Αφηρημένο

Η χημειοθεραπεία και η αντι-ορμονικές θεραπείες είναι οι πιο κοινές θεραπείες για μη-όργανο-περιορισμένο καρκίνο του προστάτη (PCA) . Ωστόσο, η αποτελεσματικότητα αυτών των θεραπειών είναι περιορισμένη, απαιτώντας έτσι την ανάπτυξη εναλλακτικών προσεγγίσεων. Η παρούσα μελέτη επικεντρώθηκε στην ανάλυση του ρόλου της pterostilbene (pter) -isothiocyanate (ITC) συζυγούς – μια νέα κατηγορία των υβριδικών ένωση συντίθεται εκχωρώντας ένα τμήμα της ITC σχετικά με ραχοκοκαλιά pter – στη ρύθμιση των λειτουργιών του υποδοχέα ανδρογόνων (AR), προκαλώντας έτσι την απόπτωση των κυττάρων του προστάτη. Το συζυγές μόριο προκάλεσε 50% αναστολή της ανάπτυξης (IC

50) στους 40 ± 1,12 και 45 ± 1,50 μΜ σε AR θετικό (LNCaP) και αρνητικό (PC-3) κύτταρα, αντιστοίχως. Η μειωμένη πολλαπλασιασμός των PC-3 όπως επίσης και κύτταρα LNCaP με συζυγούς συσχετίζεται με τη συσσώρευση των κυττάρων στο G2 /M φάση και επαγωγή των εξαρτώμενων κασπάσης απόπτωση. Τόσο PI3K /Akt και μονοπάτια /ERK MAPK έπαιξε σημαντικό και διαφορικό ρόλο στην συζυγούς-επαγόμενη απόπτωση αυτών των κυττάρων του προστάτη. Ενώ ο αναστολέας της Akt (A6730) ή RNA μικρές παρεμβολές Akt-ειδική (siRNA) ευαισθητοποιήθηκαν σε μεγάλο βαθμό PC-3 κύτταρα να συζευχθεί επαγόμενη απόπτωση, αντιθέτως, η απόπτωση επιταχύνθηκε με αναστολή της ERK (με PD98059 ή ERK siRNA) σε περίπτωση των κυττάρων LNCaP, τόσο τελικά με αποκορύφωμα την έκφραση της πρωτεΐνης που διασπάται κασπάσης-3. Επιπλέον, αντι-ανδρογονική δραστικότητα του συζυγούς διαμεσολαβείται από μειωμένη έκφραση του AR και συν-ενεργοποιητών του (SRC-1, GRIP-1), παρεμβαίνοντας έτσι στις αλληλεπιδράσεις τους με AR. Όλα αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι συζυγούς προκαλούμενη αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και επαγωγή απόπτωσης εν μέρει προκαλούνται από την προς τα κάτω ρύθμιση του AR, Akt, και σηματοδότηση ERK. Οι παρατηρήσεις αυτές παρέχουν μια λογική για την επινόηση νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων για τη θεραπεία του προστάτη με τη χρήση συζυγούς μόνο του ή σε συνδυασμό με άλλα θεραπευτικά

Παράθεση:. Nikhil K, Sharan S, Chakraborty Α, Roy P (2014) Pterostilbene-σύμπλοκο ισοθειοκυανικής καταστέλλει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του προστάτη Ανεξάρτητα από ανδρογόνων υποδοχέων Κατάσταση. PLoS ONE 9 (4): e93335. doi: 10.1371 /journal.pone.0093335

Επιμέλεια: Chih-Pin Chuu, Εθνική Έρευνα Υγείας Ινστιτούτα, την Ταϊβάν

Ελήφθη: 30 Σεπτεμβρίου του 2013? Αποδεκτές: 3 Μάρτη του 2014? Δημοσιεύθηκε: 3 Απριλίου, 2014

Copyright: © 2014 Nikhil et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από ερευνητικές επιχορηγήσεις από το Συμβούλιο Επιστημονικής και Βιομηχανικής έρευνας και Υπουργείο Ανθρωπίνων Πόρων και Ανάπτυξης (MHRD), η κυβέρνηση της Ινδίας ως ερευνητικές υποτροφίες σε kN και άσκησης έργου σε PR, αντίστοιχα. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Περαιτέρω PR ήθελα επίσης να δεξαμενή άλλους φορείς χρηματοδότησης, Τμήμα Βιοτεχνολογίας (BT /PR14836 /AAQ /01/455/2010) και του Τμήματος Επιστήμης και Τεχνολογίας (SR /SO /HS-39/2009) για την οικονομική τους υποστήριξη. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Παρά τις σημαντικές προσπάθειες που καταβάλλονται προς την εκτομή των καρκίνων, του καρκίνου του προστάτη (PCA) είναι η πιο συχνά διαγιγνώσκεται καρκίνος και η δεύτερη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο μεταξύ των ανδρών στις Ηνωμένες Πολιτείες, με κατ ‘εκτίμηση 217.730 νέες περιπτώσεις και 32.050 θανάτους το 2010 [1]. Αν και η αιτιολογία της προστάτη παραμένει άγνωστη, αυξημένα επίπεδα των στεροειδών ορμονών, όπως τα ανδρογόνα και οιστρογόνα, καθώς και αυξητικούς παράγοντες, όπως η ινσουλίνη αυξητικός παράγοντας 1, θεωρούνται ότι είναι σημαντικοί παράγοντες κινδύνου [2] – [4]. Θεραπεία απόσπασης ανδρογόνων έχει μια πρώτη απάντηση, αλλά οι περισσότεροι ασθενείς με προχωρημένο προστάτη τελικά αναπτύσσουν αντίσταση σε αυτή τη θεραπεία και εξελίσσεται σε ορμόνες ανθεκτικό καρκίνο προστάτη (HRPC), για τα οποία δεν υπάρχει θεραπευτική αγωγή [5]. Η έλλειψη αποτελεσματικών θεραπευτικών επιλογών για τη διαχείριση των HRPC ενισχύουν την ανάγκη να αναπτυχθούν νέες ενώσεις που δρουν μεμονωμένα ή σε συνδυασμό.

ανδρογόνων και AR λειτουργίες παίζουν ένα κεντρικό ρόλο στην καρκινογένεση και της εξέλιξης του προστάτη, καθώς επίσης και σε φυσιολογικά προστάτη ανάπτυξη [6], [7]. Οι δράσεις των ανδρογόνων, όπως η τεστοστερόνη και διυδροτεστοστερόνη (DHT) που προκαλείται από AR, η οποία είναι μέλος του πυρηνικού υποδοχέα σούπερ οικογένεια παραγόντων μεταγραφής εξαρτώμενη από συνδετήρα [8]. Εκτός από την ανδρογόνων, δραστικότητα AR μπορεί επίσης να τροποποιούνται με μόρια σε άλλες οδούς κυτταρικής σηματοδότησης. Μέχρι ρύθμιση του υποδοχέα επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) και επακόλουθες αυξήσεις σε εξωκυτταρικό ρυθμιζόμενη κινάση (ERK) και σηματοδότηση Akt, εμπλέκονται στην πρόοδο του προστάτη [9]. Akt ρυθμίζει το σηματοδοτικό μονοπάτι AR με φωσφορυλίωση ή /και μεταγραφική ρύθμιση της AR. Akt φωσφορυλιώνει AR σε σερίνες 210/213 και 790/791 και τελικά διαενεργοποιεί δραστηριότητά της. Μια προηγούμενη μελέτη έδειξε ότι η αναστολή της Akt μονοπατιού καταργεί την δραστικότητα HER-2 /neu-επαγόμενη σηματοδότηση AR [10]. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι Akt είναι ένας ενεργοποιητής της AR που απαιτούνται για ανδρογόνου ανεξάρτητη επιβίωση και ανάπτυξη των κυττάρων του προστάτη. Η έρευνα έχει δείξει ότι η αναστολή μίας ή και των δύο από αυτά τα μονοπάτια έχει μια πιο βαθιά επίδραση στην ανάπτυξη των κυττάρων του όγκου και του θανάτου, που τους καθιστά ελκυστικές συνδυαστική στόχους σε θεραπεία PCa. Ως εκ τούτου, AR, Akt, και ERK θα μπορούσαν να είναι πιθανοί στόχοι για τη θεραπεία της ΣΕΣΣ.

βιοενεργά συστατικά τροφίμων, ιδίως, όλο και περισσότερο αξιολογούνται ως πιθανοί PCa χημειοπροληπτικές παράγοντες λόγω της τεκμαίρεται ασφάλεια τους [11]. Μία τέτοια ένωση είναι pterostilbene (pter), ένα φυσικώς απαντώμενο ανάλογο διμεθυλαιθέρα της ρεσβερατρόλης (RESV), το οποίο έχει υψηλότερη στοματική βιοδιαθεσιμότητα και αυξημένη δραστικότητα σε σύγκριση με RESV [12]. Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι pter μπορεί να αναστείλει την ανάπτυξη των διαφόρων ορμονών που αποκρίνονται καρκίνων, όπως του μαστού [13] – [15] και του προστάτη [14], [16] – [18] και οι δύο

in vitro

και

in vivo

. Αν και οι αντι-μεταστατική, κατά του όγκου και αντι-λευχαιμικά ιδιότητες της pter έχουν καθιερωθεί στον καρκίνο του μαστού, υπάρχουν περιορισμένες αναφορές σχετικά με τη δράση του pter στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων προστάτη που επάγεται από στεροειδείς ορμόνες [16]. Ομοίως, ισοθειοκυανικά (ΔΕΕ) είναι φυσικά, χαμηλού μοριακού βάρους οργανικές ενώσεις με τον γενικό τύπο R-NCS [19]. Αυτές οι χημειοπροστατευτικής παράγοντες που βρέθηκαν σε μια ευρεία ποικιλία των σταυρανθή λαχανικά όπως το μπρόκολο, το κουνουπίδι, το λάχανο, Βρυξέλλες βλαστάνουν και το λάχανο [20]. Επιδημιολογικές μελέτες έχουν δείξει ότι η αυξημένη κατανάλωση σταυρανθή λαχανικά μπορεί να είναι προστατευτική έναντι του προστάτη του κινδύνου [21] – [24]. Ωστόσο, παρά την επιτακτική επιδημιολογικής συσχέτισης, η δραστηριότητα των ITC έναντι των κυττάρων του προστάτη είναι ακόμα να αξιολογούνται συστηματικά. Δεδομένου ότι οι επιμέρους ρόλοι των pter και ITC έχουν ήδη εμπλακεί στην PCa, έχουμε ως στόχο την ανάπτυξη ενός συζυγούς pter-ITC σε αναζήτηση ισχυρών αντικαρκινικών μορίων. Το προϊόν σύζευξης παρασκευάστηκε με προσάρτηση ITC περιέχουν θειοημικαρβαζίδιο φαρμακοφόρο με σκελετό pter όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25]. Απροσδόκητα, το προϊόν σύζευξης μορίου όταν δοκιμάζονται in vitro, έδειξαν αποτελεσματική κυτταροτοξικότητα σε ευρύ φάσμα καρκινικών κυτταρικών σειρών σε συγκριτικά χαμηλότερη δόση σε σύγκριση με μητρική ένωση του δηλαδή, pter [25]. Περαιτέρω, η μελέτη μας έδειξε ότι η αντι-πολλαπλασιαστική δράση του συζυγούς έναντι ανθρώπινων κυτταρικών σειρών καρκίνου του μαστού οφείλεται στην ικανότητά της να συλλάβει κυττάρων σε G2 /M φάση και ενεργοποίηση της κασπάσης, και μπορεί να συσχετιστεί με τον αποκλεισμό της Akt και ERK μονοπάτια σηματοδότησης [ ,,,0],25].

στην παρούσα μελέτη εξετάσαμε λεπτομερή αποτελεσματικότητα και μοριακών μηχανισμών δράσης της συζυγούς pter-ITC χρήση ανδρογόνων-εξαρτώμενη (LNCaP) και ανδρογόνα-ανεξάρτητο (PC-3) του προστάτη κύτταρα. Περαιτέρω, συγκρίναμε επίσης την αποτελεσματικότητα του συζυγούς pter-ITC με την μητρική ένωση δηλ pter, RESV. έτσι μελέτη μας εντόπισε την προσφάτως ανεπτυγμένα συζυγές να είναι ένας ισχυρός AR-αναστολέα που εξασθενεί έντονα την ανάπτυξη των κυττάρων προστάτη in vitro με ρύθμιση της έκφρασης AR, καθώς και τη ρύθμιση της προόδου του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης.

Υλικά και Μέθοδοι

αντιδραστήρια

Όλες οι κυτταρικές αντιδραστήρια καλλιέργειας ελήφθησαν από την GIBCO (Invitrogen, CA, USA), εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά. Πενικιλίνη, στρεπτομυκίνη, ΜΤΤ (3- (4, 5-διμεθυλο-2-θειαζολυλ) 2,5diphenyl-2Η-tetrazoliumbromide), καλλιέργειας κυττάρων βαθμού διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO), αγαρόζη και όλες οι χημικές ουσίες αναλυτικής καθαρότητας ήταν από HIMEDIA (Mumbai, Ινδία ). Αντίστροφη transcription- αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (RT-PCR) σετ ήταν από Genei (Bangalore, Ινδία). RESV, pter, DHT, /2 κινάσης Akt1, PD98059 (αναστολέας ΕΚΚ), Z-VAD-FMK (pan αναστολέα της κασπάσης), Ζ-LEHD-FMK (κασπάσης-9 ειδικός αναστολέας), Ζ-IETD-FMK (caspase- 8 ειδικός αναστολέας) και BCA κιτ εκτίμησης πρωτεΐνης ήταν από τη Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ, USA). Polyfect αντιδραστήριο επιμόλυνσης αγοράστηκε από την QIAGEN (Valencia, CA, USA). Pifithrin-α (αναστολέας ρ53), αντισώματα για κασπάση-3, Bax, Akt, ρ-Akt, ΕΚΚ, ρ-ΕΚΚ, SRC-1, GRIP-1, Ν-ΟοΚ, β-ακτίνη και μικρά παρεμβαλλόμενα RNA (siRNAs) κατά Akt (sc-43609), ΕΚΚ (sc-35335) και ελέγχου (SC-37007? αρνητικός έλεγχος για πειράματα χρησιμοποιώντας στοχευόμενη διαμόλυνση siRNA? καθένα αποτελείται από ένα κωδικοποιημένο αλληλουχία που δεν θα οδηγήσει στην ειδική αποικοδόμηση οποιουδήποτε γνωστού κυτταρικού mRNA) αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). συζυγούς pter-ITC συντέθηκε στην ασύμμετρη εργαστήριο σύνθεση του Τμήματος Χημείας, Ινδικό Ινστιτούτο Τεχνολογίας Roorkee, Ινδία, σύμφωνα με την διαδικασία που περιγράφηκε προηγουμένως [25] και πλέον ορίζεται ως συζυγές στο χειρόγραφο (Εικ. 1Α).

(Α) Διάρθρωση της ρεσβερατρόλης, Pterostilbene και Pterostilbene-ισοθειοκυανικό συζευγμένο. (Β) Η επίδραση του συζυγούς σχετικά με την απόπτωση των κυττάρων PC-3 και LNCaP, όπως καταδεικνύεται από έναν εκπρόσωπο ανάλυση FACS χρησιμοποιώντας αννεξίνη V ως δείκτη. (Γ) Το ιστόγραμμα δείχνει τα στοιχεία για την ανάλυση FACS, όπου τα αποτελέσματα είναι η μέση τιμή ± SEM τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. # Και * αντιπροσωπεύει στατιστικά σημαντική διαφορά σε σχέση με ειδικούς ελέγχους τους (όχημα θεραπεία) για τα κύτταρα στην πρώιμη και όψιμη απόπτωση αντιστοίχως σε

σ

& lt?. 0.05

Η

Γραμμές κυττάρων και Πολιτισμού

το κυτταρικές σειρές καρκινώματος προστάτη (AR-θετικά LNCaP και AR-αρνητικών PC-3) και noncancer κυτταρικές γραμμές (CHO και COS-1) ελήφθησαν από το Εθνικό Κέντρο για Cell Science (NCCS), Pune, Ινδία. PC-3, CHO και COS-1 κύτταρα διατηρήθηκαν σε μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco (ϋΜΕΜ), ενώ τα κύτταρα LNCaP διατηρήθηκαν σε RPMI-1640 συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) (αδρανοποιημένος με θερμότητα) υπό 5% CO

2 στους 37 ° C. Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας LNCaP, PC-3, CHO και κύτταρα COS-1 από το πέρασμα κάτω 29, 34, 20 και 30 αντίστοιχα. Τα κύτταρα πλύθηκαν σωστά πριν την αλλαγή της μετάδοσης χωρίς στεροειδή πλήρους μέσου πριν από κάθε αγωγή με τις ενώσεις, εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά.

Δοκιμασίες κυτοτοξικότητας

ΜΤΤ δοκιμασία διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [ ,,,0],25]. Εν συντομία, 5 χ 103 κύτταρα σε 200 μΙ μέσου σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων (Griener, Γερμανία

).

Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις (0.1, 1, 10, 100 και 1000 μΜ) του RESV, pter και συζυγούς. Τα κύτταρα μάρτυρες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0,1% DMSO (έλεγχος οχήματος). Τα καλλιεργημένα κύτταρα αναλύθηκαν μετά από 24 ώρες με την προσθήκη 20 μΙ 5 mg /ml ΜΤΤ που ακολουθείται από επώαση στους 37 ° C για 4 ώρες. Το ΜΤΤ περιέχον μέσο στη συνέχεια αναρροφήθηκε και 200 ​​μΙ DMSO (HIMEDIA, Mumbai, Ινδία) προστέθηκε για να διαλύσει τους κρυστάλλους formazone. Η οπτική πυκνότητα (OD) μετρήθηκε στα 570 nm χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης πλάκας ELISA (Fluostar Optima, BMG Labtech, Germany). Η ποσοστιαία αναστολή υπολογίστηκε ως:

Η καμπύλη δόσης-απόκρισης και IC

50 τιμές ελήφθησαν με ανάλυση μη γραμμικής παλινδρόμησης [μη-γραμμική παλινδρόμηση (σιγμοειδή απόκρισης δόσης με μεταβλητή κλίση)] χρησιμοποιώντας Graph Pad Prism, version 5.02 του λογισμικού (Graph Pad Software Inc., CA, USA).

κυτταρικού κύκλου διανομής και Δοκιμασία απόπτωσης με κυτταρομετρία ροής

η κατανομή κυτταρικού κύκλου και ιωδιούχο αννεξίνη V /προπιδίου (PI) θετικά κύτταρα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής. Εν συντομία, πρώτα τα κύτταρα σπάρθηκαν και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 0, 10, 20 και 40 μΜ συζυγούς σε πλήρες μέσο για 24 ώρες. Αυτό ακολουθήθηκε από θρυψίνη και στερέωση σε 70% αιθανόλη, και τελικά έκπλυση με PBS. Στη συνέχεια, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με RNase Α (50 μg /ml), χρωματίστηκαν με ΡΙ (50 μg /ml) και επωάζονται στο σκοτάδι για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής για τη διανομή του κυτταρικού κύκλου. Για την απόπτωση, τα κύτταρα συζυγούς αγωγή βάφτηκαν με Alexa Fluor-488-συζευγμένο αννεξίνης-V με το Vybrant απόπτωση Assay Kit από Invitrogen (USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Τα βαμμένα κύτταρα στη συνέχεια αναλύθηκαν με φθορισμό ενεργοποιημένων κυττάρων (FACS Calibur, BD Biosciences, San Jose, CA, USA) και τα δεδομένα τυποποιήθηκαν χρησιμοποιώντας Cell Quest 3.3 λογισμικό.

Δοκιμασία Caspase

δραστικότητα κασπάσης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ApoTarget κασπάσης χρωματομετρική κιτ πρωτεάσης δειγματολήπτη δοκιμασίας (KHZ1001? Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, τόσο τα κύτταρα του προστάτη υποβλήθηκαν σε θεραπεία με αυξανόμενες δόσεις συζυγούς και RESV για 24 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια συλλέχθηκαν, πλύθηκαν σε PBS και λύθηκαν σε 50 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος λύσης σε πάγο για 10 λεπτά. Μετά από φυγοκέντρηση, το υπερκείμενο που περιέχει 150 μg πρωτεΐνες επωάστηκαν με 200 μΜ της κασπάσης-3 (Ac-DEVD-ρΝΑ), κασπάσης-8 (Ac-IETD-ρΝΑ) και κασπάσης-9 (Ac-LEHD-ρΝΑ) υποστρώματα αντίστοιχα σε ρυθμιστικό διάλυμα αντίδρασης στους 37 ° C για 1 ώρα σε 96 φρεατίων επίπεδου πυθμένα πλάκα. Επίπεδα απελευθερώνεται ρΝΑ συνέχεια μετρήθηκαν στα 405 nm μήκος κύματος με τον αναγνώστη πλάκας ELISA (Fluostar Optima, BMG Labtech, Germany). Η αναδιπλούμενη αύξηση των κασπάσης-3, -8, -9 και δραστηριότητες προσδιορίστηκαν με άμεση σύγκριση με το επίπεδο του un-επαγόμενης ελέγχου. Για τη δοκιμασία αναστολέα κασπάσης, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με ένα συνθετικό αναστολέα παν-κασπάσης (Ζ-VAD-FMK), κασπάσης-8 αναστολέα (Z-IETD-FMK) και κασπάσης-9 αναστολέα (Z-LEHD-FMK) για 1 h πριν από την προσθήκη του συζυγούς και του κυτταρικού θανάτου αναλύθηκαν με δοκιμασία ΜΤΤ όπως συζητήθηκε νωρίτερα.

RT-PCR Ανάλυση

το συνολικό RNA εκχυλίστηκε από τα κύτταρα σε αγωγή χρησιμοποιώντας κιτ απομόνωσης RNA που λαμβάνεται από Genei ( Μπανγκαλόρ, Ινδία). Τα εκχυλισθέντα δείγματα RNA στη συνέχεια ποσοτικοποιούνται και ίση ποσότητα των μεμονωμένων θεραπειών μεταγράφηκε με τη βοήθεια ενός RT – PCR κιτ από Genei (Bangalore, Ινδία) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Διεξήχθη PCR με μετουσίωση στους 94 ° C για 60 s, ανόπτηση σε διάφορες θερμοκρασίες (ανάλογα με ζεύγη εκκινητών που χρησιμοποιούνται) για 45 s και επέκταση στους 72 ° C για 2 λεπτά ακολουθούμενο από τον αριθμό των κύκλων για ενίσχυση. Εκκινητές για Bcl-2, Bcl-xL, Bax, AR και β-ακτίνης σχεδιάστηκαν με τη βοήθεια του Primer 3 λογισμικό και τυποποιηθεί στο εργαστήριο. Τα PCR προϊόντα στη συνέχεια διαχωρίστηκαν επί γέλης αγαρόζης 2% και απεικονίστηκαν σε ένα σύστημα τεκμηρίωσης γέλης (Bio Rad, USA). Η ένταση των ζωνών σε πηκτώματα αγαρόζης αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ImageJ 1,43 λογισμικού (ΝΙΗ, USA) και ομαλοποιήθηκε σε σχέση προς β-ακτίνη προϊόντα PCR. Κάθε ένα από τα RT-PCR πραγματοποιήθηκε τρεις φορές. Ο Πίνακας παρουσιάζει την S1 εκκινητή αλληλουχία, το μέγεθος του προϊόντος, θερμοκρασία ανόπτησης, και ο αριθμός των κύκλων που χρησιμοποιούνται για όλα τα αρχικά τεμάχια.

ανοσοφθορισμού χρώσης

Για τη χρώση ανοσοφθορισμού, τα κύτταρα LNCaP πλύθηκαν με PBS, σταθεροποιήθηκαν σε 3 % παραφορμαλδεΰδη, κατέστησαν διαπερατά με 0,1% Triton Χ-100 και τελικά αποκλείστηκαν με 1% BSA για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού AR αραιωμένο 1:200 σε ρυθμιστικό αποκλεισμού για 1 ώρα σε RT. Τέλος, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και επωάστηκαν με δευτερεύον αντίσωμα ΡΙΤΟ-επισημασμένο αντι-κουνελιού αραιωμένο 1:1000 σε ρυθμιστικό αποκλεισμού για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα στη συνέχεια παρατηρήθηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού (Zeiss, Axiovert 25, Γερμανία).

Co-ανοσοκατακρήμνιση και ανάλυση Western Blot

Τα κύτταρα LNCaP απλώθηκαν σε δίσκους καλλιέργειας των 100 mm και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με συζυγούς ή DHT για 24 ώρες. Τα ολόκληρα-κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν όπως περιγράφεται προηγουμένως ρυθμιστικό [26] σε ανοσοκαταβύθιση (ΙΡ) που περιέχει 50 mM Tris-HCl (ρΗ 8,0), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, και 1% Triton Χ-100. κλάσματα πρωτεΐνης των 500 μg κατόπιν επωάστηκαν όλη τη νύχτα στους 4 ° C χρησιμοποιώντας 2 μg του αντισώματος που κατευθύνεται εναντίον AR. Η πρωτεΐνη Α-Cl αγαρόζης προστέθηκαν στη συνέχεια και περαιτέρω επωάστηκαν για 6 ώρες στους 4 ° C. Τα ανοσοϊζήματα πλύθηκαν τέσσερεις φορές με το ρυθμιστικό διάλυμα ΙΡ και ανοσοσύμπλοκα ανακτήθηκαν με βρασμό σε ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος SDS. Τέλος, το Western Blot πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας αντι-AR, αντι-SRC-1 και αντι-GRIP-1 αντισώματα (Santa Cruz, CA, USA). Για ανάλυση στυπώματος Western, τα κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν μετά τη συγκομιδή τους σε ρυθμιστικό λύσης. Περίπου 40 μg ολικής πρωτεΐνης ηλεκτροφορήθηκε κατά 12% SDS-PAGE, και η κηλίδωση Western διεξήχθη χρησιμοποιώντας πρότυπο πρωτόκολλο. Εν συντομία, οι αναλυθούν οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νάιλον. Οι κηλίδες στη συνέχεια αποκλείστηκαν με ρυθμιστικό TBST (20 mM Tris-Cl, ρΗ 7,5, 150 mM χλωριούχο νάτριο, 0,05% Tween-20) που περιείχε 5% αποβουτυρωμένο γάλα σε σκόνη. Αυτά στη συνέχεια πλύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα TBST και επωάστηκε όλη τη νύκτα στους 4 ° C με το ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει κατάλληλες ποσότητες του πρωτογενή αντισώματα: κασπάσης-3, Bax, Bcl-2, Akt, ρ-Akt, ΕΚΚ, ρ-ΕΚΚ, AR, SRC -1, GRIP-1 (1:500) και β-ακτίνη (1:1000). Οι κηλίδες στη συνέχεια πλύθηκαν και επωάστηκαν με δευτερογενές αντίσωμα αντι-κουνελιού (1:20,000) συζευγμένο με υπεροξειδάση (HRP). Η ανάπτυξη χρώματος πραγματοποιήθηκε στο σκοτάδι, χρησιμοποιώντας ένα κιτ ECL (Amersham, GE Healthcare, Buckinghamshire, UK). Οι ανεπτυγμένες κηλίδες υποβλήθηκαν σε πυκνομετρική ανάλυση με ImageJ 1,43 λογισμικού (ΝΙΗ, USA) χρησιμοποιώντας β-ακτίνης ως εσωτερικός έλεγχος.

Η επιμόλυνση

Τα κύτταρα LNCaP αναπτύχθηκαν και παροδικά επιμολυσμένα με pMMTV-νεομυκίνη -luciferase πλασμίδιο (300 ng /105 κύτταρα) σε μέσα RPMI συμπληρωμένα με 10% FBS με τη χρήση polyfect αντιδραστηρίου επιμόλυνσης (Qiagen, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Στη συνέχεια, 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα μέσα κυτταρικής καλλιέργειας αλλάχθηκαν με μέσα που περιέχουν 5% απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα FBS για τη μείωση των μολυσματικών στεροειδών από τον ορό και επωάστηκαν για επιπλέον ημέρα πριν από την έναρξη των θεραπειών. Σε περίπτωση PC-3 κύτταρα, ομοίως επιμολύνθηκαν, αλλά εκτός από κατασκεύασμα pMMTV-νεομυκίνη-λουσιφεράση, αυτοί επιμολύνθηκαν επίσης με πλασμίδιο pSG5-Har-puro (πλήρους μήκους Har στο διάνυσμα έκφρασης pSG5) σε αναλογία 5: 1 όπως αναφέρεται παραπάνω. Για πειράματα που περιλαμβάνουν συν-ρυθμιστές, 50 ng των πλασμιδίων συν-ενεργοποιητή (25 ng καθενός από GRIP-1 και SRC-1) μαζί με pMMTV-neo-Luc (250 ng) επιμολύνθηκαν σε κύτταρα LNCaP. Για να αξιολογηθεί η αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης, 500 ng /105 κύτταρα του SV40 υποκινητή-λουσιφεράση της Renilla (pRL-SV40) φορέα (Promega Madison, USA) συν-επιμολύνθηκαν ως εσωτερικός έλεγχος. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή είτε με όχημα ή διάφορες συγκεντρώσεις (1-40 μΜ) του συζυγούς ή /και 10 ηΜ του DHT για 24 ώρες, και μετρήθηκε η δραστικότητα λουσιφεράσης σύμφωνα με τις οδηγίες που παρέχονται στο κιτ (Promega, Madison, USA ). Κάθε πειραματικό σημείο διεξήχθη εις τριπλούν και μεταβάλλεται κατά λιγότερο από 10%. Οι τιμές λουσιφεράσης για κάθε λύματα κανονικοποιήθηκαν προς τη δραστικότητα της λουσιφεράσης της Renilla.

Για μελέτες εντοπισμού, το πλασμίδιο ρΕΟΡΡ-AR επιμολύνθηκε σε LNCaP και PC-3 κύτταρα (300 ng /105 κύτταρα). Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με 10 ηΜ DHT με /χωρίς συζυγούς 10 και 20 μΜ και ελέγχονται τακτικά μέχρι 12 ώρες κάτω από μικροσκόπιο φθορισμού (Zeiss, Axiovert 25, Γερμανία).

siRNA Επιμόλυνση

Η siRNAs κατά της ανθρώπινης Akt και ERK και ελέγχου siRNA αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology (USA). Τα κύτταρα LNCaP και PC-3 προστάτη επιμολύνθηκαν με siRNAs (σε τελική συγκέντρωση 100 ηΜ) χρησιμοποιώντας polyfect αντιδραστηρίου επιμόλυνσης (Qiagen, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά από 24 h επιμόλυνσης, τα κύτταρα πλύθηκαν σωστά και αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με 20 συζυγές μΜ για 24 ώρες, και τελικά προϊόντα λύσης πρωτεΐνης παρασκευάστηκαν με την ολοκλήρωση της θεραπείας. Τα επίπεδα του p-Akt, ρ-ERK και διασπασμένη κασπάση 3 εκφράσεις ανιχνεύθηκαν με ανάλυση κηλίδας Western.

Στατιστική Ανάλυση

Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SEM και αξιολογήθηκαν στατιστικά χρησιμοποιώντας το ένα τρόπος ANOVA που ακολουθείται από Bonferroni

post hoc

δοκιμής χρησιμοποιώντας Graph Pad Prism 5.04 του λογισμικού (Graph Pad Software, San Diego, CA, USA). Ένα

σ

-τιμή μικρότερη από 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική.

Αποτελέσματα

Αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού από Σύζευγμα

LNCaP (AR θετική ) και PC-3 (AR αρνητικό) κύτταρα καλλιεργήθηκαν με διαφορετικές συγκεντρώσεις RESV, pter και σύζευξης για 24 ώρες σε πλήρες μέσο RPMI και DMEM, αντίστοιχα. Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι η επεξεργασία των LNCaP και PC-3 κύτταρα PCa με RESV, pter και συζυγούς οδήγησε σε δοσοεξαρτώμενη αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 1, σε περίπτωση των κυττάρων LNCaP, το συζυγές είχε ως αποτέλεσμα μείωση περίπου 50% στον αριθμό των ζωντανών κυττάρων στους 40 ± 1,12 μΜ ενώ ήταν περίπου 66,4 ± 1,39 και 82,2 ± 2,19 μΜ σε περίπτωση pter και RESV επεξεργασμένο κύτταρα αντίστοιχα μετά από 24 ώρες θεραπείας. Ομοίως, στην περίπτωση των PC-3 κύτταρα το IC

50 αξία του συζυγούς, pter και RESV βρέθηκε να είναι 45 ± 1.50, 75 ± 2.55 και 95.0 ± 1.13 μΜ αντίστοιχα μετά από 24 ώρες θεραπείας (Πίνακας 1). Περαιτέρω, όταν δοκιμάζεται σε noncancer κυτταρικές σειρές όπως CHO και COS-1, όλες οι ενώσεις βρέθηκαν να έχουν IC

50 τιμές πάνω από 100 μΜ συγκέντρωση. Έτσι και οι δύο κυτταρικές σειρές καρκίνου βρέθηκαν να είναι πιο ευαίσθητα στην θεραπεία συζυγούς σε σύγκριση με pter και RESV όπως απεικονίζεται από το κατώτερο IC

50 τιμές σε όλα αυτά. Περαιτέρω, αποτέλεσμα μας έδειξε ότι η συζυγής pter-ITC είναι ένας ισχυρός κυτταροτοξικός παράγοντας τόσο AR θετικά και AR αρνητικές κυτταρικές σειρές αν και σε οριακά υψηλότερο επίπεδο στην πρώην σύγκριση με τελευταία.

Η

διαφορετικής ευαισθησίας της PC-3 και LNCaP κύτταρα σε απόπτωση που επάγεται από σύζευγμα

στο περιβάλλον των αποτελεσμάτων δοκιμασίας ΜΤΤ, επεκτείναμε τη μελέτη μας για να εξετάσει κατά πόσο τα κύτταρα του προστάτη υφίστανται απόπτωση μετά από επεξεργασία συζυγούς χρησιμοποιώντας αννεξίνη-V PI διπλή δοκιμασία /χρώσης και της ροής ανάλυση κυτταρομετρίας. Αφού τα κύτταρα του προστάτη επωάστηκαν με διαφορετικές συγκεντρώσεις συζυγούς, τα κύτταρα βάφτηκαν με Alexa Fluor 488-συζευγμένη αννεξίνη-V και ΡΙ, τα οποία μπορεί να εκτιμήσει τις πρώιμη και την όψιμη πληθυσμούς αποπτωτικών κυττάρων. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Β, το συζυγές παρήγαγε μια δοσοεξαρτώμενη αύξηση στον πληθυσμό αποπτωτικό κυτταρικό τόσο στα κύτταρα του προστάτη που μελετήθηκαν. Θεραπεία της PC-3 κύτταρα με αυξανόμενες δόσεις του συζυγούς επί 24 ώρες είχε ως αποτέλεσμα μια αύξηση των πρώιμων αποπτωτικών κυττάρων από περίπου 44% έως 68% και αργά αποπτωτικά κύτταρα από 12% έως 16% στα 20 και 40 μΜ συγκεντρώσεις, σε σύγκριση με όχημα αγωγή ομάδες αντίστοιχα (Σχ. 1 Β ανώτερο πλαίσιο). Από PC-3 κύτταρα στερούνται μία λειτουργική πρωτεΐνη ρ53, ήταν ενδιαφέρον να προσδιορισθεί αν η παρουσία της άγριου τύπου ρ53 επηρεάζει την κυτταρική ευαισθησία στο θάνατο κυττάρου που προκαλείται από συζυγές επειδή ρ53 είναι γνωστό ότι ρυθμίζει την απόπτωση σε διαφορετικά ερεθίσματα. Έχουμε αντιμετωπιστεί αυτό το ζήτημα με τον προσδιορισμό της ευαισθησίας των κυττάρων LNCaP (άγριου τύπου ρ53) προς συζυγούς προκαλούμενη απόπτωση με ανάλυση FACS. Η επεξεργασία των κυττάρων LNCaP για 24 ώρες με αυξανόμενες δόσεις του συζυγούς οδήγησε σε σταδιακή αύξηση των πρώιμων αποπτωτικών κυττάρων (Αννεξίνη V θετική μόνο) από 52% έως 72% στα 20 και 40 μΜ, αντίστοιχα (Σχ. 1Β, κάτω πίνακας). Τα αργά αποπτωτικά κύτταρα (Αννεξίνη V και θετική ΡΙ) αυξήθηκε επίσης σημαντικά από 8% σε 18,5% (Σχ. 1Β, κάτω πίνακας), σε σύγκριση με μόνο 0,23% του πρώιμων αποπτωτικών κυττάρων και σχεδόν αμελητέο αριθμό αργά αποπτωτικών κυττάρων στον αρνητικό έλεγχο ομάδα που έλαβε αγωγή με 0,1% DMSO. Το ιστόγραμμα στη δεξιά πλευρά (Σχ. 1 C) υποδεικνύει στατιστική ανάλυση από τρία παρόμοια ανεξάρτητα πειράματα, τόσο για τις κυτταρικές γραμμές. Είναι ενδιαφέρον ότι, ο συνολικός αριθμός των αποπτωτικών κυττάρων ήταν στατιστικά μη σημαντική (

ρ

& lt? 0,05) μεταξύ LNCaP και κυττάρων PC-3 όταν δοκιμάζεται με διαφορετικές συγκεντρώσεις του συζυγούς, γεγονός που υποδηλώνει ότι η πρωτεΐνη ρ53 δεν εμπλέκεται στη ρύθμιση του συζυγούς προκαλούμενη απόπτωση κυττάρων του προστάτη.

σύζευγμα Induced Στάδιο Ειδικά Σύλληψη κυττάρων καρκίνου του προστάτη

Με βάση την αύξηση και τη σύνθεση του DNA ανασταλτικές αποκρίσεις συζυγούς σε κύτταρα PCa, εξετάσαμε έπειτα επίδραση του στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Α και 2Β, η θεραπεία της PC-3 και LNCaP κύτταρα με αυξανόμενες δόσεις του συζυγούς επί 24 ώρες είχε ως αποτέλεσμα μια δοσοεξαρτώμενη αύξηση στη συσσώρευση των κυττάρων στο G2 /M φάση με ταυτόχρονη ελάττωση των κυττάρων φάση G1. Σε περίπτωση PC-3 κύτταρα, η επίδραση παρατηρήθηκε σε 40 μΜ συζυγούς ήταν η μεγαλύτερη με περίπου 50% των κυττάρων που συνελήφθησαν στη G2 /M φάση, σε σύγκριση με μόνο 22% στην ομάδα ελέγχου (Σχ. 2Α). Μια παρόμοια τάση σε G2 /M σύλληψης φάση καταδείχθηκε επίσης σε κύτταρα LNCaP (35% σε κύτταρα κατεργασμένα έναντι 11% σε κύτταρα ελέγχου), αν και ο συνολικός πληθυσμός των κυττάρων δεν θα μπορούσε να φθάσει σε υψηλό επίπεδο του 50% όπως παρατηρήθηκε σε PC-3 κύτταρα. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Β, η θεραπεία συζυγές είχε ως αποτέλεσμα μια συσσώρευση του 16-35% των κυττάρων σε G2 /M φάση με αυξανόμενες δόσεις προϊόντος σύζευξης. Έτσι, συζυγές μεσολάβηση αναστολή της ανάπτυξης και των δύο κυττάρων PC-3 και LNCaP συσχετίζεται με G2 /M φάση διακοπή του κυτταρικού κύκλου.

Η κατανομή κυτταρικού κύκλου του PC-3 και (Β) LNCaP κύτταρα (Α) κατά την αγωγή με διάφορες δόσεις του προϊόντος σύζευξης. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SEM τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. * Αντιπροσωπεύει στατιστικά σημαντική διαφορά σε σχέση με το PC-3 και LNCaP κύτταρα επεξεργασμένα οχήματος αντίστοιχα που αντιστοιχούν σε κάθε στάδιο του κυτταρικού κύκλου σε

ρ

& lt? 0.05. (Γ) Τα αποτελέσματα διαφόρων δόσεων του συζυγούς (αριστερό πάνελ) και της ρεσβερατρόλης (δεξί πάνελ) επί κασπάσης-8, -9 και -3 δραστηριότητες σε PC-3 και (D) κύτταρα LNCaP. Τα αποτελέσματα είναι η μέση τιμή ± SEM τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. * Αντιπροσωπεύει στατιστικά σημαντική διαφορά σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου για τις αντίστοιχες κασπάσες δοκιμάζονται σε

ρ

& lt? 0.05. (Ε) Η επίδραση των αναστολέων κασπάσης επί συζυγούς προκαλούμενη κυτταρικό θάνατο σε PC-3 και (F) κύτταρα LNCaP. Τα κύτταρα προ-επεξεργασία με 20 μΜ του αντίστοιχου αναστολέων κασπάσης: Z-LEHDFMK (κασπάσης-9 αναστολέα)? Ζ-IETDFMK (κασπάσης-8 αναστολέα)? και Ζ-VAD-FMK (γενικός αναστολέας κασπάσης) για 1 ώρα πριν από την προσθήκη 20 μΜ συζυγούς. Ο θάνατος των κυττάρων μετρήθηκε 24 ώρες μετά την αγωγή με τη χρήση συζυγούς ΜΤΤ δοκιμασία. Τα δεδομένα είναι η μέση τιμή ± SEM τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. * Και # αντιπροσωπεύει στατιστικά σημαντική διαφορά σε σχέση με το μάρτυρα (όχημα) και τα κύτταρα συζυγούς αγωγή αντιστοίχως για κάθε κυτταρικές γραμμές σε

ρ

& lt? 0.05. ns, μη σημαντική.

Η

Σύζευγμα Ενεργοποιεί κασπάσης-3 μέσω της κασπάσης-9

Η ενεργοποίηση και των δύο εξωγενών και ενδογενών οδών κασπάσης έχει ήδη γνωστό ότι είναι οι κύριοι μηχανισμοί των αποπτωτικών κυττάρων θανάτου στις περισσότερες κυψελοειδή συστήματα. Για την καλύτερη κατανόηση των υποκείμενων κυτταρικά μονοπάτια για συζυγούς προκαλούμενη θάνατο των κυττάρων προστάτη, ένας πιθανός ρόλος της κασπάσης στη διαδικασία αυτή διερευνήθηκε με μέτρηση των δραστηριοτήτων της κασπάσης-8, -9, και -3 σε αυτά τα κύτταρα όγκου. Ενώ κασπάσης-8 και κασπάσης-9 είναι απαραίτητα πρωτεάσες εξωγενών και ενδογενών αποπτωτικών οδών αντίστοιχα, κασπάσης-3 δρα ως κατάντη παράγοντες επίδρασης και των δύο αυτών των οδών. Θεραπεία της PC-3 κυττάρων με αυξανόμενες δόσεις (10, 20 και 40 μΜ) του συζυγούς και RESV για 24 h προκάλεσε μια δοσο-εξαρτώμενη αύξηση σε κασπάση-9 και δραστηριότητες κασπάσης-3 ένζυμο. Αυτή η αύξηση ήταν συγκριτικά υψηλότερη σε περίπτωση κυττάρων συζυγούς αντιμετωπίζονται σε σύγκριση με κύτταρα επεξεργασμένα με ίδια δόση RESV (Σχ. 2C). Για κασπάσης-8, αν και υπήρξε οριακή αύξηση της δραστηριότητας της σε υψηλή δόση της θεραπείας RESV, καμία τέτοια επαγωγή παρατηρήθηκε στην περίπτωση του συζυγούς θεραπείας (Εικ. 2C). Αντίθετα, τα αποτελέσματα που λαμβάνονται σε περίπτωση κυττάρων LNCaP παρουσίασαν σημαντική αύξηση σε όλα τα τρία κασπάσης δηλαδή κασπάσης-8, -9 και -3 σε συζυγούς θεραπεία ενδεικτική της εμπλοκής των δύο εγγενή (μέσω κασπάσης-9) και εξωγενών (μέσω κασπάση-8) οδούς σε αποπτωτική διεργασία από το προϊόν σύζευξης σε αυτή την κυτταρική γραμμή (Σχ. 2D, αριστερό πάνελ). Επιπλέον, τα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι η ενεργοποίηση της κασπάσης-9 λαμβάνει χώρα πριν από εκείνη της κασπάσης-8 (σε χαμηλότερη δόση), γεγονός που υποδηλώνει ότι η μιτοχονδριακή μονοπάτι μπορεί να είναι απαραίτητη για την συζυγούς προκαλούμενη απόπτωση. Από την άλλη πλευρά, η θεραπεία RESV έδειξε επίσης σημαντική αύξηση της κασπάσης -9 και -3 δραστηριότητες, αλλά σε μικρότερο βαθμό σε σύγκριση με το προϊόν σύζευξης (Σχήμα 2D, δεξί πάνελ). (

ρ

& lt? 0,05). Έτσι, τα παραπάνω δεδομένα σαφώς δείχνουν ότι επάγεται συζυγούς απόπτωση σε κύτταρα PC-3 διαμεσολαβείται μέσω της ενδογενούς οδού, ενώ τόσο οι εσωτερικές και εξωτερικές διεργασίες συμβάλλει στην απόπτωση σε κύτταρα LNCaP. Επίσης, το προϊόν σύζευξης βρέθηκε να είναι πιο αποτελεσματική από RESV στην επαγωγή της απόπτωσης σε αμφότερες τις κυτταρικές γραμμές του προστάτη που δοκιμάστηκαν.

Επιπλέον, για να αποσαφηνιστεί η οδός η οποία ήταν κυρίαρχη για συζυγούς προκαλούμενη απόπτωση, φαρμακολογικές αναστολείς ειδικών κασπασών απασχολούνται για να εξετάσουν εάν θα μπορούσαν να προστατεύουν τα κύτταρα από το να υποστούν απόπτωση. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Ε και 2F, Z-VAD-FMK, ένας γενικός αναστολέας κασπάσης, έδειξαν σημαντική αναστολή του κυτταρικού θανάτου σε δύο PC-3 και LNCaP κύτταρα υποδεικνύοντας ότι η απόπτωση είναι η κυρίαρχη μορφή κυτταρικού θανάτου που επάγεται από το προϊόν σύζευξης. Σε περίπτωση PC-3 κύτταρα, Ζ-LEHD-FMK, ένας ειδικός αναστολέας της κασπάσης-9 επίσης ανέστειλαν επάγεται συζυγούς κυτταρικό θάνατο κατά 73%, ενώ το Ζ-IETD-FMK, ένας ειδικός αναστολέας της κασπάσης-8, ήταν εντελώς αναποτελεσματικό στον αποκλεισμό της που προκαλείται από συζυγούς κυτταρικό θάνατο (

σ

& lt? 0,05) (Εικ. 2Ε). Επιπλέον, στην περίπτωση των κυττάρων LNCaP, ο αναστολέας της κασπάσης-9 μπλοκάρει σχεδόν πλήρως την επαγόμενη από συζυγές απόπτωση ενώ αναστολέα της κασπάσης-8 μόνο μερικώς ανέστειλε αυτή (Εικ. 2F). Η επαγόμενη συζυγές κυτταρικός θάνατος πιο γνωστή αναστέλλεται όταν τα κύτταρα προ-αγωγή με δύο αναστολείς κασπάσης-8 και κασπάσης-9. Μαζί, αυτά τα δεδομένα ενισχύει περαιτέρω εύρημα μας ότι συζυγούς απόπτωση που επάγεται περιλαμβάνει κασπάσης -9 /-8 /-3 και κασπάσης-9 /-3 οδών σε LNCaP και PC-3 κύτταρα, αντίστοιχα.

Bcl-2 και Bax εμπλέκονται στην απόπτωση από Σύζευγμα

Bcl-2 σχηματίζει ένα ετεροδιμερές σύμπλοκο με αποπτωτική πρωτεΐνη Bax, εξουδετερώνοντας έτσι την αποπτωτική δράση του. Ως εκ τούτου, ο λόγος του Βαχ /Bcl2 θεωρείται συχνά ως αποφασιστικό παράγοντα για τον καθορισμό κυτταρικό θάνατο ή την επιβίωση. Στην παρούσα μελέτη, η θεραπεία των κυττάρων με προϊόν σύζευξης είχε σαν αποτέλεσμα μία μείωση στην έκφραση του

Bcl-2

και

Bcl-xL

με ταυτόχρονη αύξηση σε ποσοστό

Βαχ

γονίδιο τόσο LNCaP και PC-3 κύτταρα (Εικ. 3). Αυτό είχε ως αποτέλεσμα σημαντική αύξηση του λόγου Βαχ /Bcl2, η οποία ευνοεί γενικά την απόπτωση. Όπως φαίνεται στο Σχ. Όπως φαίνεται στο Σχ. Όπως φαίνεται στο Σχ. Όπως φαίνεται στο Σχ. Όπως φαίνεται στο Σχ. Όπως φαίνεται στο Σχ. Όπως φαίνεται στο Σχ. Όπως φαίνεται στο Σχ. Όπως φαίνεται στο Σχ. Όπως φαίνεται στο Σχ. Όπως φαίνεται στο Σχ. [16].