Αφηρημένο

γοναδοτροπίνη-απελευθερώνοντας ορμόνης-I (GnRH-Ι) έχει προσελκύσει μεγάλη προσοχή ως ένα ορμονικό θεραπευτικό εργαλείο, ιδιαίτερα για ασθενείς με καρκίνο του προστάτη ανδρογόνο-εξαρτώμενη. Ωστόσο, η ανδρογόνο-ανεξαρτησίας του καρκίνου σε προχωρημένο στάδιο έχει κεντρίσει ερευνητές να ψάξουν για νέες ιατρικές θεραπείες. Σε προηγούμενες εκθέσεις, έχουμε αναπτύξει τον ανταγωνιστή GnRH-ΙΙ Trp-1 να αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό και διεγείρουν την αυτοφαγικά θάνατο διαφόρων κυττάρων καρκίνου του προστάτη, συμπεριλαμβανομένης ανεξάρτητου από ανδρογόνο κύτταρα. Έχουμε περαιτέρω διαλογή πολλές ανταγωνιστές GnRH-ΙΙ για τον εντοπισμό μορίων με υψηλότερη απόδοση. Εδώ, ερευνήσαμε την επίδραση του SN09-2 επί της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων PC3 προστάτη. SN09-2 μείωσε την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του προστάτη, αλλά δεν είχε καμία επίδραση επί των κυττάρων που προέρχονται από άλλους ιστούς. Σε σύγκριση με ΤΚΡ-1, SN09-2 εμφανώς ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων του καρκίνου του προστάτη, ακόμη και σε χαμηλές συγκεντρώσεις. SN09-2 επαγόμενη PC3 αναστολή ανάπτυξης κυττάρου που σχετίζεται με το δυναμικό μειώθηκε μεμβράνη στα μιτοχόνδρια όπου συσσωρεύτηκε ο ανταγωνιστής, και αυξημένη μιτοχονδριακή και κυτοσολικές αντιδραστικά είδη οξυγόνου. SN09-2 επαγόμενη γαλακτικής αφυδρογονάσης απελευθέρωση εντός του μέσου και αννεξίνη V-χρώση στην επιφάνεια PC3 κυττάρων, γεγονός που υποδηλώνει ότι ο ανταγωνιστής διεγερμένα προστάτη θάνατο των καρκινικών κυττάρων μέσω της ενεργοποίησης αποπτωτικών οδών σηματοδότησης. Επιπλέον, το κυτόχρωμα c απελευθέρωση από μιτοχόνδρια στο κυτοσόλιο και την ενεργοποίηση της κασπάσης-3 εμφανιστεί σε μια συγκέντρωση και το χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο. SN09-2 επίσης ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων PC3 ξενομεταμοσχευμένων σε γυμνά ποντίκια. Αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι SN09-2 προκαλεί άμεσα μιτοχονδριακή δυσλειτουργία και την επακόλουθη παραγωγή ROS, με αποτέλεσμα όχι μόνο την αναστολή της ανάπτυξης, αλλά και την απόπτωση των καρκινικών κυττάρων του προστάτη

Παράθεση:. Πάρκο S, Han JM, Cheon J, Hwang JI , Seong JY (2014) Αποπτωτικού θάνατο των κυττάρων καρκίνου του προστάτη από μια ορμόνη απελευθέρωσης γοναδοτροπινών-ΙΙ ανταγωνιστή. PLoS ONE 9 (6): e99723. doi: 10.1371 /journal.pone.0099723

Επιμέλεια: Ντχιάνι Chandra, Roswell Park Cancer Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 6 Φεβρουαρίου 2014? Αποδεκτές: 18 του Μάη του 2014? Δημοσιεύθηκε: 13 Ιουνίου 2014

Copyright: © 2014 Πάρκο et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το πρόγραμμα βασικής έρευνας (2013R1A2A2A01068295) του Εθνικού Ιδρύματος Ερευνών της Κορέας (NRF), που χρηματοδοτείται από το Υπουργείο Επιστημών, των ΤΠΕ, και μελλοντικό σχεδιασμό και την Εθνική R & amp? D Προγράμματος Ελέγχου Καρκίνου, Υπουργείο Υγείας & amp? Πρόνοιας (0520270-1). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη είναι η πιο κοινή κακοήθεια που εμφανίζεται στο ανδρικού αναπαραγωγικού συστήματος. Αν και οι περισσότεροι καρκίνοι του προστάτη είναι αργή ανάπτυξη, μπορεί να προκαλέσει πόνο και δυσκολία στην ούρηση, και οι πιο επιθετική από αυτές είναι πιθανό να υφίστανται μετάσταση σε άλλα μέρη του σώματος [1]. Παγκοσμίως, ο καρκίνος του προστάτη είναι η έκτη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο που σχετίζονται με τους άνδρες [2], και στις Ηνωμένες Πολιτείες, αυτή κατατάσσεται δεύτερη [3]. Μια κοινή θεραπεία για τον προχωρημένο καρκίνο του προστάτη είναι η ορμονική θεραπεία σε συνδυασμό με θεραπεία με ακτινοβολία [4]. Ο κύριος στόχος της ορμονικής θεραπείας είναι να αφαιρεθούν ή να μειώσετε ανδρογόνων στον ορό, μια πιθανή διεγερτικό ανάπτυξης για τον καρκίνο του προστάτη. Ωστόσο, σε πολλές περιπτώσεις, η αρχική υποχώρηση των όγκων που ακολουθείται από επανα-ανάπτυξη ανεξάρτητη από ανδρογόνο επίπεδα, αυξημένη επιθετικότητα και μεταστατική δραστηριότητα υψηλής [5]. Για το λόγο αυτό, η ανάπτυξη αποτελεσματικών φαρμάκων για τη θεραπεία της μη εξαρτώμενου από ανδρογόνα καρκίνου του προστάτη είναι ένα επείγον θέμα.

Στην υποθαλάμου-υπόφυσης-γονάδων άξονα, ορμόνη απελευθέρωσης γοναδοτροπινών-I (GnRH-Ι) που συντίθεται στον υποθάλαμο διεγείρει την έκκριση των γοναδοτροπινών της υπόφυσης ωχρινοτρόπου ορμόνης (LH) και της ωοθυλακιοτρόπου ορμόνης (FSH), η οποία με τη σειρά τους ρυθμίζουν την σύνθεση και έκκριση των ανδρογόνων, συμπεριλαμβανομένης της τεστοστερόνης, από τους όρχεις [6]. Η χρόνια χορήγηση ενός ΟηΚΗ-Ι αγωνιστής οδήγησε στην προς τα κάτω ρύθμιση του υποδοχέα της GnRH στην υπόφυση, με αποτέλεσμα μια σημαντική μείωση στα κυκλοφορούντα επίπεδα ανδρογόνων [7]. ανταγωνιστές GnRH-Ι επίσης μείωσε τα επίπεδα των ανδρογόνων στον ορό αδρανοποιώντας τον υποδοχέα GnRH [6], [8]. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι οι ορμονικές θεραπείες που χρησιμοποιούν αγωνιστές και ανταγωνιστές GnRH-Ι είναι εφαρμόσιμη στην αγωγή της καλοήθους υπερπλασίας του προστάτη και εξαρτώμενων από ανδρογόνα καρκίνων του προστάτη. Επιπλέον, πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι ΟηΚΗ-Ι επηρεάζει άμεσα και τις δύο ανδρογόνο-εξαρτώμενη και ανεξάρτητη από ανδρογόνο καρκινικών κυττάρων του προστάτη. ΟηΚΗ-Ι αγωνιστές ανέστειλαν παράγοντα επιδερμικής ανάπτυξης ή πολλαπλασιασμού του προστάτη καρκινικών κυττάρων παράγοντα διεγείρεται ανάπτυξης ινσουλίνης, και προκάλεσε την απόπτωση των καρκινικών κυττάρων σε συνθήκες στέρησης ορού [9], [10]. Οι επιδράσεις αυτές προτείνεται να μεσολαβεί ο υποδοχέας ΟηΚΗ-Ι, η οποία διεγείρει G

i-συνδεδεμένη σηματοδότηση εξαρτώμενη ενεργοποίηση των πρωτεϊνών απόπτωση, συμπεριλαμβανομένης της c-Jun NH

κινάση 2-τερματικό (JNK) [11 ]

στις περισσότερες σπονδυλωτά, ο άλλος τύπος της GnRH, που ονομάζεται ΟηΚΗ-ΙΙ, προσδιορίζεται, η οποία είναι δομικά συντηρημένη σε εξέλιξη από ψάρια σε θηλαστικά [12] – [14].. ΟηΚΗ-ΙΙ εκφράζεται όχι μόνο στον εγκέφαλο αλλά και στο περιφερικό αναπαραγωγικό και ανοσοποιητικό ιστούς [15]. Αυτή η ευρεία πρότυπο έκφρασης μπορούν να αναθέτουν μια ποικιλία από φυσιολογικές λειτουργίες επί του πεπτιδίου. Παρόμοια με ΟηΚΗ-Ι, ΟηΚΗ-ΙΙ είναι σε θέση να ρυθμίζουν την αναπαραγωγή σε γυναίκες με διέγερση της έκκρισης της LH και FSH [16], [17]. Ακόμα κι αν οι δύο GnRHs δρουν στην ανθρώπινη κοκκιώδη-ωχρινική κύτταρα, παρουσιάζουν διαφορετικές ορμονικές πρότυπα της νομοθεσίας [18], [19]. ΟηΚΗ-ΙΙ που παράγονται από ανθρώπινα κύτταρα Τ διεγείρει την έκφραση του υποδοχέα λαμινίνης και της μετανάστευσης των κυττάρων [20]. έκφραση του υποδοχέα λαμινίνης ενδιαφέρον, ΟηΚΗ-ΙΙ-επαγόμενη δεν μπλοκάρεται από το ΟηΚΗ-Ι ανταγωνιστής cetrorelix, υπονοώντας ότι ΟηΚΗ-ΙΙ δεν αλληλεπιδρά με τον υποδοχέα GnRH-Ι [20]. Πρόσφατα, έχουμε και άλλες ομάδες που προσδιορίζονται με τον υποδοχέα GnRH-ΙΙ σε είδη μη-θηλαστικών. Ο υποδοχέας δεσμεύεται με ΟηΚΗ-ΙΙ με υψηλότερη ευαισθησία και συγγένεια παρά να ΟηΚΗ-Ι [21], [22]. Επιπλέον, μια ΟηΚΗ-ΙΙ-ειδικού υποδοχέα κλωνοποιήθηκε από πίθηκο και ονομάζεται υποδοχέας θηλαστικών ΟηΚΗ-ΙΙ [23]. Ο υποδοχέας είναι άκρως επιλεκτική για ΟηΚΗ-ΙΙ και φαίνεται να είναι διαφορετική από τον υποδοχέα ΟηΚΗ-Ι από την άποψη της ταχείας εσωτερίκευση κατά την αλληλεπίδραση συνδέτη και μονοπάτια σηματοδότησης. Στον άνθρωπο, τα γονίδια των υποδοχέων που μοιάζουν με ΟηΚΗ-ΙΙ εντοπίζεται σε χρωμοσώματα 1 και 14. Αν και τα mRNA για αυτά τα γονίδια που εκφράζονται σε πολλούς ιστούς συμπεριλαμβανομένου του εγκεφάλου και ακόμη και σε πολλές κυτταρικές γραμμές, φαίνεται να είναι μη λειτουργική ψευδογονίδια οφείλεται σε ένα πρόωρο κωδικόνιο τερματισμού [24], [25]. Η απουσία ενός λειτουργικού υποδοχέα συζευγμένου με πρωτεΐνη G για ΟηΚΗ-ΙΙ στον ανθρώπινο υποδεικνύει την πιθανότητα άλλων τύπων εταίρων δέσμευσης για μεμβράνη του πλάσματος, ενώ λειτουργική μεσολαβητές του παραμένουν ακόμη άγνωστες.

Είναι ενδιαφέρον ότι, ΟηΚΗ-ΙΙ εμφανίζει την ικανότητα να αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών, καθώς και καρκινικά κύτταρα προστάτη [26], [27]. ΟηΚΗ-ΙΙ είναι πιθανό να λειτουργεί σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη με αλληλεπίδραση με άγνωστες πρωτεΐνες, με βάση την προηγούμενη παρατήρηση μας ότι ραδιοσημάνθηκαν ΟηΚΗ-ΙΙ ήταν ικανή να δεσμεύει διάφορα ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του προστάτη [27]. Αυτή η δέσμευση εκτοπίστηκε από μη σημασμένο ΟηΚΗ-ΙΙ, αλλά όχι από ΟηΚΗ-Ι. Το εύρημα αυτό υποδηλώνει ότι ΟηΚΗ-ΙΙ μπορεί να είναι ένα πιθανό φάρμακο για τη θεραπεία του καρκίνου του προστάτη, αν και υψηλή συγγένεια δέσμευσης του ΟηΚΗ-ΙΙ για καρκινικά κύτταρα του προστάτη φαίνεται να μην οφείλεται στην έκφραση ενός συμβατικού υποδοχέα ΟηΚΗ-ΙΙ. Πρόσφατα, έχουμε αναπτύξει ένα νέο ανταγωνιστή της GnRH-ΙΙ, που ονομάζεται trptorelix-1 (ΤΚΡ-1). Trp-1 είναι σε θέση να διεγείρει τον θάνατο ανδρογόνο-εξαρτώμενη και ανεξάρτητη από κύτταρα καρκίνου του προστάτη από υποκείμενων μηχανισμών όπως μιτοχονδριακή δυσλειτουργία που ακολουθείται από αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) και autophagy [28].

Συνθέσαμε επιπλέον GnRH -II ανταγωνιστές να συγκριθεί με την επίδραση ΤΚΡ-1 και να βελτιώσει την επίδραση του θανάτου. Εδώ, παρουσιάζουμε έναν άλλο ανταγωνιστή, SN09-2 που είναι σε θέση να αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό και επάγει το θάνατο σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του προστάτη με υψηλότερη απόδοση από ό, τι εκείνη του ΤΚΡ-1. Επιπλέον, οι λειτουργικές τους μηχανισμούς του θανάτου είναι διαφορετική μορφή Trp-1, και περιλαμβάνουν την ενεργοποίηση των αποπτωτικών μονοπατιών.

Υλικά και Μέθοδοι

αναλόγων GnRH-ΙΙ και αντιδραστήρια

ο ανταγωνιστής GnRH-ΙΙ [Ac-D-Nal (2) -D-Phe (4Cl) -D-Pal (3) -Ser-Phe-D-Lys-Trp-Tyr-Arg-D-Ala-NH

2], ορίζεται ως SN09-2 και ισοθειοκυανική φθορεσκεΐνη του (FITC) μορφή συντέθηκαν από AnyGen (Gawngju, Κορέα). Trp-1 [Ac-D-Nal (2) -D-Phe (4Cl) -D-Pal (3) -Ser-Tyr-D-Cit-Trp-Tyr-Pro-D-Ala-NH

2 ] συνετέθη επίσης από την ίδια εταιρεία [28].

Η μιτοχονδριακή μεμβράνη 5,5 δυναμικό ανιχνευτή ‘, 6,6′-τετρα-1,1′, 3,3’-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine ιωδιούχο (JC- 1), Mitotracker, και 2 ‘, 7’-dichlorfluorescein-διοξεικό (DCF-DA) αγοράστηκαν από την Invitrogen (Palo Alto, CA, USA). μέσα καλλιέργειας κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco (ϋΜΕΜ) και Roswell Park Memorial Institute (RPMI) ελήφθησαν από Welgene Inc. (Daegu, Κορέα). Ο ορός εμβρύου μόσχου (FBS) και πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη ήταν από την Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Όλα τα αντιδραστήρια περιλαμβανομένων Hoechst 33342, Annexin-V, H

2O

2, και βόειο ορό αλβουμίνης ελήφθησαν από την Sigma (St. Louis, ΜΟ) εκτός αν ορίζεται διαφορετικά. Αντισώματα έναντι διασπασμένης κασπάσης-3, ακέραια κασπάσης-3, και κυτόχρωμα C αγοράστηκαν από την Cell Signaling Technology (Danver, ΜΑ, USA). Αντι-β-ακτίνης αντισώματα ήταν από τη Sigma.

Κυτταρική καλλιέργεια

Όλες οι κυτταρικές γραμμές ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). PC3, κυτταρικές σειρές LNCaP, DU145, και DLD1 καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 που περιέχει 10% θερμο-απενεργοποιημένο FBS, 100 μονάδες πενικιλλίνη, και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη σε 37 ° C και υγροποιημένο 5% CO

2. κύτταρα HeLa καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ που περιέχει 10% FBS κάτω από τις ίδιες συνθήκες.

προσδιορισμό γονιδίου αναφοράς

CV-1 κύτταρα καλλιέργειας για μία νύχτα σε τρυβλία 24 φρεατίων και στη συνέχεια επιμολύνθηκαν με σύμπλεγμα λιποσώματος που περιέχει pGL3 /SRE-Luc πλασμίδια με ταύρο βάτραχος ΟηΚΗΚ-ΙΙ (bfGnRHR-II) ή πράσινο μαϊμού-ΟηΚΗΚ II (gmGnRHR-ΙΙ). Ένα άλλο 48 ώρες αργότερα, τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με ΟηΚΗ-ΙΙ (1 ηΜ για bfGnRHR-ΙΙ, 10 ηΜ gmGnRHR-ΙΙ) και διαφορετική συγκέντρωση SN09-2 ή Trp-1 για 6 ώρες πλύθηκαν με PBS και διαλυτοποιημένο με ρυθμιστικό λύσης. Η δραστικότητα λουσιφεράσης των κυτταρικών εκχυλισμάτων προσδιορίσθηκε χρησιμοποιώντας το τυποποιημένο σύστημα δοκιμασίας λουσιφεράσης από BioTek Instrument, Inc. (Winooski, VT). Για να προσδιοριστεί η αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης, λουσιφεράση δραστηριότητες κανονικοποιήθηκαν με τη δραστικότητα β-gal. Όλα τα δεδομένα που υπολογίζονται από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα κανονικοποιήθηκαν με μη επεξεργασμένα ομάδες.

Κυτταρική βιωσιμότητα δοκιμασία

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 12-φρεατίων εις τριπλούν (1 × 10

4 κύτταρα /Λοιπόν). Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις ανταγωνιστών GnRH-ΙΙ διαλυτοποιήθηκαν σε 0,1% DMSO κάθε 24 ώρες για τον αναφερόμενο αριθμό ημερών. Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν με ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο (PBS), διαχωρίστηκαν με θρυψίνη /ΕϋΤΑ, και επανα-αιωρήθηκαν σε 500 μΐ πλήρους μέσου ανάπτυξης. Μπλε τρυπάνης (0,4%) των κυττάρων χρωστικής-με εξαίρεση μετρήθηκαν υπό ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο (Olympus, Tokyo, Japan).

Γαλακτική αφυδρογονάση απελευθέρωση δοκιμασία

δοκιμασία Γαλακτική αφυδρογονάση (LDH) δραστηριότητα διεξήχθη σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Roche Applied Science, Mannheim, Germany). Εν συντομία, τα κύτταρα PC3 σπάρθηκαν σε πλάκες 12-φρεατίων σε 2 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο. Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις SN09-2 σε 5% FBS που περιέχει RPMI 1640 για 3 ημέρες. Τα μέσα καλλιέργειας μεταφέρθηκαν σε σωλήνες Eppendorf και φυγοκεντρήθηκε για 1 λεπτό στις 5000 rpm. Εκατό μικρολίτρα από κάθε υπερκείμενο μεταφέρεται σε ένα οπτικά διαυγές πλάκα 96 φρεατίων. Εκατό μικρολίτρα προσφάτως παρασκευασθέντος μίγματος της αντίδρασης προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο και επωάστηκαν για 30 λεπτά στους 25 ° C. Η απορρόφηση των δειγμάτων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας το φίλτρο μήκους κύματος 490 nm-του αναγνώστη ELISA.

αννεξίνης V δοκιμασία χρώσης

Η απόπτωση των κυττάρων PC3 αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ ανίχνευσης απόπτωσης (Koma Biotech, Σεούλ, Κορέα). Μετά από έκθεση σε SN09-2 για τους υποδεικνυόμενους χρόνους ή σε διαφορετικές συγκεντρώσεις, τα κύτταρα PC3 συλλέχθηκαν και πλύθηκαν με ψυχρό PBS και επανα-εναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC) σύνδεση συζευγμένη πρωτεΐνη V αννεξίνης και ιωδιούχο προπίδιο. δέσμευσης αννεξίνης V και χρώση ΡΙ προσδιορίστηκαν με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). Τα αποπτωτικά κύτταρα ορίζονται ως ΡΙ-αρνητικά και αννεξίνης ν-θετικής.

Μετά την επεξεργασία με SN09-2, PC3 κύτταρα με πολυ-D-λυσίνη καλυπτρίδες καθηλώθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη για 15 λεπτά, πλύθηκαν με PBS τρεις φορές, και επωάστηκαν με Cy3-συζευγμένο αννεξίνη V. τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και επωάστηκαν με σύντομα Heochst33342 (10 μg /ml). Βιτρώ κύτταρα έγιναν ορατά κάτω από LSM 510 ομοεστιακό μικροσκόπιο (Carl Zeiss, Jena, Germany).

ανάλυση Western blot

Κύτταρα (5 × 10

4) απλώθηκαν σε πιάτα 100 mm . Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις SN09-2 για διαφορετικούς χρόνους, συλλέχθηκαν, και επωάζονται με ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 10 mM HEPES (ρΗ 7.9), 10 mM KCl, 0,5 mM DTT, και κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Roche) για 30 λεπτά επί πάγου. Τα κύτταρα διασπάσθηκαν με έναν ομογενοποιητή Dounce με 20 χτυπήματα και φυγοκεντρήθηκαν στις 5900 χ

g

για 10 λεπτά για να συλλεχθεί το κυτοσολικό κλάσμα. Τα προκύπτοντα σφαιρίδια αιωρούνται εκ νέου σε ψυχρό ρυθμιστικό, εν συντομία σε υπερήχους τρεις φορές, και φυγοκεντρήθηκε στα 5900 χ

g

για 10 λεπτά για να ληφθεί ακατέργαστο μιτοχονδριακών πρωτεϊνών. Πρωτεΐνες από κάθε κλάσμα (20 μα) εφαρμόστηκαν σε ηλεκτροφόρηση SDS-πολυακρυλαμιδίου (12% gel) και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (Millipore, Billerica, ΜΑ). Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με 3% αλβουμίνη βόειου ορού και επωάστηκαν με τα κατάλληλα αντισώματα. Μετά από πλύσιμο με ρυθμισμένο με Tris αλατούχο διάλυμα που περιέχει 0.05% Tween 20, οι μεμβράνες επωάστηκαν με δευτερεύοντα αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση αρμορακίας και τα σήματα ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ενισχυμένο διάλυμα χημειοφωταύγειας (GE Healthcare Life Science, Buckinghamshire, UK).

υποκυτταρικός εντοπισμός της SN09-2

Δύο ημέρες μετά την επίστρωση σε πολυ D-λυσίνη-κάλυμμα γλιστρά σε 12-φρεατίων, τα κύτταρα PC3 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 66 ηΜ Mitotracker για 30 λεπτά και στη συνέχεια με 10 mM FITC- SN09-2 για 10 λεπτά στους 37 ° C. Μετά από πλύση με PBS, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη για 10 λεπτά. Οι πυρήνες βάφτηκαν με Hoechst 33342. σήματα φθορισμού εντοπίστηκαν κάτω από το συνεστιακό μικροσκόπιο.

Μέτρηση του δυναμικού δυναμικό

μιτοχονδριακή μεμβράνη μιτοχονδριακής μεμβράνης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας JC-1. Σε υγιή κύτταρα, JC-1 σχηματίζει συσσωματώματα εντός μιτοχόνδρια, δημιουργώντας κόκκινο φθορισμό. Ωστόσο, κατά τη διάρκεια μιτοχονδριακή αποπόλωση, JC-1 μονομερών διαχυθεί σε όλο το κύτταρο, παράγοντας πράσινο φθορισμό. PC3 κύτταρα σπάρθηκαν με πολυ-D-λυσίνη καλυπτρίδων σε πλάκες 12 φρεατίων. Μετά την επεξεργασία με 10 μΜ SN09-2 για 3 ημέρες, τα κύτταρα επωάστηκαν με PBS που περιέχει JC-1 (2,5 μg /ml) για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα πλύθηκαν, σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη, και παρατηρήθηκαν κάτω από το μικροσκόπιο συνεστιακό. Μετά την επώαση με JC-1, PC3 κύτταρα αποκολλήθηκαν από το πιάτο και να εφαρμοστεί για τη διαλογή ανάλυση ενεργοποιημένων με φθορισμό κυττάρων (FACS).

Χάντρες σύζευξη και τραβήξτε προς τα κάτω

δοκιμασία

Χάντρες σύζευξη SN09- 2 πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται στο προηγούμενο έγγραφο [28]. Εν συντομία, Ν-hydroxysunninimide-ενεργοποιημένη sepharose σφαιρίδια επωάστηκαν με SN09-2 σε ρυθμιστικό σύζευξης όλη τη νύχτα σε 4 ° C, και στη συνέχεια πλένεται με ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 0.1 Μ Tris-HCl (ρΗ 8,5) και ένα ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 0.1 Μ οξικό (ρΗ 4.5) και 0.5 Μ NaCl. κλάσμα μεμβράνης των κυττάρων PC3 απομονώθηκε με ομογενοποίηση και φυγοκέντρηση. Τα προκύπτοντα σφαιρίδια διαλύθηκαν σε ρυθμιστικό λύσης που περιέχει 1% Triton-X 100 και φυγοκεντρείται σε 20.000 χ

g

για 15 λεπτά στους 4 ° C. Τα υπερκείμενα επωάστηκαν με SN09-2-συζευγμένο σεφαρόζης και πλένονται με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης. Τα ιζήματα επωάστηκαν με 50 μΜ SN09-2 και τα υπερκείμενα εφαρμόστηκαν για SDS-PAGE και κηλίδωση Western με αντι-GPR75 αντισώματα.

γενιάς Ενδοκυτταρική ROS

Αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) ήσαν μετράται με τη χρήση DCF-DA. PC3 κύτταρα (1 χ 10

5) καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία 60-mm, καλλιεργήθηκαν σε 5% FBS RPMI, και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με SN09-2 για 3 ώρες. Μετά από επώαση με 5 μΜ DCF-DA για 30 λεπτά στους 37 ° C στο σκοτάδι, τα κύτταρα πλύθηκαν, επαναιωρήθηκαν σε PBS, και στη συνέχεια εφαρμόστηκε σε ανάλυση FACS.

Η ανοσοκυτταροχημεία

PC3 κύτταρα (4 χ 10

4) απλώθηκαν σε καλυπτρίδες σε 12 φρεατίων και αγωγή με 10 μΜ SN09-2 για 12 ώρες. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη για 10 λεπτά, διαπερατά με 0,2% Triton-X σε PBS, πλύθηκαν και αποκλείστηκαν με 3% BSA σε PBS για 30 λεπτά. Πολυκλωνικά αντισώματα κουνελιού έναντι διασπασμένης κασπάσης-3 (1:200) και αντισώματα αντι-β-ακτίνης ποντικού μονοκλωνικό (1:1000) εφαρμόστηκαν στα κύτταρα. Δραστική κασπάση-3 και β-ακτίνης έγιναν ορατά με επώαση τόσο με Alexa 594-συζευγμένη αντι-ποντικού και Alexa 488-συζευγμένο αντι-κουνελιού δευτερογενή αντισώματα για 1 ώρα. Στη συνέχεια, τα κύτταρα βάφτηκαν με Hoechst 33342 (1 μg /ml) για 5 λεπτά, τοποθετήθηκαν πάνω σε πλάκες, και παρατηρήθηκαν κάτω από το μικροσκόπιο συνεστιακό.

In vivo

ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του προστάτη

Έξι-εβδομάδων αρσενικών αθυμικών γυμνών ποντικών (BALB /c-nu) ελήφθησαν από τη Harlan (Houston, ΤΧ). Τα ποντίκια στεγάστηκαν κάτω από ειδικές συνθήκες άνευ παθογόνου σε ατομικά αεριζόμενους σύστημα εγκλωβισμού. Όλες οι πειραματικές διαδικασίες πραγματοποιήθηκαν μετά τη λήψη έγκρισης από την Επιτροπή Θεσμικών Animal Care and Use of Clinical Research Institute στο Εθνικό Πανεπιστήμιο της Σεούλ Νοσοκομείο. PC3 κύτταρα (6 × 10

6) εγχύθηκαν στο δεξί πλευρό των ποντικών. Δέκα ημέρες μετά την ένεση των κυττάρων, οι όγκοι με όγκο περίπου 20-25 mm

3 αναπτύχθηκε στα περισσότερα ποντίκια? όγκοι του όγκου μετρήθηκαν κάθε μέρα. Οι όγκοι των όγκων καθορίζονται από δύο κάθετες διαστάσεις [μήκος (

L

) και το πλάτος (

W

)] και το ύψος (

H

), μετρήθηκε χρησιμοποιώντας Vernier δαγκάνες (το τύπος είναι

V

= (π /6) × (

W

×

L

×

Η

). Από αυτή τη στιγμή, SN09-2 ( μορφή οξικό οξύ) διαλύθηκε σε 5% Ν, Ν-διμεθυλακεταμίδιο (DMA), 10% γλυκερόλη, και το% απεσταγμένο νερό 85 το οποίο είναι βιοσυμβατό διαλύτη εγχύθηκαν υποδορίως εντός των ποντικών για 25 διαδοχικές ημέρες. το μέγεθος του όγκου σε κάθε ποντίκι μετρήθηκε κάθε ημέρες. Έξι έως επτά ποντίκια χρησιμοποιήθηκαν για κάθε πειραματική ομάδα.

Στατιστική ανάλυση

τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό PRISM4 (GraphPad). μέσα ομάδα συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας το Student

t

δοκιμής ή μονόδρομη ANOVA που ακολουθείται από πολλαπλές συγκρίσεις Bonferroni είναι ένα

P-

αξία & lt?.. 0.05 έγινε δεκτή ως σημαντική

Αποτελέσματα

SN09-2 προκαλεί καρκίνο του προστάτη κυττάρων -εξειδικευμένης θάνατο

Έχουμε αναφερθεί στο παρελθόν ότι ένα νέο ανταγωνιστή GnRH-ΙΙ Trp-1 που προκαλείται από καρκίνο του προστάτη κυτταρικό θάνατο [28]. Για τον εντοπισμό πιο αποτελεσματικό μόριο, συνθέσαμε 65 ανάλογα με βάση Trp-1 δομή και έλεγχο των δραστηριοτήτων θάνατό τους για PC3 και LNCaP χωρίς καμία τοξική δράση στην πνευμονική ινοβλαστών MRC-5. Τέλος, SN09-2 επελέγη ως δυνητικά αποτελεσματικές GnRH ανταγωνιστή-ΙΙ να αναστέλλουν την ανάπτυξη καρκίνου του προστάτη κυττάρων. Σε προηγούμενες ρεπόρτερ, εντοπίσαμε Trp-1 έχει ανταγωνιστική δράση επί GnRHR-II [28]. παρούσα δοκιμασία γονιδίου αναφοράς μας αποκαλύπτει ότι SN09-2 έχει επίσης μια ισχυρή ανταγωνιστική δράση επί GnRHR-ΙΙ ακόμη και σε σύγκριση με ΤΚΡ-1 (Εικ. 1). SN09-2 ανταγωνίζεται αποτελεσματικά την επίδραση των GnRH-ΙΙ ταύρος βάτραχος ΟηΚΗΚ-II (IC

50 = 0.01 μΜ) και το πράσινο μαϊμού-ΟηΚΗΚ II (IC

50 = 1,9 μΜ). Ωστόσο, Trp-1 ανέστειλε την ενεργοποίηση μόνο ταύρος βάτραχος ΟηΚΗΚ-II με υψηλής δραστικότητας (IC

50 = 0.25 μΜ). Οι αλληλουχίες του ΟηΚΗ-ΙΙ, Trp-1, και SN09-2 περιγράφηκαν στο Σχ. 2Α. PC3 κύτταρα (ανεξάρτητο από ανδρογόνο καρκίνου του προστάτη κύτταρα) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 μΜ SN09-2 σε μέσα καλλιέργειας που περιέχουν διάφορες συγκεντρώσεις FBS. Σε χαμηλές συγκεντρώσεις στον ορό (λιγότερο από 2%) SN09-2 επάγεται περισσότερο από 95% αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων PC3 εντός 4 ημερών. Και ακόμη και σε υψηλότερες συγκεντρώσεις στον ορό, SN09-2 δραματικά ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων κατά περισσότερο από 85%, αν και η αναστολή επηρεάστηκε ελαφρά κατά συγκέντρωσης στον ορό (Εικ. 2Β). Η θεραπεία με SN09-2 για 4 ημέρες επαγόμενη 91% και 88% αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων PC3 σε 5% και 10% ορό συνθήκες, αντίστοιχα. Αυτό το αποτέλεσμα δείχνει ότι SN09-2 ρυθμίζει αρνητικά την ανάπτυξη καρκίνου του προστάτη κύτταρο κατά τρόπο ανεξάρτητο από ορό. Στη συνέχεια, διάφορα καρκινικά κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 μΜ SN09-2 σε 5% μέσα που περιέχουν ορό για τον προσδιορισμό της καρκίνου του προστάτη κυττάρου-ειδικό αποτέλεσμα του ανταγωνιστή GnRH-ΙΙ. Τρεις ημέρες μετά την αγωγή με SN09-2, η ανάπτυξη των PC3 και LNCaP κυττάρων ήταν δραστικά μειωτικά, και εκείνη των κυττάρων DU145 επίσης αναστέλλεται από ≈50%, γεγονός που υποδηλώνει ότι η ευαισθησία των κυττάρων καρκίνου του προστάτη να SN09-2 μπορεί να είναι διάφορα. Ωστόσο, η ανάπτυξη των κυττάρων από άλλους ιστούς όπως HeLa (καρκίνος του τραχήλου της μήτρας) και DLD1 (καρκίνος του παχέος εντέρου) δεν επηρεάστηκε από SN09-2 (Σχ. 2C). Αν και περισσότερα κύτταρα θα πρέπει να ελέγχεται, τα αποτελέσματα αυτά μπορεί να υποδηλώνουν SN09-2 έχει καρκίνο του προστάτη κυττάρου-ειδικό ανασταλτικό αύξησης αποτελέσματος.

Είτε bfGnRHR-ΙΙ ή gmGnRHR-ΙΙ επιμολύνθηκε με SRE-Luc ανταποκριτή σε κύτταρα CV-1 . Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις ανταγωνιστές διαφορετική συγκέντρωση υπό την παρουσία ΟηΚΗ-ΙΙ (1 ηΜ για bfGnRHR-ΙΙ, 10 ηΜ gmGnRHR-ΙΙ).

Η

(Α) Molecular αλληλουχίες ΟηΚΗ-ΙΙ, Trp-1, και SN09-2 (Β) κύτταρα PC3 επωάσθηκαν σε μέσα RPMI που περιέχει διάφορες συγκεντρώσεις του FBS και εκτέθηκαν σε 10 μΜ SN09-2 για 4 ημέρες. Ο αριθμός των βιώσιμων κυττάρων μετρήθηκε υπό μικροσκόπιο φωτός. (Γ) PC3 κύτταρα Du145, LNCaP, HeLa, και DLD1 επωάστηκαν με 5% FBS μέσο που περιέχει 10 mM SN09-2 ή DMSO για 3 ημέρες. (D) κύτταρα PC3 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις ΤΚΡ-1 ή SN09-2 για 3 ημέρες, και στη συνέχεια, τα βιώσιμα κύτταρα μετρήθηκαν κάτω από το μικροσκόπιο φωτός. Ο αριθμός των κυττάρων για κάθε ομάδα συγκριτικά με την ομάδα DMSO-θεραπεία. CTL: DMSO-θεραπεία. (Ε) κύτταρα PC3 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις SN09-2 για 3 ημέρες. Χρησιμοποιώντας υπερκείμενα καλλιέργειας από κάθε ομάδα, η δραστικότητα LDH προσδιορίστηκε όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Τα δεδομένα είναι μέσες τιμές ± S.E. *,

p & lt?

0,05? **

p & lt?.

0,01, έναντι του ελέγχου

Η

Σε μια προηγούμενη έκθεση, αποδείξαμε ότι Trp-1 ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων PC3 [28]. Για τη διερεύνηση της αποτελεσματικότητας αναστολής της ανάπτυξης των ανταγωνιστών GnRH-ΙΙ, τους προστίθεται σε κύτταρα PC3 καλλιεργήθηκαν σε 5% ορό προϋπόθεση για 3 ημέρες. Σε σύγκριση με τις ομάδες ελέγχου, και οι δύο ανταγωνιστές εξασθενημένα σημαντικά την ανάπτυξη των κυττάρων με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Επιπλέον, σε όλες τις ομάδες που έλαβαν θεραπεία με διαφορετικές συγκεντρώσεις, η κυτταρική ανάπτυξη ήταν πιο ισχυρά αναστέλλεται από SN09-2 αντί Trp-1, γεγονός που υποδηλώνει ότι SN09-2 είναι πιθανό να είναι καλύτερα μόριο για ανάπτυξη ως αναστολέας του καρκίνου του προστάτη (Σχ. 2D). Η ανασταλτική δράση επί της κυτταρικής ανάπτυξης μπορεί να συσχετίζεται με το κυτταρικό θάνατο. Για να επιβεβαιωθεί η ιδέα, μετρήσαμε δραστηριότητα LDH από μέσα κυτταρικής καλλιέργειας που έλαβαν θεραπεία με διαφορετικές δόσεις SN09-2. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Ε, η δραστηριότητα ήταν αυξημένη σε όλα τα κύτταρα SN09-2 επεξεργασία. Αυτό το αποτέλεσμα υποδηλώνει ότι SN09-2 είναι ικανή να διεγείρει κύτταρα καρκίνου του προστάτη σε θάνατο ακόμη και σε μικρές ποσότητες. Ακόμα κι αν μια υψηλή δόση SN09-2 ελαφρώς αυξημένη δραστικότητα LDH, η δραστηριότητα δεν συσχετιζόταν με τη δόση του αγωνιστή, γεγονός που υποδηλώνει ότι αυτή η δοκιμασία φαίνεται να είναι πολύ ευαίσθητο για να διακρίνει δραστικότητα εξαρτώμενη από τη δόση σε κυτταρικό θάνατο.

μιτοχονδριακή συσσώρευση SN09-2

σε προηγούμενες εκθέσεις, έχουμε και άλλες ομάδες παρατήρησε ότι ραδιοσημασμένου GnRH-ΙΙ συνδεδεμένο με καρκίνο του προστάτη κύτταρα μέσω της αλληλεπίδρασης με μια πρωτεΐνη περίπου 80-kDa του οποίου η ταυτότητα ορίστηκε ως πρωτεΐνη που ρυθμίζεται από γλυκόζη 75 (GRP75) με βάση την υγρή χρωματογραφία-ιονισμού ηλεκτροψεκασμού-διαδοχική φασματομετρία μάζας [11], [28], [29]. Είναι ενδιαφέρον, pull-down ανάλυση μας έδειξε επίσης ότι SN09-2 αλληλεπιδρά άμεσα με GRP75 (Εικ. 3Α). Από GRP75 βρίσκεται κυρίως στα μιτοχόνδρια, ο τελικός προορισμός των SN09-2 μπορεί να μην είναι η επιφάνεια των κυττάρων. Για τη διερεύνηση του υποκυτταρική τοποθεσία του ανταγωνιστή, εμείς επισημασμένο SN09-2 με FITC και πρόσθεσε ότι σε κύτταρα PC3 σε συγκέντρωση 1 μΜ για 10 λεπτά. Το σήμα FITC-SN09-2 δεν παρατηρήθηκε επί της μεμβράνης του πλάσματος, αλλά γύρω από τον πυρήνα. Όταν υποβλήθηκε σε επεξεργασία με Mitotracker βαφή, το σήμα FITC επικαλύπτεται με εκείνη της βαφής, υποδεικνύοντας ότι FITC-SN09-2 μπορεί να συσσωρεύεται στα μιτοχόνδρια (Σχ. 3Β). FITC-SN09-2 ήταν δύσκολα ανιχνεύσιμη σε άλλες κυτταρικές γραμμές όπως HeLa, MCF7, και DLD1 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Μιτοχονδριακή συσσώρευση αυτού του προϊόντος σύζευξης είναι αρκετά παρόμοια με εκείνη του FITC-συζευγμένο ΟηΚΗ-ΙΙ και Trp-1, που εξασθένησαν από μη επισημασμένο ΟηΚΗ-ΙΙ. Αυτό το αποτέλεσμα σημαίνει ότι ένας άγνωστος μονοπάτι ενδοκυττάρωση για ΟηΚΗ-ΙΙ και οι ανταγωνιστές του μπορούν να υπάρχουν σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη.

Τα κύτταρα επωάστηκαν με ΡΙΤΟ-συζευγμένο SN09-2 και Mitotracker. Μετά την πλύση, τα κύτταρα επισημάνθηκαν με συντομία Hoechst33342 (για πυρήνας χρώση). Οι εικόνες ελήφθησαν κάτω από ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο. Κόκκινο: Mitotracker, Πράσινο: FITC-SN09-2, Μπλε: Hoechst33342

Η

μιτοχονδριακή βλάβη και επαγωγή ROS σε SN09-2 επεξεργασμένα κύτταρα

Η μιτοχονδριακή δυσλειτουργία πιστεύεται ότι είναι άμεσα συνδεδεμένα σε κυτταρικό θάνατο [30]. Μιτοχονδριακή στόχευση των SN09-2 μπορεί να συνδέεται με την επίδραση του θανάτου επί κυττάρων καρκίνου του προστάτη μέσω της δυσλειτουργίας του οργανιδίου. Ερευνήσαμε το ηλεκτρικό δυναμικό αλλαγή στη μιτοχονδριακή μεμβράνη, η οποία δείχνει τη μιτοχονδριακή λειτουργία. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4Α, 3-ημερών θεραπεία των PC3 κυττάρων με SN09-2 μειωμένη κόκκινο ένταση φθορισμού γύρω από τον πυρήνα, αλλά αυξήθηκαν κίτρινο και πράσινο φθορισμό κατά περισσότερο από 80% στο κυτταρόπλασμα, υποδεικνύοντας μία μείωση στην μιτοχονδριακή μεμβράνη δυναμικό (Σχ. 4Β). Σε πολλές περιπτώσεις, μιτοχονδριακή δυσλειτουργία αποτελεί προϋπόθεση για την παραγωγή των κυτταροπλασματικών ROS. Όταν τα κύτταρα PC3 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 μΜ SN09-2, κυτταροπλασματικά επίπεδα ROS, μετριέται από τον φθορισμό του fluoroprobe DCF-DA, αυξήθηκαν (Εικ. 4C). Αν και η γεωμετρική μέση του φθορισμού ήταν πολύ χαμηλότερη από αυτή που παρατηρείται σε H

2O

κύτταρα 2-αγωγή, η τιμή μπορεί να είναι αρκετό για να υποδείξει μεταβολή της μιτοχονδριακής λειτουργίας (Εικ. 4D). Επιπλέον, SN09-2 αυξημένα κυτταροπλασματικά επίπεδα ROS με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Εικ. 4Ε).

(Α) Μετά την επεξεργασία με 10 μΜ SN09-2 για 3 ημέρες, PC3 κύτταρα πάνω σε λουρίδες κάλυψης επωάστηκαν με JC-1, σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη, χρωματίστηκαν με συντομία Hoechst33342, και παρατηρήθηκαν κάτω από το μικροσκόπιο συνεστιακό. (Β) SN09-2-κατεργασμένων κυττάρων PC3 αποκολλήθηκαν από το τρυβλίο και εφαρμόζονται σε ανάλυση FACS για να εξετάσει την αλλαγή χρώματος φθορισμού. κύτταρα (C) υποβλήθηκε σε επεξεργασία με PC3 SN09-2 για 3 ώρες επωάστηκαν με DCF-DA, και εφαρμόστηκε σε ανάλυση FACS (D) Θετικός έλεγχος της ενδοκυτταρικής ROS. κύτταρα PC3 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με H

2O

2 για 5 λεπτά, επισημασμένο με DCF-DA, και στη συνέχεια εφαρμόστηκε σε ανάλυση FACS. (Ε) Γεωμετρικός μέσω σημάτων φθορισμού σε κύτταρα PC3 σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις SN09-2 δείχνονται ως γραφικές παραστάσεις. Τα δεδομένα είναι μέσες τιμές ± S.E. **

p & lt?.

0,01, έναντι του ελέγχου

Η

SN09-2 προκαλεί κυτταρικό θάνατο μέσω της ενεργοποίησης των αποπτωτικών σηματοδότηση μονοπατιών

δυσλειτουργία μιτοχονδριακού και τη συνακόλουθη ROS γενιά μπορεί να προηγείται της απόπτωσης, ένα είδος κυτταρικού θανάτου. Για τον προσδιορισμό των μηχανισμών υποκείμενη κυτταρικού θανάτου που διεγείρεται από SN09-2, εμείς χρώση κυττάρων PC3 με Cy3-συζευγμένο αννεξίνης V, που δεσμεύεται ειδικά με τη μεμβράνη φωσφατιδυλοσερίνη. PC3 κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με 10 μΜ SN09-2 για 24 ώρες εκτενώς χρωματίστηκαν με Cy3-αννεξίνης V, γεγονός που υποδηλώνει ότι τα κύτταρα υφίστανται αποπτωτικό αλλαγή (Εικ. 5Α). Όταν τα κύτταρα εφαρμόσθηκαν σε ανάλυση FACS μετά από χρώση με ΡΙΤΟ-συζευγμένο Annexin V και ιωδιούχο προπίδιο, τα περισσότερα κύτταρα ήταν ΡΙΤΟ-θετικών αλλά ΡΙ-αρνητικά, πράγμα που σημαίνει ότι SN09-2 διεγερμένα αποπτωτικό θάνατο αλλά όχι νεκρωτικό θάνατο. χρώση αννεξίνης V ενισχύθηκε δραματικά από 9 ώρες μετά από 10 θεραπεία μΜ SN09-2 και σταθερή μέχρι 24 ώρες (Σχ. 5Β). Σύμφωνα με χαμηλές συγκεντρώσεις SN09-2, μερικά κύτταρα ήταν FITC-θετικά, ενώ τα περισσότερα κύτταρα σε επεξεργασία με υψηλές συγκεντρώσεις (περισσότερο από 5 μm) FITC-θετικά, υποδεικνύοντας ότι SN09-2 είναι ένα αποτελεσματικό επαγωγέας απόπτωσης για κύτταρα καρκίνου του προστάτη (Σχ. 5C). Μαζί με το αποτέλεσμα του πολλαπλασιασμού, το σπάνιο χρώση των κυττάρων σε επεξεργασία με λιγότερο από 0.5 μΜ SN09-2 αποδεικνύει ότι μια χαμηλή δόση του ανταγωνιστή αναστέλλει την κυτταρική ανάπτυξη και όχι διέγερση του κυτταρικού θανάτου.

(Α) κύτταρα PC3 κατεργασία με 10 μΜ SN09-2 πάνω σε λουρίδες κάλυψης επωάστηκαν με Cy3-συζευγμένο αννεξίνης V, και χρωματίστηκαν με συντομία Hoechst33342. εικόνες φθορισμού ελήφθησαν κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού. BF: η μορφολογία των κυττάρων κάτω από μικροσκόπιο φωτός (Β, C) αννεξίνης V-θετικά κύτταρα αυξήθηκαν σε δόση και το χρόνο εξαρτώμενο τρόπο (Β) PC3 κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με SN09-2 συνελέγησαν σε διαφορετικά χρονικά σημεία, επωάστηκαν με ΡΙΤΟ-συζευγμένο αννεξίνης V, και εφαρμόστηκε σε ανάλυση FACS (C) κύτταρα PC3 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις SN09-2 για 12 ώρες πριν από την χρώση αννεξίνης V. Τα δεδομένα είναι μέσες τιμές ± S.E. *,

p & lt?

0,05? **

p & lt?.

0,01, έναντι του ελέγχου

Η

Η απελευθέρωση του κυτοχρώματος c από τα μιτοχόνδρια είναι ένα πρώιμο συμβάν κατά τη διάρκεια της κασπάσης-εξαρτώμενο κυτταρικό θάνατο. Μετά την απελευθέρωση του κυτοχρώματος c στο κυτταρόπλασμα, συνδέεται αποπτωτικών πρωτεασών ενεργοποίησης παράγοντα-1 και procaspase-9 για να σχηματίσει το αποπτωσώματος, η οποία στη συνέχεια ενεργοποιεί κασπάση-3 και -7 υπεύθυνη για την καταστροφή των κυττάρων [31]. Η ανάλυση στυπώματος Western αποκάλυψε ότι SN09-2 διεγείρει την απελευθέρωση κυτοχρώματος c στο κυτταρόπλασμα σε ένα χρόνο- και δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Η πιο κυτόχρωμα c απελευθερώθηκε από μιτοχόνδρια σε κύτταρα επεξεργασμένα με περισσότερα από 5 μΜ SN09-2 (Σχ. 6Α, C), και κυτοσολική κορεσμός της πρωτεΐνης επιτεύχθηκε με 24 ώρες μετά την κατεργασία (Σχ. 6Β, D).

(Α-Δ) κηλίδωση Western του κυτοχρώματος c στο κυτοσολικό και μιτοχονδριακή κλάσματα (Α, C) τα κύτταρα PC3 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις SN09-2 για 24 ώρες και κλασματώνεται σε κυτοσόλιο και τα μιτοχόνδρια. 20 μg προϊόντα λύσης από κάθε κλάσμα χρησιμοποιήθηκε για SDS-PAGE και κηλίδωση Western με αντισώματα αντι-κυτοχρώματος c. (B, D) Κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με 10 μΜ SN09-2 συνελέγησαν σε διαφορετικά χρονικά σημεία, και στη συνέχεια κλασματώνεται. (C, D) Η ένταση σήματος κάθε κηλίδα μετρήθηκε και παρουσιάζεται ως γραφικές παραστάσεις (Ε) κύτταρα PC3 σε επεξεργασία με 10 μΜ SN09-2 συνελέγησαν σε διαφορετικά χρονικά σημεία, και χρησιμοποιείται για την κηλίδωση Western με αντι-κασπάση-3 ή διασπώνται