, καμία σημασία). Η ανάλυση στυπώματος Western εκτελέστηκε σε 96 ώρες μετά την επιμόλυνση (αριστερό πάνελ). δοκιμασία ΜΤΤ διεξήχθη στις 48, 72 και 96 ώρες μετά την επιμόλυνση με FLAG-EGR4 (μαύρο) ή ψευδο φορέα (λευκό) (δεξιός πίνακας). Αυτά τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

Η

Αναγνώριση

EGR4

γονιδίων στόχων

Για να αποκτήσετε την περαιτέρω κατανόηση του βιολογικού ρόλου του

EGR4

για κυτταρική ανάπτυξη, προσπαθήσαμε να προσδιορίσει κατάντη γονίδια ειδικά ρυθμίζονται από EGR4 στο SCLC κύτταρα. siEGR4 ή siEGFP (έλεγχος siRNA) μετασκευάστηκε σε SBC-5 κύτταρα στα οποία

EGR4

ήταν εντόνως εκφρασμένων (Σχήμα 3Α), και αλλαγές στην έκφραση των γονιδίων σε δύο χρονικά σημεία παρακολουθήθηκαν με ανάλυση μικροσυστοιχιών DNA. Για την ταυτοποίηση των γονιδίων που πιθανώς ρυθμίζονται από EGR4, επιλέξαμε γονίδια με τα ακόλουθα δύο κριτήρια: το επίπεδο (i) έκφραση μειώθηκε κατά περισσότερο από δύο φορές στις 48 και 72 ώρες σε κύτταρα επιμολυσμένα με siEGR4 σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με τον έλεγχο siEGFP, και (ii) ένα υποθετικό μοτίβο δέσμευσης EGR είχε προβλεφθεί να υπάρχει εντός 500 bp της θέσης έναρξης της μεταγραφής από το πρόγραμμα MatInspector (που περιγράφεται παραπάνω). Εντοπίσαμε 13 γονίδια τα οποία ρυθμίζεται προς τα κάτω μετά από νοκ ντάουν της έκφρασης EGR4 (Πίνακας S5). Real-time PCR ανάλυση επιβεβαίωσε ότι επτά μεταγραφές ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα κάτω στα δύο χρονικά σημεία σε κύτταρα EGR4-knockdown (Σχήμα 4Α). Ακολούθως, αξιολογήσαμε επίσης την προς τα πάνω ρύθμιση αυτών των γονιδίων κατά εξωγενή έκφραση EGR4 σε κύτταρα ΗΕΚ293Τ και τελικά επιλεγεί τέσσερα EGR4 γονίδια υποψήφιος στόχος, συμπεριλαμβανομένων των άπω-λιγότερο ομοιοακολουθίας 5 (

DLX5

), synaptopodin (

SYNPO

), αποστειρωμένο πεδίο άλφα μοτίβο που περιέχει 5 (

SAMD5

), και RAB15, μέλος του ογκογονιδίου οικογένειας RAS (

RAB15

), η οποία ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω από το

EGR4

υπερέκφραση (Σχήμα 4Β). Εμείς επιβεβαίωσε σημαντική ρύθμιση προς τα κάτω των

DLX5

,

SYNPO

και

SAMD5

γονίδια από

EGR4

νοκ ντάουν στο SBC-3 κύτταρα (Εικόνα S2).

Α: Real-time PCR του

EGR4

και επτά κατάντη γονίδια (

DLX5, SYNPO, SAMD5

,

MREG, AHNAK, RAB15

, και

PTPN23

) σε siEGFP- ή siEGR4 επεξεργασμένα SBC-5 κύτταρα (η = 2, *,

P

& lt? 0,05, **,

P

& lt? 0,01, * **

P

& lt? 0.005). Β: Real-time PCR του

DLX5

,

SYNPO

,

SAMD5

, και

RAB15

γονίδια σε ψευδώς ή EGR4-κύτταρα που υπερεκφράζουν ΗΕΚ293Τ (n = 2, *,

P

& lt? 0,05, ***

P

& lt? 0.005). Αυτό το πείραμα διεξήχθη χρησιμοποιώντας ολικό RNA από κύτταρα που εκφράζουν εξωγενή FLAG-tagged EGR4 (FLAG-EGR4) ή εκείνα επιμολυσμένα με τον φορέα που χρησιμοποιείται mock στο σχήμα 1Β. C: λουσιφεράσης δοκιμασία του

SAMD5

,

RAB15

,

SYNPO

και

DLX5

γονίδια. (N = 2, *,

P

& lt? 0,05, **,

P

& lt? 0,01). D: δοκιμασίες ChIP χρησιμοποιήθηκαν για να καθοριστεί η άμεση δέσμευση των EGR4 στους υποστηρικτές του

SAMD5

,

RAB15

,

SYNPO

και

DLX5

γονίδια .

η

για να αποκτήσετε άμεση απόδειξη για την τρανσενεργοποίηση των τεσσάρων EGR4 υποψήφια γονίδια-στόχους, μετρήθηκε η μεταγραφική δραστηριότητα των EGR4 με δοκιμασία λουσιφεράσης. FLAG-EGR4-μορφομετατραπέντα κύτταρα είχαν σημαντικά υψηλότερη ενεργότητα της λουσιφεράσης από ψευδο-επιμολυσμένα κύτταρα (Σχήμα 4C). Στη συνέχεια, μελετήθηκε η πρόσληψη EGR4 σε κάθε χώρο EGR4 δέσμευσης με τη δοκιμασία chip. EGR4 δείχθηκε να συνδέεται προς το προβλεπόμενο μοτίβο EGR δέσμευσης εντός των περιοχών προαγωγού του συνόλου των γονιδίων στόχων (Εικόνα 4D). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι EGR4 διαενεργοποιεί άμεσα

SAMD5

,

RAB15

,

SYNPO

και

DLX5

. Στη συνέχεια, μελετήθηκε η βιολογικός ρόλος των τεσσάρων γονιδίων στόχων EGR4 στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων SCLC. Η εισαγωγή των siRNAs σε SBC-5, SBC-3 και τα κύτταρα NCI-H1048 είχε ως αποτέλεσμα σημαντική μείωση στην έκφραση των γονιδίων στόχων που συνοδεύεται από σημαντική καταστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων (Σχήμα 5Α-D, Εικόνα S3), υποδηλώνοντας ότι αυτά τα γονίδια είναι επίσης πιθανό να διαδραματίσει έναν κρίσιμο ρόλο στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων SCLC μέσω EGR4 μεταγραφική ενεργοποίηση.

Επιπτώσεις του

EGR4

κατάντη γονίδια

SAMD5

(Α),

RAB15

(Β),

SYNPO

(C) και

DLX5

(D) στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων προσδιορίστηκαν με siRNA νοκ ντάουν στο SBC-5 κύτταρα. Το αριστερό πάνελ δείχνει σε πραγματικό χρόνο ως αποτέλεσμα PCR για γονίδια στόχους σε κύτταρα siRNA-αγωγή (n = 2). Ο δεξιός πίνακας δείχνει τα αποτελέσματα από τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων αναλύσεις, όπως μετράται με ΜΤΤ δοκιμασία (

SAMD5

και

RAB15

: n = 2,

DLX5

και

SYNPO

:. n = 3, *,

P

& lt? 0,05, **,

P

& lt? 0,01, ***

P

& lt? 0.005)

Συζήτηση

σε αυτή τη μελέτη, ο στόχος μας ήταν να προσδιορίσει και να χαρακτηρίσει τα μόρια ή πορείες δυνητικά εμπλέκονται στη μετάσταση του καρκίνου, ιδιαίτερα μετάσταση στα οστά. Μέσα από ένα γονιδίωμα-ευρεία transcriptomic ανάλυση της μετάστασης οργάνου προτιμησιακή των ανθρώπινων SCLC κυττάρων σε ποντίκια, βρήκαμε ότι

EGR4

, ένα μέλος μιας οικογένειας τεσσάρων σχετικών ψευδαργύρου-δακτύλου Cys

2-His

2 τύπου (

EGR1

να

EGR4

), είναι σημαντικά υπερεκφράζεται σε μεταστατικούς όγκους των οστών σε σύγκριση με άλλα όργανα, δηλαδή, ο πνεύμονας, τα νεφρά και το ήπαρ [7]. EGR4 αρχικά αναγνωρίστηκε ως παράγοντας μεταγραφής ψευδαργύρου-δακτύλου που προκαλείται άμεσα από μιτογονική διέγερση σε Τ λεμφοκύτταρα και ινοβλάστες [31]. Η στόχευση γονιδίων μελέτες σε ποντίκια έχουν δείξει ότι EGR4 ρυθμίζει διάφορες κρίσιμες γονίδια που εμπλέκονται στα πρώτα στάδια της διαδικασίας της μείωσης και παίζει ζωτικό ρόλο στην γονιμότητα αρσενικών ποντικών [11], [12]. Επιπλέον, έχει αναφερθεί ότι EGR4 προσδένεται σε παράγοντα ενεργοποιημένων Τ κυττάρων πυρηνικό (NFAT) ή του πυρηνικού παράγοντα κάππα Β (ΝΡκΒ) για την ενίσχυση της μεταγραφής των κατάντη γονιδίων που κωδικοποιούν φλεγμονώδεις κυτοκίνες, όπως IL-2, TNF-α και ICAM-1 [32], [33]. Μια προηγούμενη έκθεση περιγράφεται ότι το επίπεδο έκφρασης του

PTHrP

, ένας ισχυρός ενεργοποιητής της οστεοκλαστικής επαναρρόφησης, σε οστικές μεταστάσεις τείνει να είναι υψηλότερη από εκείνη στις μεταστάσεις στα νεφρά, το συκώτι, οι πνεύμονες και χρησιμοποιώντας ένα γονιδίωμα σε επίπεδο transcriptomics των ανθρώπινων κυττάρων SCLC σε ποντικούς [7]. Συνεπώς, σε αυτή τη μελέτη, επικεντρώθηκε σε

PTHrP

, ένας ισχυρός ενεργοποιητής της οστεοκλαστικής επαναρρόφησης, ως EGR4-κατάντη γονίδιο να διευκρινίσει το παθοφυσιολογικό ρόλο του EGR4 ως παράγοντας μεταγραφής σε SCLC οστικές μεταστάσεις.

PTHrP είναι γνωστό ότι είναι ένας κύριος μεσολαβητής της χυμικής υπερασβεστιαιμίας κακοηθειών και οστεολυτικές μεταστάσεις καρκίνου του πνεύμονα [22], [23], [34]. Περίπου το 80% των ασθενών με συμπαγείς όγκους και υπερασβεστιαιμία έχουν αυξημένες συγκεντρώσεις στο πλάσμα PTHrP τους [35]. Έχει αναφερθεί ότι PTHrP πρωτεΐνη που εκκρίνεται από τα καρκινικά κύτταρα ρυθμίζει την έκφραση του

RANKL

,

IL-6

και

IL-8

γονιδίων, τα οποία έχουν ενοχοποιηθεί ως παράγοντες που ενισχύουν τον σχηματισμό οστεοκλαστών και την καταστροφή των οστών σε κακοήθεις νόσους [28] – [30] σε οστεοβλάστη κύτταρα. Βρήκαμε ότι EGR4 διαενεργοποιεί άμεσα συγκεκριμένες παραλλαγές (

V3

και

V4

) από το

PTHrP

γονίδιο, έτσι πιθανώς την προώθηση της έκκρισης της πρωτεΐνης PTHrP στα κύτταρα EGR4-υπερεκφράζουν , με αποτέλεσμα στις επόμενες διενεργοποίηση του

RANKL

,

IL-6

και

IL-8

γονιδίων μέσω παρακρινούς δράση της PTHrP. RANKL είναι γνωστό ότι συνδέεται με τον υποδοχέα RANK για τις πρόδρομες ουσίες των οστεοκλαστών και επάγουν το σχηματισμό οστεοκλαστών. IL-6 και IL-8 έχουν επίσης αναφερθεί ότι είναι σημαντική για την οστεοκλαστογένεση και την ενεργοποίηση των οστεοκλαστών, αντίστοιχα [30]. Ως εκ τούτου, τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η επαγωγή της PTHrP από EGR4 υπερέκφραση μπορεί να είναι υπεύθυνη για την οστική μετάσταση των καρκινικών κυττάρων SCLC πνεύμονα.