Αφηρημένο

Η αυτοφαγία είναι μια κρίσιμη κυτταρική διαδικασία που απαιτείται για τη διατήρηση της κυτταρικής ομοιόστασης στην υγεία και την ασθένεια κράτη, αλλά οι μοριακοί μηχανισμοί και οι επιπτώσεις της αυτοφαγία σχετικά με τον καρκίνο δεν είναι πλήρως κατανοητός. Εδώ, βρήκαμε ότι Sox2, ένας βασικός παράγοντας μεταγραφής στη ρύθμιση της «βλαστική ικανότητα» των εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων και επαγόμενη-πολυδύναμα βλαστικά κύτταρα, που προκαλείται από έντονα φαινόμενα αυτοφαγικά, συμπεριλαμβανομένων ενδοκυτταρικών σχηματισμός κενοτοπίων και την ενεργοποίηση λυσοσωμικών σε καρκινικά κύτταρα κόλου. Η ενεργοποίηση έγινε μέσω Sox2 μεσολάβηση

ATG10

γονιδιακή έκφραση και είχε ως αποτέλεσμα την αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη αποικιών

ex vivo

και ανάπτυξη του όγκου

in vivo.

περαιτέρω, βρήκαμε ότι Sox2 που προκαλείται-αυτοφαγία ενισχυμένη κυτταρική γήρανση έως ρύθμισης καταστολείς όγκων ή παράγοντες γήρανση, συμπεριλαμβανομένης της p16

ΙΝΚ4 Χ200). (

C

) ανάλυση ενεργοποίησης Λυσοσωμική. κύτταρα HCT116 μολυσμένα με

παρωδία

ή

Sox2

βάφτηκαν με την προσθήκη lysotracker (50 Nm) στο μέσο καλλιέργειας για 5 λεπτά σε 37

oC, 5% CO

2 εκκολαπτήριο. Τα κύτταρα στερεώθηκαν με 4% φορμαλίνη, πλύθηκαν με PBS και ενεργοποίηση λυσοσωμικών παρατηρήθηκε κάτω από μικροσκόπιο φθορισμού (Χ200). (

D

) δοκιμασία ανοσοφθορισμού των LC3b (δηλαδή, ATG8b). HCT116 κύτταρα που εκφράζουν σταθερά

παρωδία

ή

Sox2

υποβλήθηκαν σε δοκιμασία φθορισμού για τον εντοπισμό LC3b. Τα κύτταρα παρατηρήθηκαν σε μικροσκόπιο φθορισμού (Χ200). Οι πυρήνες βάφτηκαν με DAPI? LM δείχνει οπτικό μικροσκόπιο (X200).

Η

Sox2 Προκαλεί Autophagy στα καρκινικά κύτταρα, αλλά όχι σε φυσιολογικά κύτταρα

Για να διερευνηθεί αν Sox2 υπερέκφραση μπορεί να προκαλέσει το σχηματισμό χυμοτόπιο σε διάφορες κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου , εμείς μετάγονται lenti-Sox2 ιικών σωματιδίων σε CCD-18Co κύτταρα φυσιολογικό κόλον και HCT116, ΗΤ29 και WiDr κύτταρα καρκίνου ανθρώπινου κόλον. Βρήκαμε ότι όλες οι κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου σχηματίζονται κενοτόπια στο κυτταρόπλασμα τους (Σχ. 2Α, βέλη). Ωστόσο, αν και CCD8-18Co κύτταρα φυσιολογικό κόλον έδειξε καλή έκφραση του Sox2 μετά από μεταγωγή με lenti-Sox2, τα κύτταρα δεν σχηματίζουν κενοτόπια ή εμφανίζουν μορφολογικές αλλαγές (Εικ. 2Α, Β). Περαιτέρω, επιπλέον αποτελέσματα επιβεβαίωσαν ότι ο σχηματισμός κενοτοπίων και την ενεργοποίηση όξινα λυσοσωμικών παρατηρήθηκαν στα καρκινικά κύτταρα HCT116 του κόλου, αλλά όχι σε CCD-18Co φυσιολογικά κύτταρα κόλου (Σχ. 2C). Επιπλέον, έκτοπη έκφραση του Sox2 σε εμβρυϊκά ινοβλάστες φυσιολογικό ποντίκι (ΠΜΑ) ή ανθρώπινο πρωτογενείς ινοβλάστες (NFDH και BJ) δεν προκάλεσε κενοτόπιο σχηματισμός (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται), αποδεικνύοντας ότι ο σχηματισμός κενοτοπίων που επάγεται από Sox2 υπερέκφραση σε κύτταρα HCT116 είναι πράγματι καρκινικό κύτταρο -εξειδικευμένης αυτοφαγία.

(

Α

) CCD-18Co (CRL-1459) φυσιολογικά κύτταρα του παχέος εντέρου και HCT116, ΗΤ29 και WiDr του παχέος εντέρου καρκινικά κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε κατάλληλο μέσο και μεταγωγή με

Sox2

ιικά σωματίδια. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν με πλήρες μέσο ανάπτυξης για 5 ημέρες μετά τη μεταγωγή. Τα κύτταρα παρατηρήθηκαν υπό μικροσκόπιο φωτός. Τα κυψελοειδή κενοτόπια που σημειώνονται με ένα βέλος στο

Sox2

εκφράζοντα κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου. (

B

) CCD-18Co κύτταρα φυσιολογικό κόλον καλλιεργήθηκαν, μεταγωγή με

mock

ή

Sox2

ιικά σωματίδια και καλλιεργήθηκαν με πλήρες μέσο ανάπτυξης για 5 ημέρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν, κατέστησαν διαπερατά και υβριδοποιήθηκε με ένα ειδικό αντίσωμα Sox2 και έπειτα με ένα Alexa 568-συζευγμένο δευτερογενές αντίσωμα, και οπτικοποιήθηκε με ένα μικροσκόπιο φθορισμού (Χ200). Οι πυρήνες βάφτηκαν με DAPI. Οι περιοχές του φωτός μικροσκόπιο είναι οι περιοχές που συνδυάζεται με Sox2 και DAPI φθορισμού. Η εγκιβωτισμένη περιοχή κάτω από χαμηλής ισχύος μεγεθύνεται για να συγκρίνετε τη μορφολογία μεταξύ HCT116-

εικονικές

και –

Sox2

εκφράζοντα κύτταρα. (

C

) ενεργοποίηση λυσοσωμικές, ένας δείκτης αυτοφαγία, συγκρίθηκε με την προσθήκη lysotracker-Red (50 ηΜ) σε 5 ημέρες μετά από μεταγωγή να CCD-18Co φυσιολογικά κύτταρα κόλου HCT116 και ορθοκολικού καρκίνου κύτταρα μολυσμένα με

mock

ή

Sox2

. Τα κύτταρα παρατηρήθηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού. LM δείχνει την ίδια περιοχή του φωτός μικροσκόπιο αντιστοιχούν σε μικροσκόπιο φθορισμού (X200).

Η

Στόχοι Sox2 ATG10 για να προκαλέσει Autophagy

Για να διερευνήσουν τον μηχανισμό (ες) του Sox2 που προκαλείται από αυτοφαγία, χρησιμοποιήσαμε για πρώτη φορά μια ανάλυση μικροσυστοιχιών σε σύνολο 30.968 γονίδια από cDNA που απομονώθηκαν από κύτταρα μολυσμένα με

παρωδία

ή

Sox2

για τον εντοπισμό του γονιδίου (ες) στόχο Sox2 να προκαλέσει αυτοφαγία. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν 11.245 γονίδια που αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας τη σημαντική Ανάλυση Microarray προγράμματος (SAM) (https://www-stat.stanford.edu/~tibs/SAM). Βρήκαμε ότι το 2153 Sox2 που προκαλείται από γονίδια θα μπορούσαν να χαρακτηριστούν ως up-ρυθμιζόμενη και 1.575 γονίδια κάτω-ρυθμίζονται σε κύτταρα HCT116 (Εικ. 3Α και τον πίνακα S1). Χρησιμοποιήσαμε την βάση δεδομένων για το σχολιασμό, την απεικόνιση και την Ολοκληρωμένη Discovery (DAVID v6.7? Http: //niaid.abcc.ncifcrf.gove) να χαρακτηρίσει περαιτέρω τα γονίδια, σύμφωνα με βιολογικές ή μοριακές λειτουργίες τους και διαπίστωσαν ότι τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων που σχετίζονται με την αυτοφαγία , τον πολλαπλασιασμό και τη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου μεταβλήθηκε σημαντικά από την έκτοπη έκφραση του

Sox2.

αλλοιωμένη έκφραση του γονιδίου που περιλαμβάνονται αλλαγές στα γονίδια επιδιόρθωσης του DNA 33, τα γονίδια αντιγραφής 25 DNA, τα γονίδια σχετίζονται με την ανάπτυξη 20 κυττάρων, 26 ​​κυττάρων σχετίζονται με το μέγεθος γονίδια, 191 γονίδια που σχετίζονται με μεταγραφή και σηματοδότηση 17 ινσουλίνη γονίδια οδού που σχετίζονται με (Σχ. 3Α και πίνακες S1, S2 και S3). Είναι σημαντικό ότι,

Sox2

έκφραση που προκαλείται από αυξημένη έκφραση του

ATG10, ATG3, ATG4a, ATG4D

και

ATG8b

γονίδια από περίπου 2-4 φορές (Εικ. 3Α). Σε αντίθεση,

Sox2

έκφραση συσχετίστηκε με μειωμένη έκφραση του

ATG12, ATG16L2

και

ATG9B

γονίδια (Σχ. 3Α). Με την αναζήτηση μιας βάσης δεδομένων που περιέχει το Sox2 συναίνεση μοτίβο σύνδεσης στην περιοχή του υποκινητή στο γονιδίωμα [26], βρήκαμε ότι το

ATG10

και

ATG12

προαγωγοί περιέχουν μία υποθετική Sox2 δεσμευτική συναίνεση νουκλεοτιδίων μοτίβο υπόθαλψη ταυτότητα 63% (Πίνακας S4). Συγκρίνοντας μικροσυστοιχιών μας και τα αποτελέσματα έρευνας σε βάση δεδομένων, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι ATG10 θα μπορούσε να είναι ένας στόχος της Sox2 στην επαγωγή της αυτοφαγία. εξαρτάται από τον κύκλο μας αποτελέσματα RT-PCR έδειξε ότι το

ATG10

επίπεδο mRNA από

Sox2-

επιμολυσμένων κυττάρων αυξήθηκε κατά περίπου 2,5 φορές σε σύγκριση με το

παρωδία

(Εικ. 3Β ). Αξιοσημείωτα, κηλίδωση Western αποτελέσματα (Σχ. 3C) και immunocytofluorescence έναντι ATG10 (Σχ. 3D) έδειξε ότι ATG10 και πρωτεΐνη LC3 επίπεδα αυξήθηκαν από υπερέκφραση του Sox2. Για να προσδιορίσετε αν το

ATG10

προαγωγός ενεργοποιείται από Sox2, κατασκευάσαμε δύο

πλασμίδια λουσιφεράσης

ρεπόρτερ που περιέχει -1.522 έως -1 (

pGL3-ATG10-1522

) και – 711 έως -1 (

pGL3-ATG10-711

) (Σχήμα 3Ε.) από την αναζήτηση και την ανάλυση του

ATG10

περιοχές προαγωγού, τα οποία περιέχουν υποθετικές Sox και SRY δεσμευτική μοτίβα σε -1327 και – 1473 από την θέση έναρξης της μεταγραφής (Σχ. 3Ε). Βρήκαμε ότι η διαγραφή της περιοχής δέσμευσης υποθετική Sox2 κατέστειλε σημαντικά την δραστηριότητα της λουσιφεράσης (Σχ. 3F). Αξίζει να σημειωθεί ότι,

ATG10

δραστηριότητα υποκινητή αυξήθηκε κατά υπερέκφραση Sox2 (Σχ. 3G), υποδεικνύοντας ότι Sox2 επάγει

AT10

γονιδιακής έκφρασης και προκαλεί αυτοφαγία.

(

Μια

) μικροσυστοιχιών.

Top πίνακα

, HCT116 καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα που εκφράζουν σταθερά

παρωδία

ή

Sox2

υποβλήθηκαν σε ανάλυση μικροσυστοιχιών όπως περιγράφεται στο «Υλικά και Μέθοδοι». Το κίτρινο χρώμα υποδηλώνει τον αριθμό των γονιδίων που δεν έδειξε σημαντική διαφορά μεταξύ των

παρωδία

και

Sox2

έκφρασης. Τα κόκκινα και πράσινα χρώματα δείχνουν τον αριθμό των γονιδίων της επέκτασης ή υποβιβασμού ρυθμίζονται, αντίστοιχα, σε κύτταρα HCT116 που εκφράζουν σταθερά

Sox2

σε σύγκριση με κύτταρα που εκφράζουν το

παρωδία

ελέγχου.

κάτω πίνακας

, περίληψη των γονιδίων που σχετίζονται με αυτοφαγία προκύπτουν από την ανάλυση μικροσυστοιχιών. Επάνω και κάτω ρύθμιση σημειώνονται στις τιμές Log2. (

Β

) Έκφραση του

ATG10

προκαλείται από Sox2. Ολικό RNA (1 μg) από κύτταρα HCT116 μολυσμένα με

mock

ή

Sox2

μεταγράφηκε ανάστροφα και

ATG10

ενισχύθηκε με τον κύκλο που εξαρτώνται από PCR και το

ATG10

επίπεδο έκφρασης έγινε ορατή με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης στο

ος κύκλος 21. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος για την επαλήθευση ίση χρησιμοποίηση του cDNA για την PCR. (

C

) Up-ρύθμιση των ATG10 και LC3b τα επίπεδα της πρωτεΐνης που προκαλείται από το

Sox2

έκφρασης. Οι πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν από κύτταρα HCT116 που εκφράζουν σταθερά

mock

ή

Sox2

και πρωτεΐνες ATG10 και LC3b έγιναν ορατές με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας ειδικά αντισώματα. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος για την επαλήθευση της ίσης φόρτωσης πρωτεΐνης. (

D

) Επιβεβαίωση του επιπέδου της πρωτεΐνης ATG10 Sox2 που προκαλείται. HCT116 καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα μολύνθηκαν με το

παρωδία

ή

Sox2

και καλλιεργούνται 5 ημέρες. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν, υβριδοποιήθηκαν με έναν ειδικό ATG10 πρωτογενές αντίσωμα και Alexa 488-συζευγμένο δευτερογενές αντίσωμα. Τα επίπεδα πρωτεΐνης ATG10 παρατηρήθηκαν με μικροσκοπία φθορισμού. L.M. υποδεικνύει την ίδια περιοχή του φωτός μικροσκοπία αντιστοιχεί σε μικροσκόπιο φθορισμού (Χ200). (

E

) Κατασκευή του

ATG10

υποστηρικτής

λουσιφεράσης

Ρεπόρτερ πλασμίδιο. Οι νουκλεοτιδικές αλληλουχίες του ανθρώπινου

ATG10

περιοχή του υποκινητή είχαν κατεβάσει από Ensemble (https://uswest.ensemble.org). Η ανάλυση υποθετικό προαγωγό διεξήχθη χρησιμοποιώντας TFSEARCH (v1.3) (https://cbrc.jp/htbin/nph-tfsearch). Οι υποθετικές δεσμευτικές συναινετικές αλληλουχίες SRY και SOx συμβολίζεται με κόκκινο χρώμα και η θέση δέσμευσης της πολυμεράσης III είναι εγκιβωτισμένη. (

F

) Ο κλώνος BAC (RP11-111B20) αγοράστηκε από την Αυτοκρατορία Genomics (Buffalo, NY) και 1528 και 711 bp του

ATG10

περιοχή του υποκινητή ενισχύθηκαν με PCR. Το θραύσμα PCR ανασυνδυάζεται με τις

pGL3

βασικό φορέα για την κατασκευή pGL3-AT10-1582 και pGL3-ATG10-711

λουσιφεράσης πλασμίδια αναφοράς. Η

pGL3-ATG10-Luc

πλασμίδια αναφοράς επιβεβαιώθηκαν με προσδιορισμό της αλληλουχίας του DNA. Η

ATG10

υποστηρικτής

λουσιφεράσης

πλασμίδια αναφοράς,

pGL3-AT10-1582

και

pGL3-ATG10-71-

Luc, επιμολύνθηκαν παροδικά σε HCT116 κύτταρα και η δραστηριότητα της λουσιφεράσης πυγολαμπίδας αναλύθηκε μετά από 24 ώρες. Η

phRL-SV40 renilla

λουσιφεράση πλασμίδιο ρεπόρτερ ήταν συν-επιμολυσμένα ως εσωτερικού ελέγχου για την επαλήθευση της ίσης επιμόλυνση και την ομαλοποίηση της δραστηριότητας της λουσιφεράσης της πυγολαμπίδας (* p & lt? 0.001). (

G

) Η

pGL3-ATG10-1528

πλασμίδιο αναφοράς λουσιφεράσης παροδικά συν-επιμολυσμένα με ένα

παρωδία

ή

Sox2

φορέα έκφρασης ιικού σε κύτταρα HCT116 και η δραστικότητα της λουσιφεράσης πυγολαμπίδας αναλύθηκε μετά από 24 ώρες. Η

phRL-SV40 renilla

λουσιφεράση πλασμίδιο ρεπόρτερ ήταν συν-επιμολυσμένα ως εσωτερικού ελέγχου για την επαλήθευση της ίσης επιμόλυνση και την ομαλοποίηση της δραστηριότητας της λουσιφεράσης της πυγολαμπίδας (* p & lt? 0.001).

Η

Sox2- που προκαλείται autophagy διαμεσολαβείται από την προς τα κάτω ρύθμιση της Akt μονοπάτι σηματοδότησης, αλλά όχι μέσω Class III PI3-K Σηματοδοσίας

η νηστεία ή εξάντληση των αυξητικών παραγόντων όπως η ινσουλίνη προκαλεί αυτοφαγία [27]. Αποτελέσματα μικροσυστοιχίας μας έδειξαν ότι η έκφραση του γονιδίου που συνδέεται με την οδό σηματοδότησης της ινσουλίνης κατεστάλη (Πίνακας S3). Επομένως, εξετάσαμε τις αλλαγές στα επίπεδα της πρωτεΐνης που συνδέεται με την αυτοφαγία και ινσουλίνη σηματοδότηση με κηλίδωση Western. Βρήκαμε ότι Class III ΡΙ3-Κ (Vps34p) και Beclin δεν άλλαξαν, υποδεικνύοντας ότι η ΡΙ3-Κ /Beclin μονοπάτι σηματοδότησης δεν εμπλέκεται στην Sox2 επαγόμενη αυτοφαγία (Σχ. 4Α) Κατηγορία III. Με τη διερεύνηση της οδού ΡΙ3-Κ-Akt σηματοδότησης, διαπιστώσαμε ότι Akt φωσφορυλίωση (Ser308) ήταν σημαντικά ανέστειλε και τα συνολικά επίπεδα πρωτεΐνης Akt, mTOR και p70S6K μειώθηκαν σε

Sox2

μολυνθέντα κύτταρα σε σύγκριση με το

mock

μολυσμένους κύτταρα (Εικ. 4Β). Για να επιβεβαιωθεί σηματοδότησης που σχετίζονται με την αναστολή του μονοπατιού σηματοδότησης ΡΙ3-Κ-Ακί, αναλύσαμε GSK3α /SS και ΡΤΕΝ. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η φωσφορυλίωση του GSK3α /SS στο Ser9 /Ser21 κατεστάλη και επίπεδα ολικής πρωτεΐνης /SS GSK3α ήταν ελαφρώς αυξημένα σε

Sox2

μολυνθέντα κύτταρα σε σύγκριση με το

mock

μολυσμένους κύτταρα (Σχ . 4C). Συγκεκριμένα, βρήκαμε ότι η φωσφορυλίωση ΡΤΕΝ αυξήθηκε επίσης (Σχ. 4C), με αποτέλεσμα την καταστολή της σηματοδότησης ΡΙ3-Κ με απο-φωσφορυλίωσης [28]. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι Sox2 μεταβάλλει την οδό σηματοδότησης ΡΙ3-Κ-Ακί μέσω GSK3α /SS και σηματοδότηση ΡΤΕΝ, αν και η ανάντη ειδική κινάση υπεύθυνη για φωσφορυλίωση της ΡΤΕΝ δεν είναι γνωστή σε αυτήν την περίπτωση. Εμείς επεξεργασμένα κύτταρα HCT116 που εκφράζουν

Sox2

ή

μακέτα

με ινσουλίνη ή LY294002, ένας αναστολέας της ΡΙ3-Κ. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι

Sox2

επαγόμενη σχηματισμό χυμοτόπια ήταν σημαντικά αναστέλλεται από τη θεραπεία με ινσουλίνη (Εικ. 4D

αριστερό πάνελ

s,

E). Ωστόσο, οι

mock

μολυσμένους κύτταρα δεν εμφάνισαν σχηματισμό κενοτόπιο ή όχι αγωγή με ινσουλίνη, σε κανονικές συνθήκες καλλιέργειας κυττάρων (10% FBS) ή να κατασταλεί ο σχηματισμός κενοτοπίων σε κατάσταση ασιτίας (0% FBS) (Σχ. 4D

αριστερό και το μεσαίο πάνελ,

E, F). Βρήκαμε επίσης ότι

mock

μολυσμένους κύτταρα παρουσίασαν αυξημένο σχηματισμό χυμοτόπια μετά τη θεραπεία με LY294002, ενώ

Sox2

υπερέκφραση προκάλεσε περισσότερους χυμοτόπια σχηματισμό που προκαλείται από τη θεραπεία LY294002 σε σύγκριση με το

εικονικές

( Εικ. 4D

δεξί πάνελ

s,

E, F). Παρόμοια φαινόμενα παρατηρήθηκαν υπό συνθήκες πείνας (Σχ. 4Ε, F). Στο σύνολό τους, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ρύθμιση προς τα κάτω της ΡΙ3-Κ-Akt μονοπατιού από PTEN μπορεί να συνεργαστεί για να προκαλέσει την αυτοφαγία που σχετίζονται με την έκφραση Sox2.

(

-C A

) επίπεδα πρωτεΐνης της κατηγορίας Ι μορίων σηματοδότησης συμπεριλαμβανομένων Akt, mTOR και p70S6K και κατηγορίας ΙΙΙ μόρια σηματοδότησης ΡΙ3-Κ συμπεριλαμβανομένων Vps34p και Beclin αναλύθηκαν σε κύτταρα HCT116 που εκφράζουν σταθερά

παρωδία

ή

Sox2

. Οι επιμέρους πρωτεΐνες έγιναν ορατές με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας ειδικά αντισώματα. β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος για την επαλήθευση της ίσης φόρτωσης πρωτεΐνης. (

D

) Συμμετοχή της σηματοδότησης Κατηγορίας Ι PI3-K σε Sox2 που προκαλείται από αυτοφαγία. (

D, αριστερά πάνελ

) Κύτταρα HCT116 που εκφράζουν σταθερά

mock

ή

Sox2

υποβλήθηκαν σε αγωγή με ινσουλίνη ή LY294002 υπό συνθήκες 10% FBS που περιέχει σε 2 ημέρες μετά τη μόλυνση. σχηματισμό χυμοτόπιο παρατηρήθηκε με οπτικό μικροσκόπιο (X200). Οι εγκιβωτισμένες περιοχές είναι ξεχωριστά μεγεθύνεται 2 φορές (

κάτω πάνελ για πλαστή και Sox2

) για να απεικονίσει καλύτερα κενοτόπια.

(D, δεξιά πάνελ)

Τα κύτταρα υπέστησαν μεταγωγή με

Sox2

ιικά σωματίδια και καλλιεργήθηκαν 2 ημέρες. Το μέσο κυτταρικής καλλιέργειας αντικαταστάθηκε με 5a του McCoy χωρίς συμπλήρωση FBS αλλά συμπεριλαμβανομένων 5 μg /ml ινσουλίνη ή 5 μg LY294002 και στη συνέχεια τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 5 ημέρες. Τα κύτταρα παρατηρήθηκαν με οπτική μικροσκοπία (Χ200). (

E

) ποσοτική σύγκριση του σχηματισμού αυτοφαγία που προκαλείται από κατηγορίας Ι σηματοδότησης PI3-K. Η χυμοτόπιο κύτταρα από D και F σχηματίζουν μετρήθηκαν και συγκρίθηκαν σε ένα αριθμώ γραφικών (* p & lt? 0.001).

Η

Sox2 που προκαλείται Autophagy καταστέλλει τον πολλαπλασιασμό και Anchorage-ανεξάρτητη ανάπτυξη αποικιών με επαγωγή κυτταρικής γήρανσης σε HCT116 κύτταρα

καταστολή της δραστηριότητας ΡΙ3-Κ με ΡΤΕΝ έχει ένα σημαντικό ρόλο στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την ανάπτυξη καρκίνου του παχέος εντέρου [29], [30], [31]. PI3-K αναστολή από ΡΤΕΝ ή ουορτμαννίνη έχει μια αντίστροφη επίδραση σε σύγκριση με παράγοντα νέκρωσης όγκου α στην ισορροπία μεταξύ των ρ50 και ρ65 υπομονάδες του πυρηνικού παράγοντα

k

Β [31]. GM3, ένα γαγγλιοσίδιο, θεραπεία αυξάνει δραματικά εξαρτώμενη από κυκλίνη κινάση (ΟϋΚ) αναστολέα (ΟΚΙ) ρ21

έκφραση WAF1 μέσω της συσσώρευσης της πρωτεΐνης p53 του ΡΤΕΝ μεσολάβηση αναστολή της ΡΙ3-Κ-Akt-MDM2 σηματοδότηση επιβίωσης σε HCT116 καρκινικά κύτταρα κόλου [29]. Στην ανθρώπινη ορθοκολικό καρκίνο, μια αρνητική συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων πρωτεΐνης ΡΤΕΝ και φωσφορυλίωση της Akt έχει παρατηρηθεί [30]. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι κάτω ρύθμιση των ΡΙ3-Κ-Akt σηματοδότηση μέσω ΡΤΕΝ μπορεί να εμπλέκεται σε Sox2 επαγόμενη αυτοφαγία (Εικ. 4). πολλαπλασιασμό των κυττάρων μας και του κυτταρικού κύκλου αναλύσεις έδειξαν ότι

λοίμωξη Sox2

σε κύτταρα HCT116 κατέστειλαν πολλαπλασιασμό επάγοντας τη συσσώρευση των κυττάρων στο G0 /G1 και υπο-G1 και τη μείωση των φάσεων του κυτταρικού κύκλου S σε σύγκριση με το

εικονικές

μολυσμένους κύτταρα (Σχ. 5Α). Η εξασθένηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων που σχετίζεται με περίπου 90% αναστολή της ανάπτυξης του καρκίνου ανεξάρτητη από προσκόλληση σε μαλακό άγαρ, ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα του ιδιοτήτων των καρκινικών κυττάρων [32] (Σχ. 5Β). Για να διερευνήσουν το υπεύθυνο σηματοδότησης για την επαγωγή της απώλειας των ιδιοτήτων των καρκινικών κυττάρων, όπως καταστολή του πολλαπλασιασμού και μαλακό άγαρ ανάπτυξης, εξετάσαμε διάφορα καταστολείς όγκων με γνωστό ρόλο στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου. Παρατηρήσαμε μια αύξηση στη φωσφορυλίωση ρ53 (Ser15) και αυξήσεις στα συνολικά επίπεδα πρωτεΐνης ρ16

ΙΝΚ4 & και ρ21 (Εικ. 5C), οι οποίες είναι καλά γνωστό ότι εμπλέκονται ισχυρά στην κυτταρική γήρανση [33]. Στη συνέχεια εξετάζεται η γήρανση χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία SA-β-γαλακτοσιδάση και διαπίστωσε ότι η έκτοπη έκφραση του

Sox2

δραστηριότητα ενισχύεται β-γαλακτοσιδάση και το επίπεδο της πρωτεΐνης (Εικ. 5D,

αριστερό και το μεσαίο πάνελ

) και κατέστειλε Ki-67 επίπεδο πρωτεΐνης, ενός δείκτη πολλαπλασιασμού των κυττάρων (Εικ. 5D,

δεξί πάνελ

). Αξίζει να σημειωθεί ότι, πάνω από το 90% των κυττάρων που περιέχουν κενοτόπια χρώση β-gal θετικά (σχ. 5D,

γράφημα

), Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι Sox2 επαγόμενη autophagy προκαλεί απώλεια των ιδιοτήτων όγκου σε HCT116 κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου .

(

Α

)

Αριστερό πάνελ

, επίδραση του

Sox2

έκφρασης στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. κύτταρα HCT116 (2 × 10

3) που εκφράζει σταθερά

mock

ή

Sox2

σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων και ο πολλαπλασιασμός αναλύθηκε με δοκιμασία MTS σε διαστήματα 24 h έως 96 h (*, p & lt? 0.001).

Μέση και δεξιά πάνελ

, επίδραση του

Sox2

έκφραση για την κατανομή του κυτταρικού κύκλου. κύτταρα HCT116 (4 × 10

5) που εκφράζει σταθερά

παρωδία

ή

Sox2

ήταν seeded, καλλιεργήθηκαν και στη συνέχεια διανομή του κυτταρικού κύκλου (

μεσαίο πλαίσιο

) και υπο- G1 συσσώρευση (

δεξί πάνελ

) αναλύθηκαν με FACS (*, ρ & lt? 0.001). (

Β

) Επίδραση του

Sox2

έκφρασης στην ανάπτυξη των αποικιών αγκύρωση-ανεξάρτητη. κύτταρα HCT116 (8 × 10

3) που εκφράζει σταθερά

mock

ή

Sox2

υποβλήθηκαν σε μια δοκιμασία μαλακού άγαρ ανάπτυξης αποικίας για 5-7 ημέρες. Οι αποικίες κυττάρων βαθμολογήθηκαν χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα Image-Pro Plus (v.6), το λογισμικό ηλεκτρονικών υπολογιστών (* p & lt? 0.001) μικροσκόπιο και. (

C

) Πρωτεΐνη προφίλ που σχετίζονται με την ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου. Οι πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν από κύτταρα HCT116 που εκφράζουν σταθερά

mock

ή

Sox2

και υποβλήθηκε σε στύπωση Western για την ανίχνευση του επιπέδου των διαφόρων πρωτεϊνών που είναι γνωστό ότι εμπλέκονται στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος για την επαλήθευση της ίσης φόρτωσης πρωτεΐνης. (

D

) Κυτταρική δοκιμασία γήρανση.

Αριστερό πάνελ

, HCT116 κύτταρα που εκφράζουν σταθερά

παρωδία

ή

Sox2

αναλύθηκαν για τη γήρανση χρησιμοποιώντας μια γήρανση β-γαλακτοσιδάση κιτ χρώσης. Τα κύτταρα παρατηρήθηκαν υπό μικροσκόπιο φωτός (Χ200).

Μέση

και

δεξιά πάνελ

, το επίπεδο της πρωτεΐνης β-γαλακτοσιδάση ή Ki-67 ανιχνεύθηκε σε κύτταρα HCT116 που εκφράζουν σταθερά

παρωδία

ή

Sox2

χρησιμοποιώντας ειδικά πρωτογενή αντισώματα όπως υποδεικνύεται και ένα συζευγμένο με HRP δευτερογενές αντίσωμα. Η ανοσοκυτταροχημική ανίχνευση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το Sigma FASTTM 3,3′-διαμινοβενζιδίνη Terahyfrochloride με Sets Metal Enhancer Tablet (DAB υποστρώματος υπεροξειδάσης). Τα επίπεδα πρωτεΐνης έγιναν ορατές χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φωτός (Χ200).

Γράφημα

, δείχνει μια σύγκριση των β-γαλακτοσιδάση πληθυσμό θετικών κυττάρων σε κύτταρα HCT116 που εκφράζουν σταθερά

παρωδία

ή

Sox2

(* p & lt? 0.001).

Νοκ ντάουν του

ATG10

Επαναφέρει

Sox2

επαγόμενη Autophagy, κυτταρική γήρανση και κυτταρικού πολλαπλασιασμού

προηγούμενα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι

Sox2

μεσολάβηση αυτοφαγία επιτυγχάνεται με τη μεσολάβηση

ATG10

έκφρασης (Εικ. 3). Να εξετάσει κατά πόσον νοκ ντάουν του

ATG10

μπορεί να καταστείλει την αυτοφαγία προκαλείται από Sox2 υπερέκφραση, έχουμε επιλέξει μια

PSH-ATG10-1755

νοκ ντάουν φορέα (Σχ. 6Α). Η

sh-ATG10

ιικά σωματίδια μολύνθηκαν σε

Sox2

-preinfected κυττάρων και έκφραση του Sox2 (Σχ. 6Β,

άνω πλαίσια

) και knockdown του

ATG10

(Εικ. 6Β,

κάτω πάνελ

) επιβεβαιώθηκαν με μια δοκιμασία ανοσοφθορισμού. Πολύ σημαντικό, οι κυτταρικές μορφολογίες των αυτοφαγία προκαλείται από Sox2, συμπεριλαμβανομένων των κυττάρων ισοπέδωση, την πυρηνική μέγεθος και το σχηματισμό χυμοτόπια, ήταν εντελώς μετατραπεί σε εκείνες που παρατηρήθηκαν σε

παρωδία

μολυσμένους HCT116 κύτταρα (Εικ. 6Β, Ε.Μ.). Επιπλέον, επιβεβαίωσε ότι η μορφολογική αποκατάσταση αντιστοιχούσε με την αποκατάσταση του Ki-67, β-γαλακτοσιδάση, p16

επίπεδα ΙΝΚ4 & και της πρωτεΐνης p21 στο

mock

μολυσμένους κύτταρα HCT116 (Εικ. 6C). Αξίζει να σημειωθεί ότι, επιβεβαιώσαμε ότι το νοκ ντάουν του

ATG10

σε HCT116 που εκφράζουν σταθερά Sox2 ανακτηθεί τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, η οποία ανεστάλη με Sox2 υπερέκφραση, και η αύξηση ήταν ακόμη πιο γρήγορα από ό, τι εκείνη των κυττάρων HCT116 που εκφράζουν σταθερά

εικονικές

ελέγχου (Εικ. 6D). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ATG10 παίζει σημαντικό ρόλο στο σχηματισμό autophagy επάγεται από Sox2 έκφραση σε HCT116 ορθοκολικό καρκίνο κύτταρα.

(

A

) Επιβεβαίωση της αποτελεσματικότητας των knockdown ATG10. Νοκ ντάουν της ATG10 χρησιμοποιώντας το

pLKO-shATG10

. Η

pLKO-shATG10

νοκ ντάουν lenti-ιικά σωματίδια μολύνθηκαν σε κύτταρα HCT116 που εκφράζουν σταθερά

Sox2

και τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 36 ώρες. Οι πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν και knockdown αποτελεσματικότητα προσδιορίστηκε με στύπωμα Western χρησιμοποιώντας ένα ειδικό αντίσωμα ATG10. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος για την επαλήθευση της ίσης φόρτωσης πρωτεΐνης. (

Β

) μορφολογικές αλλαγές που προκαλούνται από

ATG10

νοκ ντάουν στα κύτταρα HCT116 που εκφράζουν σταθερά

Sox2

. HCT116-mock, -Sox2 και -Sox2 /sh-ATG10 κύτταρα αναλύθηκαν για μορφολογικές αλλαγές και τα επίπεδα πρωτεΐνης του Sox2 (κόκκινο) και ATG10 (πράσινο) προσδιορίστηκαν με μια δοκιμασία ανοσοφθορισμού χρησιμοποιώντας ειδικά αντισώματα. Τα κύτταρα παρατηρήθηκαν κάτω από ένα φθορισμού ή ένα ελαφρύ μικροσκόπιο (X200). Ε.Μ. δείχνει οπτικό μικροσκόπιο. (

C

) Αποκατάσταση του κυτταρικού κύκλου, του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και των δεικτών γήρανση με να χτυπήσει κάτω

ATG10

στα κύτταρα HCT116 που εκφράζουν σταθερά

Sox2

. HCT116-παρωδία, -Sox2 και -Sox2 /sh-ATG10 κύτταρα σπάρθηκαν σε μια διαφάνεια 4-θάλαμο, σταθερό και διαπερατά. Μαρκαδόροι για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, την κυτταρική γήρανση και τη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου που περιλαμβάνονται Ki-67, β-γαλακτοσιδάση, p16

ΙΝΚ4 & και p21. Αυτοί οι δείκτες αναλύθηκαν με ανοσοκυτταροχημεία με ειδικά αντισώματα όπως υποδεικνύεται με τη χρήση του Sigma FASTTM 3,3′-Διαμινοβενζιδίνη Terahyfrochloride με Σετ Μεταλλικά Enhancer Tablet (ΣΔΠ υποστρώματος υπεροξειδάσης). Τα κύτταρα παρατηρήθηκαν κάτω από ένα φθορισμού ή ένα ελαφρύ μικροσκόπιο (X200). (

D

) Αποκατάσταση του πολλαπλασιασμού με να χτυπήσει κάτω

ATG10

στα κύτταρα HCT116 που εκφράζουν σταθερά

Sox2

.