Αφηρημένο

Ιστορικό

Ο υποδοχέας της βιταμίνης D (VDR) οδός είναι σημαντική στην πρόληψη και ενδεχομένως στη θεραπεία πολλών μορφών καρκίνου. Ένας σημαντικός μηχανισμός δράσης VDR σχετίζεται με την αλληλεπίδραση της με την οδό /β-κατενίνης Wnt. Αγωνιστή δεσμευμένο VDR αναστέλλει την ογκογόνο Wnt μονοπάτι /β-κατενίνης /TCF αλληλεπιδρώντας απευθείας με β-κατενίνης και σε μερικά κύτταρα αυξάνοντας την έκφραση καδερίνης οποία, με τη σειρά του, προσλαμβάνει β-κατενίνης στη μεμβράνη. Εδώ έχουμε εντοπίσει TCF-4, ένας μεταγραφικός ρυθμιστής και το β-κατενίνης εταίρος δέσμευσης ως έμμεση στόχος του μονοπατιού VDR.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Σε αυτή την εργασία, δείχνουμε ότι TCF- 4 (όνομα γονίδιο TCF7L2) μειώνεται στο μαστικό αδένα του ποντικού knockout VDR σε σύγκριση με το ποντίκι άγριου τύπου. Επιπλέον, δείχνουμε 1,25 (ΟΗ)

2D

3 αυξάνει TCF-4 στα επίπεδα του RNA και της πρωτεΐνης σε αρκετούς ανθρώπινους ορθοκολικού καρκίνου κυτταρικές σειρές, το αποτέλεσμα της οποίας εξαρτάται πλήρως από τον VDR.

Στο silico

ανάλυση των υποκινητών ανθρώπινων και TCF7L2 ποντίκι εντοπίστηκαν αρκετές υποθετικές στοιχεία δεσμευτική VDR. Αν και δημοσιογράφους υποστηρικτής TCF7L2 ανταποκρίθηκε στην εξωγενή VDR, και 1,25 (ΟΗ)

2D

3, ανάλυση μετάλλαξης και της χρωματίνης ανοσοκατακρήμνιση δοκιμασίες, έδειξε ότι η αύξηση της TCF7L2 δεν απαιτεί την πρόσληψη του VDR στα εντοπίστηκαν στοιχεία και δείχνει ότι η ρύθμιση από VDR είναι έμμεση. Αυτό επιβεβαιώνεται περαιτέρω από την απαίτηση του

de novo

πρωτεϊνική σύνθεση γι ‘αυτή τη ρύθμιση.

Συμπεράσματα /Σημασία

Αν και είναι γενικά παραδεκτό ότι η πρόσδεση της β-κατενίνης για τα μέλη της οικογένειας TCF /LEF είναι καρκίνος-προώθηση, πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι TCF-4 λειτουργεί αντί ως ένας μεταγραφικός καταστολέας που περιορίζει μαστού και του παχέος ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων. Συνεπώς, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η 1,25 (ΟΗ)

2D

3 /VDR-διαμεσολαβούμενη αύξηση TCF-4 μπορεί να έχει ένα προστατευτικό ρόλο στον καρκίνο του παχέος εντέρου, καθώς και ο διαβήτης και η νόσος του Crohn.

Παράθεση: Beildeck ME, το Ισλάμ Μ, Shah S, Welsh J, Byers ΝΔ (2009) Έλεγχος της TCF-4 Έκφραση από VDR και βιταμίνη D στις γραμμές κυττάρων ποντίκι του μαστικού αδένα και τον καρκίνο του παχέος εντέρου. PLoS ONE 4 (11): e7872. doi: 10.1371 /journal.pone.0007872

Επιμέλεια: Ιωσήφ Alan Bauer, Ίδρυμα Bauer Έρευνας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 15, 2009? Αποδεκτές: 14 Οκτ 2009? Δημοσιεύθηκε: 17 του Νοέμβρη 2009

Copyright: © 2009 Beildeck et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. R01- CA-129 – 813 (SWB)? Υπουργείο Άμυνας CDMRP Predoctoral Βραβείο Πρακτική άσκηση: W81XWH-06-1-0786 (MEB) https://cdmrp.army.mil/bcrp/default.htm? Πυρήνα Εγκαταστάσεις Grant: ΝΙΗ Ρ30 CA51008 (LCCC). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η ενεργοποίηση της οδού της βιταμίνης D έχει συσχετιστεί με μειωμένο κίνδυνο για την ανάπτυξη και την εξέλιξη πολλών καρκίνων (που επισκοπείται στο [1]). Αν και επιδημιολογικές μελέτες είναι λιγότερο σαφής όσον αφορά τη σύνδεση του κινδύνου καρκίνου με επίπεδα ορού της βιταμίνης D και των μεταβολιτών της, της μοριακής βιολογίας και τις ζωικές μελέτες υποστηρίζουν ένα ρόλο για βιταμίνης D σε αυξημένη απόπτωση των κυττάρων και τη διαφοροποίηση, και μειωμένη ανάπτυξη των κυττάρων. Καθώς η βιταμίνη D είναι μια ένωση η οποία είναι διαθέσιμη στη δίαιτα (αν και ανεπαρκώς) ως συμπλήρωμα, ή εύκολα-συντίθενται από το σώμα, είναι ένας ελκυστικός υποψήφιος για τη χημειοπρόληψη και τη χημειοθεραπεία. κλινικό όφελος του σε αυτήν την ιδιότητα, ωστόσο, αναστέλλεται από υπερασβεστιαιμία περιοριστική της δόσης, παρενέργεια που αναπτύσσεται από τον πρωταρχικό ρόλο της βιταμίνης D στην ομοιόσταση του ασβεστίου. Σε μια προσπάθεια να αξιοποιήσει βιταμίνης D στην κλινική ως αντικαρκινικού παράγοντα, έχουν γίνει προσπάθειες για να δημιουργήσει ανάλογα της βιταμίνης D που έχουν σαν αποτέλεσμα μειωμένη υπερασβεστιαιμία. Ενώ αυτά τα ανάλογα έχουν δείξει μεγάλη υπόσχεση

in vitro

και σε ζωικά μοντέλα, υπολείπονται σε παραπέμπει σε μια ισοδύναμη αντίδραση στην κλινική. Επιπλέον, μια επιτυχημένη ανάλογο μπορεί να δημιουργήσει ιδιαίτερο πρόβλημα στο πλαίσιο του καρκίνου του παχέος εντέρου, η τρίτη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο που σχετίζονται με τους άνδρες και τις γυναίκες στις ΗΠΑ. Αν και η απόδειξη για τη βιταμίνη D ως αντικαρκινικός παράγοντας σε αυτό το όργανο είναι ιδιαίτερα ισχυρή, η ΓΕ οδού είναι στενά εμπλέκεται στη διαμεσολάβηση των επιπτώσεων της βιταμίνης D στην ομοιόσταση του ασβεστίου. Αυτό υποδεικνύει ότι στο κόλον, μπορεί να είναι δύσκολο να αποσυνδεθούν τα αντικαρκινικά και ασβέστιο ομοιοστατική επιδράσεις της βιταμίνης D. Αν και, σε άλλες μελέτες δείχνουμε ότι ορισμένοι βιταμίνης D μερικοί ανταγωνιστές θα ενεργοποιήσει τον υποδοχέα της βιταμίνης D σε κύτταρα τα οποία εκφράζουν υψηλά επίπεδα ενεργοποιημένων β-κατενίνης (καρκινικά κύτταρα), αλλά όχι σε φυσιολογικά κύτταρα και μπορεί να έχουν τη δυνατότητα να κάνουν αυτή [2].

πυρηνικών υποδοχέων ορμόνης μπορεί να επηρεάσει την κανονική καταρράκτη σηματοδότησης Wnt αλληλεπιδρώντας με β-κατενίνης [3 ]. Το φαινόμενο αυτό μπορεί να είναι ιδιαίτερα σχετικό σε καρκίνο του παχέος εντέρου, όπου το 80% των περιπτώσεων είναι ένα λιμάνι των μεταλλάξεων APC που ενεργοποιούν παρεκκλίνοντα β-κατενίνης [4], που οδηγεί σε συσσώρευση των ενεργοποιημένων β-κατενίνης στον πυρήνα (που επισκοπείται στο [5]). Εντός του πυρήνα, β-κατενίνη είναι υπεύθυνη για την συν-ενεργοποίηση της μεταγραφής των γονιδίων των οποίων οι προαγωγοί καταλαμβάνονται από μέλη της οικογένειας TCF /LEF των παραγόντων μεταγραφής. Μερικά από αυτά τα γονίδια, όπως

c-myc

[6] και

κυκλίνη D1

[7], είναι που εμπλέκονται στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου και μπορεί να συμβάλει σε μια ογκογόνο φαινότυπο. Η επεξεργασία των κυττάρων με κάποια (αλλά όχι όλα) υποδοχέα πυρηνικής ορμόνης (NHR) αγωνιστές προκαλεί μία ανοδική ρύθμιση του NHR-γονιδίων που αποκρίνονται ενώ ταυτόχρονα προκαλεί μια μείωση στην /β-κατενίνης μεταγραφή γονιδίου-στόχου TCF. Αυτό έχει αποδοθεί στην ανταγωνιστική σύνδεση μεταξύ TCF και NHRs για β-κατενίνης [3], [8] – [11], και /ή κοινές συν-ενεργοποιητές όπως p300 [2]. Μια δεύτερη λειτουργία αναστολής της Wnt γονιδίου στόχου μεταγραφής έχει αποδοθεί στην πρόληψη της β-κατενίνης πυρηνική μετατόπιση από την πρόσληψη του κυτταροπλασματικής β-κατενίνης σε ενώσεις προσφύσεως [9], [12], [13]. Τρίτον, υπάρχουν ενδείξεις ότι NHRs δεσμεύονται με μέλη της οικογένειας TCF /LEF, άμεσα, και έτσι αναστέλλουν τη μεταγραφή του TCF /β-κατενίνης γονιδίων που αποκρίνονται [14] – [18]. Αυτό πιθανόν να οφείλεται στην πρόσληψη των συν-καταστολείς, όπως TLE (Groucho) [19], NCoR και SMRT [20].

Εδώ θα αναφέρω ένα πρόσθετο μηχανισμό της αλληλεπίδρασης μεταξύ του μονοπατιού β-κατενίνης και της βιταμίνης υποδοχέα D (VDR) μονοπάτι. Για να διευκρινιστεί, θα χρησιμοποιήσουμε την ακόλουθη ονοματολογία: TCF7L2 στο πλαίσιο των πλασμιδίων, DNA και RNA, και TCF-4, στο πλαίσιο της πρωτεΐνης, και μόνο. Βρήκαμε ότι TCF-4 εκφράζεται διαφορικά σε κύτταρα που προέρχονται από όγκους μαστού ποντικού ΟΜΒΑ επαγόμενη από VDR αγρίου τύπου και knock out ποντίκια, και ο μαστικούς αδένες οι ίδιοι. Περαιτέρω διερεύνηση αποκάλυψε ένα VDR εξαρτώμενη αυξητική ρύθμιση του TCF7L2 στο mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης με κατεργασία με 1,25 (ΟΗ)

2D

3 σε κύτταρα CaCo2. Ανάλυση του υποκινητή της ανθρώπινης και ποντικού TCF7L2 προέβλεψε διάφορα στοιχεία πρόσδεσης υποτιθέμενο υποδοχέα της βιταμίνης D εγγύς προς τη θέση έναρξης της μεταγραφής. Αν και η κλωνοποίηση αυτής της περιοχής προαγωγού αποκάλυψε ρύθμιση από την VDR /1,25 (ΟΗ)

2D

3, μετέπειτα ανάλυση μετάλλαξης, χρωματίνη ανοσοκαθίζηση και πειράματα σύνθεσης αναστολής πρωτεΐνη υποδεικνύουν ότι αυτή η επίδραση πιθανότατα μεταφέρεται έμμεσα, μέσω ενός VDR /1,25 (ΟΗ)

2D

3-ευαίσθητα μεσάζοντα. Αυξήσεις στην TCF-4 επίπεδα πρωτεΐνης μεταφράζεται σε αυξημένη δραστηριότητα TopFlash μετά από 24 ώρες θεραπείας συνδέτη σε κύτταρα CaCo2. Προτείνουμε έναν μηχανισμό με τον οποίο αυτή η επίδραση μπορεί να αναστέλλει την ογκογόνο δράση

στο cellulo

.

Αποτελέσματα

μαστικών αδένων από VDR Knockout ποντίκια έχουν Λιγότερο TCF-4 από τους μαστικούς αδένες από VDR Άγρια -Τύπος ποντίκια

VDR145

+ /+ και VDRK240

– /- οι κυτταρικές σειρές που προέρχονται από DMBA που προκαλείται από όγκους μαστού ποντικού από φυσικού τύπου (WT) και VDR νοκ-άουτ (KO) ποντίκια, αντίστοιχα και είχαν περιγραφεί προηγουμένως [21]. VDR ΚΟ είναι πιο επιρρεπή σε επαγόμενη από καρκινογόνο μαστικού και καρκινογόνες ουσίες του παχέος εντέρου, καθώς και άλλες βλάβες [22], [23]. Προκαταρκτικά πειράματα έδειξαν ότι TCF-4 ήταν περισσότερο άφθονο σε κύτταρα WT από κύτταρα ΚΟ (δεν φαίνεται). Πραγματοποιήσαμε ανάλυση κηλίδος western για TCF-4 και επιβεβαίωσε ότι VDRK240

– /- κύτταρα έχουν πολύ χαμηλά επίπεδα του TCF-4 σε σύγκριση με VDR145

+ /+ κύτταρα (Εικόνα 1Α). Εμείς επόμενη εκτελείται ένα pull-down δοκιμασία στην οποία χρησιμοποιήσαμε δύο GST-tagged πρωτεΐνες σύντηξης β-κατενίνης. WT GST-tagged β-κατενίνης συνδέεται με TCF /LEFs μέσω της επανάληψης περιοχή Armadillo, ενώ GST-dTCF-β-Cat, που φιλοξενεί μεταλλάξεις στα κατάλοιπα 253, 312, και 435 εντός της Armadillo περιοχής, έχει δραματικά μειωμένη συγγένεια για TCF /LEFs [24]. Σε συμφωνία με τα δεδομένα κηλίδος Western, η πρωτεΐνη σύντηξης WT τραβηχτεί προς τα κάτω περισσότερο TCF-4 από VDR145

+ /+ λύματα από από VDRK240

– /- λύματα. Η μεταλλαγμένη πρωτεΐνη σύντηξης τράβηξε προς τα κάτω πολύ λιγότερο TCF-4 από τη VDR145

+ /+ κύτταρα και κανένας από το VDRK240

– /-. Κύτταρα (Σχήμα 1Β)

(Α) κηλίδας Western των προϊόντων λύσης ολικού κυττάρου, εις διπλούν, από VDR145

+ /+ (VDR + /+) κύτταρα (διαδρομές 1 και 2) και VDRK240

– /- (VDR – /-) κύτταρα (λωρίδες 3 και 4) ερωτάται για TCF-4, VDR και GAPDH. (Β) Τραβήξτε προς τα κάτω των πρωτεϊνών σε VDR + /+ και VDR – /- λύματα με GST-tagged κατασκευάσματα β-κατενίνης και ανιχνεύτηκαν για TCF-4. GST-WT-β-κατενίνης (GST-β-Cat) χρησιμοποιείται στις διαδρομές 1 και 2. Η μεταλλαγμένη β-κατενίνης που δεν θα δεσμεύουν αποτελεσματικά πρωτεΐνες TCF /LEF (GST-dTCF-β-Cat) χρησιμοποιείται στις διαδρομές 3 και 4. Χάντρες μόνα που χρησιμοποιούνται στις διαδρομές 5 και 6. (C) ΟΤ δραστικότητα σε VDR + /+ και VDR – /- κύτταρα επιμολυσμένα με

Renilla

και VP16-β-κατενίνης. Τα δεδομένα κανονικοποιούνται σε

ΚβηϊΙΙβ

. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν SEM. ρ-τιμές αντιπροσωπεύουν t-test του Student για significan διαφορές μεταξύ των κυτταρικών σειρών. RLU: Σχετικές Μονάδες Φωτός (D) ΟΤ δραστικότητα σε VDR + /+ και VDR – /- κύτταρα επιμολυσμένα με

Renilla

, VP16-β-κατενίνης και με ή χωρίς ένα πλασμίδιο TCF7L2. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν SEM. Οι στατιστικές είναι t-test του Student για τις διαφορές μεταξύ διαμολύνονται και ελέγχου-επιμολυσμένα κύτταρα. * P & lt? 0,05? *** P & lt? .0005. (Ε) Μαστικού αδένα ιστούς από VDR WT (επάνω πάνελ) και VDR ΚΟ (κάτω πάνελ) ποντικούς βάφτηκαν για TCF-4 παρουσιάζεται σε τρεις μεγεθύνσεις.

Η

Είμαστε δίπλα χρησιμοποιείται το OT /ΤΟΥ σύστημα δημοσιογράφος να δοκιμασία δραστικότητας /β-κατενίνης TCF σε αυτά τα κύτταρα. Η ρεπόρτερ OT περιέχει τρεις διαδοχικές TCF /LEF στοιχεία πρόσδεσης ανάντη ενός γονιδίου λουσιφεράσης και το αντίστοιχο ανταποκριτή ελέγχου (OF) έχει μεταλλαχθεί θέσεις πρόσδεσης TCF και αντιπροσωπεύει δέσμευση υποβάθρου. Επειδή αυτά τα κύτταρα έχουν χαμηλή ενδογενή δραστικότητα β-κατενίνης, VP16-β-κατενίνης συν-εκφράζεται με τους φορείς αναφοράς σε όλα τα δείγματα. Συνεπής με μειωμένα επίπεδα τους TCF-4, VDRK240

– /- κύτταρα είχαν λιγότερη δραστηριότητα της β-κατενίνης από VDR145

+ /+ κύτταρα (Σχήμα 1Γ). Αυτή η διαφορά ήταν σημαντική αλλά όχι μεγάλες και δείχνει ότι VDRK240

– /- κύτταρα έχουν άλλα μέλη της οικογένειας TCF που μπορεί να αντισταθμίσει την TCF-4, και /ή τα χαμηλά επίπεδα του TCF-4 που παραμένουν σε αυτά τα κύτταρα είναι επαρκής για την ενεργοποίηση , τουλάχιστον στο πλαίσιο των υψηλών επιπέδων του ενεργοποιημένου β-κατενίνης [25], [26]. Συν-επιμόλυνση με εξωγενή TCF7L2 διασωθεί η μειωμένη δραστικότητα β-κατενίνης στην VDRK240

– /- κύτταρα (Σχήμα 1 D). Για να προσδιορίσετε αν το φαινόμενο αυτό συνέβαινε και

in vivo

, θα βάφονται κανονική μαστικούς ιστούς από VDR WT και τα ποντίκια VDR ΚΟ για TCF-4. Σε συμφωνία με τα υπόλοιπα δεδομένα στο Σχήμα 1, μαστικούς ιστούς ζώων VDR WT έχουν πιο εμφανή χρώση σε σύγκριση με μαστικούς ιστούς ζώων VDR ΚΟ (Σχήμα 1 Ε). χρώση TCF-4 δεν είναι εντελώς απούσα στο VDR ΚΟ μαστικούς αδένες, αν και είναι πολύ λιγότερο συχνή και λιγότερο έντονη (Σχήμα 1Ε, κάτω δεξιά πλαίσιο).

CYP24A1 είναι η καλύτερη χαρακτηρισμένη, προς τα κάτω στόχος της βιταμίνης Δ οδού και του mRNA της είναι εξαιρετικά ευαίσθητη σε αγωνιστές VDR. CYP24A1 εμπλέκεται στο μεταβολισμό των δραστικών ενώσεων βιταμίνης D σε ανενεργούς μεταβολίτες. Δραστηριότητα του ρεπόρτερ CYP24A1 απουσίαζε και δεν επηρεάζεται από 1,25 (ΟΗ)

2D

3 σε VDRK240

– /- κύτταρα, αλλά αποκαταστάθηκε μετά την επιμόλυνση του VDR (Εικόνα 2Α). Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι τα κύτταρα που είναι null για το VDR έχουν χαμηλότερα βασικά επίπεδα του TCF-4 και ότι αυτή η δραστηριότητα μειώνει β-κατενίνης σε VDR-null μαστικού μοντέλο μας.

(Α) CYP24-Luc δραστηριότητα σε VDRK240

– /- (VDR – /-) και VDR145

+ /+ (VDR + /+) κύτταρα που επιμολύνθηκαν με GFP ή VDR και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 10

-7 Μ 1,25 ( ΟΗ)

2D

3 ή EtOH-ελέγχου για 24 ώρες όπως υποδεικνύεται. RLU = Σχετικές Μονάδες Φωτός. (Β) ανάλυση PCR ανάστροφης μεταγραφάσης του CYP24A1 ποντικού (άνω πάνελ), ποντικού και ανθρώπου VDR (μεσαίο πάνελ) και β-ακτίνης (κάτω πάνελ) μεταγραφές σε απόκριση σε εξωγενή έκφραση ανθρώπινης VDR και 1,25 (ΟΗ)

2D

3 κατεργασία όπως περιγράφεται στο μέρος Α (C) Διάφορα ορθοκολικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές επωάστηκαν για 24 ώρες σε 10

-7 Μ 1,25 (ΟΗ)

2D

3 ή EtOH, ως υποδεικνύεται. Cellular πρωτεΐνες προσδιορίστηκαν για TCF-4 έκφρασης (άνω πάνελ) και GAPDH παρακολουθήθηκε για ίση φόρτωση λωρίδα (κάτω πίνακας). Και οι δύο TCF-4 ζώνες αντιπροσωπεύουν διαφορετικές ισομορφές του TCF-4 που έχουν διαφορετικό μήκος C-τέρματα. (D) κύτταρα CaCo2 επιμολύνθηκαν με διαφορετικές ποσότητες VDR ή siRNA επί 24 ώρες και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 10

-7 Μ 1,25 (ΟΗ)

2D

3 ή EtOH για μετέπειτα 24 ωρών, όπως υποδεικνύεται, και ανιχνεύτηκαν για TCF-4. ΝΤ: Μη στοχεύετε. (Ε) Η πυκνομετρική ανάλυση τριών κηλίδων Western, όπως αναφέρεται στο μέρος Α δεδομένα σχεδιάστηκαν σε σχέση με το έλεγχο EtOH-θεραπεία. ρ-τιμές δημιουργήθηκαν με μονόπλευρο t-test: * ρ ​​& lt? 0,05? ** P & lt? 0,005? *** Ρ & lt? 0,0005 (F) Caco2 κύτταρα επιμολύνθηκαν για 24 ώρες με VDRE-Ιυο,

Renilla

και siRNA και υποβάλλονται σε θεραπεία για μετέπειτα 24 ώρες με 10

-7 Μ 1,25 ( ΟΗ)

2D

3, όπως υποδεικνύεται. RLU: Σχετικές Μονάδες Φωτός. (G) Caco2 κύτταρα επιμολύνθηκαν με siRNA επί 24 ώρες και υποβάλλονται σε θεραπεία για μετέπειτα 24 ώρες με 10

-7 Μ 1,25 (ΟΗ)

2D

3 ή EtOH όπως υποδεικνύεται. μεταγραφές CYP24A1 προσδιορίστηκαν με qPCR. Τα δεδομένα κανονικοποιούνται για έκφραση GAPDH και απεικονίζονται σε σχέση με κάθε EtOH έλεγχο.

Η

VDR /1,25 (ΟΗ)

2D

3 Ρυθμίζει TCF7L2 mRNA και της πρωτεΐνης στον Καρκίνο του παχέος Κυτταρικές Γραμμές

επόμενο επιμολυσμένα VDRK240

– /- κύτταρα με ανθρώπινο VDR και διαπίστωσε ότι TCF-4 πρωτεΐνης και TCF7L2 mRNA δεν επηρεάστηκαν από VDR ή 1,25 (ΟΗ)

2D

3 (Συμπληρωματική Εικόνα S1 Α και S1B). Αξίζει να σημειωθεί ότι, αν και η δραστικότητα του ανταποκριτή CYP24A1 ήταν ευαίσθητη σε εξωγενείς VDR και 1,25 (ΟΗ)

2D

3 σε αυτά τα κύτταρα (Σχήμα 2Α), όπως και TCF7L2,

mRNA CYP24A1 ενδογενές

δεν ήταν, παρά βελτιστοποίηση μορφομετατροπή που μας επέτρεψε να επιτύχουμε% αποτελεσματικότητα 60 (Σχήμα 2Β). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι VDRK240

– /- κύτταρα έχουν μακρόβιων μεταβολές στην ικανότητα των ενδογενών γονιδίων-στόχων για την αντιμετώπιση της παροδικής αποκατάσταση του VDR. Όπως αυτή εκφράζεται εξωγενώς υποκινητές είναι ευαίσθητο, αυτό είναι πιθανό αποτέλεσμα των αλλαγών στην οργάνωση της χρωματίνης που δεν μπορεί να αντιστραφεί με βραχυπρόθεσμη έκφραση VDR και η θεραπεία με 1,25 (ΟΗ)

2D

3.

Ως εκ τούτου, για τον προσδιορισμό περαιτέρω τα αποτελέσματα του VDR και της κλασικής συνδετήρα αυτού επί TCF-4 έκφραση, προσδιορίσαμε αρκετές ορθοκολικό καρκίνο κυτταρικές γραμμές για αλλαγές στην TCF-4 έκφραση σε απόκριση προς 1,25 (ΟΗ)

2D

3 (Σχήμα 2C, Συμπληρωματική Εικόνα S2). Αν και όλα αυτά τα κύτταρα αυξημένη έκφραση TCF4 σε απόκριση σε βιταμίνη D επιλέξαμε να χρησιμοποιήσει την κυτταρική σειρά ορθοκολικού αδενοκαρκινώματος ανθρώπινης, CaCo2 για διάφορους λόγους. Αυτά τα κύτταρα είναι καλά μελετηθεί στο πλαίσιο της σηματοδότησης βιταμίνης D και η ανάπτυξή τους αναστέλλεται από 1,25 (ΟΗ)

2D

3 [27]. Επιπλέον, είναι ένα μοναδικό σύστημα που μιμείται φυσιολογικό επιθήλιο του εντέρου ως τη στιγμή που θα γίνει συρροή διαφοροποιούνται στον πολιτισμό [28]. Αυτά τα κύτταρα εκφράζουν επίσης VDR, αλλά σε χαμηλότερες (δηλαδή κανονικών) επίπεδα σε σχέση με διάφορες άλλες καρκίνου του παχέος εντέρου κυτταρικές γραμμές [29], [30]. Θεραπεία της συρρέοντα κύτταρα CaCo2 με 10

-7 Μ 1,25 (ΟΗ)

2D

3, με ή χωρίς την επιμόλυνση του VDR οδηγούν σε μια ισχυρή και στατιστικά σημαντική αύξηση των TCF-4 πρωτεΐνης (Εικόνα 2D και ΜΙ). Τα αποτελέσματα της 1,25 (ΟΗ)

2D

3 σεμνά ενισχύεται από εξωγενείς VDR και αυτό είναι πιθανό ένας υποτιμημένος, καθώς μόνο το 50-60% των κυττάρων που επιμολύνονται. Το πιο σημαντικό, η αύξηση του TCF-4 διεγείρεται από 1,25 (ΟΗ)

2D

3 είναι απολύτως εξαρτάται από το VDR, καθώς knockdown του όχι μόνο αναστέλλει τις επιδράσεις της 1,25 (ΟΗ)

2D

3 σχετικά με τη δραστηριότητα του ρεπόρτερ VDRE υποκινητή και στην επαγωγή CYP24A1 mRNA, αλλά επίσης και για TCF-4-επαγωγή (Σχήμα 2D-G). Σε αντίθεση με VDRK240

– /- κύτταρα (Συμπληρωματική Εικόνα S1B), TCF7L2 και CYP24A1 mRNAs αυξήθηκαν κατά 1,25 (ΟΗ)

2D

3 σε CaCo2 κύτταρα (Σχήμα 3Α). Τόσο TCF7L2 και τα επίπεδα CYP24A1 ήταν αυξημένα μετά από 4 ώρες με TCF7L2 φθάνοντας στο μέγιστο επαγωγή στις 24 ώρες (Σχήμα 3Β). Ο κανονισμός αυτός υπόκειται επίσης σε κυτταρική πυκνότητα, όπως οι στατιστικά σημαντικές διαφορές σε TCF7L2 mRNA δει μόνο σε υψηλότερη πυκνότητα (Συμπληρωματική Εικόνα S3). Αυτό μπορεί να είναι ανάλογο με τις μετρίως ενισχύεται επιδράσεις εξωγενών VDR σε 1,25 (ΟΗ)

2D

3-διαμεσολαβούμενη αύξηση του TCF-4 (Σχήμα 2Ε), όπως τα κύτταρα CaCo2 γνωστό ότι ρυθμίζουν VDR επάνω συρροή /διαφοροποίηση [31].

(Α) qPCR ανάλυση των κυττάρων CaCo2 επιμολυσμένα και επεξεργασία όπως περιγράφεται στο Σχήμα 2D και 2Ε. TCF7L2 (αριστερό πάνελ) και CYP24A1 (δεξιά πλευρά) μεταγραφές. Τα δεδομένα κανονικοποιούνται σε GAPDH και απεικονίζονται σε σχέση με κάθε έλεγχο EtOH-θεραπεία. Οι p-τιμές που προκύπτουν από τη σύγκριση έλεγχος τ μεταξύ EtOH και D

3 έλεγχοι: * p & lt? 0,05? **? p & lt? 0,005? *** Ρ & lt? 0,0005 (Β) κύτταρα CaCo2 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία σε διαφορετικά χρονικά σημεία με 10

-7 Μ 1,25 (ΟΗ)

2D

3 έως και 48 ώρες πριν από τη συλλογή. mRNA για TCF7L2 (αριστερό πάνελ) και CYP24A1 (δεξί πάνελ) προσδιορίστηκε με qPCR. Δεδομένα κανονικοποιήθηκαν σε GAPDH και σχεδιάστηκαν ως φορές μεταβολής σε σχέση με το χρονικό σημείο μηδέν Hr. ρ-τιμές προήλθαν από έλεγχος τ σε σύγκριση με 0 Hr χρονικό σημείο: * ρ ​​& lt? 0,05? **? p & lt? 0,005? *** P & lt?. .0005

Η

VDR /1,25 (ΟΗ)

2D

3 ρυθμίζει τη δραστηριότητα της TCF7L2 Διοργανωτή μαστού ποντικού και ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου

Δεδομένου ότι TCF7L2 ρυθμίζεται από 1,25 (ΟΗ)

2D

3 στο επίπεδο mRNA σε κύτταρα CaCo2, εμείς σαρωθεί το ποντίκι και ανθρώπινα γονίδια TCF7L2 περίπου 4000 ζεύγη βάσεων ανοδικά της θέσης έναρξης μεταγραφής για την παρουσία του μισού sites που συμμορφώνονται με τη συναίνεση RGKTSA VDRE (R = Α ή G, K = G ή T? S = G ή C), ή μισο-sites που αποκλίνουν ελαφρώς από τη συναίνεση, αλλά που έχουν περιγραφεί ως λειτουργική VDRE μισό-sites στη βιβλιογραφία. Ταυτοποιήσαμε διάφορες υποθετικές VDREs κωδικοποιούνται στον υποκινητή TCF7L2 τόσο του γονιδίου ανθρώπου και ποντικού (Συμπληρωματικό πίνακα S1 [32] – [41]). Από το ποντίκι και το μερίδιο του ανθρώπου TCF7L2 υποκινητή περισσότερο από 80% ταυτότητα αλληλουχίας στο πρώτο ~2000 ζεύγη βάσεων, κλωνοποιήσαμε δύο τμήματα του υποκινητή ποντικού σε ένα κατασκεύασμα λουσιφεράσης (Σχήμα 4Α). Ένας ρεπόρτερ, -1037-Ιυο, περιέχει την περιοχή μεταξύ 522 και -515 ζεύγη βάσεων σε σχέση με τη θέση έναρξης της μεταγραφής και περιέχει το 5’UTR και την προβλεπόμενη ΤΑΤΑ σε -25 ζεύγη βάσεων. Το -2068-Ιυο ανταποκριτή εκτείνεται στην περιοχή μεταξύ 430 και -1542 σε σχέση με τη θέση μεταγραφικής έναρξης. Το πλασμίδιο ονόματα και ακολούθως αναφερθείσα VDREs αναφέρονται στην απόσταση από το κωδικόνιο έναρξης και όχι τη θέση έναρξης μεταγραφής αφού θέσεις έναρξης μεταγραφής βάση δεδομένων ποικίλλουν. Τα μισά sites των -187 /-177 DR4 στοιχεία, (δύο εξαμερή μισό-sites που διοργανώνονται ως άμεσες επαναλήψεις που χωρίζονται από τέσσερα νουκλεοτίδια) μετοχή ένα χρόνο ημίσειας χώρο μεταξύ τους.

(Α) TCF7L2 υποστηρικτής Δύο ποντίκι κατασκευάσματα κλωνοποιήθηκαν ανάντη ενός ανταποκριτή λουσιφεράσης. Οι τέσσερις υποθετικές θέσεις VDRE σε σχέση με τη θέση έναρξης της μετάφρασης υποδηλώνονται, και όλες οι VDREs κωδικοποιούνται επί του μη κωδικοποιητικού κλώνου. Οι -177 και -187 VDREs επικάλυψη και να μοιραστούν ένα μισό-χώρο μεταξύ τους. Το κατασκεύασμα -1037 (-1037-Luc) περιέχει την περιοχή από -1 έως -1037 σε σχέση με την θέση έναρξης της μετάφρασης και διαθέτει την -177 /-187 VDRE, μόνο, ενώ το -2068 ρεπόρτερ (-2068-Ιυο) περιέχει το περιοχή μεταξύ -96 και -2068 σε σχέση με την θέση έναρξης μετάφρασης του υποκινητή TCF7L2 ποντίκι, και διαθέτει τα τέσσερα υποθετικό VDREs. (Β) κύτταρα CaCo2 επιμολύνθηκαν για 24 ώρες με

Renilla

και ρεπόρτερ όπως υποδεικνύεται, καθώς και διαφορετικές ποσότητες ρ53. Τα δεδομένα κανονικοποιούνται σε

ΚβηϊΙΙθ

και σε κενή έκφραση δημοσιογράφος. RLU = Σχετικές Μονάδες Φωτός. (C) -1038-Luc ή κενό κατασκευάσματα φορέα επιμολύνθηκαν σε κύτταρα CaCo2 με

Renilla

και διαφορετικές ποσότητες VDR, όπως υποδεικνύεται. 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία επί άλλες 24 ώρες με 10

-7 Μ 1,25 (ΟΗ)

2D

3 ή ελέγχου του οχήματος EtOH. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν SEM. Στατιστικά προήλθαν από αμφίδρομης ANOVA για τις διαφορές μεταξύ EtOH-και 1,25 (ΟΗ)

2D

3-επεξεργασμένα δείγματα: * ρ ​​& lt? 0,05? **? p & lt? 0,005? *** P & lt? .0005. (D) κύτταρα επιμολύνθηκαν CaCo2, επεξεργασία και αναλύθηκαν όπως στο μέρος C χρησιμοποιώντας -2068-Luc αντί -1038-Luc. Στατιστικά δημιουργήθηκαν με αμφίδρομη ΑΝΟνΑ για σημαντικές διαφορές μεταξύ της ποσότητας του VDR επιμολυσμένα: *** ρ & lt? 0,0005. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν SEM. RLU:. Σχετικές Μονάδες Φωτός

Η

Reporter -1037-Luc περιέχει το πρώτο υποθετικό, ένωση μόνο VDRE, ενώ η -2068-Luc δημοσιογράφος περιέχει και τα τέσσερα VDREs. p53 μειώνει τη δραστηριότητα του ανθρώπινου ρεπόρτερ TCF7L2 και βρήκαμε ότι η ρ53 επίσης ανέστειλε την δραστικότητα τόσο -2068-Luc και -1037-Luc ρεπόρτερ ποντικού [42], [43] (Σχήμα 4Β). Επιπλέον, η βασική δράση του αναφορέα -2068-Ιυο ήταν σημαντικά μικρότερη από την -1037-Ιυο ανταποκριτή που δείχνει την παρουσία ενός ισχυρού στοιχείου καταστολέα στην περιοχή αυτή (Εικόνα 4Β). Σε κύτταρα CaCo2, το κατασκεύασμα -1038-Ιυο αποκρίνεται μετρίως, αλλά σημαντικά, με την προσθήκη του συνδέτη, αλλά το αποτέλεσμα δεν ήταν ενισχύεται από εξωγενή VDR (Σχήμα 4C, αριστερό πάνελ). Σε αντίθεση, -2068-Luc ανταποκρίνεται έντονα σε εξωγενή VDR, αλλά όχι σε θεραπεία με 1,25 (ΟΗ)

2D

3 σε CaCo2 και VDRK240

– /- κύτταρα (Σχήμα 4C, δεξιά πάνελ και των συμπληρωματικών Σχήμα S4A, αντίστοιχα). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι VDR και η θεραπεία με 1,25 (ΟΗ)

2D

3 επιρροές της δραστηριότητας του υποκινητή TCF7L2 αλλά δεν αποδεικνύουν ότι το αποτέλεσμα είναι άμεσο.

Υποθετικά VDREs εντός της ποντίκι TCF7L2 Ανάδοχος δεν είναι σημαντικά για τον κανονισμό με VDR στην μαστού ποντικού και Ανθρωπίνων παχέος καρκινικά κύτταρα

για να ελεγχθεί η υπόθεση ότι οι υποθετικές VDREs ήταν σημαντική στη μετάδοση της απάντησης του υποκινητή TCF7L2 στο VDR, το τρίτο και το τέταρτο νουκλεοτιδίων εντός κάθε μισό χώρο του μεταλλάχθηκαν σε διπλή υπολείμματα αλανίνης (Σχήμα 5Α). Το 5 ‘ήμισυ του χώρου των -187 δεν μεταλλάχθηκε από την 3’half τόπου εάν αυτό VDRE μοιράζεται με -178 VDRE, και μεταλλάχθηκε σε αυτό το κατασκεύασμα. Αυτές οι μεταλλάξεις μεταβάλλουν τα μισά sites όπως ότι δεν είναι σύμφωνες με την συναινετική αλληλουχία VDRE, και δεν πρέπει να δεσμεύει VDR. Οι μεταλλάξεις παράχθηκαν έτσι ώστε κάθε VDRE (που περιέχουν δύο μισές-sites, καθένα) μεταλλάχθηκε σε όλες τις επτά δυνατούς συνδυασμούς απλές μεταλλάξεις, διπλές μεταλλάξεις, και ένα τριπλό μετάλλαξη. Η επιμόλυνση αυτών των κατασκευασμάτων αποκάλυψε ότι διατήρησαν την ανταπόκριση στην εξωγενή VDR σε κύτταρα CaCo2 και VDRK240

– /- (Σχήμα 5Β και Σχήμα Συμπληρωματική S4B, αντίστοιχα). Είμαστε δίπλα εκτελούνται χρωματίνης ανοσοκατακρήμνιση (chip) θα δοκιμασίες για τον έλεγχο της πρόσληψης του VDR στα έξι υποθετικό VDREs προσδιορίζονται στο TCF7L2 υποστηρικτής των ανθρωπίνων (Σχήμα 5C). Caco2 κύτταρα σπάρθηκαν σε υψηλή πυκνότητα και υποβλήθηκε σε επεξεργασία για 4 ώρες με 10

-7 Μ 1,25 (ΟΗ)

2D

3. Τόσο η ρητινοειδούς Χ Υποδοχέα (RXR) και το VDR προσλήφθηκαν με τις δημοσιευμένες VDREs στον υποκινητή CYP24A1 (Σχήμα 5D, λωρίδες 1 και 2), ωστόσο, ούτε NHR προσλήφθηκε με οποιαδήποτε από τις υποθετικές VDREs στην περιοχή της ανθρώπινης TCF7L2 υποκινητή. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η αύξηση στην έκφραση TCF7L2 δεν οφείλεται στην πρόσληψη του VDR σε αυτές τις υποθετικές VDREs στο ποντίκι και προαγωγούς ανθρώπινης TCF7L2. Αυτό θα μπορούσε να σημαίνει ότι είτε το VDR είναι να προσληφθεί σε άλλες περιοχές του γονιδιώματος και τον έλεγχο της μεταγραφής του TCF7L2 άμεσα, ή το VDR ρυθμίζει αυτό το φαινόμενο μέσω ενός 1,25 (ΟΗ)

2D

3-ευαίσθητα μεσάζοντα .

(Α) Γραφική παράσταση των τεσσάρων υποθετικών VDREs μέσα στις πρώτες ~1500 ζεύγη βάσεων του υποκινητή της TCF7L2 ποντικού και οι αλληλουχίες τους. DR3: άμεση επανάληψη διανθίζονται από τρία νουκλεοτίδια. 2xDR4: δύο, επικαλυπτόμενες άμεσες επαναλήψεις που διανθίζονται από τέσσερα νουκλεοτίδια. Αν και οι υποθετικές VDREs κωδικοποιούνται επί του μη κωδικοποιητικού κλώνου, οι ακολουθίες τους γραμμένο σε αντίστροφη-συμπληρώματος έτσι ώστε τα VDREs μπορούν να αναγνωριστούν ως σύμφωνο με τη συναίνεση RGKTSA. (Β) -2068-Luc κατασκεύασμα που περιέχει και τα τρία σύνολα μεταλλάξεων ήμισυ χώρο (d1502 /d1153 /d177) διαμολύνθηκε σε κύτταρα CaCo2 και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με συνδέτη, όπως περιγράφεται στο Σχήμα 4C με μόνο 3 συγκεντρώσεις VDR (χαμηλής, μέσης και υψηλής ). Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν SEM. Στατιστικές αντιπροσωπεύουν ανάλυση χρησιμοποιώντας αμφίδρομη ΑΝΟνΑ: * ρ ​​& lt? 0.05. RLU-Σχετικές Μονάδες Φωτός. (Γ) Απεικόνιση των έξι υποθετικών VDREs προσδιορίζονται εντός 4000 ζεύγη βάσεων ανοδικά της θέσης έναρξης μεταγραφής της περιοχής της ανθρώπινης TCF7L2 υποκινητή και ονομάζονται σε σχέση με την απόστασή τους από τη θέση έναρξης της μετάφρασης (+ είναι κατάντη και ευεξία ανάντη). Όλα περιοχές εκτός από 88 (που σημειώνονται με) που κωδικοποιείται επί του μη κωδικοποιητικού κλώνου. (D) χρωματίνης ανοσοκαταβύθιση VDR και RXR δεσμευμένο θραύσματα DNA από κύτταρα CaCo2 αγωγή για 4 ώρες με 10

-7 Μ 1,25 (ΟΗ)

2D

3 (D-ζυγές λωρίδες) ή EtOH (E-μονό αριθμό λωρίδων). Οι περιοχές που ενισχύουν VDRE που περιέχουν περιοχές υποδηλώνονται κατά μήκος της κορυφής των λωρίδων. Το προϊόν CYP ενισχύει μια περιοχή του προαγωγέα ανθρώπινης CYP24A1 που είναι γνωστό ότι συνδέεται VDR και RXR υπό την παρουσία συνδέτη και χρησιμεύει ως ένας θετικός έλεγχος. IgG αντιπροσωπεύει μη-ειδική ενίσχυση. Εισόδου αποδεικνύει ισοδύναμο υλικό που χρησιμοποιείται σε κάθε δείγμα.

Η

Κανονισμός του TCF7L2 από VDR /1,25 (ΟΗ)

2D

3 είναι πιθανό διαμεσολαβείται από έναν έμμεσο μηχανισμό σε κύτταρα του καρκίνου του παχέος

Για να ελέγξετε την τελευταία υπόθεση, χρησιμοποιήσαμε τον αναστολέα μετάφρασης, κυκλοεξιμίδιο (CHX). Caco2 κύτταρα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με διαφορετικές ποσότητες CHX για 30 λεπτά και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 10

-7 Μ 1,25 (ΟΗ)

2D

3 για 24 ώρες. Σε κύτταρα CaCo2, σε συγκεντρώσεις τόσο χαμηλές όσο 12.5 μg /mL, CHX ήταν σε θέση να εμποδίσει σημαντικά την επαγωγή του mRNA TCF7L2 by1,25 (ΟΗ)

2D

3, όπως είναι DKK-4, μια άλλη έμμεση στόχου βιταμίνης D ότι είναι αρνητικά ρυθμιζόμενη (Σχήμα 6) [44]. Αυτά τα στοιχεία υποδεικνύουν ότι η απαίτηση για

de novo

πρωτεϊνική σύνθεση για τη ρύθμιση από 1,25 (ΟΗ

) 2D

3. Η επαγωγή mRNA CYP24A1 με 1,25 (ΟΗ)

2D

3 επίσης σημαντικά αναστέλλεται από CHX, αλλά εξακολουθεί να επάγεται ~ 20 φορές με 1,25 (ΟΗ)

2D

3 κατά τη υψηλότερη συγκέντρωση της CHX (Συμπληρωματική Εικόνα S5), ένα φαινόμενο που έχει δειχθεί για άλλη άμεση γονιδίου στόχου βιταμίνης D, E-cadherin [9]. Η ρύθμιση των CYP24A1 είναι τόσο δραματική που απαιτεί ίσως τη συνεχή σύνθεση των πρωτεϊνών συν-ενεργοποιητή για να υποστηρίξει μια πρόκληση αυτού του μεγέθους. Στο σύνολό τους, τα στοιχεία αυτά υποδηλώνουν ότι η ρύθμιση της TCF7L2 από VDR /1,25 (ΟΗ)

2D

3 είναι έμμεση.

Caco2 κύτταρα προ-επεξεργασία για 30 λεπτά με διάφορες συγκεντρώσεις ο αναστολέας της πρωτεϊνικής σύνθεσης κυκλοεξιμίδιο (CHX) πριν από την προσθήκη 10

-7 Μ 1,25 (ΟΗ)

2D

3 ή EtOH για 24 ώρες, όπως υποδεικνύεται. Ανάλυση των mRNA αφθονία του TCF7L2 (άνω πλαίσιο) και DKK4 (κάτω πίνακας) δοκιμάστηκε με qPCR. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν SEM. * P & lt?. .05 Μέσω t-test του Student για σημαντικές διαφορές μεταξύ των D

3 έναντι EtOH επεξεργασμένα κύτταρα

Η

1,25 (ΟΗ)

2D

3 Αυξάνει Reporter TCF δραστηριότητα στον καρκίνο του παχέος κύτταρα

Αν και η ρύθμιση της TCF7L2 είναι σημαντική για πολλούς παθολογικά αποτελέσματα, θέλαμε να δούμε αυτό στο πλαίσιο του καρκίνου. Εμείς επιλέξαμε να εξετάσουμε τις επιπτώσεις του VDR-μεσολάβηση TCF-4 πάνω ρύθμιση μέσω του κλασικού συστήματος δημοσιογράφος TopFlash που έχει περιγραφεί προηγουμένως (TopFlash, σε αντίθεση με ΟΤ, χρησιμοποιεί ένα ελάχιστο

c-fos

υποκινητή). Caco2 κύτταρα έχουν μια σωματική μετάλλαξη APC που επιτρέπει β-κατενίνης να συσσωρεύονται και μετατοπίζονται στον πυρήνα. Στην περίπτωση της υπερ-άφθονη, ενεργή β-κατενίνης μπορούμε να αναμένουμε μια αύξηση στην έκφραση TCF7L2 να οδηγήσει σε αυξημένη δραστηριότητα TopFlash. Πράγματι, επαναλάβαμε τα ίδια πειράματα τιτλοδότησης VDR όπως περιγράφεται στα πειράματα αναφοράς TCF7L2 προαγωγό (Σχήμα 4C), με τη χρήση TopFlash (κανονικοποιημένης ως προς το πλασμίδιο ελέγχου, FopFlash) αντ ‘αυτού, και παρατηρείται μια συνεπή, σημαντική αύξηση στη δραστηριότητα TopFlash με 24 ώρες 10

-7 Μ 1,25 (ΟΗ)

2D

3 σε κύτταρα CaCo2 (Σχήμα 7) ότι, όπως και τα δεδομένα πρωτεΐνης (Εικόνα 2D και 2Ε) ενισχύεται από το VDR. Αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν ένα ρόλο για VDR εξαρτώμενη, 1,25 (ΟΗ)

2D

3-διαμεσολαβούμενη αύξηση του TCF-4 στο μαστικό ποντικού και ανθρώπου κύτταρα όγκου του ορθού, τα αποτελέσματα των οποίων μπορεί διαφορικά ρυθμίζει β-κατενίνης δραστηριότητα

in vivo

.

Caco2 κύτταρα επιμολύνθηκαν για 24 ώρες με TopFlash,

Renilla

και διαφορετικές ποσότητες VDR και υποβάλλονται σε θεραπεία για μετέπειτα 24 ώρες με 10

-7 Μ 1,25 (ΟΗ)

2D

3 ή EtOH. Λουσιφεράσης δεδομένα κανονικοποιήθηκαν σε

Renilla

και FopFlash και απεικονίζονται σε σχέση με το κάθε δείγμα ελέγχου EtOH-θεραπεία. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν SEM. ρ-τιμές που αναφέρονται είναι από έλεγχος τ. RLU:. Σχετικές Μονάδες Φωτός

Η

Συζήτηση

Η βιταμίνη D έχει δείξει μεγάλη υπόσχεση ως αντικαρκινικός παράγοντας και στις δύο μοριακής και μελέτες σε ζώα, καθώς και ορισμένες επιδημιολογικές μελέτες (κριτική στην [45]). Σε μια προσπάθεια να αποσυνδέσει τις αντικαρκινικές επιδράσεις της βιταμίνης D από τις καλσεμικά αποτελέσματα που περιορίζουν τη χρησιμότητά της στην κλινική, πολλές εργαστήρια τεμαχίζοντας κατάντη δραστηριότητές της. Αρκετές μοριακούς μηχανισμούς που συμβάλλουν στην δυνητική θεραπευτική δράση της βιταμίνης D περιλαμβάνουν αλληλεπιδράσεις με το μονοπάτι β-κατενίνης. Μια άμεση αλληλεπίδραση μεταξύ β-κατενίνης και NHR, σε αυτήν την περίπτωση, ο υποδοχέας ρετινοϊκού οξέος περιγράφηκε για πρώτη φορά το 1999 [3]. Από τότε, πολλές μελέτες έχουν βρει παρόμοιες αλληλεπιδράσεις για υποδοχέα ανδρογόνων [8], [10], [11], ενεργοποιείται από πολλαπλασιαστή περοξυσώματος υποδοχέα [18], και VDR [2], [9]. Αυτές οι μελέτες δείχνουν ότι τα μέλη της οικογένειας NHR και TCF /LEF ανταγωνίζονται για δέσμευση με β-κατενίνης ή /και κοινή συν-ενεργοποιητές, όπως p300. Με την παρουσία του συνδέτη, β-κατενίνης και /ή p300 ευνοεί σύνδεση με το ΝΗΚ, προκαλώντας μια συνεργική ρύθμιση προς τα πάνω (σε συνδυασμό με συνδέτη NHR) του NHR ρυθμιζόμενα γονίδια, καθώς και την ταυτόχρονη ρύθμιση προς τα κάτω του TCF /β κατενίνης ανταποκρίνεται γονίδια.