Abstract

υποξία παίζει σημαντικό ρόλο στην αντίσταση των καρκινικών κυττάρων στη χημειοθεραπεία. Ωστόσο, οι ακριβείς μηχανισμοί που βρίσκονται πίσω αυτή τη διαδικασία δεν είναι καλά κατανοητοί. Επιπλέον, σύμφωνα με τις κυτταρικές γραμμές, υποξία επηρεάζει διαφορετικά κυτταρικό θάνατο. Η μελέτη των αποτελεσμάτων της υποξίας στην απόπτωση που επάγεται από 5 χημειοθεραπευτικών φαρμάκων σε 7 τύπους καρκινικών κυττάρων έδειξαν ότι η υποξία ανέστειλε γενικά το φάρμακο προκαλούμενη απόπτωση. Στις περισσότερες περιπτώσεις, η επίδραση της υποξίας ήταν η ίδια για όλα τα φάρμακα σε ένα κυτταρικό τύπο. Το προφίλ έκφρασης του 93 γονιδίων που εμπλέκονται στην απόπτωση, καθώς και το επίπεδο πρωτεΐνης του BCL-2 πρωτεΐνες της οικογένειας στη συνέχεια διερευνήθηκαν. Στα κύτταρα HepG2 που είναι σταθερά προστατεύονται έναντι κυτταρικού θανάτου από υποξία, υποξία μείωσε την αφθονία σχεδόν όλων των προ-αποπτωτικών Bcl-2 πρωτεϊνών της οικογένειας, ενώ κανένας από αυτούς δεν μειώθηκε το Α549 κύτταρα που δεν προστατεύονται από τον κυτταρικό θάνατο από την υποξία. Σε κύτταρα HepG2, υποξία μειώθηκε NOXA και BAD αφθονία και τροποποίησε την ηλεκτροφορητική κινητικότητα των BIM

ΕΛ. BIM και NOXA είναι σημαντικοί μεσολαβητές της ετοποσίδης κυτταρικό θάνατο που επάγεται σε κύτταρα HepG2 και την υποξία-επαγόμενη τροποποίηση αυτών των πρωτεϊνών αφθονίας ή μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις, εν μέρει αντιπροσωπεύουν χημειοαντίσταση. Τέλος, η διαμόρφωση της αφθονίας ή /και των μετα-μεταφραστικών τροποποιήσεων των περισσότερων πρωτεϊνών της οικογένειας Bcl-2 από την υποξία περιλαμβάνει ρ53-εξαρτώμενη και ανεξάρτητη από τις οδούς και είναι κύτταρο τύπου-εξαρτώμενη. Μια καλύτερη κατανόηση αυτών των κυττάρων-να-κυττάρων παραλλαγές είναι ζωτικής σημασίας, προκειμένου να ξεπεραστούν υποξία που προκαλείται από την αντίσταση και τη βελτίωση της θεραπείας του καρκίνου

Παράθεση:. Sermeus Α, Genin M, Maincent Α, Fransolet M, Notte A, Leclere L, et al. (2012) που προκαλείται από υποξία ρύθμιση της απόπτωσης και BCL-2 οικογένεια Πρωτεϊνών σε διάφορους τύπους καρκινικών κυττάρων. PLoS ONE 7 (11): e47519. doi: 10.1371 /journal.pone.0047519

Επιμέλεια: Elad Katz, του Πανεπιστημίου του Εδιμβούργου, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 4 Ιουνίου του 2012? Αποδεκτές: 12 Σεπτεμβρίου, 2012? Δημοσιεύθηκε: 5 Νοέμβρη, 2012

Copyright: © 2012 Sermeus et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. AS και AN είναι Επιστημονικός Συνεργάτης του FNRS (Fonds de la Recherche Scientifique, Βέλγιο). MG και LL υποστηρίζονται από FRIA (Fonds pour la Recherche dans l’Industrie et l’Agriculture, Βέλγιο). HR είναι αποδέκτης της επιχορήγησης FNRS-Télévie. Αυτό το άρθρο παρουσιάζει τα αποτελέσματα του βελγικού προγράμματος για Διαπανεπιστημιακό πόλους έλξης που ξεκίνησε από το βελγικό κράτος, Γραφείο Πρωθυπουργού, Προγραμματισμού Πολιτικής Επιστήμης. Η ευθύνη αυτή δεν καλύπτεται από τους δημιουργούς του. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος είναι μία από τις κύριες αιτίες θανάτου στις αναπτυγμένες χώρες. Οι θεραπείες περιλαμβάνουν συχνά τη χρήση χημειοθεραπείες αλλά αντίστασης φαρμάκου είναι μια κοινή αιτία της αποτυχίας της θεραπείας και υποτροπής. Τα περισσότερα χημειοθεραπευτικά φάρμακα επάγουν τον κυτταρικό θάνατο με την ενεργοποίηση της απόπτωσης. Η απόπτωση ρυθμίζεται από πρωτεΐνες της (λέμφωμα-2 Β-κυττάρου) οικογένεια Bcl-2 που δρουν κυρίως σε μιτοχονδριακό επίπεδο. Αυτή η οικογένεια πρωτεϊνών μπορούν να υποδιαιρεθούν σε τρεις κατηγορίες σύμφωνα με τη λειτουργία και τη δομή των πρωτεϊνών [1]. Πρώτον, οι ΒΑΧ-όπως πρωτεΐνες, όπως ΒΑΧ (BCL-2 σχετίζεται × πρωτεΐνης) και ΒΑΚ (BCL-2 ομόλογο ανταγωνιστή /δολοφόνος), είναι παράγοντες θάνατο. Μόλις ενεργοποιηθεί, αυτοί ολιγομερίζονται στα μιτοχόνδρια και επάγουν μιτοχονδριακή διαπερατότητα της εξωτερικής μεμβράνης, η οποία προκαλεί κυτταρικό θάνατο. Οι BCL-2-όπως πρωτεΐνες, όπως BCL-2, BCL-xL (Β-κυτταρικού λεμφώματος-πολύ μεγάλο), BCL-W και MCL-1 (μυελοειδή λευχαιμία κυττάρων 1), είναι παράγοντες επιβίωσης. Σχηματίζουν ετεροδιμερή με ΒΑΧ /ΒΑΚ και αναστέλλουν τη δράση τους. Τέλος, το ΒΗ3 (BCL-2 τομείς ομολογίας 3) -μόνο πρωτεΐνες, όπως BID (BH3-αλληλεπιδρώντας αγωνιστής πεδίου θανάτου), BAD (BCL-2-ανταγωνιστής του κυτταρικού θανάτου), ΒΙΜ (BCL-2-αλληλεπιδρούν μεσολαβητής του κυττάρου θάνατος), BIK (BCL-2 αλληλεπιδρούν δολοφόνος), PUMA (ρ53 ρυθμίζεται προς τα πάνω ρυθμιστής της απόπτωσης) και NOXA, επάγει απόπτωση εξουδετερώνοντας αντιαποπτωτικού BCL-2-όπως μορίων και, για ορισμένα από αυτά, με την άμεση ενεργοποίηση ΒΑΧ /ΒΑΚ. Σε υγιή κύτταρα, ΒΗ3-μόνο πρωτεΐνες δεν είναι ούτε παρόν ούτε να διατηρηθεί ανενεργό ή να απορροφάται. Μετά την προ-αποπτωτικών σημάτων, γίνονται μεταγραφικά ρυθμίζεται προς τα πάνω και /ή μετα-μεταφραστικά τροποποιημένο (και /ή relocalised) για να αποκτήσουν πλήρη προαποπτωτικής λειτουργία τους [1], [2].

Μία από τις κύριες αιτίες της αντίστασης στη χημειοθεραπεία επαγόμενη απόπτωση είναι μετάλλαξη ρ53. p53 είναι πράγματι μια κεντρική συσκευή αναπαραγωγής για την επαγωγή απόπτωσης σε κύτταρα τόνισε [3], [4] Μια άλλη γνωστή αιτία της ανθεκτικότητας είναι υποξίας των όγκων [5]. Οι επιδράσεις της υποξίας σε καρκινικά κύτταρα είναι κυτταρικού τύπου εξαρτώνται από και διαφέρουν ανάλογα με την ένταση και τη διάρκεια της έλλειψης O

2. Σοβαρή και παρατεταμένη υποξία μπορεί να κινήσει την απόπτωση ή νέκρωση, ενώ ήπια υποξία είναι προστατευτική [6], [7]. Πράγματι, η ήπια υποξία παρεμβαίνει με διάφορα συστατικά του αποπτωτικού μονοπατιού στο μεταγραφικό όσο και στο μετα-μεταφραστικό επίπεδο.

Προηγούμενα αποτελέσματα από την ομάδα μας έδειξε ότι η υποξία προστατεύει τα κύτταρα του όγκου από την απόπτωση που επάγεται από τους χημειοθεραπευτικούς παράγοντες. Η υποξία προστατεύει HepG2 κύτταρα έναντι ετοποσίδη επαγόμενη απόπτωση όπως επίσης και κύτταρα MDA-ΜΒ231 κατά paclitaxel επαγόμενη απόπτωση [8], [9], [10]. Ωστόσο, σε άλλους τύπους κυττάρων, υποξία μπορεί να έχει καμία επίδραση ή ακόμη και να επιδεινώσει την απόπτωση που επάγεται από τους χημειοθεραπευτικούς παράγοντες. Είναι για παράδειγμα η περίπτωση για ετοποσίδη επαγόμενη απόπτωση των Α549 και MCF-7 κύτταρα καθώς και για epirubicin επαγόμενη απόπτωση των κυττάρων MDA-ΜΒ231 κύτταρα [8], [10]. Τα αποτελέσματα αυτά έχουν επίσης τονίσει ότι κυτταρικές αποκρίσεις σε υποξία είναι πολύ περίπλοκη, με τη συμμετοχή διαφορετικές οδούς μεταγωγής σήματος, καθώς και διάφορους παράγοντες μεταγραφής. Συγκεκριμένα, ο παράγοντας μεταγραφής ρ53 φαίνεται να παίζουν σημαντικό ρόλο στη συμπεριφορά των κυττάρων κάτω από υποξία [8]. Ο σκοπός της εργασίας αυτής είναι να καταλάβουμε πώς υποξία μπορεί διαφορετικά να επηρεάσουν το χημειοθεραπευτικό φάρμακο απόπτωση στα καρκινικά κύτταρα. Ως εκ τούτου, επεκτείναμε την πρώτη προηγούμενες παρατηρήσεις μας χρησιμοποιώντας κυτταρικές σειρές 7 του καρκίνου, που προέρχονται από διάφορα όργανα και έχουν διαφορετικό καθεστώς p53, που εκτίθενται σε 5 επάγει την απόπτωση φάρμακα που χρησιμοποιούνται στη χημειοθεραπεία που απευθύνονται σε διαφορετικές κυτταρικές οδούς. Στις περισσότερες περιπτώσεις, η υποξία μερική πρόληψη του κυτταρικού θανάτου και η επίδραση της υποξίας ήταν η ίδια για όλα τα φάρμακα σε ένα κυτταρικό τύπο. Δεύτερον, παρατηρήσαμε ότι η υποξία διαμορφωμένο την αφθονία των περισσότερων πρωτεϊνών της οικογένειας Bcl-2 σε έναν τύπο με τρόπο που εξαρτάται κύτταρο. Τρίτον, σε HepG2 κύτταρα που προστατεύονται από υποξία έναντι ετοποσίδης-κυτταρικό θάνατο που επάγεται, παρατηρήσαμε μια μείωση των επιπέδων της πρωτεΐνης BAD και NOXA καθώς και μια αλλαγή στην ηλεκτροφορητική κινητικότητα του BIM

EL (ΒΙΜ Μεγάλα) σε υποξία επωάζονται κύτταρα. Τα αποτελέσματα από μελέτες ακύρωση δείχνουν ότι η συνδυασμένη απώλεια του BIM και NOXA κατά τη διάρκεια της υποξίας, τουλάχιστον εν μέρει αντιπροσώπευαν χημειοαντίσταση.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture και υποξία επώασης

Ανθρώπινο ηπατώματος HepG2 κύτταρα, τα ανθρώπινα κύτταρα καρκινώματος πνεύμονα Α549, αδενοκαρκίνωμα του μαστού ανθρώπινα κύτταρα MDA-ΜΒ231, τα ανθρώπινα κύτταρα ηπατώματος Hep3B, τα ανθρώπινα οστεογονικά κύτταρα U2OS σαρκώματος, ανθρώπινο αδενοκαρκίνωμα του κόλου ΗΤ-29 κυττάρων και του αδενοκαρκινώματος ανθρώπινου προστάτη PC-3 κύτταρα (ATCC) διατηρήθηκαν σε καλλιέργειας σε 75-cm

2 φιάλες πολυστυρενίου (Costar) με αντίστοιχα D-ΜΕΜ (χαμηλής γλυκόζης) (Gibco), ΜΕΜ (Gibco), RPMI 1640 (Gibco), RPMI 1640 (Gibco) που περιέχει 50 U /ml πενικιλλίνη και 50 μg /ml στρεπτομυκίνη (Gibco), μέσης 5Α Mc Coy (Gibco), RPMI 1640 (Gibco) και μέσου F12 Kaighn (Gibco) που περιέχει 10% του FCS και επωάζεται υπό μία ατμόσφαιρα που περιέχει 5% CO

2.

Για πειράματα υποξίας, τα κύτταρα επωάστηκαν σε CO ελεύθερο ορού

2-ανεξάρτητο μέσο (Invitrogen) συμπληρωμένο με 0,5 mM Ε-γλουταμίνη (Sigma) με ή χωρίς ετοποσίδη (Sigma), μεθοτρεξάτη (Sigma), η πακλιταξέλη (Molecular Probes), σισπλατίνη (Sigma) ή καμπτοθεκίνη (Sigma) για 16 ώρες. Η επώαση υπό υποξία έγινε σε σπιτικά θερμοκοιτίδες που περιέχει 99% Ν

2 και 1% O

2. Το επίπεδο της υποξίας στο μέσο σε πειραματικές συνθήκες μας είναι 10 mm Hg του διαλυμένου οξυγόνου εντός του μέσου. Αυτό το επίπεδο της υποξίας επιτυγχάνεται μετά από περίπου 10 λεπτά της επώασης. PO

2 επίπεδο μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα διαλυμένο μετρητή οξυγόνου (Inolab Oxi 730) εξοπλισμένο με Cellox 325 ανιχνευτή. κύτταρα ελέγχου Normoxic επωάστηκαν υπό τις ίδιες συνθήκες, αλλά σε κανονική ατμόσφαιρα (21% O

2)

siRNA Επιμόλυνση

siGENOME SMARTpool ανθρώπου (Dharmacon? χρησιμοποιείται στα 50 ηΜ). BCL2L11 ( ΒΙΜ, Μ-004383-02), PMAIP1 (NOXA, Μ-005275-03), BAD (Μ-003870-02) ή ΤΡ53 (Μ-003329-03) διαμολύνθηκαν με το αντιδραστήριο διαμόλυνσης DharmaFECT1 (Dharmacon? χρησιμοποιούνται σε 1:500 αραίωση). Κατά το συνδυασμό BIM και NOXA siRNA, κάθε siRNA χρησιμοποιήθηκε σε 25 Nm. Η siGENOME RISC-Free siRNA ελέγχου (D-001220-01, Dharmacon? Χρησιμοποιήθηκε σε 50 ηΜ) ή siGENOME Μη Στόχευση siRNA πισίνα # 1 (D-001206 – 13, Dharmacon? Χρησιμοποιήθηκε σε 50 ηΜ) χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικοί έλεγχοι. Τα κύτταρα επωάστηκαν για 24 ώρες με μέσο επιμόλυνση και το μέσο στη συνέχεια αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο με 10% FCS. 6 ώρες αργότερα (ή 30 ώρες αργότερα για BIM siRNA), τα κύτταρα επωάστηκαν υπό υποξία ή φυσιολογική οξυγόνωση με χημειοθεραπευτικούς παράγοντες ή όχι.

Υποκυτταρική κλασματοποίηση

Cells, σπέρνονται σε 75-cm

2 φιάλες, συλλέχθηκαν σε σακχαρόζη M /4 και ομογενοποιείται με 3 κινήσεις ενός εμβόλου Β σε Dounce. Το προϊόν ομογενοποίησης φυγοκεντρήθηκε 10 λεπτά σε 1,418

g

(Labofuge 400R Heraeus Instruments). Το υπερκείμενο ανακτήθηκε και φυγοκεντρήθηκε σε 81.085

g

(Beckman L7-35, ρότορα 50 Ti) για μία διάρκεια που εξαρτάται από τον όγκο. Το ίζημα επαναιωρήθηκε σε σακχαρόζη M /4 και ονομάστηκε το κλάσμα MLP. Το υπερκείμενο συμπυκνώθηκε με φυγοκέντρηση σε Ultra-4 σωλήνες Amicon (Millipore) και ονομάστηκε το κλάσμα S. Όλα τα δείγματα τελικά ομογενοποιούνται με υπερήχους.

Ανάλυση Western Blot

εκχύλιση πρωτεΐνης εκτελέστηκε όπως περιγράφεται στο [9]. Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE σε 15% πηκτή πολυακρυλαμιδίου, επί 4-12% πηκτές NuPAGE Bis-Tris με ρυθμιστικό MES (Invitrogen) ή σε 3-8% πηκτώματα NuPAGE Τρις-Οξικό (Invitrogen) και στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε μία μεμβράνη PVDF (Hybond-P, Amersham για ανίχνευση χημειοφωταύγειας ή Immobilon-FL, Millipore για ανίχνευση φθορισμού). ανίχνευση χημικής φωταύγειας διεξήχθη όπως περιγράφεται στο [11] χρησιμοποιώντας ολονύκτια επώαση με ειδικά πρωτογενή αντισώματα. Για την ανίχνευση του φθορισμού, οι μεμβράνες αποκλείστηκαν 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου σε ρυθμιστικό διάλυμα δεσμεύσεως Οδύσσεια (LI-COR) και στη συνέχεια όλη τη νύκτα στους 4 ° C σε Οδύσσεια ρυθμιστικό αποκλεισμού με 0,1% Tween που περιέχει ένα ειδικό αντίσωμα. Μετά από 4 × 5 λεπτά με τα πλύσεις σε PBS-Tween 0,1%, η επώαση με το δευτερεύον αντίσωμα (αίγας αντι-κουνελιού ή αντι-ποντικού IRDye-επισημασμένο αντίσωμα, LI-COR, 1:10,000 αραίωση) εκτελέστηκε για 1 ώρα στον αποκλεισμό Οδύσσεια ρυθμιστικό διάλυμα με 0,1% Tween ακολουθούμενη από 4 πλύσεις των 5 λεπτών σε PBS-Tween και 2 πλύσεις σε PBS. Η μεμβράνη στη συνέχεια ξηραίνεται 1 ώρα στους 37 ° C και σαρώνονται χρησιμοποιώντας Odyssey σύστημα υπέρυθρης απεικόνισης (LI-COR).

ανοσοφθορισμού χρώσης

κύτταρα HepG2 σπάρθηκαν στα 40.000 κύτταρα /φρεάτιο σε γυάλινο κάλυμμα διαφάνειες σε πλάκες 24 φρεατίων. Μετά την επώαση με ή χωρίς ετοποσίδη ή πακλιταξέλη, χρώση ανοσοφθορισμού διεξήχθη όπως περιγράφεται στο [11]. Το πρώτο αντίσωμα για χρώση άλφα-τουμπουλίνης ήταν αντι-άλφα-τουμπουλίνης ποντικού (# T5186 Sigma) (αραίωση 1/100). Alexa Fluor-647-συζευγμένο αντι-ποντικού IgG αντίσωμα (Molecular Probes) χρησιμοποιήθηκε σε 1/1000 αραίωση.

Caspase-3/7 Δράση Δοκιμασία

Το φθορογόνο υπόστρωμα DEVD-Ac-AFC (BD Pharmingen) χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση της κασπάσης-3/7 δράση σύμφωνα με το [12]. κυτταρικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν όπως περιγράφεται στο [13]. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 25-cm

2 φιάλες. Η δοκιμασία για κασπάση-3/7 Δράση διεξήχθη σύμφωνα με [8] με τη χρήση 20 μα εκχυλισμάτων.

Γαλακτική δεϋδρογενάση Δοκιμασία Release

Γαλακτική αφυδρογονάση (LDH) απελευθέρωση μετρήθηκε με το «Κυτταροτοξικότητα Κιτ ανίχνευσης «από τη Roche Applied Science, όπως περιγράφεται στο [9]. Το μέσο καλλιέργειας από τα κύτταρα επωάζονται απομακρύνθηκαν και φυγοκεντρήθηκαν για να ιζηματοποιηθούν τα κυτταρικά θραύσματα και αποπτωτικά σώματα. Προκειμένου να λυθούν τα κύτταρα, Triton Χ100 (Merck) σε 10% σε PBS προστέθηκε σε αυτό το σφαιρίδιο καθώς και επί των κυττάρων παραμένουν προσκολλημένα στον πυθμένα των φρεατίων. Η απελευθέρωση ποσοστό LDH υπολογίστηκε ως εξής: [δραστηριότητα LDH στο μέσο (1) + LDH δραστηριότητα των κυττάρων θραύσματα και αποπτωτικά σώματα (2)] /[(1) + (2) + LDH δραστηριότητα των κυττάρων που παραμένουν στα φρεάτια].

παροδική επιμόλυνση και λουσιφεράσης Δοκιμασία

διαμόλυνση κυττάρων πραγματοποιήθηκε σε πλάκες 24 φρεατίων (50,000 κύτταρα ανά φρεάτιο για HepG2 και MDA-ΜΒ231 κύτταρα? 30000 για κύτταρα Α549? και 40.000 για τα κύτταρα Hep3B) με αντιδραστήριο SuperFect (Qiagen). 923 ng (1.385 ng για κύτταρα MDA-ΜΒ231) του πλασμιδίου αναφοράς pGL3- (PGK-HRE6) -tk-luc, το οποίο περιέχει 6 HRE cis-στοιχεία από το γονίδιο PGK που συνδέεται με το βασικό υποκινητή θυμιδινο κινάσης και στη λουσιφεράση πυγολαμπίδας γονίδιο [14], συν-επιμολύνθηκαν με 577 ng (115 ng για κύτταρα MDA-ΜΒ231) του φορέα ομαλοποίηση (ρΟΜνβ φορέα που κωδικοποιεί για την β-γαλακτοσιδάση, Clontech) σε μέσο χωρίς ορό επί 6 ώρες (ή 3 ώρες για τα κύτταρα Hep3B πριν από την αντικατάσταση του μέσου με νωπό μέσο). Στη συνέχεια, τα κύτταρα επωάστηκαν υπό υποξία ή νορμοξία για 16 ώρες. Μετά την επώαση, τα κύτταρα λύθηκαν σε παθητική ρυθμιστικού λύσης (Promega) και β-γαλακτοσιδάσης προσδιορίστηκαν παράλληλα με τη δραστηριότητα της λουσιφεράσης της πυγολαμπίδας, προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το σύστημα δοκιμασίας λουσιφεράσης (Promega).

Taqman χαμηλής πυκνότητας Array

Μετά την επώαση, το ολικό RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας TRI διαλύματος αντιδραστηρίου (Applied Biosystems). mRNA που περιέχεται σε 2 μg ολικού RNA μεταγράφηκε αντίστροφα με τη χρήση του «High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit» από την Applied Biosystems σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. 100 ng αναδρομικά μεταγραφομένων ολικού RNA σε 50 μΐ αναμίχθηκαν στη συνέχεια με 50 μΙ του «Taqman καθολική PCR Master Mix» (Applied Biosystems) και φορτώθηκε σε μία από τις 8 θύρες πλήρωσης του microfluidic συστοιχίας. «TLDA Ανθρώπινα Απόπτωση Panel» είναι 384-καλά μικρορευστονικής κάρτες που περιέχουν αναλύσεις για 96 ανθρώπινα γονίδια. Δίνουν τη δυνατότητα να εκτελέσει 96 πραγματικού χρόνου PCR αντιδράσεις ταυτόχρονα για 4 δείγματα. επίπεδο έκφρασης mRNA ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο κύκλος κατωφλίου με 18S και το γονίδιο αναφοράς.

RT Real-time-PCR για mRNA ποσοτικοποίηση

Μετά την επώαση, το ολικό RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας TRI διάλυμα αντιδραστηρίου (Applied Biosystems). mRNA που περιέχεται σε 2 μg ολικού RNA μεταγράφηκε ανάστροφα χρησιμοποιώντας Superscript II Reverse Transcriptase (Invitrogen). Εμπρόσθιοι και αντίστροφοι εκκινητές αλληλουχίες είναι διαθέσιμες στον Πίνακα S1 και σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Primer Express 1.5 (Applied Biosystem). δοκιμασίες αντίδρασης πολλαπλασιασμού περιείχε 1 × SYBRGreen PCR Master Mix (Applied Biosystem) και εκκινητές (Applied Biosystems, 300 ηΜ). RPL13A χρησιμοποιήθηκε ως γονίδιο αναφοράς για την ομαλοποίηση και το επίπεδο έκφρασης του mRNA ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο κύκλος κατωφλίου.

Heatmap και Στατιστικές Αναλύσεις

Heatmaps δημιουργήθηκαν με τα δεδομένα μετασχηματίζονται σε λογάριθμο βάσης 2 του αποτελέσματα για TDLA (n = 1) και των μέσων τριών τιμών για τα αποτελέσματα qRT-PCR. Οι στατιστικές αναλύσεις έγιναν με ANOVA 1 και του Tukey πολλαπλές δοκιμές σύγκριση με τη χρήση GraphPad Prism.

Αποτελέσματα

Η υποξία έχει διαφορετικές επιπτώσεις για τα ναρκωτικά που προκαλείται θάνατο των κυττάρων σε διαφορετικούς τύπους κυττάρων

προκειμένου να αποκτηθούν περαιτέρω γνώσεις των μηχανισμών που ξεκίνησε από την υποξία που οδηγούν σε ανθεκτικότητα καρκινικών κυττάρων, επεκτείναμε τις προηγούμενες παρατηρήσεις μας χρησιμοποιώντας άλλες καρκινικές κυτταρικές γραμμές που προέρχονται από διάφορα όργανα και έχουν διαφορετικό καθεστώς ρ53 και άλλα επαγωγής απόπτωσης χημειοθεραπευτικά φάρμακα που στοχεύουν διαφορετικές κυτταρικές οδούς . Οι κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιούνται είναι HepG2 (κύτταρα άγριου-τύπου ρ53 ηπατώματος), Α549 (ρ53 άγριου τύπου κύτταρα καρκινώματος του πνεύμονα), U2-OS (ρ53 άγριου τύπου οστεογονικά κύτταρα σαρκώματος), MDA-ΜΒ231 (κύτταρα p53 αδενοκαρκινώματος μαστού μεταλλαγμένο), ΗΤ-29 (ρ53 μεταλλαγμένων κυττάρων αδενοκαρκινώματος κόλου), Hep3B (ρ53 null ηπατώματος κύτταρα), και PC-3 κύτταρα (ρ53 κύτταρα αδενοκαρκινώματος του προστάτη null). Οι χημειοθεραπευτικοί παράγοντες που επιλέγονται είναι η ετοποσίδη (αναστολέας τοποϊσομεράσης II), μεθοτρεξάτη (αναστολέας της σύνθεσης DNA και RNA), πακλιταξέλη (ένας αναστολέας της δυναμικής μικροσωληνίσκων), σισπλατίνη (ένα αλκυλιωτικό παράγοντα) και καμπτοθεκίνη (α αναστολέας τοποϊσομεράσης Ι).

Πρώτον, η συγκέντρωση του φαρμάκου για χρήση σε κάθε τύπο κυττάρου επιλέχθηκε με προσδιορισμό της κασπάσης-3/7 δράση μετά από 16 ώρες επώαση με τα φάρμακα. Σε κάθε περίπτωση, μια συγκέντρωση που επάγει απόπτωση μέτρια επιλέχθηκε. Για τους παράγοντες που επάγουν δραστικότητα κασπάσης, η συνολική τοξικότητα τους αξιολογήθηκε με τη μέτρηση της γαλακτικής αφυδρογονάσης (LDH) απελευθερώνουν 40 ώρες μετά την επώαση με τους παράγοντες. Μόλις επιλέχθηκαν οι συγκεντρώσεις, η επίδραση της υποξίας (1% O

2) για την κυτταρικού θανάτου που προκαλείται από κάθε παράγοντα σε κάθε τύπο κυττάρου παρακολουθήθηκε από τους δύο ίδιες τεχνικές (Εικόνα 1).

HepG2 , Α549, U2OS, MDA-ΜΒ231, ΗΤ-29, τα κύτταρα Hep3B και PC-3 επωάστηκαν υπό φυσιολογική οξυγόνωση (21% O

2) ή υποξία (1% O

2) απουσία (CTL) ή παρουσία ετοποσίδης (ΕΤΟ), πακλιταξέλη (ΦΠΑ), σισπλατίνη (CIS) ή camptothecin (CPT) για 16 (A, C, E, G, J) ή 40 ώρες (Β, D, F, Η, Ι, Κ) . Η συγκέντρωση που χρησιμοποιείται για κάθε μόριο υποδεικνύεται στις γραφικές παραστάσεις (σε μΜ). (A, C, E, G, J) Κασπάση-3/7 Δράση προσδιορίστηκε με μέτρηση του φθορισμού του ελεύθερου AFC απελευθερώνεται από τη διάσπαση του κασπάσης-3/7 Ειδικές υπόστρωμα Ac-DEVD-AFC. Τα αποτελέσματα εκφράζονται σε σχετικές μονάδες φθορισμού (RFU) ως μέσα ± 1 SD (η = 3). αξιολογήθηκε (Β, Δ, ΣΤ, Η, Θ, Κ) απελευθέρωση LDH. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται σε ποσοστά ως μέσοι ± 1 SD (η = 3). (Α-Κ) Στατιστική ανάλυση διεξήχθη με ANOVA 1. ns: μη σημαντική? *: P & lt? 0,05? **: Ρ & lt? 0,01? ***: Ρ & lt? 0.001. Σύμβολα πάνω από ένα ορθοξικές στήλη είναι η σύγκριση με την ορθοξικές έλεγχο και σύμβολα πάνω από ένα υποξικό στήλη είναι η σύγκριση με την αντίστοιχη ορθοξικές κατάσταση (με το ίδιο φάρμακο).

Η

Παρατηρήσαμε ότι, σε γενικές γραμμές, η ρ53 μεταλλαγμένη ή null κύτταρα είναι πιο δύσκολο να σκοτώσει από τα κύτταρα άγριου τύπου ρ53. Στις περισσότερες περιπτώσεις, η επίδραση της υποξίας επί του κυτταρικού θανάτου ήταν η ίδια για όλα τα μόρια σε ένα κυτταρικό τύπο. Ωστόσο, αυτό το αποτέλεσμα ποικίλει ανάλογα με τον τύπο κυττάρου. Παρατηρήσαμε επίσης ότι η υποξία είχε περισσότερο συχνά μια προστατευτική επίδραση έναντι του κυτταρικού θανάτου από επιβαρυντική επίδραση. Για παράδειγμα, η υποξία κύτταρα HepG2 προστατεύονται και MDA-ΜΒ231 κατά τον θάνατο των κυττάρων που προκαλείται από όλα τα μόρια δοκιμαστεί ενώ παρατηρήσαμε καμία επίδραση ή την επιδείνωση του κυτταρικού θανάτου που προκαλείται από φάρμακα από υποξία σε Α549 και κύτταρα Hep3B. Η υποξία μπορεί επομένως να προστατεύουν ρ53 άγριου τύπου, καθώς και ρ53 μεταλλαγμένων κυττάρων. Συνολικά, τα αποτελέσματα αυτά δημιουργούνται μία μήτρα δεδομένων σχετικά με την επίδραση της υποξίας στην απόπτωση που επάγεται από 5 μόρια σε 7 τύπους κυττάρων (Πίνακας 1). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η επίδραση της υποξίας είναι διαφορετική ανάλογα με τον τύπο κυττάρου, αλλά σταθερή για όλα τα φάρμακα σε έναν κυτταρικό τύπο. Για το καλύτερο της γνώσης μας, η παρατήρηση αυτή δεν έχει γίνει πριν.

Η

Η έκφραση Προφίλ του mRNA και πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην απόπτωση σε διαφορετικούς τύπους κυττάρων

Για να καταλάβουμε γιατί υποξία προστατεύεται ορισμένες κυτταρικές σειρές κατά των ναρκωτικών που προκαλείται θάνατος και άλλα όχι, επιλέξαμε τέσσερα κυτταρικές σειρές που φιλοξενούν διαφορετικό καθεστώς ρ53 και για την οποία η επίδραση της υποξίας είναι διαφορετική: κύτταρα HepG2, Α549, MDA-ΜΒ231 και Hep3B. Χρησιμοποιήσαμε ετοποσίδη ως επαγωγέας κυτταρικού θανάτου, δεδομένου ότι είναι ισχυρό σε όλες τις τέσσερις κυτταρικές γραμμές και ο τρόπος δράσης είναι πολύ γνωστή. Η επίδραση της υποξίας στην πακλιταξέλη που προκαλείται από το θάνατο των κυττάρων HepG2 μελετήθηκε επίσης.

Etoposide και πακλιταξέλη είναι ενεργός και HIF-1 ενεργοποιείται κάτω υποξία σε όλους τους τύπους κυττάρων

Η υποξία είναι συχνά περιγράφεται για την αναστολή της βλαπτική επίδραση των χημειοθεραπευτικών παραγόντων [15]. Για να ελέγξετε αν η υποξία αναστέλλει ετοποσίδης που προκαλείται από βλάβη του DNA ή /και πακλιταξέλη που προκαλείται από τη σταθεροποίηση των μικροσωληνίσκων ή αν δρα σε ένα επίπεδο προς τα κάτω των ζημιών που προκλήθηκαν από το φάρμακο, ΑΤΜ (αταξία τηλαγγειεκτασία μεταλλαγμένο) φωσφορυλίωση μελετήθηκε 1 ώρα μετά την επώαση ετοποσίδη και η μορφολογία των ινών μικροσωληνίσκων μελετήθηκε μετά από έκθεση 16 ωρών paclitaxel. Etoposide προκαλεί κυτταρικό θάνατο μέσω επαγωγής θραύσεων διπλής έλικας DNA που οδηγούν σε ΑΤΜ ενεργοποίηση. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι πράγματι προκάλεσε την φωσφορυλίωση του ΑΤΜ στις τέσσερις κυτταρικούς τύπους. Καμία επίδραση της υποξίας παρατηρήθηκε στην επαγωγή Ρ-ΑΤΜ, ακόμη και σε HepG2 και MDA-ΜΒ231 κύτταρα στα οποία υποξία μείωσε την ετοποσίδη-επαγόμενη απόπτωση (Σχήμα 2Α). Στα κύτταρα HepG2 που προστατεύονται από την υποξία έναντι paclitaxel μεσολάβηση κυτταρικό θάνατο, υποξία δεν φαίνεται να εμποδίζουν το σχηματισμό του πάχους ινών μικροσωληνίσκων που προκαλείται από paclitaxel (Σχήμα 2Β και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η υποξία προστατεύει τα κύτταρα κατάντη της βλάβης που προκαλείται από φάρμακα.

(Α) Επίδραση της υποξίας, ετοποσίδη και πακλιταξέλη για την αφθονία και την φωσφορυλίωση του ΑΤΜ. HepG2, Α549, MDA-ΜΒ231 και Hep3B κύτταρα επωάστηκαν 1 ώρα υπό φυσιολογική οξυγόνωση (Ν, 21% O

2) ή υποξία (Η, 1% O

2) με την παρουσία ή όχι (CTL) ετοποσίδης (ΕΤΟ, 100 μΜ σε κύτταρα Hep3B και 50 μΜ σε άλλους τύπους κυττάρων) ή πακλιταξέλη (φόροι, 10 μΜ) σε κύτταρα HepG2. ΑΤΜ και P-ATM ανιχνεύθηκαν σε εκχυλίσματα πυρηνικής πρωτεΐνης με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας ειδικά αντισώματα. αντιπροσωπευτικό Ένα πείραμα από τρία. Οι Αξάκριστο στυπώματα Western παρουσιάζονται στο Σχήμα S1. (Β) Επίδραση της υποξίας, ετοποσίδη και πακλιταξέλη σε μικροσωληνίσκους. κύτταρα HepG2 επωάστηκαν 16 ώρες υπό φυσιολογική οξυγόνωση (21% O

2) ή υποξία (1% O

2) παρουσία ή όχι του ετοποσίδης (50 μΜ) ή πακλιταξέλη (10 μΜ). Μετά την επώαση, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν, περατά και χρωματίστηκαν για αλφα-τουμπουλίνης χρησιμοποιώντας ένα ειδικό αντίσωμα. Παρατήρηση διεξήχθη χρησιμοποιώντας ομοεστιακό μικροσκόπιο με σταθερή φωτοπολλαπλασιαστή.

Η

Πολλές προστατευτικές επιδράσεις της υποξίας μεσολαβεί ο HIF-1 (1-παράγοντας προκαλείται από υποξαιμία) παράγοντα μεταγραφής, το οποίο είναι ένα ετεροδιμερές που αποτελείται από ένα ιδιοσυστατικά εκφραζόμενο υπομονάδα, HIF-1 βήτα, και μια υπομονάδα σταθεροποιούνται μόνο υπό συνθήκες υποξίας, HIF-1 [5]. Ως εκ τούτου, ερευνήθηκε εάν ο παράγοντας αυτός ήταν ουσιαστικά ενεργοποιούνται από υποξία στις κυτταρικές γραμμές στις οποίες υποξία δεν έχει προστατευτικό αποτέλεσμα (Σχήμα 3). Η υποξία προκάλεσε την συσσώρευση του HIF-1 αλλά ετοποσίδη μειώθηκε αυτή συσσώρευση σε κύτταρα Α549, MDA-MB-231 και Hep3B. Σε κύτταρα HepG2, ετοποσίδη είχε καμία ή μικρή επίδραση ανασταλτική, ανάλογα με το πείραμα. Η επίδραση της ετοποσίδης σε επίπεδο πρωτεΐνης HIF-1 έχει ήδη παρατηρηθεί [16]. Όπως αξιολογήθηκε από ρεπόρτερ λουσιφεράσης, HIF-1 ήταν ενεργός σε κάθε τύπο κυττάρου κατά τη διάρκεια της υποξίας και αυτό συσχετίζεται με την αφθονία του mRNA των δύο γονιδίων στόχων του (LDHA και BNIP3).

HepG2, Α549, MDA-MB231 και κύτταρα Hep3B επωάστηκαν 16 ώρες υπό φυσιολογική οξυγόνωση (Ν, 21% O

2) ή υποξία (η, 1% O

2) (AD) με την παρουσία ή όχι (CTL) ετοποσίδης (ΕΤΟ, 100 μΜ σε κύτταρα Hep3B και 50 μΜ σε άλλους τύπους κυττάρων) ή πακλιταξέλη (φόροι, 10 μΜ) σε κύτταρα HepG2 (Α, C, D). (Α) HIF-1 ανιχνεύτηκε σε κυτταρικά εκχυλίσματα σύνολο με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας ένα ειδικό αντίσωμα. Αλφα-τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. αντιπροσωπευτικό Ένα πείραμα από τρία. Οι Αξάκριστο στυπώματα Western παρουσιάζονται στο Σχήμα S1. (Β) πριν από την επώαση, τα κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν με το pGL3- (PGK-HRE6) -tk-luc πλασμίδιο ανταποκριτή που κωδικοποιεί την λουσιφεράση πυγολαμπίδας και το πλασμίδιο pCMVß ομαλοποίηση. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή του λόγου μεταξύ της πυγολαμπίδας δραστικότητα λουσιφεράσης και η δραστικότητα β-γαλακτοσιδάσης ± 1 SD (η = 3). Η στατιστική ανάλυση έγινε με ANOVA 1. ***: Ρ & lt? 0.001. Τα σύμβολα είναι μια σύγκριση μεταξύ των νορμοξικές και υποξικές συνθήκες του ίδιου κυτταρικού τύπου. (C, D) Μετά την επώαση, το συνολικό RNA εκχυλίζεται, υποβλήθηκε σε αντίστροφη μεταγραφή και έπειτα από την ενίσχυση με την παρουσία SYBR Green και ειδικούς εκκινητές για BNIP3 (γ) ή LDHA (D). RPL13A χρησιμοποιήθηκε ως γονίδιο καθαριότητας για την κανονικοποίηση των δεδομένων. Τα δεδομένα δίδονται σε πολλαπλάσια επαγωγή ως η μέση τιμή ± 1 SD (η = 3). Η στατιστική ανάλυση έγινε με ANOVA 1. ns: μη σημαντική? *: P & lt? 0,05? **: Ρ & lt? 0,01? ***: Ρ & lt? 0.001. Σύμβολα πάνω από τα υποξικά στήλες είναι μια σύγκριση με την αντίστοιχη ορθοξικές κατάσταση (με το ίδιο φάρμακο).

Η

Εν κατακλείδι, το γεγονός ότι η υποξία προστατεύει HepG2 και MDA-MB231 κυττάρων ενάντια στον θάνατο, αλλά δεν Α549 και Hep3B κύτταρα δεν θα μπορούσε να εξηγηθεί από μια διαφορά στην ετοποσόδη- ή πακλιταξέλη προκαλούμενη βλάβη ή σε HIF-1 ενεργοποίησης.

Έκφραση Προφίλ των mRNAs συμμετέχει στην απόπτωση

τα αποτελέσματα από το Σχήμα 2 υποδηλώνουν ότι η απόκλιση επίδραση της υποξίας επί του κυτταρικού θανάτου συμβαίνει κατάντη της επαγωγής κυτταρικής βλάβης. έτσι Υποθέσαμε ότι η υποξία επηρεάζει τα μονοπάτια μεταγωγής σήματος που ενεργοποιούν την απόπτωση. Αυτά τα μονοπάτια είναι κυρίως ανάλογα με το p53, αλλά και από άλλους παράγοντες μεταγραφής. μελέτες γονιδιακής έκφρασης διεξήχθησαν έτσι να βρουν γονίδια των οποίων η έκφραση ρυθμίζεται διαφορικά από υποξία σε προστατευμένη κύτταρα σε σύγκριση με μη-προστατευμένη κύτταρα. Χρησιμοποιήθηκαν Taqman χαμηλής πυκνότητας Arrays (Applied Biosystems) που επιτρέπει τη μελέτη της αφθονίας των 93 mRNAs που είναι γνωστό ότι εμπλέκονται στη διαδικασία απόπτωσης (καθώς και 3 mRNAs housekeeping). Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως θερμικός χάρτης στο Σχήμα 4, ενώ οι αριθμητικές τιμές που παρέχονται στον Πίνακα S2. Όπως ήταν αναμενόμενο, παρατηρήσαμε την επαγωγή των γονιδίων HIF-1-στόχο (BNIP3, BNIP3L και GAPDH) μετά από 16 ώρες υποξίας στους τέσσερις τύπους κυττάρων. Επαγωγή των γονιδίων στόχων p53 (αΡΑΡ-1, BAK1 και ΒΑΧ) παρατηρήθηκε σε HepG2 και κύτταρα Α549 μετά από 16 ώρες επώαση ετοποσίδη αλλά όχι στην μεταλλαγμένη ρ53 (κύτταρα MDA-ΜΒ231) ή μηδενική (κύτταρα Hep3B) κύτταρα. Το γονίδιο στόχος PMAIP1 p53 (NOXA) προκλήθηκε με ετοποσίδη σε όλους τους τύπους κυττάρων.

αποτελέσματα ελήφθησαν χρησιμοποιώντας «TLDA Human Απόπτωση Panel» (Applied Biosystems) (TLDA). HepG2, Α549, MDA-ΜΒ231 και τα κύτταρα Hep3B επωάστηκαν 16 ώρες υπό φυσιολογική οξυγόνωση (Ν, 21% O

2) ή υποξία (Η, 1% O

2) παρουσία ή όχι ετοποσίδης (Ε, 100 μΜ σε κύτταρα Hep3B και 50 μΜ σε άλλους τύπους κυττάρων) ή πακλιταξέλη (Τ, 10 μΜ) σε κύτταρα HepG2. Μετά την επώαση, το συνολικό RNA εκχυλίζεται, υποβλήθηκε σε αντίστροφη μεταγραφή και στη συνέχεια σε ανάλυση TLDA. 18S χρησιμοποιήθηκε ως γονίδιο καθαριότητας για την κανονικοποίηση των δεδομένων. Οι πραγματικές αριθμητικές τιμές που παρέχονται στον Πίνακα S2. Γονίδια εμφανίζονται με έντονη γραφή είναι γονίδια των οποίων η έκφραση ελέγχθηκε με qRT-PCT.

Η

Στη συνέχεια αναζητούνται γονίδια των οποίων η έκφραση είναι το προφίλ παράλληλο με το προφίλ του κυτταρικού θανάτου σε καθεμία από τις τέσσερις τύπους κυττάρων, δηλαδή γονίδια των οποίων η έκφραση ρυθμίζεται προς τα κάτω από την υποξία σε HepG2 και κύτταρα MDA-MB231 και ανεπηρέαστο ή αυξήθηκε το Α549 και κύτταρα Hep3B, ή το αντίστροφο. Ωστόσο, θα μπορούσε να παρατηρηθεί καμία τέτοια προφίλ έκφρασης. Είναι ενδιαφέρον ότι η έκφραση του BCL2L11 (ονομάζεται επίσης BIM), BIK, CASP10, CASP3, DEDD2, NALP1 και TRADD μειώθηκε από υποξία σε κύτταρα HepG2 ετοποσίδη-επωάστηκαν ενώ η έκφραση τους αυξήθηκε ή μη τροποποιημένη σε κύτταρα Α549, συσχετίζοντας με την αποπτωτική προφίλ αυτοί οι δύο τύποι κυττάρων. Επιπλέον, το προφίλ έκφρασης BIRC3 και MCL1 ήταν αντίστροφο της αποπτωτικής προφίλ για HepG2 και Α549 κύτταρα. Το προφίλ έκφρασης αυτών των γονιδίων ελέγχθηκε με ενιαία πραγματικού χρόνου RT-PCR αντιδράσεις. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως θερμικός χάρτης στο Σχήμα 5, ενώ είναι οι αριθμητικές τιμές που παρέχονται στον Πίνακα S3. Το προφίλ του BAK1, ΒΑΧ, BBC3 (ονομάζεται επίσης PUMA) και PMAIP1 (ονομάζεται επίσης NOXA) επίσης επικυρωθεί, δεδομένου ότι είναι γνωστό μεσολαβητών του κυτταρικού θανάτου που προκαλείται από ετοποσίδη-. Τα περισσότερα από τα αποτελέσματα που λαμβάνονται χρησιμοποιώντας Taqman Low Density Arrays επιβεβαιώθηκαν. Πρέπει ωστόσο να σημειωθεί ότι η έκφραση σχεδόν όλων μελετήθηκαν γονίδια μειώθηκε από υποξία σε όλες τις ετοποσίδη-εκτεθειμένων κυττάρων.

HepG2, Α549, MDA-ΜΒ231 και τα κύτταρα Hep3B επωάστηκαν 16 ώρες υπό φυσιολογική οξυγόνωση (Ν, 21% O

2) ή υποξία (η, 1% O

2) παρουσία ή όχι ετοποσίδης (Ε, 100 μΜ σε κύτταρα Hep3B και 50 μΜ σε άλλους τύπους κυττάρων) ή πακλιταξέλη (Τ, 10 μΜ) σε κύτταρα HepG2. Μετά την επώαση, το συνολικό RNA εκχυλίζεται, υποβλήθηκε σε αντίστροφη μεταγραφή και, στη συνέχεια, σε πραγματικό χρόνο PCR παρουσία SYBR Green και ειδικών εκκινητών. Οι πραγματικές αριθμητικές τιμές που παρέχονται στον Πίνακα S3. Γονίδια εμφανίζονται με έντονους χαρακτήρες είναι γονίδια των οποίων η έκφραση αξιολογήθηκε σε επίπεδο πρωτεΐνης με κηλίδα western αναλύσεις.

Η

Έκφραση Προφίλ των πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην απόπτωση

Εκτός από να ρυθμίζονται από τις αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση, οι περισσότερες από τις πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην απόπτωση είναι γνωστό ότι επίσης ρυθμίζεται σε μετα-μεταφραστικό επίπεδο [2]. Η ετοποσίδη και πακλιταξέλη επάγουν απόπτωση με ενεργοποίηση κυρίως την ενδογενή οδό [17], [18], [19], το οποίο ρυθμίζεται από την αφθονία και την υποκυτταρική εντόπιση των πρωτεϊνών της οικογένειας Bcl-2. Ως εκ τούτου, μελετήθηκε η πρωτεΐνη αφθονία του BCL-2 πρωτεΐνες της οικογένειας σε τέσσερις τύπους κυττάρων καθώς και την υποκυτταρική εντόπιση του μερικά από αυτά σε HepG2 και κύτταρα Α549 (Εικόνα 6).

HepG2, Α549, MDA-ΜΒ231 και τα κύτταρα Hep3B επωάστηκαν 16 ώρες υπό φυσιολογική οξυγόνωση (Ν, 21% O

2) ή υποξία (η, 1% O

2) με την παρουσία ή όχι (CTL) ετοποσίδης (ΕΤΟ, 100 μΜ σε Hep3B κύτταρα και 50 μΜ σε άλλους τύπους κυττάρων) ή πακλιταξέλη (φόροι, 10 μΜ) σε κύτταρα HepG2. (Α) Οι πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν συνολικά κυτταρικά εκχυλίσματα με κηλίδωση Western, χρησιμοποιώντας ειδικά αντισώματα. άλφα-τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. αντιπροσωπευτικό Ένα πείραμα από τρία. Οι Αξάκριστο στυπώματα Western παρουσιάζονται στο Σχήμα S1. (Β) Μετά την επώαση, υποκυτταρική κλασμάτωση εκτελέσθηκε και πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν στα κλάσματα MLP (μιτοχόνδρια-λυσόσωμα-περοξυσώματος) και S (κυτοσολική) με κηλίδωση Western, χρησιμοποιώντας ειδικά αντισώματα. TOM20 και β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχοι φόρτωσης για τα κλάσματα MLP και S αντίστοιχα. αντιπροσωπευτικό Ένα πείραμα από τρία. Οι uncropped δυτική κηλίδες παρουσιάζονται στο Σχήμα S1.

Η

Μελετήσαμε πρώτα τα προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών ΒΑΧ και ΒΑΚ. ΒΑΧ επίπεδο συνολικής πρωτεΐνης ήταν ελαφρώς αυξημένες από ετοποσίδη σε HepG2, Α549 και Hep3B κύτταρα, αλλά παρέμεινε ανεπηρέαστο στα κύτταρα MDA-MB231. Η υποξία μειώθηκε ελαφρά ΒΑΧ αφθονία στα κύτταρα HepG2, αλλά δεν είχε καμία επίδραση σε άλλους τύπους κυττάρων. Αυτή η πρωτεΐνη ήταν παρούσα στο MLP (μιτοχόνδρια-λυσόσωμα-περοξυσώματος) κλάσμα, καθώς και στο κυτταρόπλασμα των HepG2 και κυττάρων Α549. Etoposide αυξημένη ΒΑΧ αφθονία στο κυτοσόλιο των κυττάρων HepG2 και στο κλάσμα MLP των κυττάρων Α549? Αυτή η αύξηση αποτράπηκε από την υποξία.