Αφηρημένο

δοκιμές Φάσης ΙΙΙ του αυξητικού παράγοντα αντι-ινσουλίνη-όπως -1 υποδοχέα (IGF1R) figitumumab αντισώματος σε μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC), οι ασθενείς έχουν διακοπεί λόγω έλλειψης όφελος επιβίωσης. Ερευνήσαμε αν η αναστολή της εξαιρετικά ομόλογες υποδοχέα ινσουλίνης (IR) επιπλέον της IGF1R θα ήταν πιο αποτελεσματική από την αναστολή της IGF1R μόνη στην πρόληψη της διάδοσης των κυττάρων NSCLC. Σηματοδότηση μέσω IGF1R και IR στον NSCLC κυτταρικές γραμμές Α549 και Hcc193 διεγέρθηκε με συνδυασμό IGF1, IGF2 και ινσουλίνη. Είναι αναστάλθηκε από αντισώματα που μπλοκάρουν συνδετήρας σύνδεσης, αIR3 (IGF1R) και IR47-9 (IR), και από τις ΑΤΡ-ανταγωνιστική μικρομοριακούς αναστολείς κινάσης τυροσίνης AZ12253801 και NVPAWD742 οι οποίες αναστέλλουν τόσο IGF1R και IR κινάσες τυροσίνης. Η επίδραση των αναστολέων προσδιορίστηκε με μία δοκιμασία πολλαπλασιασμού ανεξάρτητο από αγκύρωση και με ανάλυση της φωσφορυλίωσης Akt. Σε Hcc193 κύτταρα η μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και φωσφορυλίωση Akt οφείλονται σε αντι-IGF1R αντίσωμα ενισχύθηκε με τη μεσολάβηση αντισωμάτων αναστολή της IR ενώ σε κύτταρα Α549, με σχετικά χαμηλό IR: IGF1R αναλογία έκφραση, δεν ήταν. Σε κάθε κυτταρικό πολλαπλασιασμό γραμμή και φωσφορυλίωση της Akt ήταν πιο αποτελεσματικά παρεμποδίζεται από AZ12253801 και NVPAWD742 παρά με συνδυασμό αIR3 και IR47-9. Όταν η IGF1R μόνη αναστέλλεται, απρόσκοπτη σηματοδότηση μέσω του IR μπορεί να συμβάλει στη συνέχιση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων NSCLC. Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι αναστολείς μικρού μορίου στόχευσης τόσο το IR και IGF1R περισσότερο μειώσει αποτελεσματικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων NSCLC κατά τρόπο ανεξάρτητο από την IR:. IGF1R αναλογία έκφρασης, παρέχοντας μια θεραπευτική σκεπτικό για τη θεραπεία αυτής της ασθένειας

Παράθεση: Vincent EE, Γέροντα DJE, Curwen J, Κίλγκουρ Ε, Δικός μου, Tavaré JM (2013) Στόχευση μη-μικροκυτταρικού καρκίνου κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα με διπλή αναστολή του υποδοχέα της ινσουλίνης και η ινσουλίνη, αυξητικός παράγοντας-1 υποδοχέα. PLoS ONE 8 (6): e66963. doi: 10.1371 /journal.pone.0066963

Επιμέλεια: Irina U. Agoulnik, Διεθνές Πανεπιστήμιο της Φλόριντα, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 25 του Φεβρουαρίου, 2013? Αποδεκτές: 14 Μαΐου 2013? Δημοσιεύθηκε: 24, Ιουνίου 2013

Copyright: © 2013 Vincent et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Το έργο περιγράφεται χρηματοδοτήθηκε από επιχορηγήσεις από το Συμβούλιο Ιατρικών Ερευνών και AstraZeneca για JMT. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Jon Curwen και Elaine Κίλγκουρ, είναι υπάλληλοι της AstraZeneca και ιδίων μετοχών στην AstraZeneca. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

καρκίνου

πνεύμονα είναι η κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο σε όλο τον κόσμο με μη μικροκυτταρικό-Cell Lung καρκίνωμα (NSCLC) που αντιπροσωπεύουν περίπου το 80% όλων των περιπτώσεων. Το συνολικό ποσοστό πενταετούς επιβίωσης στην Ευρώπη είναι 8% [1] και η διάμεση επιβίωση μετά τη διάγνωση είναι 4-5 μήνες αν αφεθεί χωρίς θεραπεία [2]. Κλασική χημειοθεραπεία σε προχωρημένο στάδιο NSCLC παρέχει μόνο οριακή βελτίωση στη συνολική επιβίωση, ωστόσο αναστολείς κινάσης τυροσίνης EGFR βελτιώνει την επιβίωση σε ασθενείς που φέρουν μεταλλάξεις ενεργοποίησης στο γονίδιο EGFR [3]. Άλλα ελπιδοφόρα θεραπευτικοί στόχοι σε NSCLC περιλαμβάνουν αναπλαστικού λεμφώματος κινάσης (ALK), απακετυλίωση ιστόνης (HDAC) και ο IGF (ινσουλίνη αυξητικού παράγοντα) συστήματος [4].

Το σύστημα IGF διαδραματίζει κρίσιμο ρόλο στη ρύθμιση του ενεργειακού μεταβολισμού και της ανάπτυξης [5]. Υπάρχουν δύο γονικών υποδοχέων στο σύστημα IGF που δραστηριοποιούνται στην σηματοδότηση? ο IGF1R και ο υποδοχέας της ινσουλίνης (IR), τα οποία αμφότερα υφίστανται ως ομοδιμερή που περιλαμβάνουν δύο «μισό υποδοχείς». Λόγω της υψηλής ομολογίας αλληλουχίας είναι επίσης παρόντες ως υβριδικοί υποδοχείς που σχηματίζεται από ένα ήμισυ των υποδοχέων της ινσουλίνης και ένα ήμισυ ΙΟΡ1 υποδοχέα σε κύτταρα που εκφράζουν και τα δύο γονίδια υποδοχέων [6], [7]. Η IR και IGF1R ενεργοποιούνται από ινσουλίνη και IGF-1, αντίστοιχα, ωστόσο ένα τρίτο υποκαταστάτη, IGF-2, δεσμεύει τόσο το IGF1R και μια παραλλαγή ματίσματος της IR που ονομάζεται IR-A [8]. Ένα τρίτο υποδοχέα, IGF2R, δεν έχει γνωστές ιδιότητες μεταγωγής σήματος και χρησιμεύει ως υποδοχέας εκκαθάρισης για IGF-2 [9]. πρωτεΐνες δέσμευσης IGF (IGFBPs 1-6) μπορούν επίσης να διαδραματίσουν στη ρύθμιση της συγκέντρωσης του ελεύθερου συνδέτη και την έκθεση ενός προσδέματος με τον υποδοχέα του [10] σημαντικό ρόλο. Στον ορό, η πλειονότητα του κυκλοφορούντος IGF-1/2 συμπλέκεται με IGFBP3. Αυτό προστατεύει τα αυξητικών παραγόντων από αποικοδόμηση, αλλά μπορεί επίσης αναστέλλουν την σύνδεση τους με τους υποδοχείς [11]. Όταν ενεργοποιείται από την δέσμευση συνδέτη οι υποδοχείς κινήσει μεταγωγής σήματος μέσω δραστικότητα κινάσης τυροσίνης τους σε κατάντη καταρράκτες όπως το RAS /RAF /μονοπάτι ΜΑΡΚ και την ΡΙ3Κ /Akt μονοπάτι. Αυτά τα μονοπάτια είναι υπεύθυνη για τη ρύθμιση των μεταποιητών, όπως η εμβρυϊκή ανάπτυξη, ανάπτυξη των ιστών και το μεταβολισμό [12].

Ως κεντρικό ρυθμιστή της ανάπτυξης και επιβίωσης, απορρύθμιση του συστήματος IGF είναι κοινή σε ανθρώπινο καρκίνο (αναθεωρηθούν [13 ]. Η περίσσεια αυτοκρινή /παρακρινή παραγωγή του IGF-1 και IGF-2 ή /και τα χαμηλά επίπεδα IGFBP3 σχετίζεται με αυξημένο κίνδυνο καρκίνου αρκετών καρκίνων συμπεριλαμβανομένου του μαστού [14], του ενδομητρίου [15] και της ουροδόχου κύστης [16]. Μελέτες σε αυτό περιοχή έχουν ερευνήσει κυρίως το ρόλο του IGF1R. Αναστολή της IGF1R χρησιμοποιώντας ανασταλτικά αντισώματα οδηγεί σε μια σημαντική μείωση στον πολλαπλασιασμό των κυτταρικών γραμμών όγκου [17] και έχει βρεθεί να είναι υπερδραστήρια σε καρκίνους συμπεριλαμβανομένου του προστάτη [18], του μαστού [19 ..], του παχέος εντέρου [20] και του καρκινώματος της χοληδόχου κύστης [21] το σώμα των στοιχείων είναι τέτοια που οδήγησε στην διερεύνηση των αναστολέων IGF1R σε περισσότερες από 70 ογκολογικές μελέτες [22] Αυτοί οι αναστολείς εμπίπτουν σε δύο κατηγορίες? μονοκλωνικά αντισώματα στόχευσης η εξωκυτταρική περιοχή και μικρό μόριο ΑΤΡ-ανταγωνιστικοί αναστολείς της τυροσινικής κινάσης σχεδιαστεί για να αναστέλλουν επιλεκτικά την IGF1R πάνω από το IR, αλλά διαθέτουν δραστικότητα κατά των δύο υποδοχέων.

οι ανησυχίες που συν-αναστολή της IR με αναστολείς κινάσης μικρό μόριο IGF1R θα είχε ανεπιθύμητες μεταβολικές συνέπειες οδήγησαν σε μονοκλωνικά αντισώματα IGF1R εκλεκτικές που ευνοείται για την ανάπτυξη και τη χρήση σε κλινικές δοκιμές. Παρ ‘όλα αυτά, είναι γνωστό εδώ και αρκετό καιρό ότι η ινσουλίνη μπορεί να διεγείρει την ανάπτυξη των ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών [23] – [26] και ότι το 80% των καρκίνων του μαστού υπερεκφράζουν το IR σε σύγκριση με το φυσιολογικό ιστό του μαστού [27]. Επιπλέον, η έκφραση του εμβρυϊκού ισομορφή του IR, IR-A, είναι αυξημένα σε πολλές ανθρώπινες κακοήθειες και, σε αντίθεση με τα σήματα που προκαλούνται από IR-Β, τα οποία έχουν κατά κύριο λόγο μεταβολικό αποτέλεσμα, IR-A έχει κυρίως πολλαπλασιαστική επίδραση [ ,,,0],28]. Zhang et al έχουν δείξει ότι η προς τα κάτω ρύθμιση της IR ανέστειλε μετάσταση των καρκινικών κυττάρων του μαστού σε ένα αθυμικό μοντέλο ποντικού [29], και οι πρόσφατες έρευνες έχουν αρχίσει να αξιολογηθεί το όφελος της διπλής αναστολής της IGF1R και IR σε μοντέλα οστεοσαρκώματος [30] και σε παγκρεατικά νευροενδοκρινή καρκινογένεση [31]. Σε κάθε περίπτωση η IR συνέβαλε στην επίδραση επιβίωση των κυττάρων του συστήματος IGF και βελτιωμένη εξέλιξη πολυβάθμιες όγκου στο σύστημα του παγκρέατος νευροενδοκρινών. Αυτές οι μελέτες προτείνουν ένα ρόλο για το IR στην ογκογένεση.

Στο NSCLC η συμμετοχή του συστήματος IGF υποστηρίζεται από μια σειρά μελετών. Η IGF1R εκφράζεται συχνά [32] – [34], και την υψηλή IGF-1 και τα χαμηλά επίπεδα IGFBP3 συνδέονται με υψηλότερο κίνδυνο και αυξημένη σοβαρότητα του καρκίνου του πνεύμονα [35], [36]. IGF1 έχει μιτογονικά αποτελέσματα σε ορισμένες κυτταρικές σειρές NSCLC [37], [38], και ινοβλάστες που προέρχονται IGF2 προάγει την ανάπτυξη των κυττάρων NSCLC in vivo [39]. Ως εκ τούτου, σε NSCLC έχει αιτιολογημένη ότι η IGF1R μπορεί να είναι μια βιώσιμη θεραπευτικό στόχο. Σε μια μελέτη φάσης ΙΙ προχωρημένο NSCLC, η θεραπεία πρώτης γραμμής με το πλήρως εξανθρωπισμένο μονοκλωνικό αντίσωμα IGF1R figitumumab (CP-751871) αύξησε το ποσοστό ανταπόκρισης και χωρίς εξέλιξη όφελος επιβίωσης της πακλιταξέλη και καρβοπλατίνη [40]. Ωστόσο, οι πρόσφατες NSCLC μελέτες φάσης ΙΙΙ δοκιμών figitumumab είτε με χημειοθεραπεία ή την erlotinib με αναστολείς του EGFR είχαν ανασταλεί λόγω έλλειψης όφελος επιβίωσης [41]. Επειδή πρόκειται για αναδυόμενες αποδείξεις για έναν ρόλο του IR σε άλλους τύπους καρκίνου, είναι πιθανό ότι αυτή η έλλειψη κλινικό όφελος του figitumumab σε NSCLC οφείλεται, τουλάχιστον εν μέρει, από την απρόσκοπτη σηματοδότηση μέσω του IR.

η παρούσα μελέτη έχουμε διαπιστώσει κατά πόσον η σηματοδότηση μέσω του IR υποστηρίζει πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων NSCLC όταν η IGF1R αναστέλλεται. Χρησιμοποιήσαμε εξουδετερωτικά μονοκλωνικά αντισώματα που επιλεκτικά δεσμεύουν το IGF1R ή το IR επιπροσθέτως ΑΤΡ-ανταγωνιστική μικρού μορίου αναστολείς που αναστέλλουν ταυτοχρόνως δύο υποδοχείς. Η προσέγγιση αυτή επέτρεψε επίσης μια σύγκριση των αποτελεσματικοτήτων των αντισωμάτων και αναστολέων μικρών μορίων στόχευσης τον άξονα IGF-σηματοδότησης στην αναστολή του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων.

Υλικά και Μέθοδοι

Υλικά |

AZ12253801 (Astra Zeneca, Μάκλσφιλντ, Cheshire, Ηνωμένο Βασίλειο), NVP-ADW742 (Σέλεκ Chemicals, Houston, TX, USA) και Ακτή-1/2 (Merck, Darmstadt, Γερμανία) έγιναν σε DMSO (τελική συγκέντρωση στα πειράματα ήταν 0,5% ( ν /ν)). αIR3 (Merck Chemicals Ltd, Nottingham) και IR47-9 (ευγενικά παρέχεται από τον Ken Siddle (Πανεπιστήμιο του Cambridge, UK)) παρασκευάστηκαν σε PBS. Ινσουλίνη (Sigma, Poole, UK), IGF1 (Gro-Pep, Αδελαΐδα, Αυστραλία) και IGF2 (R &? D Systems, Abingdon, UK) χρησιμοποιείται σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Αντισώματα: p-Akt S473 και IGFRβ αγοράσθηκαν από τη Cell Technology σηματοδότηση (Boston, MA, USA), IRβ από την Santa Cruz Biotechnology Inc (Santa Cruz, CA, USA) και α-τουμπουλίνης από τη Sigma. Donkey συζευγμένο με HRP αντι-ποντικού IgG και αντισωμάτων IgG αντι-κουνελιού ήταν από Jackson ImmunoResearch Laboratories (Bar Harbor, ΜΕ, USA).

Cell Culture και η χρήση της ανάπτυξης Συνδυασμοί Factor

κύτταρα Α549 ήταν από την ATCC (Teddington, Ηνωμένο Βασίλειο) και τα κύτταρα Hcc193 [42] – [44] ήταν ένα δώρο από τον Michael Seckl (Imperial College, London). Οι κυτταρικές γραμμές ήταν συνήθως καλλιεργούνται σε «μέσο ανάπτυξης» που αποτελείται από DMEM (Α549) ή RPMI (Hcc193) συμπληρωμένο με 10% (ν /ν) εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS, Invitrogen, Paisley, UK), 20.000 U /ml πενικιλίνη, 7 mM στρεπτομυκίνη και 200 ​​mM γλουταμίνη. Οι κυτταρικές σειρές αναπτύχθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα συμπληρωμένη με 5% (ν /ν) CO

2.

Για τις περισσότερες από τις δοκιμασίες που περιγράφονται, τα κύτταρα εκτέθηκαν σε ένα συνδυασμό 1 ηΜ ινσουλίνης , 50 ηΜ IGF1, 50 nM IGF2 (ονομάζεται «3GF»), προκειμένου να αντιπροσωπεύουν καλύτερα το μικροπεριβάλλον του όγκου. Εδώ ινσουλίνη και IGFs παραδίδονται από την κυκλοφορία και IGFs παράγονται επίσης από τα στρωματικά κύτταρα και κύτταρα όγκου οι ίδιοι να ενεργούν κατά παρακρινή και αυτοκρινή τρόπο. Η συγκέντρωση του IGF1 και IGF2 σε 3GF βασίστηκε σε αυτή που βρίσκεται σε προκαταρκτικά πειράματα για να ενισχύσει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε δοκιμασίες ανάπτυξης αγκυροβόλιο ανεξάρτητη λαμβάνοντας παράλληλα στο λογαριασμό την αυξημένη βιοδιαθεσιμότητα του IGF στο μικροπεριβάλλον του όγκου λόγω της τοπικής παραγωγής και σε πρωτεάσες όγκων που εκκρίνεται προκαλεί υδρόλυση του IGF δεσμευτικές πρωτεΐνες [5].

για να εκτιμηθεί η επίδραση των αυξητικών παραγόντων και των αναστολέων επί της φωσφορυλίωσης Akt και στην έκφραση του υποδοχέα, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 12 φρεατίων πλάκες πειραματική να φθάσει το 90% συρροή μετά από 24 ώρες. Τα κύτταρα επωάστηκαν με διάφορους αναστολείς για 2 ώρες σε μέσο ελεύθερο ορού πριν από την αγωγή με αυξητικούς παράγοντες επί 10 λεπτά. Μετά την επώαση, η πρωτεΐνη εκχυλίστηκε από κύτταρα όπως περιγράφεται προηγουμένως [45].

Anchorage-ανεξάρτητη ανάπτυξη Δοκιμασία

Από προσκολλημένα κύτταρα καλλιέργειας τρυψινοποιήθηκαν και διέρχεται μέσω μιας βελόνας 18G για να σχηματίσει ένα μονοκύτταρους εναιώρημα. Αυτά τα κύτταρα αιωρήθηκαν σε 0,4% (w /v) ευγενή άγαρ σε μέσο ανάπτυξης που περιέχει 0,1% (ν /ν) FBS και 150μ μΙ του εναιωρήματος προστίθενται ανά φρεάτιο ενός 96 φρεατίων (Greiner Βίο-One, κύτταρα Α549: 15000 κύτταρα /φρεάτιο, τα κύτταρα Hcc193: 25,000 κύτταρα /φρεάτιο) σε μία στερεοποιήθηκε 40 μΐ στρώμα βάσης από 0,6% (β /ο) άγαρ. Όπου απαιτείται, οι αναστολείς και παράγοντες ανάπτυξης προστέθηκαν στα κύτταρα κατά το χρόνο της αναστολής στο διάλυμα ανάπτυξη μέσου άγαρ. Οι καλλιέργειες αιωρήματος επωάστηκαν για 5 ημέρες στο οποίο σημείο το 10% κατ ‘όγκο του Alamar Blue (Serotec, Kidlington, UK) προστέθηκε στα φρεάτια και οι καλλιέργειες επωάζονται για περαιτέρω 2-5 ώρες. Μεταβολικώς δραστικά κύτταρα μετατρέπουν Alamar Μπλε σε ένα φθορίζοντα δείκτη ώστε ποσοτικοποίηση του φθορισμού είναι ένα μέτρο του αριθμού των ζωντανών κυττάρων. Ο φθορισμός αναλύθηκε χρησιμοποιώντας ένα Perkin Elmer, αναγνώστη πλάκας Fusion με φίλτρα εκπομπής 544 nm διέγερση και 590 nm.

Ανάλυση Western Blotting

NSCLC κυτταρολύματα (15 μα πρωτεΐνης) υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE και κηλίδωση Western, όπως περιγράφεται προηγουμένως [45]. Εν συντομία, μετά από διαχωρισμό των προϊόντων λύσης με χρήση γελών 4-12% Bis-Tris κλίση (Invitrogen Ltd., Paisley, UK), οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (Millipore, Hertfordshire, UK). Οι μεμβράνες επωάστηκαν με πρωτογενές αντίσωμα (1 μg /ml) όλη τη νύχτα πριν το πλύσιμο και επώαση με τα κατάλληλα δευτερογενή αντισώματα για 1 ώρα. Ανοσοστυπώματα εμφανίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα ενισχυμένο σύστημα ανίχνευσης χημειοφωταύγειας (ECL? Amersham Biosciences). Όλα τα πρωτεύοντα αντισώματα χρησιμοποιούνται εδώ ανιχνεύσουν μία εξέχουσα ταινία στο προβλεπόμενο μοριακό βάρος της πρωτεΐνης το αντίσωμα που εγείρεται έναντι. Οι σαρωμένες εικόνες των ανοσοκηλίδων περικοπεί για να χαρακτηρίσει τον εξέχοντα μπάντα.

Στατιστική Ανάλυση

Η στατιστική σημαντικότητα προσδιορίστηκε από δύο-ουρά αταίριαστο

t

τεστ. p & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

AZ12253801 Αναστέλλει μεταγενέστεροι σηματοδότηση από την IGF1R και IR με Ίσων Ισχύς ενώ Ανασταλτικά μονοκλωνικά αντισώματα (αIR3 και IR47-9) είναι ειδικοί στον υποδοχέα τους στόχος.

στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήσαμε τα ανασταλτικά μονοκλωνικά αντισώματα αIR3 και IR47-9, με στόχο να IGF1R [46] και IR [7], αντίστοιχα, και το ATP ανταγωνιστικός αναστολέας AZ12253801 μικρό μόριο κινάσης που έχει ανασταλτική δράση έναντι αμφοτέρων των υποδοχέων . Αρχικά πειράματα διεξήχθησαν για να εκτιμηθεί η αποτελεσματικότητα και ειδικότητα της αIR3, IR47-9 και AZ12253801 στην κυτταρική σειρά Hcc193 NSCLC. 24 ώρες μετά την σπορά, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αIR3, IR47-9 (0,5-10 μg /ml) ή AZ12253801 (2-100 ηΜ) και στη συνέχεια διεγέρθηκαν με αυξητικό παράγοντα. Μια χαμηλή συγκέντρωση (5 nm) του αυξητικού παράγοντα χρησιμοποιήθηκε έτσι οι παράγοντες ενεργοποιείται μόνο συγγενή υποδοχέα τους. Η φωσφορυλίωση του κατάντη κινάσης σερίνης /θρεονίνης, Akt, επί σερίνη-473 (S473) χρησιμοποιήθηκε ως μέτρο της ινσουλίνη και IGF1-επαγόμενη δραστικότητα σηματοδότησης.

διέγερση είτε με ινσουλίνη ή IGF-1 προκάλεσαν αυξημένη φωσφορυλίωση της Akt σε S473 (Σχήμα 1Α). Η ανασταλτική μονοκλωνικό αντίσωμα IGF1R, αIR3, ανέστειλε IGF-1, αλλά όχι την μεσολάβηση της ινσουλίνης φωσφορυλίωσης Akt. Αντιστρόφως, η ανασταλτική μονοκλωνικό αντίσωμα IR, IR47-9, ανέστειλε την ινσουλίνη, αλλά όχι τον IGF-1, με μεσολάβηση Akt φωσφορυλίωση (Σχήμα 1Β). Αυτό επιβεβαίωσε ότι τα αντισώματα αυτά αναστέλλουν μόνο τους αντίστοιχους υποδοχείς τους στις συγκεντρώσεις αντισωμάτων που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη. Η θεραπεία με αIR3 μείωσε το επίπεδο έκφρασης του IGF1R (Σχήμα 1Α, δεξιό πίνακα), το οποίο είναι σύμφωνο με τις προηγούμενες παρατηρήσεις στην κυτταρική σειρά MCF7 ([47]? DJEE, EK, JMT αδημοσίευτες παρατηρήσεις).

Hcc193 κύτταρα επεξεργάστηκαν είτε αIR3 (Α), IR47-9 (Β) ή AZ12253801 (C) στις ενδεικνυόμενες δόσεις για 2 ώρες πριν από 10 λεπτά επώαση με είτε 5 ηΜ ινσουλίνης ή 5 ηΜ IGF-1. Η φωσφορυλίωση της Akt σε S473 και έκφραση IGFRβ και IRβ προσδιορίστηκε με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας ειδικά αντισώματα. Ένα αντι-α-τουμπουλίνης αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος για την πρωτεΐνη φόρτωσης. Όλα τα πρωτεύοντα αντισώματα χρησιμοποιούνται εδώ ανιχνεύσουν μία εξέχουσα ταινία στο προβλεπόμενο μοριακό βάρος της πρωτεΐνης το αντίσωμα που εγείρεται έναντι. Οι σαρωμένες εικόνες των ανοσοκηλίδων περικοπεί για να χαρακτηρίσει αυτή την εξέχουσα μπάντα.

Η

Προ-επεξεργασία των κυττάρων με Α-Ω μπλοκάρει ινσουλίνη και IGF1-επαγόμενη φωσφορυλίωση της Akt σε έναν δοσοεξαρτώμενο τρόπο και με παρόμοια δραστικότητα (Σχήμα 1C ). Σε αντίθεση με προ-επεξεργασία με ανασταλτικά μονοκλωνικά αντισώματα, AZ12253801 (σε 25 ηΜ και παραπάνω) ανέστειλε Akt φωσφορυλίωση σε επίπεδα κάτω από ότι σε μη επεξεργασμένα κύτταρα (Σχήμα 1 C). Ούτε αIR3 ή IR47-9 επιτευχθεί αυτό, ακόμη και στην υψηλότερη συγκέντρωση που χρησιμοποιήθηκε (10 μg /ml) ή όταν ο χρόνος προεπεξεργασίας (στα 2 μg /ml) επεκτάθηκε σε 24 h (Σχήμα 1Α, Β και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Σε αντίθεση με αIR3, AZ12253801 δεν μειώνουν το επίπεδο έκφρασης του IGF1R.

Συνδυασμένη Αναστολή της IGF1R και IR μπλοκ ανάπτυξης κυττάρων ισχυρότερα από ό, τι Αναστολή της IGF1R μόνος στο Hcc193 κύτταρα

Για να ερευνήσει πιθανή συμβολή της IR στην υποστήριξη πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων όταν ο IGF1R αναστέλλεται, τα κύτταρα Hcc193 NSCLC καλλιεργήθηκαν υπό ανεξάρτητη από προσκόλληση συνθήκες παρουσία του IGF1, IGF2 (σε συγκεντρώσεις που ενεργοποιούν ταυτόχρονα και τις δύο υποδοχείς) και της ινσουλίνης (3GF, βλέπε Υλικά και μέθοδοι). Οι επιδράσεις επί του πολλαπλασιασμού της αναστολής της IGF1R και το IR, μόνο και σε συνδυασμό, προσδιορίστηκαν. Μέγιστη επιλεγμένα αποτελεσματικές συγκεντρώσεις αναστολέα με βάση τα δεδομένα στο Σχήμα 1.

Το σχήμα 2Α απεικονίζει τα δεδομένα πολλαπλασιασμού για Hcc193 κύτταρα σε ανεξάρτητο από αγκύρωση καλλιέργειας. 3GF ενίσχυσε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων Hcc193 κατά 1,6 φορές σε σύγκριση με αυτή που παρατηρήθηκε με μόνο όχημα. Αναστολή της IGF1R από αIR3 ή το IR με IR47-9 μείωσε τον πολλαπλασιασμό που παρατηρήθηκε σε παρουσία 3GF (πολλαπλασιασμός 3GF) κατά 22% (

ρ

& lt? 0,0001) και 17% (

ρ

& lt? 0,01), αντίστοιχα. Μπλόκο τόσο την IGF1R και IR με αIR3 και IR47-9 οδήγησε σε μείωση 48% σε 3GF πολλαπλασιασμό, μια σημαντικά μεγαλύτερη επίδραση από εκείνα που λαμβάνονται από τον αποκλεισμό των δύο υποδοχέων μόνο (

σ

& lt? 1 × 10

-5 σε κάθε περίπτωση). Το εύρημα ότι IR47-9 μπλοκάρει τον πολλαπλασιασμό που επάγεται από 3GF είτε μόνα τους είτε σε συνδυασμό με αIR3 υποδηλώνει ότι ο υποδοχέας της ινσουλίνης είναι άμεσα ικανός να προάγει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων Hcc193.

(Α) Hcc193 κύτταρα καλλιεργήθηκαν υπό anchorage- ανεξάρτητες συνθήκες σε 0.1% ορό με την παρουσία του 3GF (1 ηΜ ινσουλίνη, 50 ηΜ IGF-1, 50 ηΜ IGF-2) μόνο και σε συνδυασμό με αIR3 (2 μg /ml), IR47-9 (2 μg /ml) , αIR3 (2 μg /ml) και IR47-9 (2 μg /ml), και AZ12253801 (50 ηΜ), όπως υποδεικνύεται. Μετά από 5 ημέρες βιώσιμα κύτταρα υπολογίστηκαν με τον φθορισμό του μεταβολικού προϊόντος μείωση του Alamar blue. Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει το μέσο φθορισμό τέσσερα φρεάτια πανομοιότυπα ± τυπική απόκλιση από ένα μόνο πείραμα. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά 3 ανεξάρτητων πειραμάτων. ***

σ

& lt? 1 × 10

-5? **

σ

& lt? 0,0001? *,

σ

& lt? 0,01 (ισχύει για όλες τις επαναλήψεις)? δίπλευρη αταίριαστο

t

τεστ. κύτταρα (Β) Hcc193 υποβλήθηκαν σε αγωγή με αIR3 (2 μg /ml), IR47-9 (2 μg /ml), αIR3 (2 μg /ml) και IR47-9 (2 μg /ml), και AZ12253801 (50 ηΜ) όπως υποδεικνύεται για 2 ώρες πριν από την επώαση 10 λεπτών με όχημα ή 3GF. Η φωσφορυλίωση της Akt σε S473 και έκφραση IGFRβ και IRβ προσδιορίστηκε με κηλίδωση Western. Ένα αντι-α-τουμπουλίνης αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος για την πρωτεΐνη φόρτωσης. Όλα τα πρωτεύοντα αντισώματα χρησιμοποιούνται εδώ ανιχνεύσουν μία εξέχουσα ταινία στο προβλεπόμενο μοριακό βάρος της πρωτεΐνης το αντίσωμα που εγείρεται έναντι. Οι σαρωμένες εικόνες των ανοσοκηλίδων περικοπεί για να χαρακτηρίσει αυτή την εξέχουσα μπάντα.

Η

Ταυτόχρονη αποκλεισμό της IGF1R και το IR χρησιμοποιώντας AZ12253801 οδήγησε σε μεγαλύτερη αναστολή του πολλαπλασιασμού (75%) από εκείνα που λαμβάνονται με αIR3 και IR47-9 σε συνδυασμό (

σ

& lt? 1 × 10

-5) (Εικόνα 2Α). Αυτό μπορεί να εξηγηθεί από την αυξημένη αποτελεσματικότητα της στην αναστολή AZ12253801 3GF επαγόμενη Akt φωσφορυλίωση (Σχήμα 2Β). Επιπλέον, τα συνδυασμένα αντισώματα ήταν περισσότερο αποτελεσματική στην αναστολή της φωσφορυλίωσης Akt ό, τι ήταν το κάθε αντίσωμα μόνο του (Σχήμα 2Β). Έτσι, η επίδραση των αναστολέων επί 3GF επαγόμενη Akt φωσφορυλίωση, όταν προστίθενται μόνοι ή σε συνδυασμό, παράλληλα επίδρασή τους στις 3GF-επαγόμενο πολλαπλασιασμό.

Η IGFR σε IR Λόγος Έκφραση μπορεί να προβλέψει την εξάρτηση των κυττάρων επί της IR για επιβίωση

επόμενο εξετάστηκε αν η σχετική έκφραση IGF1R και IR υποδοχείς επηρέασε την ικανότητα του IR47-9 να αναστέλλει πολλαπλασιασμό κυττάρου όγκου ή την συγκριτική αποτελεσματικότητα της AZ12253801 και τα συνδυασμένα εξουδετερωτικά αντισώματα. Για το σκοπό αυτό μια άλλη γραμμή NSCLC, Α549 χρησιμοποιήθηκε ως εκφράζει περίπου ίσο αριθμό IR τα κύτταρα Hcc193 αλλά σημαντικά περισσότερο IGF1R, όπως προσδιορίζεται με κηλίδωση Western ίσες ποσότητες λύματος (Σχήμα 3Α). Πυκνομετρική ανάλυση έδειξε ότι τα κύτταρα Hcc193 έχουν IR:. IGF1R αναλογία έκφρασης -15 φορές εκείνη των κυττάρων Α549

(Α) Σύγκριση της έκφρασης των IGF1Rβ και IRβ στην Hcc193 και κυτταρικές σειρές Α549 προσδιορίστηκε με western αποτύπωση χρησιμοποιώντας 15 μg πρωτεΐνη εξάγεται από κάθε κυτταρική γραμμή. (Β) κύτταρα Α549 καλλιεργήθηκαν υπό ανεξάρτητη από προσκόλληση συνθήκες σε 0.1% ορό παρουσία 3GF μόνα τους και σε συνδυασμό με αIR3 (2 μg /ml), IR47-9 (2 μg /ml), αIR3 (2 μg /ml ) και IR47-9 (2 μg /ml), και AZ12253801 (50 ηΜ), όπως υποδεικνύεται. Μετά από 5 ημέρες βιώσιμα κύτταρα υπολογίστηκαν με τον φθορισμό του μεταβολικού προϊόντος μείωση του Alamar blue. Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει το μέσο φθορισμό τέσσερα φρεάτια πανομοιότυπα ± τυπική απόκλιση από ένα μόνο πείραμα. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά 3 ανεξάρτητων πειραμάτων. ***

σ

& lt? 1 × 10

-6? **

σ

& lt? 0,0001? *,

σ

& lt? 0,05 (ισχύει για όλες τις επαναλήψεις)? δίπλευρη αταίριαστο

t

τεστ. (Γ) Κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αIR3 (2 μg /ml), IR47-9 (2 μg /ml), αIR3 (2 μg /ml) και IR47-9 (2 μg /ml), και AZ12253801 (50 ηΜ) όπως υποδεικνύεται για 2 ώρες πριν από την επώαση 10 λεπτών με όχημα ή 3GF. Η φωσφορυλίωση της Akt σε S473 και έκφραση IGFRβ και IRβ προσδιορίστηκε με κηλίδωση Western. Ένα αντι-α-τουμπουλίνης αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος για την πρωτεΐνη φόρτωσης. Οι σαρωμένες εικόνες των ανοσοκηλίδων περικοπεί για να χαρακτηρίσει τον εξέχοντα μπάντα.

Η

κύτταρα Α549 καλλιεργήθηκαν υπό τις συνθήκες που περιγράφονται για Hcc193 (Σχήμα 2). 3GF ενίσχυσε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων Α549 με 2-φορές πάνω από εκείνη που παρατηρείται για τον έλεγχο του οχήματος (Σχήμα 3Β). Αναστολή της IGF1R από αIR3 μειωμένη 3GF-διεγερμένο πολλαπλασιασμό κατά 40% (

σ

& lt? 1 × 10

-6) περίπου 2 φορές τη μείωση παρατηρήθηκε στα κύτταρα Hcc193. Σε αντίθεση, η αναστολή της IR με IR47-9 είχαν μέτρια επίδραση ελάττωση του πολλαπλασιασμού 3GF κατά 10% (

ρ

& lt? 0,05) και, σε αντίθεση με Hcc193 κύτταρα, η παρουσία του IR47-9 απέτυχε να ενισχυθεί η επίδραση του αIR3 επί του πολλαπλασιασμού 3GF (Σχήμα 3Β). Έτσι, σε κύτταρα Α549 η IR είναι πολύ λιγότερο αποτελεσματικό στην υποστήριξη ανεξάρτητη από προσκόλληση πολλαπλασιασμός από αυτά που παρατηρήθηκαν με τα κύτταρα Hcc193. Παρ ‘όλα αυτά, όπως παρατηρείται με τα κύτταρα Hcc193, ο βαθμός αναστολής του πολλαπλασιασμού των Α549 κυττάρων με AZ12253801 ήταν σημαντικά μεγαλύτερη από αυτή που παρατηρήθηκε με την παρουσία του συνδυασμού αντισώματος (ρ & lt? 0,0001? Σχήμα 3Β).

Η επίδραση του οι αναστολείς της Α549 ανεξάρτητη από προσκόλληση δοκιμασία ήταν και πάλι συνεπείς με την επίδρασή τους επί της φωσφορυλίωσης Akt (Σχήμα 3C)? αIR3 ανέστειλε 3GF επαγόμενη Akt φωσφορυλίωση, δεν απαιτείται επιπλέον επίδραση παρατηρήθηκε όταν IR47-9 συνδυάστηκε με αIR3, και AZ12253801 ήταν πιο αποτελεσματικό από αIR3 (ή συνδυασμένα αIR3 και IR47-9). αIR3 προκάλεσε μείωση στην έκφραση του IGF1Rβ αλλά όχι από IRβ σε κύτταρα Α549 (Εικόνα 3C), όπως παρατηρήθηκε προηγουμένως στα κύτταρα Hcc193 (Σχήμα 1 και 2).

αποτελεσματική αναστολή Κυτταρικού Πολλαπλασιασμού από ένα μικρό μόριο IR /IGF1R αναστολέα χωριστά για AZ12253801

και στις δύο κυτταρικές σειρές Α549 Hcc193 και AZ12253801 έχει μεγαλύτερη ανασταλτική επίδραση στην αγκύρωση-ανεξάρτητο πολλαπλασιασμό από το συνδυασμό αIR3 και IR47-9. Για να διερευνηθεί αν ΑΤΡ-ανταγωνιστικοί αναστολείς του IGF1R /IR παρέχει ένα πιο αποτελεσματικό τρόπο αναστολή πολλαπλασιασμού παράγοντα ανάπτυξης που προκαλείται από κύτταρο από εξουδετερωτικά αντισώματα, η επίδραση μιας δομικώς διακριτές ΑΤΡ-ανταγωνιστική μικρό μόριο IGF1R αναστολέα /IR NVP-ADW742 στην ανάπτυξη του Hcc193 και Α549 αξιολογήθηκε επίσης. NVP-ADW742 δοσοεξαρτώμενο ελαττωμένη 5 IGF-1 και 5 ηΜ ινσουλίνης που διεγείρεται από Akt φωσφορυλίωση σε Hcc193 και Α549 κύτταρα nm με μέγιστη αποτελεσματική συγκέντρωση έφθασε σε 1 μΜ (Σχήμα 4Α).

(Α) και Hcc193 κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με NVP-ADW742 (0,1 έως 3 μΜ) για 2 ώρες πριν από 10 λεπτά επώαση με 5 ηΜ ινσουλίνης ή 5 ηΜ IGF-1. Η φωσφορυλίωση της Akt σε S473 προσδιορίστηκε με κηλίδωση Western. Ένα αντι-α-τουμπουλίνης αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος για την πρωτεΐνη φόρτωσης. (Β) Hcc193 και Α549 κύτταρα καλλιεργήθηκαν κάτω από ανεξάρτητη από προσκόλληση συνθήκες σε 0.1% ορό παρουσία 3GF μόνα τους και σε συνδυασμό με αIR3 (2 μg /ml) και IR47-9 (2 μg /ml), AZ12253801 (50 ηΜ ), NVP-ADW742 (1 μΜ), ή Ακτή-1/2 (10 μΜ) όπως υποδεικνύεται. Μετά από 5 ημέρες βιώσιμα κύτταρα υπολογίστηκαν με τον φθορισμό του μεταβολικού προϊόντος μείωση του Alamar blue. Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει το μέσο φθορισμό τέσσερα φρεάτια πανομοιότυπα ± τυπική απόκλιση από ένα μόνο πείραμα. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά 2 ανεξάρτητων πειραμάτων. ***

σ

& lt? 0.001? **, P & lt? 0,01 (ισχύει για κάθε πείραμα)? δίπλευρη αταίριαστο

t

τεστ. (Γ) Hcc193 και Α549 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αIR3 (2 μg /ml) και IR47-9 (2 μg /ml) AZ12253801 (50 ηΜ), NVP-ADW742 (1 μΜ) ή Ακτή (10 μΜ) όπως υποδεικνύεται για 2 h πριν επώαση 10 λεπτών με όχημα ή 3GF. Η φωσφορυλίωση της Akt σε S473 και έκφραση IGFRβ και IRβ προσδιορίστηκε με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας ειδικά αντισώματα. Ένα αντι-α-τουμπουλίνης αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος για την πρωτεΐνη φόρτωση.

Η

Σχήμα 4Β απεικονίζει την ανεξάρτητη από προσκόλληση πολλαπλασιασμό των Hcc193 και Α549 κύτταρα αντίστοιχα με την παρουσία 3GF και την επίδραση της αIR3 και IR47-9, AZ12253801 και NVP-ADW742 επ ‘αυτού. NVP-ADW742 ανέστειλε 3GF επαγόμενη Hcc193 και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων Α549 σε παρόμοιο βαθμό να AZ12253801 και σε μεγαλύτερο βαθμό από ό, τι παρατηρείται με έναν συνδυασμό αIR3 και IR47-9. Αυτό αντικατοπτρίζεται στο μεγαλύτερο βαθμό της αναστολής της φωσφορυλίωσης της Akt από ΑΤΡ-ανταγωνιστικοί αναστολείς σε σχέση με αIR3 /IR47-9 (Σχήμα 4C).

Η στενή σχέση μεταξύ του αποτελέσματος της AZ12253801, NVP-ADW742, αIR3 και IR47-9 επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και επί της φωσφορυλίωσης Akt πρότεινε ότι Akt μπορεί να συνεισφέρει στην 3GF διεγείρεται πολλαπλασιασμός των κυττάρων. Για να διερευνήσουν αυτή την περαιτέρω χρησιμοποιήσαμε ένα εκλεκτικός αναστολέας αλλοστερική της Akt, Ακτή-1/2 για Hcc193 και τα κύτταρα Α549. Ακτή-1/2 ήταν εξίσου αποτελεσματικό με AZ12253801 και NVP-ADW742 στην αναστολή πολλαπλασιασμού ανεξάρτητη από προσκόλληση των κυττάρων (Σχήμα 4Β) και ομοίως αποτελεσματική στην αναστολή της φωσφορυλίωσης Akt (Σχήμα 4C). Αυτό το αποτέλεσμα είναι συνεπές με Akt διαμεσολάβηση αγκύρωση-ανεξάρτητος πολλαπλασιασμός αυτών των κυτταρικών γραμμών κατάντη της IGF1R και IR.

Συζήτηση

Η IGF1-R έχει ένα καθιερωμένο ρόλο στην ογκογένεση, ωστόσο η πρόσφατη αποτυχία της figitumumab μονοκλωνικού αντισώματος IGF1-R σε NSCLC δοκιμές έχει το ερώτημα κατά πόσον στόχευση αυτή την οδό και μόνο θα οδηγήσει σε ένα θεραπευτικό όφελος. Οι αναδυόμενες στοιχεία δείχνουν ότι η σηματοδότηση μέσω του σχετικού IR παρέχει ένα μηχανισμό με τον οποίο τα καρκινικά κύτταρα αντιστέκονται στις επιδράσεις της αναστολής IGF1-R σε ανθρώπινου οστεοσαρκώματος και του καρκίνου του μαστού. Σε συμφωνία με αυτό, τα δεδομένα μας υποστηρίζουν έναν πιθανό ρόλο για το IR στον πολλαπλασιασμό των κυτταρικών γραμμών NSCLC με υψηλή IR: IGF1R αναλογία. Επιπλέον παρέχουμε αποδεικτικά στοιχεία ότι ο διπλός αποκλεισμός του IR και IGF-1 R χρησιμοποιώντας ένα ΑΤΡ-ανταγωνιστική μικρό μόριο αναστολέα IR /IGF-1R έχει βελτιωμένη αποτελεσματικότητα στην αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων NSCLC πάνω από εκείνη που λαμβάνεται με ταυτόχρονη αναστολή της IR και IGF1-R χρησιμοποιώντας επιλεκτική μονοκλωνικά αντισώματα.

Σύμφωνα με το καθιερωμένο ρόλο της IGF1 στην υποστήριξη του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων [17], [30], [31], [38], [48], εξουδετερώνοντας αντίσωμα που κατευθύνεται αποκλεισμό του IGF1 -R σε κάθε μία από τις κυτταρικές σειρές NSCLC δοκιμάστηκαν ως αποτέλεσμα την μερική αναστολή του πολλαπλασιασμού (Σχήματα 2-4). Α549 κύτταρα πιο ευαίσθητα από Hcc193 από την άποψη αυτή πιθανώς αντανακλά την υψηλότερη έκφραση του IGF1R σε Α549 και το προκύπτον χαμηλό IR: IGF1R αναλογία έκφρασης. Επιλεκτικό αποκλεισμό των IR χρησιμοποιώντας ένα ειδικό αντίσωμα μείωσε επίσης τον πολλαπλασιασμό σε κάθε κυτταρική σειρά. Σε κύτταρα Hcc193, τα οποία έχουν ένα σχετικά υψηλό IR: IGF1R αναλογία έκφραση, η έκταση αυτής της μείωσης ήταν παρόμοια με εκείνη που προκαλείται από την αναστολή IGF1R, αλλά σε κύτταρα Α549 η μείωση στον πολλαπλασιασμό με αποκλεισμό του IR ήταν σημαντικά μικρότερη από εκείνη που παρατηρήθηκε κατά την IGF1R αναχαίτηση. Αυτά τα ευρήματα είναι συνεπή με μια προηγούμενη αναφορά που δείχνει ότι μια κυτταρική γραμμή καρκίνου του μαστού με υψηλό IR: IGF1R αναλογία έκφρασης (MDAMB231) ήταν πιο ευαίσθητη σε αποκλεισμό IR από μία κυτταρική γραμμή με ένα χαμηλό IR: IGF1R αναλογία έκφρασης (MCF7) [31]. Η καταστολή της έκφρασης IR με παρεμβολή RNA έχει επίσης δειχθεί ότι αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, ο βαθμός στον οποίο αυτό συμβαίνει μεταβάλλοντας με τον κυτταρικό τύπο και τη φύση της δοκιμασίας [29], [30]. Κατά συνέπεια, η IR υποστηρίζει πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων διαφόρων τύπων κυττάρων ανεξάρτητα από την IGF1R, και έχουμε εδώ επεκταθεί αυτές τις παρατηρήσεις σε κύτταρα NSCLC.

Συνδυασμένη παρεμπόδιση της IGF1R και IR με μονοκλωνικά αντισώματα στην κυτταρική γραμμή Hcc193 μειωμένη πολλαπλασιασμό σε μεγαλύτερο βαθμό από ό, τι αναστολή είτε μόνος υποδοχέα. Αυτό δείχνει ότι σε NSCLC ο IR έχει τη δυνατότητα να συμβάλλει στην αντίσταση στην αναστολή IGF1R υποστηρίζοντας τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Ένας τέτοιος ρόλος για την IR στο πλαίσιο των στοχευμένων IGF1R έχει αποδειχθεί σε ένα διαγονιδιακό μοντέλο ποντικού των παγκρεατικών καρκινογένεσης νευροενδοκρινών και ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του μαστού [31], και σε κυτταρικές γραμμές οστεοσαρκώματος [30]. Σε δύο αυτά μελέτες IGF2, αντί IGF1, ορίστηκε ως ο αυξητικός παράγοντας σηματοδότησης μέσω του IR για να προκαλέσει αυτό το φαινόμενο protumorigenic. Αυτό μπορεί επίσης να συμβαίνει σε NSCLC όπου IGF2 είναι γνωστό για την υποστήριξη της ανάπτυξης του όγκου [39], [49]. Επιπλέον, είναι πιθανό ότι η ίδια η ινσουλίνη μπορεί να συνεισφέρει σε αυτήν την σχέση, όπως έχει καθιερωθεί μιτογόνες ιδιότητες [23] – [26] και περιλαμβάνεται, με IGF1 και IGF2, στο μέσο ανάπτυξης στην παρούσα μελέτη. Ο αποκλεισμός του IR απέτυχε να ενισχύσει την επίδραση της αναστολής IGF1R σε κύτταρα Α549 που υποδηλώνει ότι σε περιπτώσεις NSCLC όπου χαμηλές αναλογίες IR: υπάρχουν IGF1R έκφραση, και όταν τα εν λόγω κύτταρα εκτίθενται σε IGF1 εκτός από IGF2 και την ινσουλίνη, συν-στόχο το IR δεν μπορεί να είναι ευεργετική.

μικρομοριακούς αναστολείς κινάσης τυροσίνης όπως AZ12253801, NVP-ADW742 και BMS754807 [50], [51] αναστέλλουν τόσο την IGF1R και το IR και, ως τέτοια, έχει τη δυνατότητα να είναι πιο αποτελεσματική αντι-νεοπλασματικών παραγόντων από αντισώματα εναντίον IGF1R. Πράγματι, στην παρούσα μελέτη η επίδραση της AZ12253801 σε κύτταρα Hcc193 ήταν σύμφωνο με αυτό της διπλής IGF1R και αποκλεισμός IR από αντισώματα ως ο βαθμός της αναστολής του πολλαπλασιασμού ήταν μεγαλύτερη από ό, τι φαίνεται κατά αποκλεισμός του IGF1R μόνο.