Abstract

Ιστορικό

γαλεκτίνη-3 είναι γνωστό ότι ρυθμίζει μετάστασης του καρκίνου. Ωστόσο, ο υποκείμενος μηχανισμός δεν έχει οριστεί. Μέσα από τις μελέτες μικροσυστοιχίας DNA μετά από γαλεκτίνη-3 σίγησης, αποδείξαμε εδώ ότι γαλεκτίνης-3 παίζει ένα ρόλο κλειδί σε up-ρυθμίζουν τις εκφράσεις πρωτεάση ενεργοποιημένου υποδοχέα-1 (PAR-1) και μεταλλοπρωτεϊνάση-1 μήτρας (ΜΜΡ-1) PAR-1 προωθώντας έτσι γαστρικό μετάστασης του καρκίνου.

Μεθοδολογία /Principal Εκτίμηση

Εξετάσαμε τα επίπεδα έκφρασης του γαλεκτίνη-3, PAR-1 και ΜΜΡ-1 σε γαστρικό ιστούς ασθενούς με καρκίνο και επίσης τα αποτελέσματα της αποσιώπησης αυτών των πρωτεϊνών με ειδικές siRNAs και του υπερ-εκφράζουν αυτούς χρησιμοποιώντας συγκεκριμένα lenti-ιικό κατασκευάσματα. Εμείς που απασχολούνται επίσης zebrafish μοντέλο έμβρυο για την ανάλυση των

in vivo

γαστρικού καρκίνου κυτταρική εισβολή. Αυτές οι μελέτες κατέδειξαν ότι: α) γαλεκτίνης-3 σίγηση μειώνει την έκφραση του PAR-1. β) γαλεκτίνη-3 η υπερέκφραση αυξάνει την κυτταρική μετανάστευση και εισβολή και η αύξηση αυτή μπορεί να αναστραφεί με PAR-1 σίγησης, υποδεικνύοντας ότι γαλεκτίνη-3 αυξάνει την κυτταρική μετανάστευση και εισβολή μέσω PAR-1 ανοδική ρύθμιση. γ) γκαλεκτίνη-3 αλληλεπιδρά άμεσα με ΑΡ-1 μεταγραφικού παράγοντα, και αυτό το συγκρότημα συνδέεται με PAR-1 υποκινητή και οδηγεί PAR-1 μεταγραφής. δ) γαλεκτίνη-3 ενισχύει επίσης φωσφο-παξιλλίνης, μια προς τα κάτω στόχος PAR-1, αυξάνοντας την έκφραση της ΜΜΡ-1. ΜΜΡ-1 φίμωση μπλοκ φωσφο-παξιλλίνη ενίσχυσης και των κυττάρων που προκαλείται από την εισβολή γαλεκτίνης-3 υπερ-έκφραση. ε) Η σίγαση του είτε γαλεκτίνη-3, PAR-1 ή ΜΜΡ-1 μείωσε σημαντικά την κυτταρική μετανάστευση εντός των δοχείων σε ψάρι zebra μοντέλο έμβρυο. στ) γαλεκτίνη-3, PAR-1 και ΜΜΡ-1 είναι εντόνως εκφράζονται και συν-εντοπίζεται σε κακοήθεις ιστούς από ασθενείς με καρκίνο του στομάχου.

Συμπεράσματα /σημαντικότητα

γαλεκτίνης-3 παίζει το κλειδί ρόλος του υποδοχέα ενεργοποίησης κυτταρικής επιφάνειας μέσω παραγωγής πρωτεάσης και ενισχύει γαστρικό μετάσταση καρκίνου. Γαλεκτίνη-3 έχει τη δυνατότητα να χρησιμεύσει ως μια χρήσιμη φαρμακολογική στόχο για την πρόληψη του γαστρικού μετάστασης καρκίνου

Παράθεση:. Kim S-J, Shin J-Y, Lee K-D, Bae Υ-Κ, Choi I-J, Πάρκο SH, et al. (2011) γαλεκτίνης-3 Διευκολύνει κυτταρική κινητικότητα σε γαστρικό καρκίνο από τα πάνω ρύθμιση Protease-ενεργοποιημένου υποδοχέα-1 (PAR-1) και μεταλλοπρωτεϊνάσης-1 (ΜΜΡ-1). PLoS ONE 6 (9): e25103. doi: 10.1371 /journal.pone.0025103

Επιμέλεια: Jean-Marc Vanacker, Institut de Génomique Fonctionnelle de Lyon, Γαλλία

Ελήφθη: May 18, 2011? Αποδεκτές: 23 Αυγούστου του 2011? Δημοσιεύθηκε: 22 Σεπ 2011

Copyright: © 2011 Kim et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Κέντρο Καρκίνου (NCC) της Δημοκρατίας της επιχορήγησης Κορέας (NCC-0910150 και NCC-0810060), Καινοτόμες Ινστιτούτο Ερευνών για την Κυτταρική θεραπεία, Δημοκρατία της Κορέας (A062260) και αυτή η έρευνα υποστηρίχθηκε από το Πρόγραμμα Basic442 Science Research μέσω της εθνικό Ίδρυμα Ερευνών (NRF), που χρηματοδοτείται από το Υπουργείο Παιδείας, Επιστημών και Τεχνολογίας (1031790-1), Δημοκρατία της Κορέας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

οι καρκίνοι που απλώνονται (μεταστάσεις) από την αρχική περιοχή τους σε μια άλλη περιοχή του σώματος, καλούνται μεταστατικούς καρκίνους. μεταστατικούς καρκίνους έχουν κακή πρόγνωση και υψηλή θνησιμότητα [1]. Μια πλήρης κατανόηση του βιολογικού μηχανισμού (-ών) που συμμετέχουν στην μετάσταση και ορθολογική προσεγγίσεις για την πρόληψη ή τον έλεγχο της μετάστασης μπορεί να οδηγήσει σε πρακτικές προσεγγίσεις για τη βελτίωση ποσοστό επιβίωσης των ασθενών που έχουν προσβληθεί με μεταστατικούς καρκίνους. Σε προηγούμενες μελέτες, έχουμε βρει ότι γαλεκτίνης-3 αυξάνει γαστρικού καρκίνου κυτταρική κινητικότητα έως ρύθμισης fascin-1, μία ομαδοποίηση ακτίνης κυτταροσκελετική πρωτεΐνη [2]. Γαλεκτίνη-3 είναι μια πρωτεΐνη 31 kDa υδατάνθρακα αναγνώριση, που εμπλέκονται στην ογκογένεση, ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων και τη μετάσταση [3], [4], [5] και υψηλή έκφραση του σε αρκετές ανθρώπινους καρκίνους έχει βρεθεί να συσχετίζεται με την κακή πρόγνωση της μεταστατικούς καρκίνους.

Για να αποσαφηνιστεί ο ρόλος των γκαλεκτίνη-3 στη μετάσταση του καρκίνου, εμείς νοκ-κάτω την έκφραση του σε γαστρικά καρκινικά κύτταρα με τη χρήση siRNA της και εξέτασε τα αποτελέσματα της γονιδιακής έκφρασης με ανάλυση μικροσυστοιχιών DNA [6]. Μεταξύ προηγούμενα αποτελέσματα, βρήκαμε σημαντική μείωση στο επίπεδο της πρωτεάσης-ενεργοποιημένου υποδοχέα-1 (PAR-1), ένα μέλος της οικογένειας διαμεμβρανικών G-πρωτεΐνη υποδοχέων συζευγμένων [7], και ενεργοποιητή του, της μήτρας μεταλλοπρωτεάσης-1 ( ΜΜΡ-1) (Σχήμα S1). Διασπασμένου PAR-1 είναι αυτο-φωσφορυλιωμένης και μετάγονται με εξωκυτταρικό σήμα (ες) μέσω διαφόρων οδών, και παίζει κρίσιμο ρόλο στην μετάσταση όγκου [7], [8], [9]. Υπερ-έκφραση του PAR-1 έχει αναφερθεί σε αρκετές μορφές καρκίνου, συμπεριλαμβανομένων των μελανωμάτων, του μαστού και του γαστρικού καρκίνου. ΜΜΡ-1 είναι επίσης επάνω ρυθμισμένο σε μια ευρεία ποικιλία των προηγμένων καρκίνων, και μια σημαντική αρνητική συσχέτιση παρατηρήθηκε μεταξύ της έκφρασης του και την επιβίωση των ασθενών [10], [11], [12], [13]. Επίσης, πολλές μελέτες διαπιστώθηκε ότι η ΜΜΡ-1 παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στη μετάσταση του καρκίνου του μαστού [14], του ήπατος και του παχέος εντέρου [15], και γαστρικούς καρκίνους [16], [17], μεταξύ άλλων. Φαίνεται ότι μόλις εκκρίνεται, ΜΜΡ-1 προάγει την προσβολή καρκινικών κυττάρων μέσω αποικοδόμηση εξωκυτταρικής μήτρες ή /και στρώσεις υποβλεννογόνια του λεμφαγγεία [10], [14]. Πολυάριθμες μελέτες έδειξαν ότι η αναστολή της ΜΜΡ οδηγεί στην αναστολή της κυτταρικής εισβολής [18], [19].

hese ευρήματα μας οδήγησε να υποθέσουμε ότι γαλεκτίνη-3, PAR-1 και ΜΜΡ-1 μπορεί να εμπλέκεται σε ενισχύοντας την μετανάστευση και την εισβολή του καρκίνου του στομάχου. Για να ελέγξει την υπόθεση αυτή, πραγματοποιήσαμε μελέτες για το ρόλο τους στη γαστρική καρκινικά κύτταρα. Και στις δύο

in vitro

και

in vivo

μελέτες, χρησιμοποιήσαμε zebrafish μοντέλο εμβρύου για τον προσδιορισμό των αποτελεσμάτων τους για τη μετανάστευση και την εισβολή των καρκινικών κυττάρων με ζωντανούς οργανίδια. Προσδιορίσαμε επίσης τα επίπεδα έκφρασης του γαλεκτίνη-3, PAR-1 και ΜΜΡ-1 σε κακοήθεις ιστούς από ασθενείς με γαστρικό καρκίνο για κλινική συσχετίσεις μεταξύ αυτών των πρωτεϊνών σε ανθρώπινα δείγματα.

Αποτελέσματα

Σίγαση γαλεκτίνη -3 ή PAR-1 μειώνει την μετανάστευση και την εισβολή ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων γαστρικού

Τα επίπεδα έκφρασης γαλεκτίνης-3 και PAR-1 ήταν υψηλά στις περισσότερες κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου. Εμείς σιγήσει γαλεκτίνη-3 και PAR-1 σε κύτταρα ΜΚΝ-28 χρησιμοποιώντας τα αντίστοιχα siRNAs. Η θεραπεία με γαλεκτίνη-3 siRNA μειωμένα επίπεδα έκφρασης αμφοτέρων γαλεκτίνης-3 και PAR-1, ενώ PAR-1 περιποίηση siRNA μειώθηκε μόνο PAR-1 έκφραση, ενώ δεν παρατηρήθηκε διαφορά σε γαλεκτίνης-3 (Σχήμα 1Α). Η επιμόλυνση του SNU-638 κύτταρα, τα οποία εμφανίζουν αρχικά δεν γαλεκτίνης-3 έκφραση, με γαλεκτίνη-3-πλασμίδιο που κωδικοποιεί οδήγησε σε αυξημένη έκφραση τόσο PAR-1 και γαλεκτίνη-3 (Εικόνα 1Β). Φίμωση είτε γκαλεκτίνη-3 ή PAR-1 μείωσε το συνολικό αριθμό των αποδημητικών (

σ

& lt? 0.001) (Σχήμα 1C) και εισβάλλοντας κύτταρα (

σ

& lt? 0.001) (Σχήμα 1D), σχεδόν κατά το ήμισυ. Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι γαλεκτίνης-3 αυξήθηκαν PAR-1 έκφραση και τόσο γαλεκτίνη-3 και PAR-1 διαμορφωμένο γαστρικού μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων και εισβολή.

Α, τα επίπεδα mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης μετά την επιμόλυνση του ανθρώπινου γαστρικού καρκίνου MKN- 28 κυττάρων με 20 ηΜ scRNA, ή siRNAs από γαλεκτίνη-3 ή PAR-1. Ολικό RNA και πρωτεΐνη που λαμβάνεται μετά την επιμόλυνση για 48 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν με RT-PCR και κηλίδωση Western. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Β, τα επίπεδα πρωτεΐνης του γαλεκτίνης-3 και PAR-1 με κηλίδωση Western μετά την επιμόλυνση με pcDNA3.1 /NT-GFP-γαλεκτίνης-3 και του φορέα ελέγχου του pcDNA3.1 /NT-GFP σε SNU-638 κύτταρα. C, δοκιμασία μετανάστευσης κυττάρων γίνονται από γαλεκτίνης-3 ή PAR-1 σε σιγήσει ΜΚΝ-28 κύτταρα. Τα αποτελέσματα ήταν παρόντες ως ιστόγραμμα (*

σ

& lt? 0.001 vs. ομάδα Cont), και η κυτταρική φωτογραφίες δοκιμασίες κυτταρικής μετανάστευσης. D, Ιστόγραμμα ήταν παρόντες οι προσδιορισμοί κυττάρων εισβολή γκαλεκτίνη-3 ή PAR-1 στη σιωπή ΜΚΝ-28 κύτταρα (*

σ

& lt? 0.001 vs. ομάδα Cont).

Η

γαλεκτίνη-3 ενισχύει την μετανάστευση κυττάρων γαστρικού καρκίνου /εισβολή αυξάνοντας την έκφραση του PAR-1

εξετάστηκε η σχέση μεταξύ γαλεκτίνης-3-επαγόμενη αυξήσεις στην κυτταρική μετανάστευση και εισβολή από τη μία πλευρά και PAR-1 έκφραση από την άλλη χέρι. Εμείς μολυσμένα SNU638 κυττάρων με ένα φακοϊό περιέχει την γαλεκτίνης-3 κασέτα έκφρασης, και εξέτασε τις εκφράσεις γαλεκτίνης-3 και PAR-1, και η μετρηθείσα μετανάστευση των κυττάρων. Βρήκαμε ότι η υπερ-έκφραση της γαλεκτίνης-3 συνοδεύτηκε από αυξημένη εκφράσεις PAR-1 mRNA και της πρωτεΐνης (Σχήμα 2Α), καθώς επίσης και τη μετανάστευση των κυττάρων (

ρ

& lt? 0.001) (Σχήμα 2Β) και κελί εισβολή (

σ

& lt? 0.001) δραστηριότητες (Σχήμα 2C). Οι αυξήσεις μειώθηκαν κατά PAR-1 αποσιώπηση. Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι γαλεκτίνης-3 προώθησε την μετανάστευση και την εισβολή του γαστρικού καρκίνου κυττάρων μέσω αυξητική ρύθμιση του PAR-1.

Α, mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης του γαλεκτίνης-3 και PAR-1 ανιχνεύθηκε με RT-PCR και ανάλυση κηλίδας Western σε SNU-638 κύτταρα, μολυσμένα με Lenti-ιού που περιέχει LacZ ή γαλεκτίνη-3, και στη συνέχεια επιμολύνθηκαν με PAR-1 siRNA ή scRNA για αρνητικό έλεγχο. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Β και C, Μετανάστευσης (Β) και την εισβολή (Γ) οι δοκιμασίες διεξήχθησαν του SNU-638 κύτταρα μολυσμένα με Lenti-ιού που περιέχει LacZ ή γαλεκτίνη-3 κύτταρα, και στη συνέχεια επιμολύνθηκαν με PAR-1 siRNA ή scRNA για αρνητικό έλεγχο. Τα αποτελέσματα φάνηκε σαν ιστόγραμμα (*

σ

& lt? 0.001 vs. ομάδα Cont). Α, Σχηματική μοντέλο του PAR-1 υποκινητή με θέση δέσμευσης ΑΡ-1, αστάρια χρησιμοποιούνται για τον προσδιορισμό ChIP ήταν έτοιμοι να ανιχνεύσει θέση δέσμευσης ΑΡ-1 (-463~-474) -666 έως -307. Ε, γαλεκτίνη-3 αλληλεπιδρά με c-Jun και fra-1 (όπως, ένα ΑΡ-1 συμπλόκου [20]) σε ΜΚΝ-28 κύτταρα. Διεξήχθη ανοσοκαταβύθιση όπως περιγράφεται στο «Υλικά και Μέθοδοι», και στη συνέχεια, γαλεκτίνη-3, c-Jun και fra-1 ανιχνεύθηκε με ανάλυση κηλίδος Western. κυτταρολύματα Ολόκληρο (WCLs) χρησιμοποιήθηκαν ως θετικός έλεγχος. F, Ανάλυση δοκιμασία ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης με τη χρήση αντισωμάτων για γαλεκτίνη-3, c-Jun και Fra-1 σε ΜΚΝ-28 κύτταρα επιμολυσμένα με scRNA και γαλεκτίνη-3 siRNA. εκκινητή PCR για το γονίδιο υποκινητή PAR-1 χρησιμοποιήθηκε για να ανιχνεύσει το θραύσμα υποκινητή σε ανοσοϊζήματα. λωρίδα εισόδου, ολικού γενωμικού DNA χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος για την αντίδραση PCR. G, λουσιφεράσης δραστικότητα της ΑΡ-1 σε lacZ και πάνω από τα κύτταρα που εκφράζουν γαλεκτίνη-3. διεξήχθη δοκιμασία λουσιφεράσης χρησιμοποιώντας ΑΡ-1 έκφραση λουσιφεράσης φορέα επιμόλυνσης για lacZ και γαλεκτίνη-3 υπερεκφράζουν κύτταρα (*

ρ

& lt? 0.001 vs. Cont). β-γαλακτοζίτη χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός μάρτυρας.

Η

γκαλεκτίνη-3 προάγει PAR-1 μεταγραφή μέσω της αλληλεπίδρασης με AP-1 συγκρότημα

Στη συνέχεια προσπάθησε να διευκρινίσει πώς γκαλεκτίνη-3 ρυθμίζει PAR -1 έκφρασης. Επειδή έχει αναφερθεί ότι ΑΡ-1 μεταγραφικής δραστικότητας ρυθμίζεται από γαλεκτίνη-3 [20], εστιάσαμε στο ρόλο αυτού του παράγοντα μεταγραφής στο θέμα αυτό (Σχήμα 2D). Πραγματοποιήσαμε μελέτες ανοσοκαταβύθισης και προσδιορίστηκε ότι γαλεκτίνη-3 αλληλεπιδρά άμεσα τόσο με Fra-1 και c-Jun στο σύμπλοκο ΑΡ-1, και ότι αυτή η αλληλεπίδραση συνδέθηκε με αυξητική ρύθμιση του ΑΡ-1 μεταγραφικής δραστικότητας (Σχήμα 2Ε). Στη συνέχεια, εξετάσαμε την δεσμευτική δραστικότητα DNA της ΑΡ-1 με και χωρίς γαλεκτίνη-3 με δοκιμασίες πλινθίου (Σχήμα 2F). Βρήκαμε ότι η AP-1 σύμπλοκο δεσμεύεται τον προαγωγό του PAR-1 παρουσία του γαλεκτίνη-3, αλλά όχι απουσία αυτού. Εκτιμήσαμε επίσης την μεταγραφική δραστικότητα του ΑΡ-1 με δοκιμασία λουσιφεράσης μετά την επιμόλυνση ενός πλασμιδίου ανταποκριτή που περιέχει αλληλουχία πρόσδεσης του ΑΡ-1 μπροστά από ένα λουσιφεράσης οδήγησης ελάχιστο προαγωγέα σε LacZ ή γαλεκτίνη-3 που υπερεκφράζουν SNU-638 κύτταρα (

σ

& lt? 0.001) (Σχήμα 2G). Η μεταγραφική δραστικότητα του ΑΡ-1 αυξήθηκαν σημαντικά σε γαλεκτίνης-3 υπερεκφράζουν κύτταρα, αλλά όχι σε LacZ υπερ-εκφράζοντα κύτταρα. Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι γαλεκτίνης-3 διευκόλυνε τη σύνδεση του προαγωγού PAR-1 με αλληλεπίδραση με ΑΡ-1 συμπλόκου, αυξάνοντας έτσι την έκφραση του PAR-1 με μεταγραφικής ρύθμισης.

γαλεκτίνης-3 αυξάνει την έκφραση της ΜΜΡ-1 και η ενεργοποίηση των PAR-1 σηματοδότηση

ΜΜΡ-1 έχει αναφερθεί ότι ρυθμίζουν την ενεργοποίηση του PAR-1 μέσω διάσπασης του PAR-1 δεμένοι ενδοκυτταρική σηματοδότηση, και να επηρεάζουν την κυτταρική διείσδυση [21]. Όπως παρουσιάζεται στο Σχήμα S1, δείξαμε ότι γαλεκτίνης-3 ρυθμισμένη έκφραση ΜΜΡ-1. Ως εκ τούτου, εμείς επιβεβαίωσε τις αλληλεξαρτήσεις των γκαλεκτίνη-3, ΜΜΡ-1 και PAR-1. Αναλύσαμε τα επίπεδα έκφρασης του mRNA της ΜΜΡ-9, το οποίο είναι ένα προς τα κάτω στόχος του PAR-1 [8], μετά την φίμωση γαλεκτίνη-3, ΜΜΡ-1 και PAR-1 μεμονωμένα (Σχήμα 3Α). Ενώ γαλεκτίνη-3 σίγηση μείωσε την έκφραση και των τριών μορίων (ΜΜΡ-1, PAR-1 και ΜΜΡ-9), ΜΜΡ-1 σίγηση μειωθεί μόνο ΜΜΡ-9 έκφραση και όχι εκείνοι γαλεκτίνης-3 ή PAR-1. Είναι ενδιαφέρον, PAR-1 αποσιώπηση παράγει τα ίδια αποτελέσματα όπως ΜΜΡ-1 αποσιώπηση. Διαπιστώσαμε επίσης την φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης κυτταροσκελετικών παξιλλίνη (pY181), ένα σήμα κατατεθέν της PAR-1 ενεργοποίησης [22], [23]. Μετά την φίμωση γκαλεκτίνη-3, ΜΜΡ-1 και PAR-1 μεμονωμένα, η phosphorylaion της παξιλλίνη μειώθηκε, το οποίο πρότεινε γκαλεκτίνη-3 ρυθμίζονται επίσης δραστηριότητα PAR-1. Ελέγξαμε επίσης την μείωση της δραστηριότητας MMP-9 μετά την φίμωση της γκαλεκτίνη-3, ΜΜΡ-1 και PAR-1 μεμονωμένα (Σχήμα 3Α).

Α, γκαλεκτίνη-3, PAR-1, ΜΜΡ-1 και MMP-9 mRNA και γαλεκτίνη-3, PAR-1, ΜΜΡ-1, φωσφο-παξιλλίνη (pY181) και πρωτεΐνη παξιλλίνη επίπεδα μετά από επιμόλυνση με scRNA ή έκαστο siRNAs από γαλεκτίνη-3, PAR-1, ΜΜΡ-1 σε ΜΚΝ-28 κύτταρα. Ολικό RNA και πρωτεΐνη που λαμβάνεται μετά την επιμόλυνση για 48 ώρες και τα κύτταρα συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν με RT-PCR και κηλίδος western. δραστικότητα ΜΜΡ-9 αναλύθηκε με ζυμογραφία ζελατίνης χρησιμοποιώντας το μέσο του ΜΚΝ-28 κύτταρα. Β, τα επίπεδα έκφρασης του mRNA της γαλεκτίνης-3, PAR-1 και ΜΜΡ-1 με RT-PCR? τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης από γαλεκτίνη-3, PAR-1, ΜΜΡ-1, φωσφο-παξιλλίνη (pY181) και παξιλλίνης με ανάλυση στυπώματος Western σε SNU-638 κύτταρα, τα οποία μολύνθηκαν με Lenti-ιού που περιέχει LacZ ή γαλεκτίνη-3, και, στη συνέχεια, επιμολυσμένα με ΜΜΡ-1 siRNA ή scRNA για αρνητικό έλεγχο. C, Εισβολή δοκιμασία SNU-638 κύτταρα μολυσμένα με Lenti-ιού που περιέχει LacZ ή κύτταρα γαλεκτίνη-3, και στη συνέχεια επιμολύνθηκαν με ΜΜΡ-1 siRNA ή scRNA για αρνητικό έλεγχο. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως ιστόγραμμα (*

σ

& lt? 0.001 vs. ομάδα Cont).

Η

γκαλεκτίνη-3 υπερεκφράζουν SNU638 κύτταρα έδειξαν αυξημένα επίπεδα έκφρασης της ΜΜΡ-1 και πρωτεΐνη PAR-1, καθώς και τα mRNA τους, εκτός από την φωσφορυλιωμένη παξιλλίνη (pY181). Σε αυτά τα κύτταρα, ΜΜΡ-1 σίγηση μείωσε την φωσφορυλίωση παξιλλίνης χωρίς να μεταβάλλεται η έκφραση του γαλεκτίνης-3 ή PAR-1 (Σχήμα 3Β). Επιπλέον, η ΜΜΡ-1 σίγηση μειωμένη κυτταρική εισβολή, η οποία ενεργοποιείται από γαλεκτίνη-3 η υπερέκφραση (

ρ

& lt? 0.001) (Σχήμα 3C), πράγμα που σημαίνει ότι γαλεκτίνης-3 αυξήθηκαν ΜΜΡ-1 έκφραση που οδηγεί σε ενεργοποίηση του PAR-1 σηματοδότηση.

Υπερ-έκφραση της ΜΜΡ-1 σε καρκινικά κύτταρα αυξάνει την κυτταρική διείσδυση μέσω της ενεργοποίησης του PAR-1 σηματοδότηση

Επιβεβαιώσαμε ότι τα πάνω ρύθμιση της ΜΜΡ-1 από γαλεκτίνη-3 είναι σημαντική για την ενεργοποίηση του PAR-1 σηματοδότηση και αυξημένη γαστρική καρκινικά κύτταρα εισβολής. Ένα φακοϊού (pLECE3 Vector) που περιέχει ΜΜΡ-1 κασέτα έκφρασης ρυθμίζεται από CMV προαγωγό παρασκευάστηκε και μολύνθηκαν σε AGS γαστρικά καρκινικά κύτταρα (Σχήμα 4Α-Β). Όπως αναμενόταν, η ΜΜΡ-1 υπερ-έκφραση αύξησε το δυναμικό εισβολής των γαστρικών καρκινικών κυττάρων, και PAR-1 σίγηση ανέστρεψε σημαντικά αυτήν την αύξηση (

ρ

& lt? 0.001) (Σχήμα 4Β). Αυτό επιβεβαιώθηκε επίσης από το γεγονός ότι η υπερ-έκφραση της ΜΜΡ-1 αύξησε την φωσφορυλίωση παξιλλίνης, και ότι επιπλέον σίγηση του PAR-1 μπλοκαριστεί όπως φωσφορυλίωση (Σχήμα 4Α). Σε ΜΜΡ-1 κύτταρα που υπερεκφράζουν, γαλεκτίνη-3 σίγηση μείωσε την έκφραση του PAR-1, αλλά όχι του ΜΜΡ-1, και επίσης τη φωσφορυλίωση της παξιλλίνης και επεμβατική δυναμικό κυττάρου (Σχήμα 4Α-Β). Οι παρατηρήσεις αυτές πρότειναν ότι η υπερ-έκφραση της ΜΜΡ-1 αύξησε καρκινικό κύτταρο invasivity με ενεργοποίηση του PAR-1 σηματοδότηση. Λαμβανόμενα όλα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι γαλεκτίνης-3 αύξησε την έκφραση τόσο PAR-1 και ΜΜΡ-1, και ότι η αυξημένη έκφραση ΜΜΡ-1 ενεργοποιείται PAR-1 σηματοδότηση, η οποία με τη σειρά της, διευκολύνει καρκινικών κυττάρων εισβολή. Αυτά τα γεγονότα που απεικονίζονται σχηματικά στο σχήμα 4C.

Α, πρωτεΐνη έκφραση της γαλεκτίνης-3, PAR-1, ΜΜΡ-1, τα επίπεδα φωσφο-παξιλλίνη (pY181) και παξιλλίνης μετρήθηκαν με ανάλυση στυπώματος western, μετά τη μόλυνση με lenti-ιικό κατασκεύασμα που περιέχει pLECE3 (μόνο vector) και pLECE3-ΜΜΡ-1 σε κύτταρα AGS, επιμολυσμένα με γαλεκτίνη-3 ή PAR-1 siRNAs. Β, Cell εισβολή εκτελούνται από τα παραπάνω κύτταρα που υπάρχουν ως ένα ιστόγραμμα (*

σ

& lt? 0.001 vs. ομάδα Cont). C, Galecitn-3 ενισχύει την έκφραση του PAR-1 μέσω δέσμευσης με την ΑΡ-1 μεταγραφικού παράγοντα, επίσης, γαλεκτίνη-3 ρύθμιση της ΜΜΡ-1 έκφρασης. MMP-1 αύξηση προκαλεί διπλή επιπτώσεις στο γαστρικό εισβολή του καρκίνου? 1) διάσπαση του PAR-1 δεμένοι συνδετήρα και PAR-1 ενεργοποίησης 2) αποδόμηση του εξωκυτταρικές μήτρες (ECM).

Η

Η σίγαση του galecin-3, PAR-1 ή ΜΜΡ-1 μπλοκ γαστρικού καρκίνου κυτταρική μετανάστευσης

in vivo

σε ένα zebrafish μοντέλο

Τα διαγονιδιακά zebrafish,

Tg (kdrl: EGFP)

s843

[24], εκφράζουν EGFP ειδικά στο αγγειακό σύστημα τους. Οι αντίστοιχες zebrafish έμβρυα είναι διαφανή με σκάφη πράσινη φθορίζουσα. Χρησιμοποιήσαμε αυτά τα ψάρια να διεξάγει

in vivo μελέτες

του ανθρώπινου γαστρικού μετανάστευση καρκινικών κυττάρων (Σχήμα 5Α). Όταν το κόκκινο φθορίζον σημασμένα κύτταρα AGS εγχύθηκαν εντός του λεκιθικό σάκο του zebrafish εμβρύων στις 48 HPF (ώρες μετά τη γονιμοποίηση), η πλειοψηφία των μεταμοσχευμένων κυττάρων AGS βρίσκονταν στο κέντρο της λεκιθικό σάκο των εμβρύων από 4 ώρες μετά τη μεταμόσχευση ( ΤΦ). Μετά από 26 ΤΦ, τόσο τις κανονικές και scRNA επιμολυσμένα κύτταρα μετανάστευσαν στην περιοχή του κορμού, και διέμενε στο δοχείο του κορμού ή /και την ουρά των εμβρύων στις 50 ΤΦ. Ωστόσο, ο αριθμός των κυττάρων που μετανάστευσαν AGS, στο οποίο καθεμία από γαλεκτίνη-3, PAR-1 ή ΜΜΡ-1 σιγήσει, μειώθηκε σημαντικά (Σχήμα 5Β). Μετρήσαμε επίσης τον αριθμό των zebrafish εμβρύων που εμφανίζουν μεταναστεύοντα κύτταρα και τα αποτελέσματα παρουσιάζονται (Σχήμα S2). Ογδόντα 4-93 τοις εκατό του zebrafish έμβρυα που μεταμοσχεύτηκαν με κύτταρα ελέγχου ή scRNA επεξεργασμένα κύτταρα εμφανίζονται τα κύτταρα μεταναστεύουν σε κορμό και την ουρά σκάφη τους σε 50 ΤΦ. Ωστόσο, μόνο 7 έως 11% των εμβρύων που μεταμοσχεύτηκαν με κύτταρα στα οποία σίγησαν γαλεκτίνη-3, PAR-1 ή ΜΜΡ-1, που εμφανίζεται μεταναστεύουν κύτταρα. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν, ότι πρώτα, το zebrafish μοντέλο έμβρυο μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την παρακολούθηση της μετανάστευσης των γαστρικών καρκινικών κυττάρων ως ένα ζωντανό ζώο, και δεύτερον, ότι σίγηση του καθενός από γαλεκτίνη-3, PAR-1 και ΜΜΡ-1 προκάλεσε σημαντική μείωση της γαστρικό μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων

in vivo

.

Α, στα 53 ώρες μετά τη γονιμοποίηση (HPF), τα μεταμοσχευμένα κύτταρα AGS που επιμολύνονται γαλεκτίνη-3, PAR-1, ΜΜΡ-1 siRNA και scRNA (κόκκινο) βρίσκονταν στο κέντρο της λεκιθικό σάκο του ζουν τρανσγονικό ψάρι zebra στα οποία εμβρυϊκά αιμοφόρα οπτικοποιούνται με πράσινο φθορισμό στις 4 ώρες μετά τη μεταμόσχευση (ΗΡΤ)? έως 50 ΤΦ ήταν σαφώς ανιχνεύθηκαν μόνο τα καρκινικά κύτταρα. Β, Ο αριθμός των κυττάρων μετανάστευσαν ανά έμβρυο μετρήθηκαν, και εμφανίζεται ως ιστόγραμμα. Τα δεδομένα αυτά προέρχονται από τρεις αναπαραχθεί πειράματα.

Κλίμακα μπαρ

, 200 μm και 50 μm στο τελευταίο πάνελ. Γ και Δ, Αυξημένη έκφραση της γαλεκτίνης-3, PAR-1 και ΜΜΡ-1 σε ασθενείς με γαστρικό καρκίνο. C, Έκφραση και εντοπισμός του γαλεκτίνη-3, PAR-1 και ΜΜΡ-1 σε κακοήθεις ιστούς από ασθενείς με καρκίνο του στομάχου χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημικές staing (καφέ) με Η &? Ε με μικροσκοπία φθορισμού. Μεγέθυνση: (άνω τμήμα) × 200? (Κάτω πάνελ) × 400. D, το mRNA από γαλεκτίνη-3, PAR-1 και ΜΜΡ-1 επίπεδα σε ιστούς ασθενών με γαστρικό καρκίνο ανιχνεύεται με RT-PCR (Σχήμα S3). Κακοήθη και φυσιολογικών ιστών αποκτήθηκαν από 20 γαστρικό ασθενείς υποβλήθηκαν σε RT-PCR, ποσοτικοποιείται και αναλύθηκαν με αναλυτή εικόνας ΝΙΗ. Υψηλότερα επίπεδα έκφρασης γαλεκτίνη-3, PAR-1 και ΜΜΡ-1 σε κακοήθεις ιστούς φαίνονται σαν ποσοστιαίες αυξήσεις πάνω από τα επίπεδα τους σε φυσιολογικούς ιστούς.

Η

Εκδήλωση γαλεκτίνη-3, PAR-1 και ΜΜΡ -1 είναι αυξημένα, παράλληλα, στους κακοήθεις ιστούς του ασθενείς με γαστρικό καρκίνο

Προσδιορίσαμε τα επίπεδα mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης από γαλεκτίνη-3, PAR-1 και ΜΜΡ-1 σε φυσιολογικούς και κακοήθεις ιστούς από 20 γαστρικό ασθενείς με καρκίνο, τότε χρησιμοποιείται RT-PCR χρησιμοποιώντας έναν αναλυτή εικόνας J. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5C και Σχήμα S3, 73,7% των ασθενών με καρκίνο έδειξαν υψηλότερα επίπεδα έκφρασης του γαλεκτίνης-3 και το 70% από αυτούς έδειξαν υψηλότερα επίπεδα PAR-1 και ΜΜΡ-1 σε κακοήθεις ιστούς τους από ό, τι στην κανονική τους ομολόγους τους. Επιπλέον, μεταξύ γκαλεκτίνη-3 θετικούς ασθενείς, 71,4% ήταν επίσης PAR-1 θετικά, ενώ το 64,3% ήταν και MMP-1 θετικά (Σχήμα 5D). Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι υπάρχει μια παράλληλη αύξηση στην έκφραση του γαλεκτίνης-3, καθώς και PAR-1 και ΜΜΡ-1, στους κακοήθεις γαστρικών ιστών. Βρήκαμε επίσης ότι αυτές οι πρωτεΐνες συν-εντοπίζεται σε κακοήθη τομείς των ιστών, και όχι σε μη κακοήθεις περιοχές (Σχήμα 5C). Γαλεκτίνη-3 ήταν παρούσα τόσο στο κυτοσόλιο και πυρήνα, ενώ PAR-1 και ΜΜΡ-1 παρατηρήθηκαν γενικά στο κυτοσόλιο και μεμβράνη εντός της ίδιας περιοχής (Σχήμα 5C). Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι και οι δύο PAR-1 και ΜΜΡ-1 εκφράσεις συσχετίζεται σημαντικά με galctin-3 έκφρασης σε ασθενείς με καρκίνο του στομάχου.

Συζήτηση

Αυτή η μελέτη έδειξε ότι γκαλεκτίνη-3 ενισχυμένη γαστρική μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων και την εισβολή. Μηχανιστικά, αυτό συνδέεται γαλεκτίνη-3 προς τα πάνω ρύθμιση του υποδοχέα επιφάνειας PAR-1 κυττάρων, και η δραστικότητα ΜΜΡ-1 πρωτεάσης. Αυτό είναι σε συμφωνία με αναφορές που δείχνουν ένα συσχετισμό μεταξύ της έκφρασης του PAR-1 και εισβολή και μετάσταση όγκου σε γαστρικό και διάφορες άλλες μορφές καρκίνου [25], [26], [27]. Αυτή η μελέτη είναι η πρώτη που επιδεικνύουν μια άμεση αλληλεπίδραση της γαλεκτίνης-3 και ΑΡ-1 συμπλόκου συστατικά, c-Jun και Fra-1, και η ρύθμιση του PAR-1 έκφραση από την ΑΡ-1 μεταγραφικού παράγοντα. Δεδομένου ότι έχει ήδη δειχθεί από άλλους ότι η υπερ-έκφραση του Fra-1 προάγει καρκινικών κυττάρων εισβολή και τη μετάσταση [28], αυξητική ρύθμιση του PAR-1 με c-Jun και Fra-1 φαινόταν να είναι ένα πιθανό μηχανισμό που εξηγεί τη σύνδεση από γαλεκτίνη-3 που επάγεται πάνω ρύθμιση του υποδοχέα επιφάνειας PAR-1 κυττάρων, και η δραστικότητα ΜΜΡ-1 πρωτεάσης. Αυτή η δυνατότητα υποστηρίζεται από το εύρημα μας παράλληλων και συν-εντοπισμένη εκφράσεις γαλεκτίνης-3 και PAR-1 σε κακοήθεις ιστούς των ασθενών με καρκίνο του στομάχου.

Είναι μία νέα παρατήρηση ότι γαλεκτίνης-3 αυξάνει ΜΜΡ-1 έκφραση . Σαφώς, η υπερ-έκφραση του ΜΜΡ-1 μπορεί να αυξήσει το γαστρικό δραστικότητα εισβολή των καρκινικών κυττάρων αναστέλλοντας κύτταρο σε κύτταρο και κυττάρου προς μήτρα αλληλεπιδράσεις με αποικοδόμηση ECM. Ως εκ τούτου, η αύξηση της ΜΜΡ-1 έκφραση που προωθείται από γαλεκτίνη-3 μπορεί να έχει διπλή δράση, δηλαδή, PAR-1 ενεργοποίηση και την υποβάθμιση της ECM, και οι δύο είναι κρίσιμης σημασίας για γαστρικό μετάσταση καρκίνου. Ωστόσο, το πώς γαλεκτίνη-3 ρυθμίζει την έκφραση της ΜΜΡ-1 είναι ακόμη ασαφής, επειδή η έκφραση της ΜΜΡ-1 ρυθμίζεται από μια σειρά πολύπλοκων γεγονότων συμπεριλαμβανομένων cross-talk μεταξύ διαφόρων μεταγραφικών παραγόντων, όπως ΑΡ-1, μετατροπέα σήματος και ενεργοποιητής της μεταγραφής-3, ΜΑΡ κινάσης, και υποξία παράγοντα-1 σε υποξία [29], [30], [31].

η δημιουργία του zebrafish (

Danio rerio

) μοντέλο εμβρύων για μελετώντας την μετανάστευση και την εισβολή των γαστρικών καρκινικών κυττάρων είναι ένα ιδιαίτερο επίτευγμα αυτής της μελέτης, διότι κατάλληλα ζωικά μοντέλα δεν ήταν διαθέσιμοι για μελέτη της ανθρώπινης γαστρικού μετάστασης του καρκίνου μέχρι τώρα. Το zebrafish μοντέλο για τη μελέτη γενετικά καρκίνους ή /και ξενομοσχεύματα όγκου, έχει πολλά πλεονεκτήματα, συμπεριλαμβανομένης της σκοπιμότητας των εμπρός και πίσω γενετικές αναλύσεις, η διαφάνεια των εμβρύων [32], και την καταλληλότητα για την επισήμανση GFP των πλοίων [32], [33], [34]. Αυτή η μελέτη έδειξε ότι επισημαίνονται RFP γαστρικά καρκινικά κύτταρα εισέβαλαν αιμοφόρα αγγεία ενώ γαλεκτίνη-3, ΜΜΡ-1 ή PAR-1 σιγήσει γαστρικά καρκινικά κύτταρα δεν μπορούσε. Έτσι, το zebrafish εμβρύου φαίνεται να είναι μια πολλά υποσχόμενη μοντέλο για τη μελέτη εισβολή και τη μετάσταση των καρκινικών κυττάρων, αν και περαιτέρω μελέτες είναι σαφώς απαραίτητη για να επιβεβαιωθεί αυτό το εύρημα.

Εν κατακλείδι, οι μελέτες μας απέδειξαν ότι γκαλεκτίνη-3 επιταχύνθηκε καρκίνο του στομάχου κυτταρική κινητικότητα με αυξητική ρύθμιση του PAR-1 και ΜΜΡ-1. Περαιτέρω μελέτες είναι σαφώς αναγκαία για τη διαπίστωση του ρόλου της γκαλεκτίνη-3 στη μετάσταση του καρκίνου και την καταλληλότητά της ως θεραπευτικό στόχο για το επιλεγμένο καρκίνους.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι ιστοί

Ζεύγη 2 mm μεγέθους δειγμάτων βιοψίας ελήφθησαν από γαστρικό αδενοκαρκίνωμα ιστούς από τους 20 ασθενείς που υποβάλλονται σε διαγνωστική ενδοσκόπηση και ενδοσκοπική εκτομή υποβλεννογόνια, στο Εθνικό κέντρο καρκίνου στην Κορέα, μετά την απόκτηση γραπτή πληροφορημένες συγκαταθέσεις τους. Τα δείγματα ιστού καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο στους -70 ° C αμέσως μετά τη βιοψία μέχρι τη χρήση. Μερικά από τα δείγματα ιστού paraffindized για ανοσοϊστοχημικές μελέτες, όπως απαιτείται. Αυτές οι μελέτες εγκρίθηκαν από το Διοικητικό Συμβούλιο Institutional Review του Εθνικού κέντρου καρκίνου (# NCCNSH 03-024).

Cell Culture και siRNA Οι επιμολύνσεις

Μέτρια διαφοροποιούνται ανθρώπινο γαστρικό αδενοκαρκίνωμα κυτταρικές σειρές, AGS, MKN- 28 και SNU-638 ελήφθησαν από την Κορέα Κυτταρική Γραμμή Τράπεζα και διατηρήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [35]. siRNAs που χρησιμοποιούνται σε επιμολύνσεις, ήταν όλα παρέχονται από την Invitrogen (Carlsbad, CA). ακολουθίες τους είναι γκαλεκτίνη-3 (LGAL3) siRNA? 5′-AUAUGAAGCACUGGUGAGGUCUAUG-3 ‘, PAR-1 siRNA? 5’-CCCAUCUGUGUACACCGGAGUGUUU-3 ‘, και ΜΜΡ-1 siRNA? 5’-GGAGAAAUAGUGGCCCAGUGGUUGA-3 ‘. Οι επιμολύνσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen), ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Επαγωγή παροδική γαλεκτίνης-3 η υπερέκφραση σε SNU-638 κύτταρα επιτεύχθηκε χρησιμοποιώντας pcDNA3.1 /NT-γαλεκτίνης-3 με pcDNA3.1 /NT-GFP. Για τη θεραπεία ελέγχου κανονικοποίηση, οι κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 1 μg από αντιδραστήρια LTX (Invitrogen).

απομόνωση RNA και RT-PCR ανάλυση

Ολικό RNA απομονώθηκε από ανθρώπινα γαστρικά καρκινικά κύτταρα και τα δείγματα ασθενούς ιστού, χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Αντίστροφη μεταγραφάση PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας μια αντίστροφη σύστημα μεταγραφής (Promega Corp. USA), ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν: 5′-ATGGCAGACAATTTTTCGCTCC-3 ‘(νοηματικό) και 5′-ATGTCACCAGAAATTCCCAGTT-3′ (αντι-νόημα) για ανθρώπινη LGAL3 γονίδιο (γαλεκτίνη-3)? 5’-CCAAAACTGAGCATAAGTCC-3 ‘(νοηματικό) και 5′-AGGATGGAGCAAATGTAGTG-3′ (αντι-νόημα) για ανθρώπινη F2R γονίδιο (PAR-1)? 5’-ACAGCTTCCCAGCGACTCTA-3 ‘(νοηματικό) και 5′-CAGGGTTTCAGCATCTGGTT-3′ (αντι-νόημα) για ανθρώπινο γονίδιο ΜΜΡ-1? 5’-CTCGAACTTTGACAGCGACA-3 ‘(νοηματικό) και 5′-GCCATTCACGTCGTCCTTAT-3′ (αντι-νόημα) για ανθρώπινο γονίδιο ΜΜΡ-9? 5’-AGCCTCGCCTTTGCCGA-3 ‘(νοηματικό) και 5′-CTGGTGCCTGGGGCG-3′ (αντι-νόημα) για ανθρώπινο γονίδιο β-ακτίνης? 5’-GGCTGCTTTTAACTCTGGTA-3 ‘(νοηματικό) και 5′-ACTTGATTTTGGAGGGATCT-3’ (αντι-νόημα) για ανθρώπινη γλυκεραλδεΰδης 3-φωσφορικής αφυδρογονάσης (GAPDH). PCR πραγματοποιήθηκε σε ένα όγκο 20 μΐ χρησιμοποιώντας ένα Taq Ex (Takara). Ο κύκλος ενίσχυσης (μετουσίωση 95 ° C για 1 λεπτό, ανόπτηση στους 60 ° C για 1 λεπτό και επέκταση βήμα στους 72 ° C για 2 λεπτά) επαναλήφθηκε 32 φορές ακολουθείται από τελική επέκταση για 10 λεπτά στους 72 ° C.

Κατασκευή γαλεκτίνης-3 που εκφράζουν lenti-ιικό φορέα και μόλυνση

το πλήρους μήκους ανθρώπινο γαλεκτίνης-3 που εκφράζουν κατασκεύασμα pcDNA3.1-NT-GFP-Gal3, ο φορέας pcDNA3.1-ΝΤ-GFP και ο lenti-ιικό φορέα για να υπερεκφράζουν LacZ, γαλεκτίνη-3 (1-250) σε pLL3.7 έχουν περιγραφεί προηγουμένως [2]. Ανθρώπινα F2R κλωνοποιήθηκε σε pLECE3 σε θέσεις περιοριστικών ενζύμων BamH1 και Not1, δημιουργώντας το pLECE3-F2R (PAR-1) κατασκεύασμα. cDNA πλήρους μήκους του F2R, ΜΜΡ-1, και τον έλεγχο mRFP χρησιμοποιήθηκαν για την ενίσχυση PCR, μαζί με τους εκκινητές που παρατίθενται στο Data S1, και τα προκύπτοντα θραύσματα PCR κλωνοποιήθηκαν στο φορέα pLECE3 χρησιμοποιώντας θέσεις ενζύμου περιορισμού Pac1 και Hpa1, δημιουργώντας το pLECE3 -ΜΜΡ-1 κατασκεύασμα. Επίσης, η θέση mRFP του ρΟΕΜ-Τ-Easy φορέα μεταφέρθηκε στο φορέα pLL3.7 αντικαθιστώντας την περιοχή GFP χρησιμοποιώντας AGE1 και EcoR1 θέσεων ενζύμων περιορισμού, να κάνει pLL3.7-mRFP. παραγωγή Lenti-ιικό φορέα έχει περιγραφεί προηγουμένως [2]

Western ανάλυση κηλίδος

εκχυλίσεις κυτταρόλυμα παρασκευάστηκαν με ρυθμιστικό RIPA (1% ΝΡ-40?. 0.1% δωδεκυλοθειικό νάτριο? 0.5 % δεσοξυχολικό? 150 mM NaCl? 50 mM Tris, ρΗ 7.5) και πρωτεάση απαγορευτής κοκτέιλ. 20 μg ολικής πρωτεΐνης του κάθε προϊόντος λύσης επιλύθηκε σε πηκτώματα 8-12% δϋδ PAGE και ηλεκτρο-μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη PVDF, και ακολούθως δεσμεύονται σε 5% αποβουτυρωμένο γάλα σε 0,05% Tween-20 με 1 χ PBS (PBST). Πολυκλωνικά πρωτογενή αντισώματα, αντι-γαλεκτίνη-3, αντι-ThrombinR (PAR-1), αντι-c-Jun, αντι-Fra-1 και αντι-β-ακτίνης (Santa Cruz), αντι-ΜΜΡ1 (Calbiochem), αντι- παξιλλίνης και αντι-φωσφο παξιλλίνη (pY181) (Epitomics) επωάστηκαν με κηλίδες στο 1:1000 αραίωση σε ελάχιστο όγκο 5% BSA (αλβουμίνη βόειου ορού) σε ρυθμιστικό PBST για τη θερμοκρασία δωματίου 1 ώρα ή όλη τη νύχτα σε 4 ° C. δευτερογενή αντισώματα κατσίκας συζευγμένο με HRP αντι-ποντικού ή αντι-κουνελιού (GE Healthcare UK Limited) επωάστηκαν σε 1:5000 αραίωση 5% BSA σε ρυθμιστικό PBST για 1.5 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Οι πρωτεΐνες που ενδιαφέρουν ανιχνεύθηκαν με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (ECL) (Amersham Corp, Arlington Heights, IL, USA).

Ανοσοκαταβύθιση

εκχυλίσματα κυτταρόλυμα παρασκευάστηκαν με ρυθμιστικό IP + (20 mM Hepes, 1 % Triton Χ-100, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 100 mM NaF, 10 mM πυροφωσφορικό νάτριο, 1 mM ορθοβαναδικό νάτριο, 0,2 mM PMSF, 10 μg /ml αναστολέα πρωτεάσης κοκτέιλ) σε πάγο για 30 λεπτά. Μετά την απομάκρυνση συντριμμάτων με φυγοκέντρηση (13.200 rpm στους 4 ° C για 20 min), τα υπερκείμενα υποβλήθηκαν σε ένα στάδιο προδιαύγαση με /G αγαρόζης πρωτεΐνης Α σε 4 ° C για 30 λεπτά σε περιστροφέα. Τα υπερκείμενα που λαμβάνονται μετά από μια σύντομη φυγοκέντρηση (2000 rpm στους 4 ° C για 4 λεπτά) υποβλήθηκαν σε ανοσοκαταβύθιση χρησιμοποιώντας αντι-galectin3 και φυσιολογική IgG ποντικού (αρνητικός έλεγχος). Τα ανοσοϊζήματα πλύθηκαν δύο φορές σε ρυθμιστικό IP-(20 mM Hepes, 1% Triton Χ-100, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 100 mM NaF, 10 mM πυροφωσφορικό νάτριο). Μετά από 30 μΙ 2 χ ρυθμιστικού διαλύματος προσθήκης SDS-δείγμα, που ακολουθείται βράζει στους 95 ° C για 5 λεπτά. Μετά υπερκείμενα που ελήφθησαν μετά από μια σύντομη φυγοκέντρηση, τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης τους προσδιορίστηκαν μέσω της ανάλυσης του κηλίδα western πραγματοποιήθηκαν.

Ανοσοϊστοχημεία

Για γαλεκτίνης-3 και PAR-1 ανοσοϊστοχημεία, αποπαραφινοποιήθηκαν γαστρικό τομές ιστού ασθενών με καρκίνο αφέθηκαν σε φούρνο μικροκυμάτων για 15 λεπτά σε ρυθμιστικό διάλυμα κιτρικού (εργαστήρια Vector), και στη συνέχεια επωάστηκαν με 3% η

2O

2 για 15 λεπτά για να εμποδίσει ενδογενούς υπεροξειδάσης, που ακολουθείται από επώαση με 10% φυσιολογικό ορό κατσίκας (Vector εργαστήρια) σε 1 × PBS για 10 λεπτά. Πρωτογενή αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν ένα αντι-γαλεκτίνης-3 (1:200) αντι-ΜΜΡ1 (Epitomics) και αντι-PAR-1 (1:200) αντισώματα (Santa Cruz), και το επόμενο βήμα έγινε σύμφωνα με τις οδηγίες του Vectastain®ABC σετ (εργαστήρια Vector).