Abstract

Τα επιθηλιακά-to-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ), την φαινοτυπικής αλλαγής κυττάρων από ένα επιθηλιακό σε έναν τύπο μεσεγχυματικά, πιστεύεται ότι είναι ένα γεγονός κλειδί στην εισβολή και τη μετάσταση των αδενοκαρκινωμάτων. Αυτές οι αλλαγές συνεπάγονται απώλεια της κερατίνης έκφρασης, καθώς και η απώλεια της κυτταρικής πολικότητας και πρόσφυση. Εμείς εδώ με στόχο να προσδιοριστεί αν η απώλεια της κεράτινης έκφρασης ίδιας δίσκους αυξημένη εισβολή και τη μετάσταση σε αδενοκαρκινώματα και αν κερατίνη απώλεια οδηγεί στις φαινοτυπικές αλλαγές που σχετίζονται με EMT. Ως εκ τούτου, χρησιμοποιείται ένα περιγράφηκε πρόσφατα μοντέλο ποντικού στο οποίο διαγραφή όρους του συμπλέγματος κερατίνη II με ανασυνδυάση Cre οδηγεί στην απώλεια του όλη την οικογένεια keratinmultiprotein. Αυτοί οι ποντικοί διασταυρώθηκαν σε ένα πρόσφατα παράγεται ανασυνδυάση Cre επαγώγιμο KRAS καθοδηγείται μοντέλο καρκίνου του πνεύμονα ποντικού να εξετάσει την επίδραση της κερατίνης απώλεια στη μορφολογία, εισβολή και μετάσταση, καθώς και την έκφραση των γονιδίων που σχετίζονται με EMT στα προκύπτοντα όγκους. Εμείς εδώ δείχνουν σαφώς ότι η απώλεια της λειτουργικής κερατίνη κυτταροσκελετό δεν μετέβαλε σημαντικά τη μορφολογία του όγκου ή βιολογία από την άποψη της εισβολής, της μετάστασης, του πολλαπλασιασμού ή φορτίο όγκου και δεν οδήγησε σε επαγωγή του EMT. Περαιτέρω, τα καρκινικά κύτταρα δεν προκάλεσε συγχρονισμένα έκφραση βιμεντίνης, που συχνά εμφανίζονται σε EMT, για να αντισταθμίσει την απώλεια κερατίνη. Εν περιλήψει, τα στοιχεία μας δείχνουν ότι οι αλλαγές στο σχήμα των κυττάρων και τη μετανάστευση που διέπουν EMT εξαρτώνται από αλλαγές στα μονοπάτια που προκαλούν δευτερογενείς αλλαγές στην κερατίνη έκφρασης και οργάνωσης σηματοδότησης. Έτσι, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η απώλεια της κερατίνης κυτταροσκελετού per se δεν είναι επαρκής για να αιτιολογικά EMT κίνησης σε αυτό το μοντέλο όγκου

Παράθεση:. König K, L Meder, Kröger C, Diehl L, Florin Α, Rommerscheidt-αναστάτωση U, et al. (2013) Απώλεια της κερατίνη Κυτταροσκελετού δεν είναι επαρκής για να προκαλέσει Τα επιθηλιακά μεσεγχυματικά μετάβαση σε ένα νέο γονίδιο KRAS Driven Σποραδικές καρκίνο του πνεύμονα μοντέλο ποντικού. PLoS ONE 8 (3): e57996. doi: 10.1371 /journal.pone.0057996

Επιμέλεια: Βικτωρία Lawson, Πανεπιστήμιο της Μελβούρνης, στην Αυστραλία

Ελήφθη: 24 Σεπ 2012? Αποδεκτές: 30 Ιαν, 2013? Δημοσιεύθηκε: 11 Μαρτίου 2013

Copyright: © 2013 König et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Το έργο χρηματοδοτήθηκε από το γερμανικό Συμβούλιο έρευνας μέσω SFB 832, Projekt Α5 και Ζ1 και τη γερμανική Ενίσχυση του καρκίνου μέσω του CIO της Κολωνίας /Βόννης. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

φαινοτύπου αλλαγές από ένα επιθηλιακό σε ένα τύπο κυττάρου μεσεγχυματικά, που αναφέρεται ως επιθηλιακά-to-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ), είναι βασικά βήματα για την εισβολή και τη μετάσταση του καρκίνου. Ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα του EMT πιστεύεται ότι αναδιαμόρφωση του κυτταροσκελετού, όπως προς τα κάτω ρύθμιση των επιθηλιακών κεράτινες, η οποία οδηγεί σε μεταβολές στην κυττάρου-προς-κύτταρο συμφύσεις και οι αλλαγές στην πολικότητα και κυτταρική κινητικότητα [1]. Αυτές οι αλλαγές έχουν περιγραφεί στα περισσότερα είδη αδενοκαρκινώματα και πιστεύεται ότι υποστηρίζουν διεισδυτικότητα των όγκων και σχηματισμού μετάστασης [2] και την αντίσταση στη χημειοθεραπεία [3].

Ο καρκίνος του πνεύμονα, η πιο κοινή αιτία θανάτου από καρκίνο παγκοσμίως, παραδοσιακά χωριστεί σε καρκινώματα μικρών κυττάρων του πνεύμονα (SCLC) και καρκινωμάτων μη-μικρού κυττάρου του πνεύμονα (NSCLC). SCLCs αποτελούν το 20% των καρκίνων του πνεύμονα [4]. Οι NSCLCs υποδιαιρούνται περαιτέρω σε τρία ιστολογική υποτύπους: καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων, αδενοκαρκίνωμα και νευροενδοκρινείς όγκους. NSCLCs σχηματίζουν μεγάλα συνεκτική πρωτογενείς όγκους που διαφέρουν από SCLCs, οι οποίες είναι κλινικά πολύ επιθετική και αποκαλύπτουν ένα ποσοστό θνησιμότητας από 95% [5]. SCLCs μεταστάσεις πολύ νωρίς, είναι μη-συνεκτική και δείχνουν μια διάχυτη διηθητική και πρότυπο ανάπτυξης. Ιστολογικά, χαρακτηρίζονται από μια ατελή και συμπυκνωμένο κερατίνη κυτταροσκελετού εμφανίζοντας μια τονισμένη και περιπυρηνική διανομής.

Με την αυξανόμενη εφαρμογή των στοχευμένων EGFR αναστολέας κινάσης τυροσίνης (ΤΚΙ) θεραπεία στην αδενοκαρκινώματα του πνεύμονα, διάφοροι μηχανισμοί αντίστασης ενάντια σε αυτό θεραπείας έχουν προκύψει. Από τη μία πλευρά, έχουν παρατηρηθεί μεταλλάξεις που προκαλούν στερεοχημική αλλαγές στην πρωτεΐνη-στόχο ή διαφυγή της ανέστειλε στόχου μέσω της πρόσληψης ενός δεύτερου μετατροπέα υποδοχέα ή σήματος. Από την άλλη πλευρά, γενεαλογία μετασχηματισμό με υποβάλλονται σε επιθηλιακά-to-μεσεγχυματικά μετάβασης (ΕΜΤ) [6] ή η υποτροπή του ΤΚΙ αντιμετωπίζονται NSCLS ως μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (SCLC) έχουν περιγραφεί [7], [8]. Έτσι, αυτές οι κλινικές παρατηρήσεις υποστηρίζουν την υπόθεση ότι η εξέλιξη από NSCLCs να SCLCs μπορεί να προκληθεί από EMT.

Δεδομένου ότι η απώλεια της κερατίνης έκφρασης πιστεύεται ότι είναι κεντρικής σημασίας για EMT, ανιχνεύοντας μειωθεί ή να χάσει την έκφραση της keratins

στο vivo

χρησιμοποιείται ως δείκτης της EMT σε πολλές

in vivo

συστήματα μοντέλου, καθώς και σε ιστολογικές ανθρώπινα τμήματα. Απώλεια κεράτινες οδηγεί σε απώλεια της κυτταρικής κόμβων, όπως οι λειτουργικές δεσμοσωμάτων και καλσόν κόμβους, και ως εκ τούτου ισχυρή πρόσφυση κυττάρου-κυττάρου [9], [10]. Ειδικότερα, η έκφραση του ενώσεις προσφύσεως ρυθμίζεται από γονίδια EMT τόσο σε αδενοκαρκινώματα και καρκινώματα πλακωδών κυττάρων του πνεύμονα [11].

Ωστόσο, ο ακριβής λειτουργικός ρόλος της κερατίνης απώλεια κατά την ανάπτυξη όγκου, μετάσταση και εισβολή και το ρόλο της στην EMT δεν είναι σαφώς σε κάθε μοντέλο όγκου. Ως εκ τούτου, διερευνήθηκε κατά πόσον πλήρη απώλεια της κερατίνης έκφρασης προκαλεί EMT, εισβολή και τη μετάσταση. Για το σκοπό αυτό, αναπτύξαμε ένα νέο επαγώγιμο μοντέλο ποντικού για αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα ελαττωματικά σε ολόκληρο το τύπο κερατίνη σύμπλεγμα II και προκαλούν αποτυχία σχηματισμού τυχόν λειτουργική κερατίνη νημάτια. Χρησιμοποιώντας αυτό το μοντέλο, έχουμε εδώ δείξει ότι η απώλεια πλήρης κερατίνη σε KRAS όγκους μεταλλαγμένου πνεύμονα δεν επηρεάζει τη μορφολογία του όγκου, εισβολή ή μετάσταση, υποδεικνύοντας ότι η απώλεια του κερατίνη κυτταροσκελετού δεν οδηγεί τη μετάβαση των όγκων του πνεύμονα σε μικροκυτταρικό καρκίνωμα του πνεύμονα ή sarcomatoid φαινότυπο . Επιπλέον, οι δείκτες EMT δεν είχαν μέχρι ρυθμίζονται με κερατίνη ανεπάρκεια αδενοκαρκινώματα.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Αυτή η μελέτη πραγματοποιήθηκε σε αυστηρά σύμφωνα με τις συστάσεις του FELASA. Το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας των πειραμάτων σε ζώα του Πανεπιστημίου της Βόννης. Όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία.

Δημιουργία RASLO διαγονιδιακά ποντίκια

Για την πρόκληση των όγκων του πνεύμονα, δημιουργήσαμε ένα φορέα έκφρασης που εκφράζει ένα μεταλλαγμένο KRAS

VAL12 καθώς και ένα μόριο σύντηξης που αποτελείται ωολευκωματίνης, ένα S-tag και ένα μόριο λουσιφεράσης καθοδηγείται από έναν 1.8-kb κοτόπουλο β-ακτίνης [4] μετά την Cre-μεσολάβηση αφαίρεση ενός STOP κωδικόνιο. RASLO ποντικοί δημιουργήθηκαν με ένεση προπυρήνα C57BL /6 × εμβρύων FVB F1 με την ογκογόνο KRAS κατασκεύασμα που απεικονίζεται στο Σχήμα 1Α. Τα ποντίκια είχαν εκτραφεί στην κεντρική εγκατάσταση ζώων του Πανεπιστημίου της Βόννης, σύμφωνα με την Ομοσπονδία των κατευθυντήριων γραμμών Επιστήμης Ευρωπαϊκό Εργαστήριο Ζώων. Η Επιτροπή Φροντίδας Ζώων της Βόρειας Ρηνανίας-Βεστφαλίας ενέκρινε όλα τα πειράματα του ποντικιού.

(Α) Σχηματική δομή που δείχνει τη στρατηγική που χρησιμοποιείται για την παραγωγή του επαγώγιμου μοντέλο καρκίνου του πνεύμονα οδηγείται KRAS (RASLO). (Β) Bio-φωταύγεια εικόνα που λαμβάνονται με IVIS-200 (Xenogen) κάμερα των ινοβλαστών ουρά πολιτισμών των ποντικών ιδρυτή RASLO μετά τη θεραπεία με πρωτεΐνη 2 μΜ ΤΑΤ-CRE και η προσθήκη των λουσιφερίνης δικαίωμα πριν από την απεικόνιση, δείχνει ισχυρά σήματα σε 5 ποντίκια ιδρυτής . (Γ) Luciferase απεικόνισης (IVIS-200) επί 1 λεπτό σε μέτρια ευαισθησία RASLO ποντικών 6 εβδομάδες μετά την επαγωγή με 2 × 10

7 PFU του αδενο-CRE i.n (+) ή τους ελέγχους αναπαραγωγής. (-). Τα ποντίκια ενέθηκαν ί.ρ. με λουσιφερίνη σε 200 μΙ PBS και αναισθητοποιούνται με εισπνοή ισοφλουράνης. (Δ) Η μακροσκοπική εικόνα του πνεύμονα ενός ποντικού RASLO 6 εβδομάδες μετά τη χορήγηση του AdCre, και (Ε) HE βάφτηκαν τμήμα με πολλαπλούς όγκους σε μεγέθυνση 100x και 400x. ανάλυση (F) PCR του DNA που απομονώθηκε από κυτταρικές σειρές που προέρχονται από όγκους των RASLO και RASLO × KIIf /d ποντίκια εμφανίζουν ένα προϊόν PCR 240 bp που δείχνει ότι η κασέτα διακοπής έχει αφαιρεθεί με επιτυχία από CRE ρεκομπινάση στον όγκο. Ο φορέας που χρησιμοποιείται για να δημιουργηθεί το στέλεχος ποντικού (pRASLO) πριν από τη θεραπεία CRE δείχνει ένα θραύσμα 1200 bp. Το ίδιο φορέα μετά τη θεραπεία Cre ίη vitro χρησιμεύει ως ένας θετικός έλεγχος για την CRE μεσολάβηση εκτομή και δείχνει την αναμενόμενη ζώνη 240 bp μετά ανασυνδυασμό.

Η

Διαλογή για RASLO διαγονιδιακά ποντίκια

αποκόμματα Tail των ιδρυτών χρησιμοποιήθηκαν για να δημιουργηθεί καλλιέργειες ινοβλαστών και την ανάλυση PCR. Ως εκ τούτου, συμβουλές ουρά αποστειρώθηκαν με 70% αιθανόλη, κομμένο σε μικρά κομμάτια και υπέστησαν πέψη με κολλαγενάση για τέσσερις ώρες στους 37 ° C. Αυτά καλλιεργήθηκαν σε μέσο DMEM που παρέχεται με 8% FCS, 2 mM γλουταμίνη και πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη. Μετά από πέντε ημέρες, ινοβλάστες ουρά υποβλήθηκαν σε αγωγή με 2 πρωτεΐνη μΜ Tat-Cre επί επτά ώρες και την επόμενη μέρα αναλύθηκαν κάτω από την κάμερα IVIS 200 βιοφωταύγεια μετά την προσθήκη του λουσιφερίνης στο μέσο καλλιέργειας. PCR και προσδιορισμού λουσιφεράσης θετική ιδρυτές χρησιμοποιήθηκαν για τη δημιουργία αρκετών στελεχών RASLO. Γονοτυπική διεξήχθη από την ουρά PCR χρησιμοποιώντας τα εμπρός (5′-CAGTGCAATGAGGGACCAGT-3 ‘) και όπισθεν εκκινητές (5′-CACCCTGTCTTGTCTTTGCTGATG-3’).

Παραγωγής και Διοίκησης του αδενοϊό CRE

ΗΕΚ 293 κύτταρα μολύνθηκαν με ανασυνδυασμένο αδενοϊό που εκφράζει ανασυνδυάση Cre (AdCre) [12] με (ΜΟΙ = 5). Μετά από πέντε ημέρες, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και ο ιός απελευθερώθηκε με ταχείς κύκλους απόψυξης και την κατάψυξη. Ο ιός καθαρίστηκε με υπερφυγοκέντρηση σε κλίση χλωριούχου καισίου [13] Στη συνέχεια, τα αποθέματα ιού που παράγεται μέσω της συγκέντρωσης χρησιμοποιώντας κασέτες Slidalyzer (Thermo Fisher Scientific).

Πριν από την ρινική εφαρμογή των ποντικών AdCre αναισθητοποιήθηκαν με ένα συνδυασμό 10 mg /ml Κεταμίνη /0.1% Rompun σε PBS. Ανάλογα με το βάρος του σώματος του ποντικού μεταξύ 150 μΐ και 200 ​​μΐ ενέθηκε ε.π. 2 × 10

7 PFU του AdCre μεταφέρθηκε με πιπέτα στη μύτη των ποντικιών που πρόκειται να εισπνευστεί. Τα ζώα παρατηρήθηκαν μέχρι πλήρως ξύπνιοι και άνετα. Δεν παρατηρήθηκαν σημάδια του άγχους και δυσφορία. Μετά την επαγωγή όγκου, τα ζώα παρακολουθούνταν καθημερινά για σημάδια δυσφορίας ή αναπνευστικής δυσχέρειας. Τα ποντίκια είχαν αποκλειστεί για περαιτέρω αναλύσεις, όταν οι ποντικοί εμφάνισαν συμπτώματα του αναπνευστικού στρες. Ποντίκια απεικονίστηκαν σε τακτική βάση στο πλαίσιο IVIS 200 φωτογραφική μηχανή βιοφωταύγεια (PerkinElmer). Εν συντομία, οι ποντικοί αναισθητοποιήθηκαν με εισπνοή ισοφλουράνης και στη συνέχεια έλαβαν 2,8 mg D-λουσιφερίνης Firefly (δαγκάνας) σε 200 μΙ PBS ί.ρ. και απεικονίζεται σε ένα θερμαινόμενο στάδιο. Τα ποντίκια θανατώθηκαν με αυχενική εξάρθρωση μετά από 6 εβδομάδες χορήγησης AdCre. Οι πνεύμονες αμέσως μονιμοποιήθηκαν σε 4% PBS-ρυθμισμένη φορμαλίνη για 24 ώρες για εμβάπτιση σε παραφίνη, ή καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο για κρυο-συντήρηση.

Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR)

DNA απομονώθηκε από κυτταρικές σειρές που παράγονται από διαγονιδιακά όγκους πνεύμονα ποντικού ή από φρέσκο ​​ιστό κατεψυγμένο (FF) των πνευμόνων με DNA Mini Kit (Qiagen). 50 ng του εκμαγείου DNA χρησιμοποιήθηκε ανά αντίδραση. Κάθε αντίδραση PCR περιείχε 1 χ ρυθμιστικό διάλυμα, 0.2 mM dNTP, 2 mM MgCl

2, 0.2 U Taq πολυμεράσης και 0,2 μΜ εκκινητή. Για να δείξουμε την επιτυχή εκτομή των θέσεων ΙοχΡ 5 ‘Lox5 εμπρός: 5′-CTGCTAACCATGTTCATGCC-3’ και 3 ‘Ras5 αντίστροφος: 5′-CCTACGCCACAAGCTCCAAC-3′ χρησιμοποιήθηκαν αποδίδοντας ένα προϊόν 240 bp. Χωρίς αποκοπή του STOP κωδικονίου Αυτοί οι εκκινητές δίδουν προϊόν 1,2 kb. Για να επιβεβαιώσετε κερατίνη εκτομή τόπου χρησιμοποιήθηκαν οι παρακάτω εκκινητές: DEL (εμπρός 5’-TGAACCCAGGAGGTTGAGAC-3 ‘και αντίστροφη 5′-TGGCGTCGTGATTAGTGATGA) και Flox (προς τα εμπρός 5′-GATAACCGTATTACCGCCTTTG-3′ και αντίστροφη 5’-CGCCCTCTTGTCTATATCAACC-3 ‘).

τηλέφωνα γραμμές

χρησιμοποιήθηκαν οι ακόλουθες κυτταρικές σειρές ανθρώπινης προέλευσης: Α549, H1975, Η460, HCC827, DMS114 και SW1271 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection. R. Thomas (Πανεπιστήμιο Κολωνίας) ευγενική παραχώρηση: N417 [14], PC9 [15]. GLC1, GLC2 [16], και GLC36 [17] ήταν ένα είδος δώρο του Dr. L. de Leij (Πανεπιστήμιο του Groningen, Groningen, Ολλανδία). κυτταρικές σειρές NSCLC και SCLC καλλιεργήθηκαν σε μέσο ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 8% FCS επωάστηκαν στους 37 ° C και 5% CO

2

κυτταρικές σειρές ποντικού πνεύμονα παρήχθησαν από RASLO ΒΠΕ + /+ και KIIf /. – ποντίκια. Οι όγκοι αποκόπηκαν με νυστέρι και πέψη για τουλάχιστον 3 ώρες στους 37 ° C σε DMEM /F12 θρεπτικό μέσο μέσο Ham με L-γλουταμίνη συμπληρωμένο με 2% λευκωματίνη βόειου, 0.5 μg /ml υδροκορτιζόνη, 600 U /ml κολλαγενάση, 5 μg /ml ανθρώπινης ινσουλίνης, 200 U /ml υαλουρονιδάση, ρυθμιστικό Hepes 10 mM, και πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη. Το κυτταρικό εναιώρημα διηθείται δύο φορές και τα ερυθρά αιμοσφαίρια λύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης ACK. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με μυϊκό EGF 20 ng /ml, βασικοί παράγοντες ινοβλαστών ανάπτυξης (bFGF) 20 ng /ml, άλας ηπαρίνης νατρίου από χοίρειο εντερικό βλεννογόνο 4 μg /ml, Β-27 ορού-Free Supplement, πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη και Γενταμυκίνη 35 μg /ml.

qRT-PCR

Ολικό RNA απομονώθηκε από ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές πνεύμονα ή κρυο-διατηρημένα ιστός πνεύμονα ποντικού (5 φορές 10 μm slides) με RNeasy Mini Kit (Qiagen). 500 ng του συνολικού RNA μεταγράφηκε σε cDNA χρησιμοποιώντας SuperScript ™ III H

– αντίστροφη μεταγραφάση και ολίγο (dT) 12-18 Primer (Life Technologies). qRT-PCR πραγματοποιήθηκε με SYBR Green (Qiagen) με εκκινητές που κατευθύνονται έναντι κερατίνη 8 (προς τα εμπρός 5′-GCCGTGGTTGTGAAGAAGA-3 ‘και αντίστροφος 5′-CTGTTCCCAGTGCTACCCT-3’). Ως μάρτυρας καθαριότητας χρησιμοποιήσαμε 28 s RNA (προς τα εμπρός 5-CCCAGTGCTCTGAATGTCAA-3 ‘και αντίστροφη 5′-AGTGGGAATCTCGTTCATCC-3′). Λουσιφεράσης εκκινητές είχαν την ακόλουθη αλληλουχία: 5’-προς τα εμπρός TTGCATTTTGATCCAGTCGAG-3 ‘και αντίστροφος 5′- TCGAGAGCGTGGATCAAACG-3′? και ως έλεγχος καθαριότητας 18 s:. εμπρός 5’-ACAGCCAGGTTCTGGCCAACGG-3 ‘και αντίστροφη 5′-TGACCGCGGACAGAAGGCCC-3’

Όλα τα qRT-ΡΟΚ έτρεξαν στο 7900HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems ), και αναλύθηκαν με λογισμικό SDS2.2 (Applied Biosystems). Όλα τα δείγματα αναλύθηκαν εις τριπλούν και επίπεδο έκφρασης υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο ΔΔCT.

ανοσοφθορισμού του καρκίνου του πνεύμονα κυτταρικών γραμμών

Τα κύτταρα απλώθηκαν σε καλυπτρίδες τη διάρκεια της νύχτας και μονιμοποιήθηκαν σε παγωμένη μεθανόλη για 5 λεπτά , στη συνέχεια χρωματίζονται με παν-κερατίνη (1:100, MNF116, Dako) και DP-1 (1:100, DP-1, Progen) αραιωμένο σε TBS /1% BSA /5% NGS για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Αντίστοιχες δευτερογενή αντισώματα κατσίκας αντι-gp

Alexa488 (1:800, Life Technologies), κατσίκα αντι-ποντικού

TexasRed (1:800, Life Technologies) και DAPI (1:1000, Life Technologies) αραιωμένο σε TBS /1% BSA /5% NGS προστέθηκαν στα κύτταρα για 45 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Εικόνες ελήφθησαν με ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο εφοδιασμένο με ApoTome (Zeiss).

Η ανοσοϊστοχημεία

Οι ιστοί μονιμοποιήθηκαν σε 4% PBS-ρυθμιστικό διάλυμα φορμόλης, ενσωματώθηκαν σε παραφίνη (FFPE). 3 μm πλάκες χρησιμοποιήθηκαν για ιστολογική λεκέδες. Ανοσοϊστοχημεία εκτελέστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18]. Χρησιμοποιήθηκαν τα ακόλουθα αντισώματα: Ki67 (1:25 TEC-3, Dako), Κ8 /18 (1:100, GP11, Progen), βιμεντίνη (1:100, EPR3776, Abcam), Ε-καδερίνης (1:50 , SC-8426, Santa Cruz Biotechnology), το β-κατενίνης (1:100, # 4270, Cell Signaling), CD56 (1:50, RNL-1, Abcam), σαλιγκάρι (1:200, Abcam), Synaptophysin (1 :200, SY38, Abcam), χρωμογρανίνης Α (1:200, Abcam), Slug (1:100, Abcam), pERK (1:50, Cell Signaling), CD44 (1:50, Abcam). Όλες οι διαφάνειες σαρώθηκαν με Pannoramic 250 σαρωτή διαφανειών (3D Histech.com).

Στατιστικά

Στατιστικά στοιχεία υπολογίστηκαν με το Excel, Prism και SPSS. Οι μπάρες σφάλματος δεικνύουν πρότυπο σφάλμα του μέσου. t-test του Student χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση των δεδομένων για σημαντικές διαφορές. P-τιμές & lt? 0,05 θεωρήθηκαν ως σημαντικές και αναφέρεται στα στοιχεία ως εξής:. * P≤ 0.05, ** p≤0.01, *** p≤0.001

Αποτελέσματα

Δημιουργία του RASLO ποντικού μοντέλο Καρκίνου του πνεύμονα

Δημιουργήσαμε ένα νέο διαγονιδιακό μοντέλο ποντικού (RASLO) για αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα, το οποίο κατά την CRE ρεκομπινάση προκαλούμενη αφαίρεση ενός κωδικονίου στοπ οδηγείται από ένα ιδιοσυστατικά ενεργοποιημένα ογκογόνο KRAS

Val12 υπό το έλεγχο ενός υποκινητή 1,8 kb κοτόπουλου β-ακτίνη. Το κατασκεύασμα εκφράζει επίσης ένα γονίδιο σύντηξης που αποτελείται από ένα S-tag (για ανοσοϊστοχημεία), λουσιφεράση (για in vivo ανίχνευση όγκων) και ωοαλβουμίνης κοτόπουλου (ως αντιγόνο μοντέλο όγκου) με τη βοήθεια ενός ιού πολυώματος εσωτερική θέση ριβοσωμικής επανεισόδου ( Σχ. 1Α). RASLO ποντικοί δημιουργήθηκαν με ένεση προπυρήνα εμβρύων C57Bl /6 × FVB F1. Τα προκύπτοντα ζώα υποβλήθηκαν σε διαλογή για την επιτυχή ενσωμάτωση ενός λειτουργικού κατασκευάσματος, με επώαση των καλλιεργειών ινοβλαστών ουράς με ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη Tat-Cre [19] για να αποκοπεί το κασέτα διακοπής και να ενεργοποιήσει το κατασκεύασμα

in vitro

. Στη συνέχεια, αυτές οι ινοβλάστες απεικονίστηκαν με μια φωτογραφική μηχανή βιοφωταύγεια IVIS 200 μετά την προσθήκη του λουσιφερίνης στο μέσο καλλιέργειας (Εικ. 1 Β) για τον εντοπισμό των ζώων με μια πλήρως λειτουργική ενσωμάτωση του κατασκευάσματος RASLO. Πέντε ιδρυτές ταυτοποιήθηκαν με βάση την PCR και λουσιφεράσης, ένα από τα οποία έδειξε μετάδοσης βλαστικής γραμμής.

Εμείς εφαρμοστεί ένα αδενοϊό που εκφράζει CRE ανασυνδυάση (AdCre) μύτη (Ι.Ν.) με RASLO ποντίκια. όγκων του πνεύμονα αναπτύχθηκαν σε αυτά τα ποντίκια μετά από 6 έως 8 εβδομάδες που θα μπορούσε να γίνει ορατή

in vivo από

ανίχνευση βιοφωταύγεια μετά ε.π. ένεση του λουσιφερίνη (Εικ. 1 C) και ήταν μακροσκοπικά ανιχνεύσιμες

ex vivo

και πολυάριθμα λευκά οζίδια που καλύπτει τους πνεύμονες (Εικ. 1ϋ). Οι όγκοι που προκύπτουν στα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με RASLO AdCre αποτελείται πολλαπλούς θηλώδη αδενώματα και αδενοκαρκινώματα επεμβατική θηλώδη (Εικ. 1 Ε), η οποία είναι συνεπής με KRAS μοντέλα καρκίνου του πνεύμονα οδηγείται περιγράφηκε προηγουμένως [4], [20]. σχηματισμός όγκου καθιερώθηκε αποκλειστικά στον πνεύμονα, καθώς δεν παρατηρήσαμε σχηματισμό όγκων σε οποιοδήποτε άλλο όργανο των AdCre επεξεργασμένου RASLO ποντικούς. ανάλυση γενωμική PCR των κυτταρικών σειρών που έχουν καταρτισθεί από όγκους του πνεύμονα RASLO αποκάλυψε την επιτυχή αφαίρεση της κασέτας στάση (Εικ. 1 F).

Μειωμένη κερατίνη Έκφραση σε SCLC

Η απώλεια της κερατίνης έκφραση παρατηρείται συνήθως κατά τη διάρκεια της EMT καθώς και μετασχηματισμός από ένα αδενοκαρκίνωμα σε ένα μικρό καρκίνωμα (SCLC) [8]. Ως εκ τούτου, χρωματίστηκαν ανθρώπινα αδενοκαρκινώματα πνεύμονα και μικρά δείγματα καρκίνου του πνεύμονα για κεράτινες και παρατηρήθηκε μόνο perinuclearly συμπυκνώνεται χρώση κερατίνη στα δείγματα SCLC σύγκριση με ισχυρή κυτταροπλασματική χρώση στα συνεκτικά αυξανόμενη αδενοκαρκινώματα πνεύμονα (Εικ. 2Α άνω πλαίσια). Παρατηρήθηκε ένα παρόμοιο πρότυπο χρώσης των κεράτινες σε κυτταρικές καλλιέργειες αδενοκαρκινώματος και SCLC κυτταρικές γραμμές με χρώση ανοσοφθορισμού (Σχ. 2Α, κάτω πάνελ). Επιπλέον, χρωματίστηκαν για δεσμοπλακίνη ότι, όταν απουσιάζει, οδηγεί σε πιο επεμβατικές ανάπτυξη όγκου και απουσιάζει ή να μειωθεί σε πολλούς ανθρώπινους καρκίνους επιθηλιακής [21]. Σε SCLC, δεσμοπλακίνη ήταν απούσα, ενώ NSCLC εξέφρασε δεσμοπλακίνη (Εικ. 2Α). Ερευνήσαμε περαιτέρω το εάν κεράτινες εκφράζονται διαφορικά σε NSCLC και SCLC κυτταρικές σειρές. Πράγματι, SCLC κυτταρικές γραμμές εξέφρασαν λίγο ή καθόλου mRNA για κερατίνη 8, ενώ NSCLC γραμμές εξέφρασαν υψηλά επίπεδα κερατίνη 8 mRNA (σχ. 2Β).

Ανοσοϊστοχημεία των FFPE δείγματα όγκων (Α) για τηγάνι κερατίνη αδενοκαρκινώματος του ο πνεύμονας και ένα τυπικό SCLC (άνω πάνελ α). Ανοσοφθορισμού ενός αδενοκαρκινώματος (HCC827) και SCLC κυτταρική σειρά (GLC36) βάφτηκαν για τηγάνι κερατίνη (κόκκινο) και δεσμοπλακίνη (DSP με πράσινο χρώμα) (A, κάτω πάνελ). (Β) Ολικό RNA απομονώθηκε από μια ομάδα ανθρώπινων SCLC και κυτταρικές σειρές NSCLC. Σχετική mRNA έκφραση της κερατίνης 8 μετρήθηκε με qRT-PCR Μέση σχετική έκφραση τετραπλούν αναλύσεις για το καθένα είναι κυτταρικές γραμμές που απεικονίζεται και η SEM ενδείκνυται. Η στατιστική σημαντικότητα υπολογίστηκε με χρήση t-test του Student: * p≤ 0.05, ** p≤0.01, *** p≤0.001. Εκπρόσωπος των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

κερατίνη Απώλεια in vivo δεν οδηγεί σε EMT ή μια πιο επιθετικός όγκος Βιολογίας

Για να διερευνηθεί κατά πόσο η απώλεια της κερατίνης έκφρασης σε αδενοκαρκινώματα του πνεύμονα λειτουργικά οδηγεί στο χειρότερο βιολογία του όγκου με επαγωγή EMT ή ένα μικρό φαινότυπο των κυττάρων, διασχίσαμε τα ποντίκια RASLO με τον επαγόμενο κερατίνη γραμμή KO (ΒΠΕ). RASLO ποντίκια με ένα σύμπλεγμα άγριου τύπου τύπου κερατίνης II (ΒΠΕ + /+) ή υποθάλπουν ένα άγριου τύπου και ένα αλληλόμορφο knock-out (ΒΠΕ +/-) ή ένα floxed και ένα αλληλόμορφο knock-out (ΒΠΕ f /-) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με AdCre ενδορινικά. Και οι τρεις ομάδες ποντικών ανέπτυξαν όγκους που ήταν ανιχνεύσιμα

in vivo από

απεικόνιση βιοφωταύγειας μέσα σε 6 εβδομάδες (Σχ. 3Α). Έξι εβδομάδες μετά την αγωγή AdCre, οι ποντικοί θυσιάστηκαν και αξιολογήθηκε το φορτίο του όγκου και της μορφολογίας. Για να επιβεβαιωθεί η γονότυπος των ποντικών και οι όγκοι του πνεύμονα, εκτελέσαμε PCR αντιδράσεις επί ϋΝΑ που εξάγεται από ολόκληρο πνεύμονα των ποντικών με εκκινητές ειδικούς για το κατασκεύασμα RASLO, ο διαγράφεται και το floxed κερατίνη τύπος δύο σύμπλεγμα (Σχ. 3Β). Όλοι οι ποντικοί έδειξαν την παρουσία του κατασκευάσματος RASLO, και όπως αναμενόταν μόνο ΒΠΕ +/- και ΒΠΕ f /- έδειξε εισαγωγή της θέσεως DEL, και αποκλειστικά τα ποντίκια με την ΒΠΕ f /- αλληλόμορφο έδωσε το αναμενόμενο ζώνη PCR (Εικ. 3Β) . Χρησιμοποιήσαμε τρία διαφορετικά μέτρα για να ποσοτικοποιηθεί το φορτίο του όγκου των ΒΠΕ + /+, ΒΠΕ +/- και ΒΠΕ f /- ζώα. Πρώτον, ποσοτικοποιηθεί το φορτίο του όγκου με μέτρηση της ποσότητας του mRNA λουσιφεράσης σε φέρουν όγκο στους πνεύμονες μέσω της qRT-PCR (Σχ. 3C). Η έκφραση λουσιφεράσης μπορεί να συσχετιστεί με φορτίο όγκου, όπως είναι συν-εκφράζεται από το κατασκεύασμα RASLO. Δεν παρατηρήσαμε μια στατιστικά σημαντική διαφορά στα επίπεδα λουσιφεράσης mRNA μεταξύ των ομάδων. Αυτό δείχνει ότι η μειωμένη έκφραση κερατίνη δεν οδηγεί σε αυξημένο φορτίο όγκου.

(Α) Ομάδες RASLO διαγονιδιακών ποντικών πέρασε σε διαφορετικά αλληλόμορφα σύμπλεγμα κερατίνης II αναισθητοποιούνται με κεταμίνη /Rompun, και 2 × 10

∧7 pfu AdCre χορηγήθηκαν σε έξι εβδομάδα προηγουμένως. Για την ανίχνευση του όγκου, τα ποντίκια ενέθηκαν ί.ρ. με λουσιφερίνη σε 200 μΙ PBS και απεικονίστηκαν με ένα IVIS-200 (Xenogen) κάμερα. Bioluminescense σύγκριση εκπρόσωπος άγριου τύπου (ctrl), RASLO διαγονιδιακά με άγριου τύπου κερατίνη τόπου (ΒΠΕ + /+), RASLO διαγονιδιακά με ετερόζυγη κερατίνη σύμπλεγμα ΙΙ έκφραση (ΒΠΕ +/-) και RASLO διαγονιδιακά ποντίκια με ένα knock-out και ένα floxed κερατίνη συμπλέγματος Β αλληλόμορφο (ΒΠΕ f /-) εδώ εμφανίζεται. Οι διαφορετικές ομάδες έδειξαν σήματα βιοφωταύγεια με συγκρίσιμη ένταση. αναλύσεις (Β) ειδική σε αλλήλιο PCR για το DNA που απομονώθηκε από κρυο-συντηρημένα όγκους πνεύμονα ποντικών RASLO για την ανίχνευση της Flox, DEL, και RASLO αλληλόμορφα διεξήχθησαν. επίπεδο έκφρασης (C) λουσιφεράσης mRNA προσδιορίστηκαν σε κρυο-συντηρημένα πνεύμονες με qRT-PCR για να εκτιμηθεί το φορτίο του όγκου. επίπεδο έκφρασης ομαλοποιήθηκε σε 18 s RNA. (D) Ποσοτικός προσδιορισμός της επιβάρυνσης του όγκου ανά περιοχή σε τρεις τομές ανά πνεύμονα. Τρεις αντιπροσωπευτικές τομές HE ανά πνεύμονα αναλύθηκαν σε σχέση με το ποσοστό της περιοχής του όγκου (άνω πάνελ) και το μέγεθος του όγκου (κάτω πίνακας). τομές FFPE βάφτηκαν για K8 /18 και απεικονίστηκαν με Pannoramic250 (3DHistech) σαρωτή διαφανειών. Μέγιστη διάμετρος όγκου μέχρι τριάντα όγκους αντιπροσωπευτική του όγκου ανά slide μετρήθηκε με την 3DHistech Pannoramic Viewer και η μέση μέγιστη διάμετρος συγκρίνει μεταξύ των διαφορετικών γονότυπων. (F) Ανοσοϊστοχημική χρώση για κεράτινες 8 και 18 σε όγκους του RASLO ΒΠΕ f /- ποντίκια. (ΣΟΛ). Η ράβδος κλίμακας αντιπροσωπεύει 100 μm. όγκοι άγριου τύπου RASLO (αριστερά) σε σύγκριση με ΒΠΕ – /- οι όγκοι στα δεξιά εμφανίζεται ως HE λεκέδες (άνω πάνελ) και κερατίνη 8 και 18 (κάτω πάνελ) τιμές απεικονίζονται ως μέση τιμή +/- SEM. Η στατιστική σημαντικότητα υπολογίστηκε με χρήση t-test του Student: * p≤ 0.05, ** p≤0.01, *** p≤0.001. Εκπρόσωπος των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Επίσης εκτιμήσαμε το φορτίο του όγκου κατά την αξιολόγηση της% της περιοχής του πνεύμονα καλύπτονται από όγκο σε τρεις οβελιαία τμήματα των πνευμόνων από δύο τύφλωσε ανεξάρτητους παρατηρητές. Αυτό αποκάλυψε ότι οι όγκοι του συγκρίσιμου μεγέθους που αναπτύχθηκε στα ποντίκια RASLO μεταφέρουν τα διάφορα κερατίνης γονότυπους (Εικ. 3D). Επιπλέον, το μέγεθος του όγκου αξιολογήθηκε με μέτρηση της διαμέτρου του όγκου χρησιμοποιώντας εικόνες των σαρωμένων ιστολογικά σλάιντ. Μια σύγκριση μεταξύ των διαφορετικών γονότυπων δεν αποκάλυψε σημαντικές διαφορές (Εικ. 3Ε). Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι η απουσία τουλάχιστον ένα αλληλόμορφο του συμπλέγματος κερατίνη τύπου ΙΙ δεν επηρεάζει σημαντικά την βιολογία του όγκου σε αυτό το γονίδιο KRAS με γνώμονα το μοντέλο του αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα.

Η ενεργοποίηση του κατασκευάσματος KRAS απαιτεί τη δημι- μεσολάβηση απομάκρυνση ενός 800 bp μεγάλο θραύσμα DNA που περιλαμβάνει ένα κωδικόνιο στοπ (Εικ. 1Α). Για να διαγράψετε ολόκληρο το σύμπλεγμα κερατίνης τύπου II, ένα θραύσμα DNA 0,68 Mbs πρέπει να αφαιρεθεί [10], [22]. Ως εκ τούτου, δεν περιμέναμε ότι όλοι οι όγκοι σε RASLO × KIIf /- ποντίκια θα ήταν εντελώς άνευ κερατίνες. Για την οπτικοποίηση εκείνων των όγκων στους πνεύμονες των RASLO × KIIf /- ποντίκια στα οποία ο floxed ΚΙΙ-αλληλόμορφο απομακρύνθηκε επιτυχώς, εμείς χρωματισμένες τομές παραφίνης για κεράτινες 8/18. Περίπου το 30% των όγκων στερούνταν εντελώς κερατίνη έκφραση, υποδεικνύοντας ότι πράγματι μεσολαβεί το CRE διαγραφή της συστάδας ΒΠΕ δεν ήταν τόσο αποτελεσματική όσο η ενεργοποίηση του κατασκευάσματος KRAS (Σχ. 3F). Μορφολογικά, οι κερατίνη ανεπάρκεια όγκοι ήταν τυπικό θηλώδη αδενώματα και αδενοκαρκινώματα διακριθεί από τις γειτονικές κερατίνη θετικούς όγκους στην ίδια αντικειμενοφόρο (Εικ. 3F) ή από το γονίδιο KRAS που προκαλείται από πνεύμονα όγκους από κερατίνη ζώα άγριου τύπου (Σχ. 3G). Να εξεταστεί κατά πόσον η απώλεια κερατίνης είχε επίδραση στον πολλαπλασιασμό ή ποσοστό απόπτωσης σε KRAS όγκους οδηγείται πνεύμονα, προσδιορίσαμε τα ποσοστά πολλαπλασιασμού και της απόπτωσης από Ki67 και διασπάστηκε χρώσης κασπάσης 3, αντίστοιχα, αλλά δεν τήρησε σημαντικές διαφορές (Εικ. 4Α, Β) . Συνοπτικά, αυτά τα δεδομένα παρέχουν απόδειξη ότι η απώλεια της κερατίνης έκφρασης δεν επηρεάζει το μέγεθος των καρκινικών κυττάρων του KRAS οδηγείται αδενοκαρκινώματα πνεύμονα ποντικού και ότι η παρουσία του 30% κερατίνη αρνητικούς όγκους δεν μετέβαλε τη συνολική επιβάρυνση του όγκου, γεγονός που υποδηλώνει ότι η απώλεια του κερατίνη έκφρασης δεν είναι άμεσα που εμπλέκονται στη δημιουργία του μικρού κυττάρου και επιθετικό φαινότυπο των SCLC

(Α) Ki-67 ανοσοϊστοχημεία ενός ΒΠΕ -. /- ανεπάρκεια όγκου (συγκρίνετε σχήμα 5 από την ίδια σειρά διαδοχικών τομών). (Β) Τυπική ανάλυση των 6 περιοχών ανά πνεύμονα έξι κερατίνη άγριου τύπου και ΒΠΕ – /- όγκοι αποκαλύπτει παρόμοιο δείκτη πολλαπλασιασμού Ki-67. Διασπασμένη χρώση κασπάσης 3 έδειξε μία μόνο θετικά κύτταρα (κόκκινο βέλος) στο κερατίνη ανεπάρκεια (- /-). Και κερατίνη που εκφράζει όγκους (ΒΠΕ)

Η

κερατίνη Απώλεια δεν επηρεάζει την έκφραση του EMT και νευροενδοκρινείς δείκτες σε πνεύμονα Οι όγκοι

η μείωση των κερατίνη έκφρασης και συμπύκνωση σε ένα στικτή περιπυρηνική μοτίβο είναι ένα χαρακτηριστικό των νευροενδοκρινών μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα και χρησιμοποιείται ευρέως ως ένας δείκτης για EMT σε αδενοκαρκινώματα. Αν και οι κερατίνη αρνητικούς όγκους που προκύπτουν στην AdCre επεξεργασμένο KRAS × KIIf /- ποντίκια δεν διαφέρουν μορφολογικά από γειτονικές κερατίνη θετικών όγκων τους, ερευνήσαμε αν τα κερατίνη αρνητικούς όγκους εξέφρασε επιπλέον δείκτες που σχετίζονται με EMT και το SCLC φαινότυπο

η ανοσοϊστοχημεία αποκάλυψε ότι ο τύπος ΙΙΙ ενδιάμεσο vimentin πρωτεΐνη νήματος, το οποίο είναι συχνά ρυθμίζεται προς τα πάνω κατά τη διάρκεια της επιθηλιακής προς μεσεγχυματικά μετάβασης (EMT) μετά την απώλεια της κερατίνης έκφρασης (Μάνη ua, 2008), δεν ήταν ούτε εκφράζεται σε κερατίνη-θετικό ούτε -αρνητικοί όγκους του KRAS × KIIf /- ποντίκια (Εικ. 5). Επιπλέον, χρωμογρανίνη Α, CD56, και συναπτοφυσίνη είναι ανοσοϊστοχημική δείκτες τυπικά εκφράζεται σε μικρό κελί νευροενδοκρινική καρκινώματα του πνεύμονα [23], [24]. Ωστόσο, και οι δύο κερατίνη-θετικά και -αρνητικοί όγκους στο KRAS × KIIf /- ποντίκια δεν εκφράζουν κανένα από αυτούς τους δείκτες (Εικ. 5). Οι θετικοί έλεγχοι για την εξειδίκευση των χρώσεων που παρουσιάζεται στο σχήμα S1. Στη συνέχεια αναλύονται δείκτες που σχετίζονται με την απώλεια των επαφών κυττάρου-κυττάρου κατά τη διάρκεια της ΕΜΤ. Συγκεκριμένα, η απώλεια του Ε-καδερίνης που προκαλείται από διάφορους μεταγραφικοί καταστολείς όπως σαλιγκάρι, και Slug [25] είναι τυπική για ΕΜΤ. Ωστόσο, δεν βρήκαμε ότι κερατίνη ανεπάρκεια όγκους πάνω από εξέφρασαν τις μεταγραφικές καταστολείς σαλιγκάρι, γυμνοσάλιαγκας ή έχασε την έκφραση Ε-καδερίνης (Εικ. 6).

Ποντίκια αναισθητοποιούνται και 2 × 10

7 PFU αδενοϊό -CRE ιός μεταφέρεται δια σιφωνίου στη μύτη του ποντικιού προς εισπνοή. Τα ποντίκια θανατώθηκαν μετά από 6 εβδομάδες και αφαιρέθηκαν οι πνεύμονες των ποντικών και σταθεροποιημένα με φορμαλίνη και εμβαπτισμένες σε παραφίνη. IHCs για K8 /18, βιμεντίνη, χρωμογρανίνης Α (χρωματοθεραπεία), CD56 και συναπτοφυσίνη (synapto) παρουσιάζονται. Μια μεγαλύτερη μεγέθυνση ενός αρνητικού όγκου κερατινών εμφανίζεται στη δεξιά στήλη και την περιοχή εγκλωβιστούμε στα αριστερά.

Η

Έξι εβδομάδες μετά τη χορήγηση αδενο-Cre, τα ποντίκια θυσιάστηκαν και απομακρύνθηκαν οι πνεύμονες των ποντικών και φορμόλη σταθερών και ενσωματωμένα σε παραφίνη. Μια μεγαλύτερη μεγέθυνση ενός αρνητικού όγκου κερατινών εμφανίζεται στη δεξιά στήλη και την περιοχή εγκλωβιστούμε στα αριστερά. Οι χρώσεις της σειριακής ενότητα για τους δείκτες EMT, δηλαδή E-cadherin, σαλιγκάρι, γυμνοσάλιαγκας, και β-κατενίνης δείξει.

Η

Ανάπτυξη και συντήρηση των ενώσεων προσφύσεως εξαρτάται από ένα πολυπρωτεϊνικό σύμπλεγμα β-κατενίνης, α κατενίνης και E-cadherin. Κατά την ενεργοποίηση του σηματοδότηση Wnt, ένα σημαντικό ποσοστό των β-κατενίνης στο να μετατοπίζεται στον πυρήνα για να ενεργοποιήσετε την έκφραση του γονιδίου που σχετίζεται με EMT [26]. Εμείς χρώση για β-κατενίνης, αλλά δεν μπορούσε να ανιχνεύσει καμία έκφραση πυρηνικών SS-κατενίνης σε κερατίνη άγριου τύπου ή με ανεπάρκεια όγκων (Σχ. 6). δεν είναι πλέον Δείξαμε προηγουμένως σε κυτταρικές σειρές που δεν έχουν την συστάδα ΒΠΕ, ZO1 και δεσμοπλακίνη βρίσκονται στην μεμβράνη [22] Έχουμε προσπαθήσει για τη χρώση για δεσμοπλακίνη και ZO1 σε υλικό FFPE ποντικού. Στο σχήμα S2 η χρώση του άγριου τύπου δέρματος και ΒΠΕ ποντικού + /+ για ZO1 φαίνονται. Θα μπορούσε να ανιχνεύσει κάποια μεμβρανώδη χρώσης του δείγματος δέρματος που χρησίμευσε ως θετικός έλεγχος. Ωστόσο, δεν βλέπω καμία μεμβρανώδη χρώση του άγριου τύπου ή ΒΠΕ – /- όγκους. Επιπλέον, θα βάφονται RASLO άγριου τυπ και κερατίνη ανεπάρκεια όγκους για pMAPK και CD44 και δεν τήρησε και τη διαφορά (Εικ. S2). Συνοπτικά, κεράτινη απώλεια στο μοντέλο μας όγκου KRAS πνεύμονα δεν οδήγησε στην ανάπτυξη των όγκων με ένα μικρό κυτταρικό φαινότυπο ή έκφραση των δεικτών που σχετίζονται με EMT. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η απώλεια κερατίνη από μόνη της δεν είναι υπεύθυνη για την έναρξη της ΕΜΤ ή της ανάπτυξης ενός μικρού κυτταρικού φαινοτύπου στα αδενοκαρκινώματα του πνεύμονα στο μοντέλο ποντικού που παρουσιάζονται εδώ.

Συζήτηση

Απώλεια της κερατίνης έκφρασης είναι ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα των δύο μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα και EMT και έχει προταθεί για την ενίσχυση της εισβολής και της μετάστασης. Επιπλέον, σε αδενοκαρκινώματα του πνεύμονα που έχουν υποστεί επεξεργασία με αναστολείς της τυροσινικής κινάσης μυθιστόρημα EGFR, μετατροπή σε ένα μικρό φαινότυπο των κυττάρων και EMT έχει αναγνωριστεί ως ένας από τους διάφορους μηχανισμούς αντίστασης, προκειμένου να αποφύγει τη θεραπεία [8].

Για