Αφηρημένο

ιδρυτική ενεργοποίηση του μεταγραφικού παράγοντα πυρηνικού παράγοντα-κΒ (NF-κΒ) εμπλέκεται στην ογκογένεση και χημειο-αντίσταση. Καθώς το κλειδί ρυθμιστής του ΝΡ-κΒ, ΙΚΚβ είναι ένα σημαντικό θεραπευτικό στόχο για διάφορους καρκίνους. Trichothecin (TCN) είναι ένας μεταβολίτης απομονώνεται από ένα ενδοφυτικό μύκητα της φυτικής φυτού

Maytenus hookeri Loes.

Στην παρούσα μελέτη, αξιολογήσαμε την αντικαρκινική δραστικότητα του TCN και διαπίστωσε ότι TCN αναστέλλει σημαντικά την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων με συστατικώς ενεργοποιημένο ΝΡ-κΒ. TCN επάγει G0 /G1 διακοπή του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα, ενεργοποιώντας προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών, συμπεριλαμβανομένων της κασπάσης-3, -8 και PARP-1, και μειώνοντας την έκφραση του αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών Bcl-2, Bcl-xL, και survivin. δοκιμασία δραστικότητας Reporter και ανάλυση γονιδίων-στόχων έκφραση απεικονίζεται ότι TCN λειτουργεί ως ένας ισχυρός αναστολέας του μονοπατιού σηματοδότησης ΝΡ-κΒ. TCN αναστέλλει την φωσφορυλίωση και την υποβάθμιση του ΙκΒα και εμποδίζει την πυρηνική μετατόπιση του p65, και έτσι αναστέλλει την έκφραση του ΝΡ-κΒ γονίδια στόχους ΧΙΑΡ, κυκλίνη D1, και Bcl-XL. Αν και υπήκοοι τρίτων χωρών δεν παρεμβαίνει άμεσα με ΙΚΚβ κινάσης, καταστέλλει την φωσφορυλίωση της ΙΚΚβ. Υπερέκφραση μόνιμα ενεργοποιημένο ΙΚΚβ ματαιώθηκε υπηκόους τρίτων χωρών που προκαλείται από τον καρκίνο των κυττάρων απόπτωση, ενώ νοκ ντάουν της ενδογενούς ΙΚΚβ με siRNA ευαισθητοποιημένα καρκινικά κύτταρα προς την απόπτωση που επάγεται από υπηκόους τρίτων χωρών. Επιπλέον, υπήκοος τρίτης χώρας έδειξαν σαφώς ασθενέστερη επίδραση στα φυσιολογικά κύτταρα. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι υπήκοος τρίτης χώρας μπορεί να είναι ένας πιθανός θεραπευτικός υποψήφιος για τη θεραπεία του καρκίνου, που στοχεύουν NF-κΒ σηματοδότηση

Παράθεση:. Su J, Zhao P, L-Κονγκ, Li Χ, Yan J, Zeng Υ, et al. (2013) Trichothecin διεγείρει θάνατο κυττάρου σε ΝΡ-κΒ συστατικά ενεργοποιημένη ανθρώπινα κύτταρα του καρκίνου μέσω αναστολής της ΙΚΚβ φωσφορυλίωσης. PLoS ONE 8 (8): e71333. doi: 10.1371 /journal.pone.0071333

Επιμέλεια: Linda Bendall, Westmead Millennium Ινστιτούτο του Πανεπιστημίου του Σίδνεϊ, Αυστραλία

Ελήφθη: 11 Απρ του 2013? Αποδεκτές: 27, Ιουνίου 2013? Δημοσιεύθηκε: 1 Αυγούστου του 2013

Copyright: © 2013 Su et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από τους 100 Ταλέντα Πρόγραμμα της κινεζικής Ακαδημίας Επιστημών (Υ Li), το Πρόγραμμα Major μέλος Βασική Έρευνα Ανάπτυξης της Κίνας (Αρ 2009CB522300), το Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (No.81173076), και η Πρόσληψη Top το ταλέντο των Επιστημών και της Τεχνολογίας της επαρχίας Γιουνάν (2009CI120). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

NF-κΒ παράγοντες μεταγραφής αποτελείται από πέντε ομόλογες υπομονάδες: ΚεΙΑ (p65), RelB, CREL (rel), NF-κB1 (p50 και πρόδρομος ρ 105 του) και NF-κΒ2 (P52 και πρόδρομος P100 του) , τα οποία λειτουργούν ως διάφορα ομοδιμερή και ετεροδιμερή [1], [2]. Στην κανονική οδό του ΝΡ-κΒ, τα κύτταρα μπορούν να διεγερθούν από διάφορα ερεθίσματα, περιλαμβανομένων των δραστικών μορφών οξυγόνου, παράγοντα νέκρωσης όγκων άλφα, ιντερλευκίνη 1-β, βακτηριακών λιποπολυσακχαριτών, κλπ Κατά την ενεργοποίηση, η ανασταλτική υπομονάδα ΙκΒα φωσφορυλιώνεται από την κινάση ΙκΒ ( ΙΚΚ) σύμπλοκο, το οποίο στη συνέχεια ουβικουιτινωμένης και αποικοδομείται μέσω του μονοπατιού πρωτεασώματος, προωθώντας τη μετατόπιση του συμπλόκου ρ65 /ρ50 στον πυρήνα και ενεργοποιώντας την έκφραση καθοδικών γονιδίων [3], [4].

ΝΡ-κΒ σηματοδότηση παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της φλεγμονής, ογκογένεσης και ανάπτυξης του καρκίνου [5] – [7]. Σε μια ευρεία ποικιλία καρκίνων, συμπεριλαμβανομένων-αιματογενή κακοήθειες (όπως λευχαιμία, το λέμφωμα και πολλαπλό μυέλωμα), και συμπαγείς όγκους (όπως του πνεύμονα, του μαστού και του παγκρέατος) -NF-κΒ ενεργοποιείται επίμονα [8], [9]. Η ενεργοποίηση του NF-κΒ up-ρυθμίζει την έκφραση των αντι-αποπτωτικών γονιδίων που κωδικοποιούν Bcl-xL, ΧΙΑΡ, cIAP1 και cIAP2, καθώς και πολλαπλασιαστική γονίδια όπως κυκλίνη D1 και IL-6 [10] – [13]. δραστικότητα ΝΡ-κΒ είναι επίσης στενά συνδεδεμένο με μετάσταση όγκου και τον καρκίνο χημειο-αντίσταση. ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ επάγει την μεταγραφή των γονιδίων που εμπλέκονται στην αγγειογένεση, μια κρίσιμη διαδικασία στον σχηματισμό του όγκου και τη μετάσταση [14]. Επιπλέον, οι αναστολείς του ΝΡ-κΒ ενισχύσει την ευαισθησία των καρκίνων σε χημειοθεραπευτικούς παράγοντες, όπως paclitaxol, TNF-α και TRIAL [15] – [17]. Δεδομένης της σύνδεσης μεταξύ της NF-κΒ και τον καρκίνο, την ανάπτυξη του αναστολέα NF-κΒ κατέχει μεγάλες δυνατότητες στην καταστολή ορισμένων τύπων καρκίνου πολλαπλασιασμό, καθώς και τη βελτίωση των υφιστάμενων θεραπειών του καρκίνου [18], [19].

Maytenus hookeri Loes.

έχει χρησιμοποιηθεί ως λαϊκή θεραπεία για μεγάλο χρονικό διάστημα στη νοτιοδυτική Κίνα, λόγω της αντικαρκινικής του και αντιφλεγμονώδεις δράσεις. Προηγουμένως, μεϋτανσίνη ταυτοποιήθηκε για την αντικαρκινική δράση του παρεμβαίνοντας μικροσωληνίσκους [20], [21]. Το παράγωγο του μεϋτανσίνη, DM1, έχει χρησιμοποιηθεί σε trastuzumab emtansine (T-DM1), ενός νέου φαρμάκου που αναπτύχθηκε για τη θεραπεία του HER2-θετικό καρκίνο του μαστού [22]. Ωστόσο, τα χημικά συστατικά υπεύθυνα για τις αντικαρκινικές δραστηριότητες αυτού του φυτού αξίζουν περαιτέρω διερεύνησης.

Trichothecin (TCN) είναι απομονωμένη από την ενδοφυτικού μύκητα του

Maytenus hookeri Loes

. Προηγούμενες αναφορές μας και άλλοι απέδειξαν ότι TCN εμπλέκεται με ορισμένες δραστηριότητες κατά του όγκου, αλλά η δημιουργία προφίλ κατά του όγκου ή υποκείμενων μηχανισμών αυτών των ενεργειών λείπουν [23] – [25]. Στην παρούσα μελέτη, διαπιστώσαμε ότι TCN αναστέλλει την ανάπτυξη των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων με αναστολή ΝΡ-κΒ σηματοδότηση. Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι TCN καταστέλλει την ενεργοποίηση των ΙΚΚβ καταστέλλοντας φωσφορυλίωση του, αναστέλλει την έκφραση των γονιδίων στόχων ΝΡ-κΒ, και επάγει διακοπή του κυτταρικού κύκλου και των καρκινικών κυττάρων σε απόπτωση. Ως νέος αναστολέας της οδού NF-κΒ, υπήκοος τρίτης χώρας μπορεί να αποδειχθεί μια δυνητικά πολλά υποσχόμενων υποψήφιων φαρμάκων στην ανάπτυξη νέων θεραπευτικών του καρκίνου.

Υλικά και Μέθοδοι

τηλέφωνα Γραμμές

ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές, HepG2, Α549, PANC-1 και HL-60, ανθρώπινη εμβρυϊκή νεφρική κυτταρική γραμμή ΗΕΚ 293Τ, τα ανθρώπινα βρογχικά επιθηλιακά κυτταρική σειρά BEAS-2B και ανθρώπινου νεφρού εγγύς σωληναρίου επιθηλιακή κυτταρική σειρά HK-2 αγοράσθηκαν από την ATCC. Ανθρώπινα παχέος επιθηλιακά κυτταρική σειρά (CCD-841-con) είχε την καλοσύνη να προικισμένος από τον Δρ Λιν, Li του Ινστιτούτου Βιοχημείας και Βιολογίας Κυττάρου, Κινεζική Ακαδημία Επιστημών (Σαγκάη, Κίνα) [26]. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 5% CO

2 στους 37 ° C σε RPMI-1640, τα μέσα ενημέρωσης ΜΕΜ ή DMEM που περιείχε 10% (ν /ν) ορό εμβρύου μόσχου (HyClone, Logan, UT).

Αντιδραστήρια

Τα μονοκλωνικά αντισώματα για ΝΡ-κΒ Ρ65, PARP-1, κασπάση-8, Bcl-xL, κασπάσης-3, κυκλίνη D1, Bcl-2, survivin, φωσφο-ΙΚΚβ (Ser177), και β-ακτίνη καθώς και πολύκλωνα αντισώματα προς ΙκΒα, φωσφο-ΙκΒα (pS32 /pS36) αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology-(Santa Cruz, CA). Το πολυκλωνικό αντίσωμα ΧΙΑΡ ελήφθη από Proteintech (Chicago, IL). Το μονοκλωνικό αντίσωμα προς φωσφο-NF-κΒ ρ65 και πολύκλωνο αντίσωμα με το σύνολο ΙΚΚβ αγοράστηκαν από τη Cell Signaling Technologies (Boston, ΜΑ). ΝΡ-κΒ πλασμίδιο αναφοράς λουσιφεράσης ρ65 (PNF-κΒ-Luc) αγοράστηκε από Beyotime Ινστιτούτο Βιοτεχνολογίας (Κίνα). Το πλασμίδιο pCMV-αθλητισμό6 εισαχθεί με ανθρώπινη αλληλουχία ΚεΙΑ οδήγηση της έκφρασης του p65 ελήφθη από Thermo Scientific (Rockford, IL). Alexa Fluor 546 δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο, Lipofectamine 2000, Ζ ‘-ΕΥΤΕ ™ κιτ δοκιμασίας κινάσης και ΙΚΚβ ανασυνδυασμένη ανθρώπινη πρωτεΐνη ελήφθησαν από την Invitrogen-Life Technologies (Carlsbad, CA). Dual-Luciferase Reporter κιτ δοκιμασίας ελήφθη από την Promega (Madison, WI). Duplex siRNAs με δύο υπολείμματα θυμιδίνη (dTdT) στο 3’-άκρο της αλληλουχίας συνετέθησαν σε GenePharma (Shanghai, Κίνα). Ανασυνδυασμένος ανθρώπινος ΤΝΡ-α αγοράστηκε από την PeproTech (Rocky Hill, NJ). Εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά, όλα τα άλλα αντιδραστήρια λήφθηκαν από Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ).

Ενώσεις

υπηκόους τρίτων χωρών και άλλες ενώσεις που εξετάστηκαν είχαν εξαχθεί από

Trichothecium roseum

LZ93, μια ενδοφυτικού μύκητας απομονώθηκε από το

Maytenus hookeri Loes.

, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24] (δομές που ορίζονται στο σχήμα 1Α και το σχήμα S1 Α).

(Α) Χημική δομή της trichothecin. (Β) Cell κυτταροτοξικά αποτελέσματα του trichothecin σε διαδοχικές συγκεντρώσεις. Μετά τη θεραπεία 48 ώρες, η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας προσδιορισμούς ΜΤΤ. (Γ) αννεξίνης V-FITC ανάλυση /ΡΙ απόπτωσης σε κύτταρα κατεργασμένα με TCN για 24 ώρες. (D) HL-60, HepG2, Α549 και κύτταρα PANC-1 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με TCN για 24 ώρες και προϊόντα κυτταρικής λύσης υποβλήθηκαν σε ανάλυση κηλίδος Western με αντισώματα υποδεικνύεται. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχοι φόρτωσης. Κάθε στήλη αντιπροσωπεύει το μέσο ± SD από τριπλότυπα σε τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Δοκιμασία κυτταροτοξικότητας και IC

50 Προσδιορισμός

Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε με δοκιμασία ΜΤΤ. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις υποδεικνυόμενες ενώσεις σε συγκεντρώσεις 0,064, 0,32, 1,6, 8 και 40 μΜ σε πλάκες 96 φρεατίων. Μετά από 48 ώρες, 0,1 mg ΜΤΤ προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο, για τελική συγκέντρωση 20%. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν στους 37 ° C επί 4 ώρες και η απορρόφηση μετρήθηκε στα 595 nm με φασματοφωτομετρία. Τα IC

50 τιμές προσδιορίστηκαν με ανάλυση μη γραμμικής παλινδρόμησης χρησιμοποιώντας λογισμικό GraphPad Prism (GraphPad, Inc., San Diego, CA).

Λουσιφεράσης Reporter

ΗΕΚ 293Τ παροδικά επιμολυσμένα με ρΡΙ_-ΤΚ (Promega, Madison, WI) πλασμίδια PNF-κΒ-Luc και χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 για 4 ώρες σε 96 φρεατίων πλάκα. Τα κύτταρα στη συνέχεια προ-επωάστηκε με διάφορες συγκεντρώσεις ενώσεων για 1 ώρα, και στη συνέχεια ενεργοποιήθηκαν με 25 ng /mL TNF-α για 18 ώρες. Οι δραστικότητες της λουσιφεράσης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας την Dual-Luciferase Reporter Assay kit.

Western Blotting

Σύνολο κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν με άμεση λύση σε 2 χ Laemmli ρυθμιστικού (0.125 Μ Tris-HCl, ρΗ 6,8, 4% SDS, 20% γλυκερόλη, 10% β-μερκαπτοαιθανόλη και 0.004% κυανό βρωμοφαινόλης). Τα δείγματα στη συνέχεια κλασματώθηκαν σε 12% πηκτή ακρυλαμιδίου, μεταφέρθηκε σε μεμβράνη PVDF (Bio-Rad), και επωάστηκαν με ειδικές πρωτογενή αντισώματα που ακολουθείται από τα αντίστοιχα συζευγμένο με υπεροξειδάση δευτερογενή αντισώματα. Πρωτεΐνες ενδιαφέροντος έγιναν ορατές με ανίχνευση χημειοφωταύγειας σε mini4000 ImageQuant LAS (GE Healthcare).

ανοσοφθορισμού χρώσης

Για το πείραμα p65 μετατόπιση, HepG2 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε διαφάνειες θάλαμο για 24 ώρες και προ- επωάστηκαν με TCN στους 37 ° C για 1 ώρα, που ακολουθείται από διέγερση ΤΝΡ-α για 20 λεπτά. Για την ανίχνευση φωσφορυλίωσης ΙΚΚβ, τα κύτταρα προ-επωάστηκαν με TCN στους 37 ° C για 1 ώρα ακολουθούμενο από ΤΝΡ-α διέγερση για 10 λεπτά. Τα κύτταρα στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν σε ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα φωσφορικών με 4% παραφορμαλδεΰδη για 20 λεπτά, και στη συνέχεια κατέστησαν διαπερατά σε αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό με 0,1% Triton Χ-100. Για να παρατηρήσουμε την εντόπιση της υπομονάδας p65, τα κύτταρα επωάστηκαν με αντίσωμα αντι-ρ65 και το αντίστοιχο FITC συζευγμένο δευτερογενές αντίσωμα πριν χρώση των πυρήνων με DAPI. Για την ανίχνευση φωσφορυλίωσης ΙΚΚβ, τα κύτταρα επωάστηκαν με αντι-φωσφο-ΙΚΚβ αντίσωμα και το αντίστοιχο Alexa Fluor 546 δευτερογενές αντίσωμα. Εικόνες αργότερα παρατηρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φθορισμού (Eclipse Ti, Nikon).

κυτταρικής απόπτωσης Δοκιμασία

κυτταρικής απόπτωσης αναλύθηκε με χρήση του κιτ Annexin V-FITC /PI απόπτωση (BD Biosciences, Franklin Lakes , NJ) σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων σε πυκνότητα 1,2 × 10

6 κύτταρα /φρεάτιο. Μετά από 24 ώρες της ένωσης θεραπείας στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και μετά πλύθηκαν δύο φορές με ψυχρό PBS, και στη συνέχεια επαναιωρήθηκαν σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης που περιέχει αννεξίνης V-FITC και ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ). Μετά από επώαση για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι, η ένταση φθορισμού μετρήθηκε χρησιμοποιώντας κυτταρόμετρο ροής FACSCalibur (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ).

Κύκλου Κυττάρου Ανάλυση

HepG2 κύτταρα ( 5 × 10

5cells /φρεάτιο σε πλάκες 12 φρεατίων) επωάστηκαν με TCN για υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία (8, 16 και 24 ώρες) και οι συγκεντρώσεις (1.25, 2.5 και 5 μΜ). Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και πλύθηκαν δύο φορές με PBS και σταθεροποιήθηκαν με 70% όλη τη νύκτα αιθανόλη. Σταθερή κύτταρα πλύθηκαν με PBS, και στη συνέχεια επωάστηκαν με 20 μλ RNase Α (1 mg /mL) για 30 λεπτά και χρωματίστηκαν με διάλυμα ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ) (/mL τελική συγκέντρωση 50 μg) στο σκοτάδι για 1 h. Η ένταση φθορισμού αναλύθηκε με ροή FACSCalibur κυτταρόμετρο (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Τα ποσοστά των κυττάρων που κατανέμεται σε διαφορετικές φάσεις του κυτταρικού κύκλου προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας FlowJo 7.6.1.

Η υπερέκφραση του ΙΚΚβ CA

Το κατασκεύασμα οδήγηση της έκφρασης ενός ιδιοσυστατικά ενεργό ΙΚΚβ (S177E, S181E) (ΙΚΚβ CA) λήφθηκε από Addgene (Catalog No.11105) [27]. κύτταρα HepG2 επιμολύνθηκαν με τα πλασμίδια χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000. Περίπου 12 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με TCN για επιπλέον 24 ώρες.

παρεμβολή RNA

κύτταρα HepG2 επιμολύνθηκαν παροδικά με ένα περιπλεγμένο έλεγχο siRNA (5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT -3 ‘) και ΙΚΚβ-siRNA (5′-GGUGGAAGAGGUGGUGAGCTT -3’) [28], αντίστοιχα, σε μία συγκέντρωση 150 pmol πιάτων /60 mm με χρήση Lipofectamine 2000. αργότερα προστέθηκε Η προκύπτουσα ένωση δοκιμάστηκε στα επιμολυσμένα κύτταρα 48 ώρες μετά την επιμόλυνση.

ΙΚΚβ κινάσης Δραστηριότητα δοκιμασία

Η δοκιμασία κινάσης ΙΚΚβ διεξήχθη με κιτ Ζ ‘-ΕΥΤΕ δοκιμασία κινάσης ™ ακόλουθα πρωτόκολλα του κατασκευαστή. Εν συντομία, ανασυνδυασμένη ανθρώπινη πρωτεΐνες ΙΚΚβ επωάστηκαν με το μίγμα της αντίδρασης κινάσης με αυξανόμενες ποσότητες TCN ή σταυροσπορίνη, έναν αναστολέα κινάσης, για 1 ώρα. Η αντίδραση στη συνέχεια διακόπηκε με το αντιδραστήριο στάση και ο φθορισμός ανιχνεύθηκε με διέγερση στα 400 nm και εκπομπές σε 445 nm και 520 nm χρησιμοποιώντας το Plate Reader EnVision Πολύτροπη.

Αποτελέσματα

TCN αναστέλλει τον κυτταρικό η ανάπτυξη και επάγει την απόπτωση σε ΝΡ-κΒ συστατικά ενεργοποιημένη Cancer Cells

Ερευνήσαμε την αντικαρκινική δράση του TCN με δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας ΜΤΤ σε τέσσερις κυτταρικές σειρές καρκίνου που φιλοξενούν συστατικώς ενεργοποιημένο ΝΡ-κΒ [29] – [32]. Σε όλες τις εξετασθείσες κυτταρικές γραμμές, TCN παρουσίασαν εμφανή αναστολή της ανάπτυξης (Σχήμα 1Β). Το IC

50 τιμές σε HL-60, HepG2, Α549 και PANC-1 κύτταρα ήταν 0.18, 0.82, 0.39, και 0.28 μΜ, αντίστοιχα. Αννεξίνη V-FITC χρώση /ΡΙ αναλύθηκε περαιτέρω για την κυτταρική απόπτωση με κυτταρομετρία ροής. Μετά την επεξεργασία με 5 μΜ TCN για 24 ώρες, η απόπτωση των κυττάρων σε HL-60, HepG2, Α549 και PANC-1 κύτταρα σημαντικά αυξημένα σε 61,13%, 44,03%, 34,93% και 24,47%, αντίστοιχα. Εν τω μεταξύ, απόπτωση σε ανθρώπινα φυσιολογικές κυτταρικές σειρές BEAS-2B, ΗΚ-2 και CCD-841-con δεν είχαν επηρεαστεί από τη θεραπεία TCN, ακόμη και στην υψηλότερη συγκέντρωση 5 μΜ, προτείνοντας TCN κατέχει εκλεκτικότητα έναντι καρκινικών κυττάρων (Σχήμα 1C). Η ανάλυση στυπώματος Western κατέδειξε επίσης ότι TCN επάγεται σημαντικά την ενεργοποίηση της κασπάσης-8 και κασπάσης-3, όπως επίσης και τη διάσπαση της PARP-1 στις τέσσερις κυτταρικές σειρές καρκίνου. Το επίπεδο της πρωτεΐνης Bcl-2, ένας ρυθμιστής κλειδί της εγγενούς αποπτωτικό μονοπάτι, επίσης κάτω ρυθμισμένα με κατεργασία TCN. Επιπλέον, το επίπεδο της survivin, ένα αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη, μειώθηκε δραστικά σε TCN επεξεργασμένα κύτταρα, ειδικά σε κύτταρα HL-60 και κύτταρα HepG2 (σχήμα 1Δ).

TCN Αναστέλλει ΝΡ-κΒ Σηματοδοσίας και επάγει κυτταρικού κύκλου σύλληψης στο G0 /G1

Η επίδραση της TCN επί ΝΡ-κΒ σηματοδότηση εξετάσθηκε σε κύτταρα ΗΕΚ 293Τ παροδικά επιμολυσμένα με ένα ρεπόρτερ ΝΡ-κΒ (PNF-κΒ-Luc) .Η έκφραση γονιδίου ανταποκριτή ήταν σαφώς ενεργοποιούνται από ΤΝΡ -α, η οποία αναστέλλεται αποτελεσματικά από TCN (Σχήμα 2Α). Για να ελέγξει εάν TCN αναστέλλει την ενδογενή ΝΡ-κΒ σε καρκινικά κύτταρα, μελετήσαμε την έκφραση των γονιδίων στόχων ΝΡ-κΒ στα τέσσερα ΝΡ-κΒ ενεργοποιείται κυτταρικές σειρές καρκίνου αντιμετωπίζονται με TCN. Τα επίπεδα πρωτεΐνης ρ65, ΧΙΑΡ, κυκλίνη D1, και Bcl-xL ήταν σαφώς κάτω-ρυθμίζονται σε TCN επεξεργασμένα κύτταρα (Σχήμα 2Β). Από Κυκλίνη D1 απαιτείται για την εξέλιξη G1 /S του κυτταρικού κύκλου, διερευνήσαμε την επίδραση της TCN για τη σύλληψη κυτταρικού κύκλου. κύτταρα HepG2 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 2,5 μΜ υπηκόους τρίτων χωρών. Εμφανή G0 /G1 διακοπή του κυτταρικού κύκλου ανιχνεύεται ήδη από 8h. Ωστόσο, με παρατεταμένη της θεραπείας, παρατηρήθηκαν αύξηση των κυττάρων του σταδίου Sub-G1, υποδεικνύοντας την απόπτωση κυττάρων που προκαλείται από TCN (Σχήμα 2C).

(Α) κύτταρα ΗΕΚ 293Τ επιμολύνθηκαν παροδικά με PNF-κB- Luc πλασμίδια ακολουθούμενη από κατεργασία με TCN για 1 ώρα πριν να διεγείρονται με 25 ng /mL TNF-α για 18 ώρες. (Β) Κυτταρολύματα fromcells κατεργάζεται με TCN για 24 ώρες υποβλήθηκαν σε ανάλυση κηλίδος western με p65, ΧΙΑΡ, κυκλίνη D1 και αντισώματα Bcl-XL. (Γ) Κύτταρα HepG2 υποβλήθηκαν σε αγωγή με 2,5 μΜ TCN για 8, 16 και 24 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και υποβλήθηκαν σε ανάλυση κυτταρικού κύκλου. Το ποσοστό των κυττάρων των διαφόρων φάσεων του κυτταρικού κύκλου αναλύθηκε με FlowJo. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν ανεξάρτητα, τα αποτελέσματα αναφέρονται ως μέσοι όροι και τυπικές αποκλίσεις. Η στατιστική σημαντικότητα αναλύθηκε από την One-way ANOVA, ** p & lt?. 0.01

Η

Ερευνήσαμε περαιτέρω τις επιπτώσεις της trichothecolone, ένα παράγωγο της τους υπηκόους τρίτων χωρών, για την ανάπτυξη των κυττάρων και τη δραστηριότητα του NF-κΒ. Trichothecolone είναι ένας άλλος μεταβολίτης απομονώνεται από ενδοφυτικού μύκητα του

Maytenus hookeri Loes.

, Η οποία μοιράζεται την ίδια μητρική πυρήνα με υπηκόους τρίτων χωρών, με την αξιοσημείωτη εξαίρεση ενός διαφορετικού υποκαταστάτη στην 4-ΟΗ [24]. Όπως TCN, trichothecolone ανέστειλε επίσης την ανάπτυξη των κυττάρων και τη δραστηριότητα ανταποκριτή ΝΡ-κΒ (Σχήμα S1), αλλά και οι δύο δραστηριότητες είναι πολύ ασθενέστερη, γεγονός που υποδηλώνει ότι ο υποκαταστάτης στην 4-ΟΗ αυτής της τάξης των ενώσεων είναι κρίσιμης σημασίας για τις βιολογικές τους δραστηριότητες.

TCN Αναστέλλει τη φωσφορυλίωση και την υποβάθμιση των ΙκΒα και μπλοκ p65 πυρηνική μετατόπιση

Ελέγξαμε την επίδραση τους υπηκόους τρίτων χωρών για την πυρηνική μετατόπιση του p65, ένα σήμα κατατεθέν της ενεργοποίησης του NF-κΒ σηματοδότηση. θεραπεία TNF-α που προκαλείται από την μετατόπιση του ΝΡ-κΒ από το κυτόπλασμα προς τον πυρήνα, και TCN μπλοκάρει σημαντικά τη διαδικασία μετατόπισης σε κύτταρα HepG2 (σχήμα 3Α). Η υπερέκφραση του p65 αντιστραφεί σημαντικά την ανασταλτική δράση της TCN στην μεταγραφή του ανταποκριτή ΝΡ-κΒ (Σχήμα 3Β). Στη συνέχεια εξετάσαμε το αποτέλεσμα της TCN επί φωσφορυλίωση και αποικοδόμηση ΙκΒα. TCN ανέστειλε ΤΝΡ-α επαγόμενη φωσφορυλίωση ΙκΒα με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο και αξιοσημείωτα μπλοκάρει την αποικοδόμηση της ΙκΒα. Πιο καυστικά, βρήκαμε ότι TCN ανέστειλε φωσφορυλίωση ρ65 σε Ser536 (Σχήμα 3C), η οποία συμβάλλει στην υποβάθμιση της ΙκΒα και την ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ σηματοδότηση [33], [34].

(Α) HepG2 κύτταρα προκατεργάστηκαν με 2.5 μΜ TCN διεγέρθηκαν με 25 ng /mL TNF-α για 20 λεπτά και σε επεξεργασία για ανοσοχρώση με αντίσωμα αντι-ρ65. Οι πυρήνες των κυττάρων βάφτηκαν με DAPI (μπλε) και ρ65 οπτικοποιήθηκε με πράσινο φθορισμό. (Β) κύτταρα ΗΕΚ293Τ διαμολύνθηκαν παροδικά με PNF-κΒ-Luc και πλασμίδια έκφρασης ρ65 που ακολουθείται από προεπεξεργασία των 0,3 μΜ TCN και διέγερση με 25 ng /mL TNF-α. δραστηριότητα Reporter μετρήθηκε στη συνέχεια. (Γ) HepG2 κύτταρα προκατεργάστηκαν με TCN συλλέχθηκαν μετά από διέγερση με 25 ng /mL TNF-α για 10 λεπτά. Τα κυτταρολύματα στη συνέχεια αναλύθηκαν με στύπωμα Western χρησιμοποιώντας αντισώματα έναντι φωσφο-ΙκΒα, φωσφο-ρ65 και ΙκΒα. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν ανεξάρτητα και τα αποτελέσματα αναφέρονται ως μέσοι όροι και τυπικές αποκλίσεις. Η στατιστική ανάλυση ήταν εκτελέσει με t-test του Student, * ρ & lt?. 0.05

Η

TCN αναστέλλει την φωσφορυλίωση της ΙΚΚβ επάγεται από τον TNF-α

Όπως ΙκΒα και p65 είναι και τα δύο υποστρώματα της ΙΚΚβ κινάση, η οποία ενεργοποιείται από υποβάλλονται σε φωσφορυλίωση (Ser 177 και Ser 181) και εν συνεχεία φωσφορυλιώνει ΙκΒα [35], [36], ελέγξαμε τη φωσφορυλίωση της ΙΚΚβ σε κατεργασμένα HepG2 κύτταρα ΤΝΡ-α με ανοσοφθορισμό και ανάλυση στυπώματος western. Βρήκαμε ότι το επίπεδο της φωσφορυλιωμένης ΙΚΚβ μειώθηκε δραματικά μετά τη θεραπεία τους υπηκόους τρίτων χωρών, με το συνολικό επίπεδο της πρωτεΐνης ΙΚΚβ αναλλοίωτα (Εικόνα 4Α και Β). Για να προσδιοριστεί αν TCN παρεμβαίνει με τη δράση της κινάσης ΙΚΚβ άμεσα, μία δοκιμασία δραστικότητας κινάσης διεξήχθη χρησιμοποιώντας καθαρισμένο ανθρώπινο ΙΚΚβ ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη χρησιμοποιώντας σταυροσπορίνη, έναν ισχυρό αναστολέα της κινάσης, ως θετικός μάρτυρας. Το αποτέλεσμα έδειξε ότι TCN δεν επηρέασε την ενεργότητα κινάσης της ανασυνδυασμένης ΙΚΚβ (Σχήμα 4C). Αυτά τα δεδομένα κατέδειξαν ότι TCN αναστέλλει ΝΡ-κΒ σηματοδότηση καταστέλλοντας την ενεργοποίηση των ΙΚΚβ μέσω αποκλεισμού φωσφορυλίωσης του.

φωσφορυλίωσης (Α) ΙΚΚβ ανιχνεύθηκε με φωσφο-ΙΚΚβ αντίσωμα σε κύτταρα HepG2 διεγείρονται με 25 ng /mL ΤΝΡ α για 10 λεπτά. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν, κατέστησαν διαπερατά, και εξετάστηκαν με μικροσκόπιο φθορισμού. (Β) ανάλυση κηλίδας Western που δείχνει την αναστολή της φωσφορυλίωσης ΙΚΚβ σε κύτταρα επεξεργασμένα με 2.5 μΜ TCN. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν μετά διεγέρθηκαν με 25 ng /mL TNF-α για 10 λεπτά. (Γ) ΙΚΚβ δραστικότητα κινάσης αναλύθηκε με ανασυνδυασμένο ΙΚΚβ χρησιμοποιώντας το κιτ δοκιμασίας κινάσης Ζ ‘-ΕΥΤΕ ™. Ο φθορισμός ανιχνεύθηκε στα 400 nm για τα μήκη κύματος διέγερσης και 445 nm και 520 nm για τα μήκη κύματος εκπομπής. Τα πειράματα έγιναν ανεξάρτητα εις τριπλούν και τα αποτελέσματα αναφέρονται ως μέσες τιμές και τυπικές αποκλίσεις.

Η

TCN Induced Cancer Cell απόπτωση μέσω της αναστολής της ΙΚΚβ φωσφορυλίωση

υπηκόους τρίτων χωρών που προκαλείται από τον κυτταρικό θάνατο ερευνήθηκε σε κύτταρα που υπερεκφράζουν ιδιοσυστατικά ενεργή (CA) μορφή ΙΚΚβ [27], [28]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Α, η υπερέκφραση του ΙΚΚβ CA σε κύτταρα HepG2 επαρκώς ενεργοποιημένα ΝΡ-κΒ σηματοδότηση σε δοκιμασία λουσιφεράσης δραστηριότητα. επεξεργασία TCN ανταγωνίστηκε με τον TNF-α στην ενεργοποίηση του NF-κΒ σηματοδότηση, ενώ ΙΚΚβ CA επιμόλυνση αντιστραφεί αποτελεσματικά την ανασταλτική δράση της υπηκόους τρίτων χωρών. Σταθερά, η υπερέκφραση του ΙΚΚβ CA ματαιώνεται η επαγωγή απόπτωσης από TCN σε κύτταρα HepG2 (σχήμα 5Β). Εν τω μεταξύ, η ανάλυση στυπώματος western έδειξε την απενεργοποίηση της κασπάσης-3, PARP-1 και προς τα πάνω ρύθμιση του survivin με ΙΚΚβ CA (Σχήμα 5C).

(Α) κύτταρα ΗΕΚ 293Τ επιμολύνθηκαν παροδικά με ΙΚΚβ CA ή κενό φορέα για 12 ώρες, στη συνέχεια προκατεργασία με 2,5 μΜ TCN και διεγείρονται με 25 ng /mL TNF-α για 18 ώρες. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε ανάλυση της δραστηριότητας της λουσιφεράσης. (Β) κύτταρα HepG2 επιμολύνθηκαν παροδικά με ΙΚΚβ CA ή κενό φορέα για 12 ώρες, και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 2,5 μΜ TCN για 24 ώρες. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε ανάλυση απόπτωσης. (C) κύτταρα HepG2 επιμολύνθηκαν με ΙΚΚβ CA ή κενό φορέα για 12 ώρες, και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 2,5 μΜ TCN για 24 ώρες. Τα κύτταρα υποβάλλονται σε ανάλυση κηλίδος Western για την έκφραση υποδεικνύεται πρωτεϊνών. (D) Κύτταρα HepG2 επιμολύνθηκαν παροδικά με ένα κωδικοποιημένο siRNA ή ΙΚΚβ-siRNA για 48 ώρες, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 2,5 μΜ TCN για 24 ώρες και υποβλήθηκαν σε ανάλυση απόπτωσης. (Ε) κύτταρα HepG2 παροδικά επιμολυσμένα με περιπλεγμένο siRNA ή ΙΚΚβ-siRNA υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 2,5 μΜ TCN για 24 ώρες. Τα κυτταρολύματα συλλέχθηκαν και υποβλήθηκαν σε ανάλυση κηλίδος Western με τις καθορισμένες αντισώματα. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν ανεξάρτητα και τα αποτελέσματα αναφέρονται ως μέσοι όροι και τυπικές αποκλίσεις. Η στατιστική ανάλυση έγινε εκτελέσει με t-test του Student, * ρ & lt?. 0.05

Η

Στη συνέχεια, ελέγξαμε την επίδραση της ΙΚΚβ νοκ ντάουν στην αποπτωτική δραστηριότητα της υπηκόους τρίτων χωρών. Σε σύγκριση με τη θεραπεία με TCN μόνο, knockdown του ΙΚΚβ με siRNA ευαισθητοποιημένα HepG2 κύτταρα να TCN επαγόμενη απόπτωση, με την αποπτωτική αναλογία αυξάνεται σε 43,11% (18,17% σε αγωγή TCN μόνο) (Εικόνα 5D). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Ε, η έκφραση της ΙΚΚβ σε HepG2 εν μέρει μειώθηκε κατά την αγωγή της ΙΚΚβ siRNA. Συνεπής με την αυξημένη διέγερση των κυττάρων απόπτωσης, ρύθμιση προς τα κάτω των αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών (survivin, ΧΙΑΡ και Bcl-2) με TCN ενισχύθηκε σε κύτταρα knockdown ΙΚΚβ, και τη διάσπαση της κασπάσης-3 αυξήθηκε επίσης (Σχήμα 5Ε) . Εν τω μεταξύ, η επιμόλυνση με έναν έλεγχο περιπλεγμένο siRNA δεν είχε καμία επίδραση στην απόκριση των κυττάρων HepG2 σε θεραπεία TCN (Σχήμα 5D, 5Ε).

Συζήτηση

Δεδομένης της συνάφειας των ΝΡ-κΒ και καρκίνου, η ανάπτυξη του αναστολέα του ΝΡ-κΒ συγκρατεί μεγάλες δυνατότητες στην καταστολή ορισμένων τύπων καρκίνου του πολλαπλασιασμού καθώς και στη βελτίωση υπάρχουσες θεραπείες του καρκίνου. Κατά τις τελευταίες δεκαετίες, μια διαφορετική ποικιλία φυσικών και συνθετικών ενώσεων έχουν βρεθεί ικανά να καταστείλουν ΝΡ-κΒ σηματοδότηση, αλλά μέσω μιας ποικιλίας διαφορετικών μηχανισμών. PS-341, ένας αναστολέας πρωτεασώματος, υπήρξε μια πρώτης γραμμής φάρμακο που χρησιμοποιείται στη θεραπεία του πολλαπλού μυελώματος για πάνω από μια δεκαετία, το οποίο λειτουργεί με αναστολή της εγγενούς δραστικότητας του ΝΡ-κΒ από το κλείδωμα ΙκΒα αποικοδόμηση [37]. Εν τω μεταξύ, Eriocalyxin Β, ent-Kauranoid απομονώθηκε από

Isodon eriocalyx

, αναστέλλει την ενεργοποίηση ΝΡ-κΒ με αλληλεπίδραση με τη σύνδεση των δύο ρ65 και ρ50 στο στοιχείο απόκρισης [38].

ΙΚΚβ διαδραματίζει κεντρικό ρόλο στην ενεργοποίηση και των δύο κανονικών και μη κανονικών οδό σηματοδότησης ΝΡ-κΒ. Κατά την ενεργοποίηση, NF-κΒ σηματοδότηση οδηγεί σε αυτόματη polyubiquitination του παράγοντα που σχετίζεται υποδοχέα του παράγοντα νέκρωσης των όγκων 6 (TRAF6). Η ουβικουιτινωμένης TRAF6 τότε στρατολογεί αυξητικού παράγοντα μεταμόρφωσης-β-ενεργοποιημένη κινάση 1 (TAK1) και την κινάση ΙκΒ (ΙΚΚ) σύμπλοκο, το οποίο αποτελείται από δύο καταλυτικές υπομονάδες, ΙΚΚ1 (ΙΚΚα) και ΙΚΚ2 (ΙΚΚβ), και μία ρυθμιστική υπομονάδα, NEMO (NF-κΒ ουσιαστικό διαμορφωτή, IKKγ), έτσι ώστε TAK1 μπορεί να φωσφορυλιώσει και να ενεργοποιήσει ΙΚΚβ. Η αυτο-φωσφορυλίωση επίσης αναφέρθηκε ότι εμπλέκεται στην ενεργοποίηση του ΙΚΚβ [39], [40]. Λόγω του ρόλου που παρατηρείται συχνά ότι η ενεργοποίηση του ΙΚΚβ παίζει στην παραγωγή καρκίνο, τον πολλαπλασιασμό και τη μετάσταση, ΙΚΚβ έχει θεωρηθεί ένα υποσχόμενο στόχο φάρμακο για θεραπείες του καρκίνου [41], [42]. Μια FDA ενέκρινε ορφανό φάρμακο για τη θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος, CDDO-Me, επίσης γνωστή ως RTA 402, μπλοκάρει το μονοπάτι NF-κΒ μέσω άμεσης αναστολής της ΙΚΚβ σε Cys-179 [43].

Στην παρούσα μελέτη, περιγράψαμε TCN, ενός ισχυρού αναστολέα του ΝΡ-κΒ, μπλοκάρεται η ενεργοποίηση ΙΚΚβ καταστέλλοντας φωσφορυλίωση της και στη συνέχεια ανέστειλε την έκφραση των γονιδίων στόχων του NF-κΒ οδό σηματοδότησης, συμπεριλαμβανομένου του ΧΙΑΡ, κυκλίνη D1 και Bcl-xL, τα οποία ρυθμίζουν την κυτταρική επιβίωση και κυτταρική πολλαπλασιασμός. Ως αποτέλεσμα, TCN επαγόμενη απόπτωση των κυττάρων και διακοπή κύκλου κυττάρου σε ΝΡ-κΒ συστατικώς ενεργοποιημένα ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα, χωρίς να επηρεάζει τα φυσιολογικά κύτταρα με χαμηλή βασική δραστηριότητα του ΝΡ-κΒ (Σχήμα S2). Λαμβάνοντας υπόψη τις σύνθετες εκδηλώσεις συνδέει με την ενεργοποίηση της ΙΚΚβ, οι ακριβείς μηχανισμοί πώς TCN μειώνει την φωσφορυλίωση της ΙΚΚβ χρήζουν περαιτέρω διερεύνησης.

Οι μεταβολίτες της ενδοφυτικού αποικισμός των μυκήτων στο φυτικό φάρμακο έχει βρεθεί να έχουν διάφορες βιοδραστικότητες [44 ], [45]. Οι Anticancer παράγοντες πολλών φυτών ξενιστών βρέθηκαν σε μεταβολίτες των ενδοφυτικού μυκήτων, όπως η ταξόλη, το οποίο απομονώθηκε από ενδοφυτικό μύκητα

Taxomyces Andreanae

σε

Taxus brevifolia

[46]. Στην παρούσα μελέτη, TCN, μαζί με 6β-hydroxyrosenonolactone, trichothecolone, roseocardin και roseotoxin Β απομονώθηκαν από ενδοφυτικό μύκητα LZ93 του

Maytenus hookeri Loes.

Και δοκιμάστηκαν για αντικαρκινική δραστηριότητές τους (Σχήμα S1). Μεταξύ των ενώσεων που απομονώθηκαν, TCN αποδείχθηκε ότι είναι η πιο ισχυρή. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι οι ιδιότητες των υπηκόων τρίτων χωρών που θα μπορούσε να είναι ένας από τους πιθανούς μηχανισμούς που διέπουν τις δραστηριότητες της αποτελεσματικότητας και αντι-καρκίνου του

Maytenus hookeri Loes.

Η

Taken στο σύνολό τους, τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι υπήκοοι τρίτων χωρών, ως ένας ισχυρός αναστολέας του NF-κΒ σηματοδότηση, έχει πολλά υποσχόμενη θεραπευτική αξία για τη θεραπεία του καρκίνου και αξίζει περαιτέρω διερεύνηση.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1. Βιο-δραστηριότητες των ενώσεων που απομονώνονται από ενδοφυτικού μύκητα LZ93 του

Maytenus hookeri Loes.

Η (Α) Χημικές δομές των 6β-hydroxyrosenonolactone (6β-HRL), trichothecolone, roseocardin και roseotoxin Β (Β) Τα κυτταροτοξικά επιδράσεις που προκαλούνται από trichothecin, trichothecolone, 6β-hydroxyrosenonolactone, roseocardin και roseotoxin Β σε 40 μΜ σε HL-60, HepG2, Α549 και κύτταρα PANC-1 μετά από αγωγή 48 ώρες. (C) Επίδραση trichothecin, trichothecolone, 6β-hydroxyrosenonolactone, roseocardin και roseotoxin Β επί ΤΝΡ-α επαγόμενη ενεργοποίηση ΝΡ-κΒ. κύτταρα ΗΕΚ 293Τ επιμολύνθηκαν παροδικά με πλασμίδια που ακολουθείται από προθεραπεία με DMSO, ή 0,3, 0,6 PNF-κΒ-Luc και ρΡΙ_-ΤΚ, 1,25 μΜ TCN, ή διαδοχικές συγκεντρώσεις 2.5, 5, 10 μΜ trichothecolone, 6β-hydroxyrosenonolactone, roseocardin ή roseotoxin Β για 1 ώρα πριν από τη διέγερση 25 ng /mL TNF-α για 18 ώρες. Σταδιακά πιο σκούρα σκίαση κάθε γραμμή υποδεικνύει υψηλότερες συγκεντρώσεις

doi:. 10.1371 /journal.pone.0071333.s001

(JPG)

Εικόνα S2. Σχηματικό διάγραμμα του TCN αναστολής της ΙΚΚβ και η οδός ΝΡ-κΒ.

Μετά διεγείρεται από ΤΝΡ-α, ένα πάνελ κινασών θα υποβληθούν ουβικιτινίωση και φωσφορυλίωση, η οποία οδηγεί σε ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ μέσω ΙΚΚβ φαρμακευτική υποβάθμιση των ΙκΒα και μετατόπιση του p65. Υπήκοος τρίτης χώρας αναστέλλει τη φωσφορυλίωση της ΙΚΚβ, το οποίο με τη σειρά του οδηγεί σε απόπτωση και αναστολή της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων

doi:. 10.1371 /journal.pone.0071333.s002

(ΔΕΘ)