Αφηρημένο

Ιστορικό

Οι οστικές μεταστάσεις είναι ιδιαίτερα συχνές επιπλοκές του καρκίνου του μαστού. Οι τρέχουσες θεραπείες μετάσταση στα οστά χρησιμοποιώντας ισχυρό αντι-resorbtive παράγοντες είναι μόνο παρηγορητική υποδεικνύοντας ότι παράγοντες ανεξάρτητοι από τον έλεγχο οστικής απορρόφησης εξέλιξη μετάσταση στα οστά. Αυτοταξίνης (ΑΤΧ /NPP2) είναι μία εκκρινόμενη πρωτεΐνη τόσο με ογκογόνο και pro-μεταστατικές ιδιότητες. Μέσω lysosphospholipase D (lysoPLD) δραστηριότητα της, ATX ελέγχει το επίπεδο του λυσοφωσφατιδικού οξέος (Ι_ΡΑ) στο αίμα. Προερχόμενος από Αιμοπετάλια ΙΡΑ προάγει την εξέλιξη της οστεολυτικές μεταστάσεις των καρκινικών κυττάρων του μαστού. Ζητήσαμε αν ΑΤΧ εμπλέκονται στη διαδικασία μετάσταση στα οστά. Έχουμε χαρακτήρισε το ρόλο της ATX στο σχηματισμό οστεολυτικές οστικές μεταστάσεις, χρησιμοποιώντας γενετικά τροποποιημένα κύτταρα καρκίνου του μαστού αξιοποιηθούν σε διαφορετικά μοντέλα μετάστασης του ποντικιού οστεολυτική οστού.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Η ενδοφλέβια ένεση ανθρώπινου καρκίνου του μαστού MDA -B02 κυττάρων με εξαναγκασμένη έκφραση της ΑΤΧ (MDA-B02 /ATX) για να inmmunodeficiency BALB /C

nude

ποντίκια αυξημένη πιθανότητα εμφάνισης οστικών μεταστάσεων οστεολυτικές, όπως κρίνεται από την αυξημένη απώλεια οστικής μάζας, το φορτίο του όγκου, καθώς και αύξηση του αριθμού των ενεργών οστεοκλαστών στο μεταστατικό χώρο. Mouse καρκίνου του μαστού 4Τ1 κυττάρων που επάγεται ο σχηματισμός οστεολυτικές μεταστάσεις μετά την ένεση ενδοκαρδιακή σε ανοσοεπαρκείς ποντικούς BALB /C. Αυτά τα κύτταρα εξέφρασαν δραστική ATX και φίμωσης έκφραση ATX ανέστειλε την έκταση του οστεολυτικές βλάβες των οστών και μείωσε τον αριθμό των ενεργών οστεοκλαστών στην μεταστατική θέση οστού.

In vitro

, τη διαφοροποίηση των οστεοκλαστών ενισχύθηκε παρουσία ρυθμισμένο μέσο MDA-B02 /ATX κύτταρο ή ανασυνδυασμένη αυτοταξίνης που έχει αποκλειστεί από την vpc8a202 αναστολέα αυτοταξίνη.

In vitro

, η προσθήκη του Ι_ΡΑ στην ενεργό ξυλάνθρακα επεξεργασμένο ορό αποκατέστησε την ικανότητα του ορού για την υποστήριξη RANK-L /MCSF επαγόμενη οστεοκλαστογένεσης.

Συμπέρασμα /σημαντικότητα

Έκφραση της αυτοταξίνης από καρκινικά κύτταρα ελέγχει το σχηματισμό μετάσταση στα οστά οστεολυτική. Αυτή η εργασία επιδεικνύει έναν νέο ρόλο για το ΙΡΑ ως παράγοντας που διεγείρει άμεσα την ανάπτυξη του καρκίνου και μετάσταση, και τη διαφοροποίηση των οστεοκλαστών. Ως εκ τούτου, με στόχο την αυτοταξίνης /ΙΡΑ κομμάτι αναδύεται ως μια πιθανή νέα θεραπευτική προσέγγιση για τη βελτίωση της έκβασης των ασθενών με οστικές μεταστάσεις

Παράθεση:. David M, Wannecq E, F Descotes, Jansen S, Deux Β, Ribeiro J , et al. (2010) Cancer Cell Έκφραση αυτοταξίνης Controls μετάσταση στα οστά Σχηματισμός στο ποντίκι μέσω Λυσοφωσφατιδικό Acid-εξαρτώμενη ενεργοποίηση των οστεοκλαστών. PLoS ONE 5 (3): e9741. doi: 10.1371 /journal.pone.0009741

Επιμέλεια: Erik Danen, Leiden /Άμστερνταμ Κέντρο Drug Research, Πανεπιστήμιο του Leiden, Ολλανδία

Ελήφθη: 14η Ιανουαρίου, 2010? Αποδεκτές: 26η, Φεβρουαρίου 2010? Δημοσιεύθηκε: 17 Μαρ 2010

Copyright: © 2010 David et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το INSERM (ΕΠ και PC), η Comité départemental de la Loire de la Ligue Nationale contre le Καρκίνο (ΕΠ), το γαλλικό Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, INCA (ΕΠ, σύμβαση 0610-3D1616-102 /PL 2006 ) και η Γαλλική Ένωση pour la Recherche sur le Cancer, ARC (ΕΠ). M.D. ήταν αποδέκτης της υποτροφίας από την Ligue Nationale contre le Cancer. J.S. κατέχει μεταδιδακτορικός υπότροφος του Ιδρύματος Έρευνας – Φλάνδρα (FWO). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

οστών είναι μια κοινή μεταστατική περιοχή για πολλές μορφές καρκίνου [1]. Οι οστικές μεταστάσεις που σχετίζονται με υπασβεστιαιμία, λόγω της καταστροφής των οστών, δυσεπίλυτα πόνο στα οστά και παθολογικά κατάγματα. Κύτταρα όγκου παρόντες στη μεταστατική θέση οστό διεγείρουν οστεοκλαστών επαναρρόφησης οστού, και των οστών που προέρχονται από παράγοντες ανάπτυξης που απελευθερώνονται από επαναρροφάται οστό την προώθηση της ανάπτυξης του όγκου, που οδηγεί στην ανάπτυξη του έναν φαύλο κύκλο. [2]. Δυστυχώς, οι τρέχουσες θεραπείες με τη χρήση ισχυρών παραγόντων κατά της απορρόφησης (διφωσφονικά) αδυνατούν να προσφέρουν όφελος παρατείνει τη ζωή σε ασθενείς με οστικές μεταστάσεις αυξάνοντας την ανάγκη για μια καλύτερη γνώση των μοριακών μηχανισμών που εμπλέκονται σε αυτή την παθολογία [3]. Έχουμε βρει πρόσφατα ότι λυσοφωσφατιδικό οξύ (Ι_ΡΑ) που προέρχεται από τα αιμοπετάλια δρα τοπικά στα κύτταρα του όγκου για την προώθηση της προόδου των μεταστάσεων στα οστά [4]. Μεταξύ των συγκεκριμένων υποδοχείς κυτταρικής επιφάνειας για LPA (LPA

1-6) που εκφράζεται από τα καρκινικά κύτταρα, αποδείξαμε ότι LPA

1 δραστικότητα επικράτησαν κατά την εξέλιξη της μετάστασης στα οστά και ότι η στόχευση αυτού του υποδοχέα ήταν μια νέα θεραπευτική στρατηγική κατά των μεταστάσεων στα οστά [ ,,,0],5]. Ωστόσο, πώς Ι_ΡΑ παράγεται στην θέση του όγκου και πώς LPA παράγονται από τα καρκινικά κύτταρα οι ίδιοι θα μπορούσαν να συμβάλλουν στην εξέλιξη των μεταστάσεων στα οστά είναι ακόμα άγνωστη.

αυτοταξίνης (ATX, NPP2) ανήκει στην φωσφοδιεστεράσης νουκλεοτιδίου πυροφωσφορικού (ΝΡΡ ) της οικογένειας [6]. Εκτός από την διατηρημένη φωσφοδιεστεράσης (PDE) δραστηριότητα μεταξύ όλων των πυρηνικών σταθμών, αυτοταξίνη έχει ένα μοναδικό λυσοφωσφολιπάση D (lysoPLD) δραστηριότητα, επιτρέποντας την παραγωγή του ΙΡΑ από λυσοφωσφατιδυλοχολίνης (LPC) [7]. Η βιολογική σημασία του PDE και lysoPLD δραστηριοτήτων στις λειτουργίες αυτοταξίνης μένει να καθοριστεί. Ωστόσο, η λειτουργική σημασία της καταλυτικής δραστικότητας των αυτοταξίνης

in vivo

αποδείχθηκε πρόσφατα από knockout ποντίκια μελέτες που δείχνουν ότι η αυτοταξίνη είναι υπεύθυνη για τα επίπεδα του Ι_ΡΑ στην κυκλοφορία του αίματος [8], [9]. Μια σύνδεση ανάμεσα στην αυξημένη δραστηριότητα lysoPLD και το σχηματισμό του LPA βρέθηκε σε διάφορες παθολογίες, όπως η ρευματοειδής αρθρίτιδα [10], ο νευροπαθητικός πόνος [11], η χρόνια ηπατίτιδα C [12] και των λιποκυττάρων ινσουλίνη αντίσταση στην παχυσαρκία [13]. Αυτοταξίνης είναι μία γλυκοπρωτεΐνη ταυτοποιήθηκε αρχικά ως αυτοκρινής παράγοντας κινητικότητος που εκκρίνεται από ανθρώπινα κύτταρα μελανώματος [14], [15]. Αυξημένη έκφραση του αυτοταξίνης φάνηκε να συσχετίζεται με αυξημένη διεισδυτικότητα των καρκινικών κυττάρων του μαστού [16] και βρέθηκε να ενισχύσει το μεταστατικό δυναμικό των ras-μετασχηματισμένων ινοβλαστών 3Τ3 [17]. Η έκφραση του mRNA αυτοταξίνης ανιχνεύθηκε σε ένα βασικό επίπεδο σε όλους σχεδόν τους ανθρώπινους ιστούς [18]. Περιέργως, προς τα πάνω ρύθμιση του γονιδίου αυτοταξίνης αναφέρθηκε σε μια μεγάλη ποικιλία καρκίνων όπως γλοιοβλάστωμα [19], η επιθετική νευροβλάστωμα [20], μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα [21], uveal μελάνωμα σχετίζονται με την κακή πρόγνωση [22], καρκίνωμα του θυρεοειδούς [23 ], ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα με μεταστάσεις [24], και του καρκίνου του μαστού [16]. MMTV-

ATX

διαγονιδιακά ποντίκια με ειδικά αυξημένη έκφραση του αυτοταξίνης στο μαστικό αδένα έδειξε αυξημένη στη συχνότητα εμφάνισης αυθόρμητων όγκων του μαστού κατά τη διάρκεια μιας περιόδου δύο ετών, που απεικονίζει το pro-ογκογόνο λειτουργία της αυτοταξίνης [25].

Εδώ, παρέχουμε πειραματικές αποδείξεις ότι τα καρκινικά κύτταρα του μαστού εκφράζουν αυτοταξίνη έχουν ένα επιλεκτικό πλεονέκτημα για την επαγωγή του σχηματισμού οστεολυτικές μεταστάσεις, ως αποτέλεσμα ενός νέου προ-οστεοκλαστική λειτουργία του αυτοταξίνης προερχόμενο προϊόν LPA. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν το ρόλο της αυτοταξίνης σε προχωρημένους καρκίνους του μαστού και προτείνουν ότι η στόχευση της αυτοταξίνης /ΙΡΑ κομμάτι μπορεί να παρέχει πρόσθετο όφελος για τους ασθενείς που πάσχουν από οστικές μεταστάσεις.

Αποτελέσματα

De novo

αυτοταξίνης έκφραση αυξάνει τον πολλαπλασιασμό και την εισβολή των ανθρώπινων MDA-B02 κύτταρα καρκίνου του μαστού

in vitro

η

Έχουμε δείξει στο παρελθόν ότι τα κύτταρα MDA-B02 δεν εκφράζουν αυτοταξίνης σε σταθερή κατάσταση [4]. Για να εκτιμηθεί κατά πόσον ή όχι αυτοταξίνης παίζει ένα ρόλο στη διάδοση μετάσταση των καρκινικών κυττάρων του μαστού, εισαγάγαμε το cDNA της αυτοταξίνης αρουραίου σε κύτταρα MDA-B02. Χρησιμοποιήσαμε το σύστημα έκφρασης tet-Off-ρυθμίζονται με τον οποίο επιτυγχάνεται η έκφραση αυτοταξίνη μαζί με την λουσιφεράση συγκεκριμένα στην απουσία του καταστολέα, δοξυκυκλίνη [4]. Ως ένα μοναδικό μέλος της οικογένειας NPP, αυτοταξίνης εκθέματα τόσο lysoPLD και τις δραστηριότητες της φωσφοδιεστεράσης [26], [27]. Ως εκ τούτου, ως κύτταρο ελέγχου γραμμής επιμολύναμε κύτταρα MDA-B02 με ένα φορέα έκφρασης που κωδικοποιεί για το ποντίκι NPP1, η οποία ενεργεί ως νουκλεοτιδικής φωσφοδιεστεράσης αλλά ότι στερείται για τη δραστηριότητα lysoPLD.

Για κάθε κατασκεύασμα, επιλέξαμε δύο σταθερές κλώνους: MDA-B02-ATX κλώνος όχι. 30 και αρ. 38, και MDA-B02-NPP1 κλώνους όχι. 10,5 και όχι. 42. Η έκφραση του αυτοταξίνης ως εκκρινόμενη πρωτεΐνη και NPP1 ως πρωτεΐνη δεσμευμένη σε μεμβράνη επιβεβαιώθηκαν με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας ειδικά αντισώματα (Σχήμα 1Α). επιλογές Κλώνος βασίστηκαν στην υψηλή έκφραση λουσιφεράσης εν απουσία δοξυκυκλίνης (Σχήμα 1Β). Όπως ήταν αναμενόμενο, παρατηρήσαμε ότι σε απουσία δοξυκυκλίνης μόνο MDA-B02-ATX κλώνοι αποκτήσει μια δραστηριότητα lysoPLD (Σχήμα 1Β), ενώ και τα δύο MDA-B02-ATX και MDA-B02-NPP1 κλώνοι είχαν αυξημένη δραστικότητα PDE, σε σύγκριση με . γονικά κύτταρα (Εικόνα 1Β)

(Α) κύτταρα επιμολυσμένα με φορείς έκφρασης αμφίδρομη pBiL-ATX ή pBil-NPP1 καλλιεργήθηκαν με (+) ή χωρίς (-) δοξυκυκλίνη (Dox). Πρωτεΐνες από ρυθμισμένα μέσα (CM) ή προϊόντα λύσεως των κυττάρων του όγκου (CL) δύο σταθερών κλώνων (αρ. 30 και αρ. 38 έως ATX, αρ. 10.5 και αριθ. 42 έως NPP1) έχουν electrophorezed συνέχεια ανοσοστυπώθηκαν με ένα αντι ΑΤΧ-αντίσωμα (αριστερός πίνακας) ή αντι-Μγο αντίσωμα (δεξί πάνελ). (Β) ποσοτικούς προσδιορισμούς λουσιφεράσης δραστηριότητας (αριστερό πάνελ), δραστικότητα lysoPLD (μεσαίο πλαίσιο) και η δραστικότητα PDE (δεξί πάνελ) σε κάθε κλώνο και γονικά κύτταρα MDA-B02. (Γ) Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων διεγέρθηκε με LPC (10 μΜ) σε απουσία ή παρουσία Ki16425 (10 μΜ). Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως το% της ενσωμάτωσης BrdU σε σύγκριση με μη διεγερμένα γονικά κύτταρα MDA-B02. Δεδομένα αντιστοιχεί στον μέσο ± SD από 6 επαναλήψεων και είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον 3 ανεξάρτητα πειράματα. (D) εισβολή των κυττάρων διεγέρθηκε με 10% FBS χρησιμοποιήθηκε ως χημειοπροσελκυστικό. Τα αποτελέσματα είναι η μέση τιμή ± SD των κυττάρων του 3 επαναλήψεων και είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον 3 ανεξάρτητα πειράματα. Τα δεδομένα εκφράζονται ως ο αριθμός των κυττάρων /mm

2. *,

P

τουμπουλίνης ως έλεγχος φόρτωσης. (Κάτω πίνακας) δραστηριότητα lysoPLD (pmol LPA /ml) μετρήθηκε σε καλλιέργεια κυττάρων ρυθμισμένο μέσο. (Δ) Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εκτιμήθηκε με BrdU ενσωμάτωση 4Τ1 κυττάρων και μία δεξαμενή τρεις κλώνους 4Τ1-sbATX (αρ. 14, αρ. 16, αρ. 20) ή τρεις κλώνους 4Τ1-siATX (αρ. 1, αρ. 17, δεν . 52), σε απάντηση σε αυξημένες συγκεντρώσεις της LPC. Τα αποτελέσματα εκφράζονται σε μέσες ± SD 6 επαναλήψεων και είναι αντιπροσωπευτικά 3 διαχωρίζει πειράματα. δοκιμασία (Ε) Εισβολή. Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε παρουσία ή απουσία του LPA (0.1-1 μΜ) στον άνω θάλαμο και FBS, χρησιμοποιήθηκε ως χημειοελκυστικό, τοποθετήθηκε στο κατώτερο θάλαμο. Τα αποτελέσματα είναι η μέση τιμή ± SD 3 επαναλήψεων και είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον 3 ανεξάρτητα πειράματα. Τα δεδομένα εκφράζονται ως ο αριθμός των κυττάρων /mm

2. *,

P

& lt?. 0.05

Η

Όπως παρατηρήθηκε προηγουμένως για τα κύτταρα MDA-B02

in vitro

(σχήμα 1Γ), LPC παρουσίασαν μια μιτογόνο δράση για 4Τ1 κύτταρα (Σχήμα 4D). Ωστόσο, αποσιώπηση της έκφρασης αυτοταξίνης δεν μετέβαλε τον πολλαπλασιασμό κυττάρων 4Τ1-siATX σε σύγκριση με εκείνη που παρατηρείται για γονικές κυτταρικές σειρές (Σχήμα 4D) έλεγχο και. Το αποτέλεσμα αυτό ήταν μάλλον εκπληκτικό και μπορεί να είναι η συνέπεια του υπόλοιπου δραστηριότητα lysoPLD σε 4Τ1-siATX κλώνων. Μια εναλλακτική εξήγηση θα ήταν ότι ο πολλαπλασιασμός των 4Τ1 κυττάρων ήδη μέγιστο διεγείρεται από LPC. Σε αντίθεση, χρησιμοποιώντας Transwell θαλάμους μετανάστευσης επικαλυμμένα με Matrigel ™, παρατηρήσαμε ότι φίμωση έκφραση αυτοταξίνη ανέστειλε FBS με γνώμονα εισβολή των κυττάρων 4Τ1-siATX (Σχήμα 4Ε). Αυτή η αναστολή ξεπεραστεί με την προσθήκη του Ι_ΡΑ μέσα στο διαμέρισμα κυψελίδας των θαλάμων μετανάστευσης αποδεικνύει ότι η εισβολή των 4Τ1 κυττάρων ελέγχθηκε με αυτοταξίνη μέσω της δραστηριότητάς του lysoPLD.

κάτω ρύθμιση έκφρασης ενδογενούς αυτοταξίνης σε 4Τ1 κύτταρα αναστέλλει οστεολυτική σχηματισμό οστικών μεταστάσεων ανεξάρτητα από πρωτογενή ανάπτυξη του όγκου

in vivo

Η

για να μάθετε αν ενδογενή έκφραση αυτοταξίνης σε καρκινικά κύτταρα του μαστού ήταν σημαντικό για το σχηματισμό οστικών μεταστάσεων, 4Τ1-siATX και κυττάρων ελέγχου σειρές ενέθηκαν στην αριστερή κοιλία της καρδιάς του θηλυκού συγγενή ποντίκια BALB /C. Η στρατηγική αυτή επιτρέπει να παρακάμψει τους πνεύμονες και να στοχεύουν τα κύτταρα σε άλλα σπλαχνικά όργανα και οστών. Δύο εβδομάδες μετά τον ενοφθαλμισμό των κυττάρων, ραδιογραφικές αναλύσεις αποκάλυψαν ότι τα ζώα που φέρουν τα κύτταρα 4Τ1-siATX είχαν 50% μείωση στην έκταση της οστεολυτικές βλάβες, σε σύγκριση με τα ζώα που ενέθηκαν με 4Τ1-sbATX ή 4Τ1 γονικά κύτταρα (Σχήμα 5Α). Ιστολογικές αναλύσεις αποκάλυψαν ότι η επιφάνεια των ενεργών οστεοκλαστών ανά περιοχή δοκιδωτού οστού που βρίσκεται στη διεπιφάνεια οστικών κυττάρων /όγκου μειώθηκε σημαντικά σε ζώα που φέρουν κύτταρα 4Τ1-siATX, σε σύγκριση με αυτή που παρατηρήθηκε σε ποντικούς που φέρουν τη γονική ή 4Τ1-sbATX καρκινικών κυττάρων (Σχήμα 5Β ). Έχουμε αποδείξει στο παρελθόν ότι Ι_ΡΑ παράγεται στο μικροπεριβάλλον του όγκου από τα αιμοπετάλια [4]. Για να αναλυθεί ο ρόλος του ενδογενούς αυτοταξίνης επί καρκινικών κυττάρων του μαστού

in vivo

ανεξάρτητα από το μικροπεριβάλλον των οστών, κυτταρικές γραμμές ελέγχου 4Τ1-siATX και εμβολιάστηκαν σε λίπος-pad θηλυκών ποντικών συγγενή Balb /c. Μετά από δύο εβδομάδες, το οποίο αντιστοιχούσε στο ίδιο χρονικό πλαίσιο της ανάπτυξης του όγκου από εκείνο που χρησιμοποιείται για τα πειράματα μετάσταση στα οστά, συλλέχθηκαν πρωτογενών όγκων. Παρατηρήσαμε ότι φίμωση έκφραση αυτοταξίνη δεν μετέβαλε την ανάπτυξη των πρωτογενών όγκων δεδομένου ότι δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στο μέγεθος των όγκων 4Τ1-siATX, σε σύγκριση με εκείνες των 4Τ1-sbATX και γονικών όγκων (Σχήμα 6Α).

Επί τόπου

ανοσοανίχνευσης του πυρηνικού αντιγόνου Ki-67 σε τομές όγκων δεν έδειξε καμία διαφορά στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ελέγχου (Εικόνα 6Β) 4Τ1-siATX και. Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ενδογενής έκφραση του σχηματισμού μετάστασης οστού αυτοταξίνη ελεγχόμενη αλλά όχι η ανάπτυξη των κυττάρων 4Τ1

in vivo

.

(Α) (αριστερή ομάδα) Αντιπροσωπευτικά ακτινογραφίες οπισθίων άκρων από BALB /C ποντικούς 14 ημέρες μετά την ένεση ενδοκαρδιακή του 4Τ1 γονικών κυττάρων ή δεξαμενές 4Τ1-sbATX κλώνοι (αρ. 14, αρ. 16, αρ. 20) ή κλώνους 4Τ1-siATX (αρ. 1, αρ. 17, αρ. 52) . Οι οστεολυτικές βλάβες υποδεικνύονται με βέλη. (Δεξιά πλευρά) Ποσοτικοποίηση των οστεολυτικές περιοχές βλάβης. Οι τιμές εκφράζονται ως το% των περιοχών αλλοιώσεων σε σύγκριση με γονικά κύτταρα 4Τ1. Δεδομένα αντιστοιχεί στον μέσο ± SE των δύο ανεξάρτητων πειραμάτων από 8 έως 10 ζώα ανά ομάδα. *,

P

& lt? 0,05. (Β) (της αριστερής άνω πλαίσια) Αντιπροσωπευτικά ανοσοϊστολογική εξέταση των εγγύς τμημάτων της κνήμης από μεταστατικό ζώα 14 ημέρες μετά τον εμβολιασμό των καρκινικών κυττάρων, με τη χρήση του 4F1 αντίσωμα αντι-ATX. Τ δείχνει τα καρκινικά κύτταρα. (Κάτω αριστερά πάνελ) Εκπρόσωπος ιστολογική εξέταση του εγγύς τμήματα κνήμης TRAP-χρωματίζονται από μεταστατικό ζώα. Τ δείχνει τα καρκινικά κύτταρα. Οστό βάφεται σε σκούρο μπλε και osteoclats χρωματίζονται με κόκκινο χρώμα (βέλη). (Δεξιά πλευρά) Ποσοτικοποίηση των ενεργών-οστεοκλαστών επιφάνειας απορρόφησης ανά επιφάνεια δοκιδωτού οστού (Oc.S /BS). Τα αποτελέσματα είναι η μέση τιμή ± SE 8-10 ζώων ανά ομάδα. *:

P

& lt? 0,05. Ράβδοι κλίμακας: 200 μm

Η

4Τ1 γονικά κύτταρα, 4Τ1-sbATX κλώνοι και οι κλώνοι 4Τ1-siATX εγχύθηκαν στον μαστικό αδένα της κανονικής συγγενή θηλυκά ποντίκια BALB /C.. Την ημέρα 14, οι πρωτογενείς όγκοι αποκόπηκαν, και ζυγίστηκαν. οικόπεδα (Α) Box αντιπροσωπεύουν το βάρος του όγκου (σε mg). (Β) Πρωτογενή καρκινώματα εγκλείστηκαν σε παραφίνη. τομές ιστών όγκου αναλύθηκαν με mmunohistochemistry χρησιμοποιώντας ένα ειδικό αντίσωμα που κατευθύνεται εναντίον του αντιγόνου της πυρηνικής Ki-67. Ο μιτωτικός δείκτης (αριθμοί σε κάθε πίνακα) υπολογίστηκε ως το ποσοστό των πυρήνων θετικά για Ki-67 (τα αποτελέσματα είναι η μέση τιμή ± SD, γραμμή κλίμακας: 50 μm). (Γ) Τα ζώα θυσιάστηκαν 35 ημέρες μετά την ένεση των κυττάρων του όγκου και οι πνεύμονες συλλέχθηκαν για την ποσοτικοποίηση αυθόρμητα μετάσταση σχηματισμό 4Τ1 κυττάρων. (Άνω πάνελ) αντιπροσωπευτικές φωτογραφίες από τομές ιστών του πνεύμονα χρωματίστηκαν με ηωσίνη. (Κάτω πίνακας) Ποσοτικοποίηση των πνευμόνων μετάστασης εστιών. Ο αριθμός των μεταστατικών εστιών απαριθμήθηκε κάτω από μικροσκόπιο. P & lt? 0,05. Τ υποδεικνύει μεταστατικές εστίες. μπαρ κλίμακα:. 200 μm

Η

Για να αναλυθεί η ικανότητα των ενδογενών αυτοταξίνης να υποστηρίξει το σχηματισμό των αυθόρμητων μεταστάσεων από κύτταρα 4Τ1

in vivo

, τα κύτταρα εγχέονται μέσα στο λίπος του μαστού ταμπόν από θηλυκά ποντίκια BALB /C. Πρωτογενή καρκινώματα αναπτύχθηκαν για δύο εβδομάδες, στον οποίο χρόνο είχαν εκτομή, επιτρέποντας την εμφάνιση της αυθόρμητης μεταστάσεων. Τρεις εβδομάδες μετά την εκτομή των πρωτοπαθών όγκων, τα ζώα θυσιάστηκαν. Πνεύμονες συλλέχθηκαν, σταθεροποιήθηκαν και ενσωματωμένα σε παραφίνη. τομές ιστών του πνεύμονα εξετάστηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο για την παρουσία μεταστατικών εστιών. Βρήκαμε ότι τα ποντίκια που εμβολιάσθηκαν με κύτταρα 4Τ1-siATX είχαν σημαντικά χαμηλότερο αριθμό μεταστάσεων πνεύμονα (μείωση κατά 80%) σε σύγκριση με ποντίκια που εμβολιάστηκαν με 4Τ1 γονικά κύτταρα (Σχήμα 6C).

Συνολικά, αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι η έκφραση της ενδογενούς αυτοταξίνης έλεγχε την ικανότητα του 4Τ1 κύτταρα καρκίνου του μαστού σε μετάσταση και να διεγείρει το σχηματισμό του οστεολυτικές μεταστάσεις ανεξάρτητα από τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων.

η έκφραση του mRNA αυτοταξίνης σε πρωτογενείς όγκους ασθενών με καρκίνους του μαστού

στη συνέχεια το ερώτημα αν οι επιδράσεις της έκφρασης αυτοταξίνης παρατηρήθηκαν σε προκλινικά μοντέλα ποντικού των καρκίνων του μαστού μπορεί να συσχετιστεί με την ανθρώπινη ασθένεια. Αναλύσαμε την έκφραση του γονιδίου που εκφράζει αυτοταξίνης (

ENNP2

) με ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου σε μια σειρά από 167 βιοψίες όγκων στήθους από ασθενείς χωρίς (n = 145) ή με (n = 22) που προσδιορίζονται κατά τη μεταστάσεις στιγμή της διάγνωσης. Παρατηρήσαμε ότι η έκφραση του

ENPP2

κανονικοποιούνται προς τα γονίδια που κωδικοποιούν L32 (L32) ή κουτί ΤΑΤΑ πρωτεΐνης δέσμευσης ριβοσώματος πρωτεΐνη (ΤΒΡ, τα δεδομένα δεν φαίνονται), δεν ήταν τροποποιημένο σημαντικά σε ασθενείς με οστό ή μαλακό ιστό μεταστάσεις κατά τη στιγμή της διάγνωσης, σε σύγκριση με μη μεταστατικό ασθενείς (Σχήμα 7). Βρήκαμε επίσης παρόμοια επίπεδα

ENPP2

mRNA σε πρωτογενείς όγκους των μη μεταστατικό ασθενείς που είχαν αναπτύξει οστών ή μεταστάσεις μαλακών ιστών σε μια περίοδο πέντε ετών (Σχήμα 7). Στη συνέχεια, μελετήθηκε η έκφραση του

ENPP2

σε σχέση με τα κλινικά, παθολογικά και βιολογικά χαρακτηριστικά, όπως ορίζεται στον Πίνακα 1. Βρήκαμε ότι ακόμα και αν οι απόλυτες μέσες τιμές του

ENPP2

επίπεδα μεταγραφής ήταν σταθερά αυξάνεται μαζί με τα χαρακτηριστικά των φτωχών προγνωστικά, οι διαφορές δεν έφθασαν στατιστική σημασία. Αυτό έδειξε ότι η έκφραση του

ENPP2

σε πρωτογενείς όγκους ασθενών με καρκίνο του μαστού ήταν ανεξάρτητο από το μέγεθος του όγκου, το βαθμό, κόμβος, υποδοχέα οιστρογόνου (ER) και υποδοχέα προγεστερόνης (PgR) κατάσταση (Πίνακας 1).

Ολικό RNA εκχυλίστηκαν από πρωτογενή βιοψίες όγκων στήθους από ασθενείς χωρίς ή με μεταστάσεις κατά τη στιγμή της διάγνωσης. Μαλακό και των οστών αντιπροσωπεύουν υποσύνολα του μεταστατικού ασθενείς με μαλακό ιστό μόνο και οστικές μεταστάσεις, αντίστοιχα. W /O Rec αντιπροσωπεύουν ένα υποσύνολο των μη μεταστατικό ασθενών χωρίς υποτροπή της μετάστασης κατά τη διάρκεια μιας περιόδου πέντε ετών. Μαλακό Rec και Rec οστών αντιπροσωπεύουν υποομάδες των ασθενών με υποτροπή μεταστάσεων σε μόνο και οστά σε μια περίοδο πέντε ετών, αντίστοιχα, των μαλακών ιστών. η δείχνει τον αριθμό των ασθενών σε κάθε ομάδα. Έκφραση των Enpp2 ATX mRNA /μετρήθηκε με πραγματικού χρόνου ποσοτική σε πραγματικό χρόνο PCR. Ποσοτικοποιήσεις ομαλοποιήθηκαν σε αντίστοιχες τιμές RNA L32. Τα δεδομένα δίνονται ως οικόπεδα κουτί με το διάμεσο. Το κουτί περιλαμβάνει το 25

ου σε 75

ου εκατοστημόρια. Το 5

ου εκατοστημόρια εμφανίζονται ως ράβδοι σφάλματος.

Η

LPA ελέγχει άμεσα οστεοκλαστών διαφοροποίηση

Δείξαμε προηγουμένως ότι LPA αυξάνει τη δραστικότητα των καρκινικών κυττάρων να παρακινηθεί η διαφοροποίηση των οστεοκλαστών

in vitro

και την πρόσληψή τους

in vivo

στη μεταστατική εντόπιση των οστών [4].

In vitro

, ρυθμισμένα μέσα συλλέγονται από MDA-B02-ATX κλώνοι ενίσχυσε σημαντικά τη διαφοροποίηση των οστεοκλαστών ώριμου από προδρόμους κυττάρων μυελού των οστών, σε σύγκριση με ρυθμισμένα μέσα που παρασκευάζονται από γονικά κύτταρα ή κλώνους MDA-B02-NPP1 (Εικόνα 8Α). Επιπλέον, η ανασυνδυασμένη αυτοταξίνη αυξήθηκε σημαντικά M-CSF /RANK-L-επαγόμενη διαφοροποίηση των οστεοκλαστών

in vitro

(Σχήμα 8Β). Για να καθοριστεί εάν η επίδραση της αυτοταξίνης οφειλόταν σε δραστηριότητα του lysoPLD, χρησιμοποιήσαμε ένα β-υποκατεστημένο ανάλογο του LPA (vpc8a202) περιγράφονται ως ειδικός αναστολέας [30]. Παρατηρήσαμε ότι vpc8a202 ανέστειλε την αυτοταξίνη εξαρτώμενη αυξήθηκε οστεοκλαστογένεσης από κύτταρα του μυελού των οστών σε επεξεργασία με Μ-CSF και RANK-L (Σχήμα 8Β). Δείξαμε προηγουμένως ότι LPA ελέγχει έμμεσα μαστού καρκινικό κύτταρο-επαγωγή του οστεοκλαστογένεσης μέσω της έκκρισης των προ-οστεοκλαστικής κυτοκίνες, IL-6 και IL-8, με καρκινικά κύτταρα [4]. Ορός απαιτείται για την πλήρη διαφοροποίηση των οστεοκλαστών κατά προδρόμους οστεοκλαστών διέγερση με M-CSF /RANK-L

in vitro

[31]. Ο ορός περιέχει υψηλές ποσότητες τόσο ΙΡΑ και LPC [32]. Ως εκ τούτου, τα αποτελέσματα μας πρότεινε ότι το ΙΡΑ που παράγεται από αυτοταξίνη παρουσία ορού μπορεί να ελέγχει άμεσα οστεοκλαστών διαφοροποίηση. Για να ελεγχθεί αυτή η υπόθεση, έχουμε επεξεργασία ορό εμβρύου μόσχου με ενεργό άνθρακα, προκειμένου να απομακρυνθούν όλα τα κλάσματα λιπιδίων. Παρατηρήσαμε ότι τα λιπίδια του ορού εξαντλημένο δεν ήταν σε θέση να υποστηρίξει την οστεοκλαστογένεση που προκαλείται από Μ-CSF /RANK-L (Σχήμα 8C). Αυτή η ανασταλτική επίδραση του λιπιδίου-εξαντλημένο ορό διασώθηκε με την προσθήκη καθαρισμένου Ι_ΡΑ στο μέσο καλλιέργειας (Εικόνα 8C). Αυτό το αποτέλεσμα έδειξε ότι το ΙΡΑ ήταν απαραίτητη για επάγεται ορού /M-CSF /RANK-L οστεοκλαστογένεσης.

(Α) κύτταρα μυελού των οστών καλλιεργήθηκαν παρουσία FBS (10%), το ποντίκι Μ-CSF, βαθμολογικά L και κυττάρων MDA-B02 ή MDA-B02-ATX κλώνος # 30 ή MDA-B02-NPP1 κλώνος # 10,5 ρυθμισμένα μέσα. (Β) κύτταρα μυελού των οστών καλλιεργήθηκαν σε παρουσία FBS (10%), το ποντίκι Μ-CSF, RANK-L και ανασυνδυασμένη ATX, σε απουσία (-) ή παρουσία αυξανόμενων συγκεντρώσεων του αναστολέα ATX, vpc8a202. (C) τα κύτταρα του μυελού των οστών καλλιεργήθηκαν σε παρουσία ποντικού M-CSF, RANK-L και FBS (έλεγχος) ή λιπίδια εξαντλημένο FBS (Dep. FBS) σε απουσία ή παρουσία 1-ελαϋλο-LPA (1 μΜ). (Αριστερό πάνελ) Εκπρόσωπος εικόνες των πολυπύρηνων χρώση για τη δραστηριότητα TRAP. (Δεξιά πλαίσια) Ποσοτικοποίηση αριθμός οστεοκλαστών βασίστηκε στην πολυπυρήνωση των TRAP-θετικών κυττάρων. Τα αποτελέσματα είναι η μέση τιμή ± SD από 3 ξεχωριστά πειράματα. *:

P

& lt? 0,05. Ράβδοι κλίμακας: 200 μm

Η

Συζήτηση

Στη μελέτη αυτή έδειξε ότι η έκφραση του αυτοταξίνης ελέγχεται η εξέλιξη της οστεολυτικές μεταστάσεις που προκαλείται από καρκινικά κύτταρα του μαστού.. Δείξαμε προηγουμένως ότι λυσοφωσφατιδικό οξύ (LPA) που παράγεται στο μικροπεριβάλλον του όγκου ελέγχει την πρόοδο της οστεολυτικές μεταστάσεις των καρκινικών κυττάρων του μαστού και τόνισε το σημαντικό ρόλο των αιμοπεταλίων σε αυτή τη διαδικασία [4]. Πάντως, οι μοριακοί μηχανισμοί που εμπλέκονται στην παραγωγή του ΙΡΑ και το άμεσο ρόλο του LPA επί κυττάρων οστού στη μεταστατική θέση των οστών είναι ακόμη άγνωστος. αναλύσεις ζώο Knockout αποκάλυψε ότι αυτοταξίνη ελέγχει τα επίπεδα του Ι_ΡΑ στην κυκλοφορία του αίματος [8], [9]. Εξαναγκασμένη έκφραση της αυτοταξίνης σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του μαστού MDA-B02 αύξησε το σχηματισμό των οστεολυτικές μεταστάσεις σε ποντικούς, ενώ knockdown έκφραση ενδογενών αυτοταξίνης σε όγκο μαστού ποντικού 4Τ1 κύτταρα μείωσε την έκταση της οστεολυτικές βλάβες. Είναι γνωστό εδώ και δύο δεκαετίες ότι τα αιμοπετάλια είναι μια άφθονη πηγή του Ι_ΡΑ στον ορό [33], [34]. Ωστόσο, η ομάδα Aoki έδειξε ότι το ΙΡΑ απελευθερώνεται άμεσα από τα αιμοπετάλια αντιπροσωπεύει μόνο ένα μικρό μέρος του ΙΡΑ στον ορό [32]. Προερχόμενος από Αιμοπετάλια Ι_ΡΑ παράγεται κυρίως μέσω της δράσης του πλάσματος λυσοφωσφολιπάση D (π.χ. αυτοταξίνη) για τις πρόδρομες LPA (LPC, λυσοφωσφατιδυλαιθανολαμίνη, και λυσοφωσφατιδυλοσερίνη) που απελευθερώνεται από τα ενεργοποιημένα αιμοπετάλια [32].