Αφηρημένο

Οι ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος έχουν μελαγχολική προγνώσεις, και νέες θεραπείες χρειάζονται επειγόντως. Οι μεταλλάξεις του KRAS ογκογονιδίου συμβαίνουν συχνά στον καρκίνο του παγκρέατος και αντιπροσωπεύουν ένα ελκυστικό στόχο. Άμεση στόχευση των κυρίαρχων οδών KRAS ήταν προκλητική και η έρευνα σε θεραπευτικές στρατηγικές έχουν τώρα επικεντρώνεται εκ νέου τις οδούς κατάντη του KRAS, φωσφοϊνοσιτίδη 3-κινάση (PI3K) και ενεργοποιείται από μιτογόνο πρωτεΐνης κινάσης (ΜΑΡΚ [ΜΕΚ]). Υποθέσαμε ότι η ταυτόχρονη αναστολή των οδών ΡΙ3Κ και ΜΕΚ θα έχει ως αποτέλεσμα συνεργική αντικαρκινική δράση, καθώς θα παρακάμψει την αντισταθμιστική βρόχος ανάδρασης μεταξύ των δύο οδών. Ερευνήσαμε το συνδυασμένο αποτέλεσμα του αναστολέα της ΡΙ3Κ, GDC0941, και τον αναστολέα ΜΕΚ, AZD6244, στη βιωσιμότητα των κυττάρων, την απόπτωση και κυτταρική σηματοδότηση σε ένα πάνελ του παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές. Ένα

in vivo

ανάλυση διεξήχθη σε παγκρεατικά ξενομοσχεύματα καρκίνου. Ενώ BxPC-3 (KRAS άγριου τύπου) και ΜΙΑ PaCa-2 (KRAS μεταλλαγμένο) κυτταρικές γραμμές ήταν ευαίσθητα στην GDC0941 και AZD6244 όπως παρατηρήθηκαν ενιαία παράγοντες, συνεργιστικά αναστολή της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων και η επαγωγή της απόπτωσης στις δύο κυτταρικές σειρές, όταν τα δύο φάρμακα συνδυάστηκαν. Είναι ενδιαφέρον ότι, η φωσφορυλίωση της ΚΓΠ που εξαρτώνται από τα συστατικά της μετάφρασης, πρωτεΐνη 4Ε-δέσμευσης (p-4E-BP1) και S6 βρέθηκε να σχετίζεται στενά με την ευαισθησία να GDC0941 και AZD6244. Σε BxPC-3 ξενομοσχεύματα κυττάρων, παρατηρήθηκαν διαφορές επιβίωσης μεταξύ του ελέγχου και του AZD6244, GDC0941, και ομάδες συνδυασμό. Η μελέτη μας παρέχει τη λογική για την ταυτόχρονη στόχευση της PI3K και ΜΕΚ οδών, ανεξάρτητα από την κατάσταση KRAS, και δείχνει ότι η φωσφορυλίωση της 4Ε-BP1and S6 μπορεί να χρησιμεύσει ως προγνωστικό βιοδείκτη για την ανταπόκριση στη θεραπεία

Παράθεση:. Zhong Η , Sanchez C, D Spitrzer, Plambeck-Suess S, Gibbs J, Hawkins WG, et al. (2013) Synergistic Επιδράσεις Ταυτόχρονη αποκλεισμός της PI3K και ΜΕΚ Πορείες σε καρκίνο του παγκρέατος προκλινικά μοντέλα. PLoS ONE 8 (10): e77243. doi: 10.1371 /journal.pone.0077243

Επιμέλεια: Adriano Angelucci, Πανεπιστήμιο της Λ ‘Άκουιλα, Ιταλία

Ελήφθη: 15η, Απριλίου του 2013? Αποδεκτές: 30 Αυγούστου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 9, Οκτώβρη του 2013

Copyright: © 2013 Zhong et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η δημοσίευση υποστηρίχθηκε από το Washington University Institute of Clinical and Translational Επιστημών Grant UL1TR000448 από το Εθνικό Κέντρο για την Ανάπτυξη της Μεταγραφική Επιστημών (MCATS) και KL2TR000450. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του παγκρέατος είναι η τέταρτη κύρια αιτία του καρκίνου που σχετίζονται με θανάτους για τους άνδρες και τις γυναίκες στις Ηνωμένες Πολιτείες. Εκτιμάται ότι 43.140 άνθρωποι είχαν διαγνωστεί με και 36.800 πέθανε από καρκίνο του παγκρέατος το 2013 [1]. Η έλλειψη μεθόδων διαλογής και αποτελεσματικοί θεραπευτικοί παράγοντες καθιστούν την ανίχνευση και τη θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος ένα δύσκολο πρόβλημα. Ενώ στοχευμένες παράγοντες έχουν γίνει η επικρατούσα τάση για άλλους τύπους καρκίνου, επί του παρόντος, μόνο ο επιδερμικός αυξητικός παράγοντας αναστολέα υποδοχέα erlotinib έχει κερδίσει την έγκριση από την Υπηρεσία Τροφίμων και Φαρμάκων για τη θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος. [2] Δυστυχώς, η κλινική χρησιμότητα της erlotinib περιορίζεται σε μεγάλο βαθμό οφείλεται σε μάλλον μέτρια κλινικό όφελος του, αντανακλώντας τη συνεχιζόμενη επείγουσα ανάγκη για την ανάπτυξη στοχευμένων παραγόντων στον καρκίνο του παγκρέατος.

Η παρουσία της μετάλλαξης του KRAS παρατηρείται στο 30% των προκαρκινικών αλλοιώσεων [3], και έως και 90% του παγκρεατικού δειγμάτων όγκου του καρκίνου [4], υποδηλώνοντας ότι η μετάλλαξη KRAS είναι το κυρίαρχο χαρακτηριστικό γνωστό καρκίνου του παγκρέατος μοριακής παθογένεσης. KRAS είναι ένα ΟΤΡάσης, και το μετατρέπει εξωκυττάρια σήματα σε ενδοκυτταρικά σήματα με ποδήλατο μεταξύ του ενεργού πληθυσμού (RAS-GTP) και ανενεργά μέλη (RAS-ΑΕΠ). Μεταλλαγμένα αποτελέσματα KRAS σε συνεχή ενεργοποίηση του μονοπατιού RAS κλειδώνοντας RAS στην ενεργή κατάσταση σύνδεσης GTP και περαιτέρω ενεργοποίησης πολλαπλές οδούς κατάντη σηματοδότησης περιλαμβανομένων του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, την απόπτωση, τη διαφοροποίηση και την επιβίωση [5]. Άμεση στόχευση του KRAS δεν υπήρξε επιτυχής σε ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος [6], έτσι τρέχουσες ερευνητικές προσπάθειες έχουν εστιάσει εκ νέου σε δύο κατάντη οδούς, η φωσφατιδυλινοσιτόλη 3-κινάση (PI3K) /μονοπατιού AKT [7] και ο /ΜΕΚ μονοπάτι RAF [8 , 9].

Επειδή κυτταρική σηματοδότηση δίκτυα είναι πολύπλοκα, απλά μπλοκάροντας ένα μεσολαβητή είναι απίθανο να οδηγήσει σε σημαντική κλινική ανταπόκριση, εκτός και αν η γενετική εναλλαγή καθιστά την στοχευμένη «τελεστή» να είναι ένα ογκολογικά οδηγείται εκδήλωση. Αυτό δεν συμβαίνει σε KRAS κατάντη οδούς, αποδεικνύεται από το εξαιρετικά χαμηλό ποσοστό των PIK3CA ή BRAF μεταλλάξεων σε όγκους του παγκρέατος [10]. Ως εκ τούτου, έχει διατυπωθεί η υπόθεση ότι η ταυτόχρονη αποκλεισμός σε δύο παράλληλες πορείες, όπως ΡΙ3Κ και ΜΕΚ θα αυξήσει σημαντικά την πιθανότητα για επιτυχία στην επίτευξη μιας κλινικά σχετική απάντηση. Πράγματι, έχουν συνεργιστική αντινεοπλασματική δράση παρατηρήθηκε όταν η PI3K /AKT και ΜΕΚ μονοπάτια αναστέλλονται τόσο σε προκλινικά μοντέλα όγκων [11], συμπεριλαμβανομένου ενός μεταλλαγμένου μοντέλου καρκίνου του πνεύμονα KRAS [12].

GDC0941 είναι ένας από του στόματος παράγοντα αναπτύχθηκε για να αναστέλλουν τις τέσσερις ισομορφές τάξη І ΡΙ3Κ [13]. Έχει αντικαρκινική δραστικότητα δοσοεξαρτώμενη κατά γλοιοβλαστώματος και ξενομοσχευμάτων ανθρώπινου καρκίνου των ωοθηκών [14]. GDC0941 έχει δείξει ελπιδοφόρα αντικαρκινική δραστικότητα στην προκλινική περιβάλλον, και αυτή τη στιγμή δοκιμάζεται σε κλινικές δοκιμές πρώιμη φάση [14]. AZD6244 είναι ένας ισχυρός, εκλεκτικός αναστολέας δευτερογενή παραγωγή ΜΕΚ1 /2, η οποία αναστέλλει ΜΑΡΚ /ΕΚΚ σε ΑΤΡ-ανταγωνιστικοί μόδας [15]. Μαζί με άλλους αναστολείς ΜΕΚ, AZD6422 είναι επί του παρόντος σε κλινικές δοκιμές πρώιμη φάση [16-18]. Οι Προκλινικές αξιολογήσεις του συνδυασμού ενός αναστολέα ΡΙ3Κ /ΑΚΤ και έναν αναστολέα ΜΕΚ σε καρκίνο του παγκρέατος αναδυόμενες [19], και η μελέτη μας επιβεβαιώνει ότι μία συνεργική δράση λαμβάνει χώρα όταν το κλείδωμα των δύο αυτών οδών. Επιπλέον, έχουμε διευκρινίζεται περαιτέρω ότι το όφελος της ταυτόχρονης αποκλεισμός δεν είναι KRAS γονότυπο περιορισμένη. Επιπλέον, η μελέτη μας δείχνει ότι η διαδικασία της μετάφρασης, και ειδικότερα, την ενεργοποίηση των 4Ε-πρωτεΐνης δέσμευσης 1 (4Ε-ΒΡ1) και S6 φαίνεται να συνδέεται με φαινοτυπική απόκριση των καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος »προς τους αναστολείς.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture και Αναστολείς

παγκρέατος κυτταρικές σειρές καρκίνου, BxPC-3 (KRAS άγριου τύπου), ΜΙΑ PaCa-2 (KRAS μεταλλαγμένο), PANC-1 (KRAS μεταλλαγμένο) και Capan -2 (KRAS μεταλλαγμένο) λήφθηκαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) και καλλιεργήθηκαν σε ένα μέσο ανάπτυξης είτε DMEM (PANC-1, μΙΑ PaCa-2), RPMI-1640 (BxPC-3) ή του McCoy μέσο 5Α (Capan-2) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό, 100 μονάδες /ml πενικιλίνη, 100 μg /ml στρεπτομυκίνη και 1 mM πυροσταφυλικό νάτριο στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 5% CO

2. Ο αναστολέας ΡΙ3Κ GDC0941 και αναστολέα ΜΕΚ AZD6244 αγοράστηκαν από Σέλεκ Chemicals LLC (Houston, ΤΧ, USA) και διαλύθηκε σε διμεθυλοσουλφοξείδιο. Και οι δύο αναστολείς φυλάχθηκαν στους -20 ° C.

Βιωσιμότητας Κυττάρων Δοκιμασία

παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα γραμμές σπάρθηκαν σε πυκνότητα 3000 κυττάρων ανά φρεάτιο σε μία πλάκα μικροτίτλου 96-φρεατίων σε μέσο αύξησης και αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύκτα. GDC0941 ή AZD6244 δόσης-απόκρισης προσδιορίστηκε με κατεργασία των παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα γραμμές με 5 συγκεντρώσεις των φαρμάκων με βάση μια 10-πλάσια σειρά αραίωσης. Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε 72 ώρες αργότερα με Alamar Blue (Invitrogen, ΝΥ, USA) (570λ

Ex /580λ

Em) με μία φθορίζουσα συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας, και εκφράζεται ως ποσοστό των κυττάρων που υποστεί αγωγή με φάρμακο σε σχέση με τον έλεγχο ( Δεν φάρμακο) κύτταρα. Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc. San Diego, CA, USA), και η καμπύλη δόσης-απόκρισης χρησιμοποιήθηκε για να υπολογιστεί η συγκέντρωση του φαρμάκου που προκύπτει σε 50% αναστολή της βιωσιμότητας των κυττάρων (IC

50) χρησιμοποιώντας τέσσερις παραμετρική υλικοτεχνική μοντέλο. Ολες οι δοκιμασίες επαναλήφθηκαν πέντε φορές

Για τις μελέτες συνδυασμού φαρμάκου, η συνεργιστική δράση εκτιμήθηκε με τον δείκτη συνδυασμού (CI), σύμφωνα με την μέθοδο των Chou & amp.? Talalay όπου συνέργεια ορίζεται ως CI & lt? 1, ενώ ο ανταγωνισμός είναι CI & gt? 1, και ένα προσθετικό αποτέλεσμα θεωρείται ως CI = 1 [20]. Οι κυτταρικές σειρές υποβλήθηκαν σε θεραπεία με GDC0941, AZD6244 ή ενός συνδυασμού GDC0941 και AZD6244, και ο αριθμός των βιώσιμων κυττάρων χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό των τιμών CI χρησιμοποιώντας λογισμικό CalcuSyn (Biosoft, Cambridge, Ηνωμένο Βασίλειο).

Προσδιορισμός απόπτωσης

Περίπου 2 × 10

5 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων για 24 ώρες. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με διάφορες συγκεντρώσεις GDC0941, AZD6244 ή ενός συνδυασμού GDC0941 και AZD6244 για 72 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με 0.25% θρυψίνη, πλύθηκαν με αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS), και συλλέγονται μαζί με φυγοκέντρηση. Τα κύτταρα στη συνέχεια χρωματίστηκαν με την Αννεξίνη V-FITC και ΡΙ διάλυμα (BD Biosciences, San Diego, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και αναλύθηκαν με ροή σάρωση FAC κυτταρόμετρο (Becton Dickinson, San Diego, CA, USA) . Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

Western Blot Δοκιμασία

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων για

in vitro

αναλύσεις. Όταν τα κύτταρα έγινε 70-80% συρροή, αυτά επωάστηκαν με GDC0941, AZD6244 ή δύο GDC0941 και AZD6244 για 24 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν με ψυχρό PBS και υπέστησαν λύση σε ρυθμιστικό RIPA (50 mM Tris-HCl ρΗ 7,4, 150 mM NaCl, 1% Triton Χ-100, 1% δεοξυχολικό νάτριο, 0.1%, SDS, 1 mM EDTA, αναστολείς πρωτεάσης ). Τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν μετά από υπερήχους και φυγοκέντριση, και ίσες ποσότητες πρωτεϊνών υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση μέσα από 4-12% Bis-Tris Gels και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με 5% άπαχο γάλα μετά από ολονύκτια επώαση με τα κατάλληλα πρωτεύοντα αντισώματα στους 4 ° C. Όλα τα πρωτογενή αντισώματα επωάστηκαν σε 5% αλβουμίνη βόειου ορού (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ, USA). Οι μεμβράνες πλύθηκαν 3 φορές για να απομακρυνθεί το μη δεσμευμένο αντίσωμα και στη συνέχεια επωάστηκαν με ένα δευτερεύον αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση αρμορακίας για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Οι μεμβράνες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ενισχυμένη αντιδραστήρια χημειοφωταύγειας σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (GE Healthcare Life Science, ΡΑ, USA). Πρωτογενή αντισώματα περιλαμβάνονται αντι-φωσφο-ΑΚΤ (Ser473), αντι-Akt, αντι-φωσφο-ΕΚΚ (Τ202 /Y204), αντι-ΕΚΚ, αντι-φωσφο-S6 (S240 /244), αντι-S6, αντι-φωσφο- 4Ε-ΒΡ1 (S65) και αντι-4E-BP1 (Cell Signaling Technology, Beverly, ΜΑ, USA). ImageJ (freeware) χρησιμοποιήθηκε για τη σύγκριση της πυκνότητας των ζωνών και να τελειώσει το πυκνομετρική ανάλυση.

In vivo μελέτες

Γυμνά ποντίκια, 4 ή 5-εβδομάδων ηλικίας, αγοράστηκαν από την Εθνική Cancer Institute. Αυτοί εγκλιματίστηκαν για 1-2 εβδομάδες πριν υποβλήθηκαν σε οποιεσδήποτε πειραματικές διαδικασίες. BxPC-3 κύτταρα (1×10

6) ενέθηκαν υποδορίως (s.c.) σε λαγόνες ποντικών. Οι όγκοι των όγκων μετρήθηκαν σε δύο διαστάσεις (μήκος και πλάτος) με παχύμετρο πριν από τη θεραπεία και δύο φορές την εβδομάδα μία φορά άρχισε θεραπεία. Οι ποντικοί επίσης ζυγίστηκαν σε αυτούς τους χρόνους, και οι αλλαγές βάρους υπολογίζεται από την ακόλουθη συνταγολόγιο: [1- (νέο βάρος /αρχικό βάρος)] × 100. Τα μεγέθη των όγκων υπολογίστηκαν με τον κανονικό τύπο του όγκου Μέγεθος = Μήκος x Πλάτος

2 x 0,5. Οι ποντικοί που ανέπτυξαν όγκους φθάνοντας 100-150 mm

3 σε μέγεθος τυχαιοποιήθηκαν στις ακόλουθες τέσσερις ομάδες με 8 ποντίκια σε κάθε ομάδα: όχημα, GDC0941, AZD6244, ή η θεραπεία συνδυασμού. Αμφότερα τα φάρμακα χορηγήθηκαν μία φορά ή δύο φορές ημερησίως από του στόματος καθετηριασμό σε όγκο 10 ml /kg σωματικού βάρους. Τα φάρμακα διαλύθηκαν σε ένα όχημα από 0,5% (β /ο) μεθυλοκυτταρίνη /0,2% Tween 20 για χορήγηση. Ο αναστολέας ΡΙ3Κ παραδόθηκε ημερησίως σε μία τελική συγκέντρωση 50 mg /kg [14], ενώ ο αναστολέας ΜΕΚ χορηγήθηκε δύο φορές ημερησίως σε μία τελική συγκέντρωση 25 mg /kg [15]. Τα ζώα ελέγχου έλαβαν έναν ισοδύναμο όγκο 0,5% μεθυλοκυτταρίνης /0.2% Tween 20 μόνο, δύο φορές ημερησίως από του στόματος καθετηριασμό. Η διάρκεια της θεραπείας ήταν 18 ημέρες. Εάν η διάμετρος όγκου ποντικού έγινε μεγαλύτερο από 15 mm κατά τη διάρκεια της θεραπείας ή το βάρος του ποντικού μειώθηκε κατά 20% σε σύγκριση με το αρχικό βάρος του, το ποντίκι θα υποβάλλονται σε ευθανασία με CO

2 υπερδοσολογία. Όλες οι μελέτες διεξήχθησαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο που εγκρίθηκε από το Μηχανισμό Θεσμικών Φροντίδας Ζώων του Πανεπιστημίου της Ουάσιγκτον (αριθμός πρωτοκόλλου: 20.100.114).

Στατιστικές Αναλύσεις

δεδομένα βιωσιμότητας κυττάρων εκπροσωπήθηκαν ως η μέση τιμή ± τυπική απόκλιση (SD). δεδομένα απόπτωση των κυττάρων και πειράματα ανάπτυξης όγκου αντιπροσωπεύθηκαν ως η μέση τιμή ± τυπικό σφάλμα του μέσου (S.E.M.). Καμπύλες Kaplan-Meier χρησιμοποιήθηκαν για αναλύσεις επιβίωσης. Στατιστικές συγκρίσεις έγιναν με την ANOVA (μόνο παράγοντα) και t-test (ζεύγη δύο δείγματα για τα μέσα και unpaired t-test), όπως υποδεικνύεται. Μία τιμή ρ & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική.

Αποτελέσματα

Η ταυτόχρονη αναστολή των PI3K και ΜΕΚ έχει μια συνεργική επίδραση στην ανάπτυξη του καρκίνου του παγκρέατος κυτταρικές σειρές

in vitro

Η

Για να προσδιοριστεί η δραστικότητα κατά του όγκου των αναστολέων ΡΙ3Κ και ΜΕΚ μόνο και σε συνδυασμό

in vitro

, επιλέχθηκαν τέσσερις παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές για μελέτη. BxPC-3 είναι ένα KRAS άγριου τύπου παγκρεατικό καρκίνο κυτταρική σειρά, ενώ οι άλλες τρεις κυτταρικές σειρές φιλοξενούν τη μετάλλαξη KRAS. Όλες οι τέσσερις κυτταρικές σειρές δεν είναι γνωστό ότι φέρουν είτε PI3K ή μεταλλάξεις BRAF [21]. Το αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση του ΡΙ3Κ ή αναστολέα ΜΕΚ μόνος στο BxPC-3, ΜΙΑ PaCa-2, PANC-1 και Capan-2 κυττάρων μετρήθηκε με Alamar Blue. η ανάπτυξη των κυττάρων ΜΙΑ PaCa-2 BxPC-3 και επηρεάστηκε μόνο από GDC0941. Οι συγκεντρώσεις των GDC0941 με αποτέλεσμα 50% αναστολή της βιωσιμότητας των κυττάρων (IC

50) μετά από έκθεση 72 ώρες ήταν 376,4 ηΜ σε BxPC-3 κύτταρα και 754,6 ηΜ σε κύτταρα ΜΙΑ PaCa-2 (Σχήμα 1Α). AZD6244 κατέστειλε μόνος επίσης την ανάπτυξη των κυττάρων με IC

50 αξία των 599 ηΜ και 375 ηΜ σε BxPC-3 και τα κύτταρα ΜΙΑ PaCa-2, αντίστοιχα (Εικόνα 1Β). Το IC

50 δεν επιτεύχθηκε για PANC-1 και Capan-2 κυτταρικών σειρών και, ως αποτέλεσμα, αυτοί θεωρήθηκαν ως ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές. Κάναμε παρατηρούμε μια μικρή αύξηση στην ανάπτυξη PANC-1 κυττάρων με GDC0941at 1ηΜ, 10 nm και 100 nm, αλλά οι αλλαγές δεν ήταν στατιστικά σημαντική (έλεγχος vs 1 nM, p = 0.32, ο έλεγχος έναντι 10 nM, ρ = 0.17, έλεγχο vs 100 nM , ρ = 0.22). Επιπλέον, συγκρίναμε τον έλεγχο vs 1 ηΜ AZD6244 σε PANC-1 και ΜΙΑ PaCa κύτταρα-2, και δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές (ρ = 0.20, ρ = 0,64, αντίστοιχα)

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις του GDC0941 (Α) ή AZD6244 (Β) μόνο για 72 ώρες. Οι δόσεις κυμαίνονταν από 1 ηΜ έως 10 μΜ.

Η

Το αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση του συνδυασμού ενός αναστολέα της ΡΙ3Κ και ΜΕΚ μετρήθηκε σε κύτταρα BxPC-3 και ΜΙΑ PaCa-2 με τον υπολογισμό του δείκτη συνδυασμού (CI) σύμφωνα με την μέθοδο Chou-Talalay (20) χρησιμοποιώντας ένα σταθερό λόγο δόσεων. Τόσο GDC0941and AZD6244 εισήχθησαν σε κυτταρικές καλλιέργειες σε 0,25 ×, 0.5 ×, 1 ×, 2 × και 4 × αντίστοιχες IC

50 τους στις κυτταρικές γραμμές ΜΙΑ PaCa-2 BxPC-3 και. Η κυτταρική ανάπτυξη στις δύο κυτταρικές σειρές ήταν σημαντικά μειωμένη μετά τη θεραπεία συνδυασμού σε συγκεντρώσεις πολλαπλά ζεύγη, σε σύγκριση με είτε απλός παράγων μόνος. Τα δεδομένα αξιολογήθηκαν για να πάρει το CI υπό την αντίστοιχη αποτελεσματική δόση (ED) σε BxPC-3 και κυτταρικές σειρές ΜΙΑ PaCa-2 (Σχήμα 2) από το λογισμικό CalcuSyn. Για την κυτταρική σειρά BxPC-3 ελήφθησαν οι ακόλουθες τιμές CI: 0,4101 (ED50), 0,0112 (ED75) και 0,0003 (ED90). Για την κυτταρική γραμμή ΜΙΑ PaCa-2 οι τιμές CI ήταν 0,02052 (ED50), 0,0295 (ED75) και 0,0440 (ED95). Τα αποτελέσματα πρότειναν ότι CI GDC0941 και AZD6244 εργαστεί συνεργικά για να παραχθεί μία αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση στις κυτταρικές γραμμές ΜΙΑ PaCa-2 BxPC-3 και (Σχήμα 2Α-Β).

BxPC-3 (Α) και ΜΙΑ κύτταρα PaCa-2 (Β) υποβλήθηκαν σε αγωγή με GDC0941 μόνο, AZD6244 μόνος ή GDC0941-AZD6244 σε συνδυασμό. Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν σύμφωνα με τη μέθοδο Chou-Talalay [18]. Οι τιμές του δείκτη συνδυασμού (CI) υπολογίστηκαν με τη χρήση λογισμικού CalcuSyn. PANC-1 (C) και κυτταρική γραμμή Capan-2 (D) υποβλήθηκαν σε αγωγή με GDC0941 στα 400 nm, AZD6244 στα 200 nm ή συνδυασμό. * Τιμή p & lt?. 0.05 σε σύγκριση με τον έλεγχο ή μόνο παράγοντα και μόνο

Η

Είναι ενδιαφέρον ότι, ενώ GDC0941 ή AZD6244 μόνη της δεν επηρέασε PANC-1 και την ανάπτυξη Capan-2 κυττάρων, η χορήγηση αυτών των δύο φαρμάκων σε συνδυασμό ήπια ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων. Η ανάπτυξη των κυττάρων μειώθηκε σε 71,4% και 67,0% στις κυτταρικές γραμμές PANC-1 και Capan-2, αντίστοιχα, μετά τη χορήγηση των φαρμάκων σε συνδυασμό (ρ & lt? 0,05, συνδυασμό σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα ομάδα ή απλός παράγων μόνο) (Σχήμα 2C- D).

Ταυτόχρονη ΡΙ3Κ και η αναστολή της ΜΕΚ επάγει απόπτωση των κυττάρων του καρκίνου του παγκρέατος γραμμές

in vitro

η

Για να προσδιοριστεί η αποπτωτική δράση της συνδυασμένης θεραπείας, δύο διαφορετικές συγκεντρώσεις GDC0941 και AZD6244 χρησιμοποιήθηκαν μόνα και σε συνδυασμό. Ενώ το ποσοστό απόπτωσης του BxPC-3 κύτταρα κατά την έναρξη ήταν 17,0%, αυξήθηκε σημαντικά σε 34,0% και 47,8% μετά από χορήγηση του GDC0941 στα 380 nm και 1520 ηΜ συγκεντρώσεις, αντίστοιχα (ρ & lt? 0,05, GDC0941 μόνος vs. χωρίς θεραπεία ομάδα). AZD6244 μόνη της στα 600 nm και 2.400 nM αύξησε το ποσοστό απόπτωσης των BxPC-3 κύτταρα σε 26,5% και 27,2%, αντίστοιχα (p & lt? 0,05, AZD6244 μόνη vs χωρίς θεραπεία ομάδα). Ένας συνδυασμός GDC0941 και AZD6244 οδήγησε σε πολύ υψηλότερο ποσοστό απόπτωσης σε BxPC-3 κύτταρα σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου ή αναστολέα μόνο. Ο συνδυασμός των GDC0941 στα 380 nm και AZD6244 σε 600 nm ή τον συνδυασμό του GDC0941 σε 1520 ηΜ και AZD6244 σε 2400 ηΜ αύξησε το ποσοστό απόπτωσης BxPC-3 κύτταρα σε 63,3% και 82,8% αντίστοιχα (ρ & lt? 0,05, συνδυασμός vs. χωρίς θεραπεία ομάδα ή απλός παράγων μόνο) (Σχήμα 3Α). Ο ρυθμός της απόπτωσης κατά την έναρξη σε κύτταρα ΜΙΑ PaCa-2 ήταν 8,0%, και ανήλθε σε 17,4% και 24,7% με GDC0941 χορηγηθούν στα 400 nm και 1600 ηΜ συγκεντρώσεις, αντίστοιχα (ρ & lt? 0,05, GDC0941 μόνος vs. χωρίς θεραπεία ομάδα). AZD6244 μόνη της στα 200 nm ή 800 nM αύξησε το ποσοστό απόπτωσης σε 22,7% και 36,9%, αντίστοιχα (p & lt? 0,05, AZD6244 μόνος εναντίον χωρίς θεραπεία ομάδα). Ο συνδυασμός των GDC0941 στα 400 nm και AZD6244 στα 200 nm ή τον συνδυασμό του GDC0941 σε 1600 ηΜ και AZD6244 στα 800 nm αύξησε το ποσοστό απόπτωσης ΜΙΑ PaCa-2 για να 49,5% και 55,6%, αντίστοιχα, και αυτό ήταν μία στατιστικά σημαντική διαφορά σε σύγκριση προς την ομάδα άνευ αγωγής ή απλός παράγων μόνο (ρ & lt? 0,05) (Σχήμα 3Β). Για ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές PANC-1 και Capan-2, ενώ ούτε παράγοντα μόνο είχε σημαντικό αντίκτυπο στην απόπτωση, ο συνδυασμός του αναστολέα της ΡΙ3Κ και ΜΕΚ είχε ως αποτέλεσμα έναν ρυθμό απόπτωσης του 31,8% σε κύτταρα PANC-1? αυτό ήταν στατιστικά σημαντική σε σύγκριση με το ποσοστό απόπτωσης 14,0% σε αυτά τα κύτταρα χωρίς θεραπεία ή με ένα μόνο αναστολέα (ρ & lt? 0,05) (Σχήμα 3C). Συνδυάζοντας GDC0941 και AZD6244 επίσης αύξησε σημαντικά το ποσοστό απόπτωσης σε κύτταρα Capan-2 για να 41,3%, σε σύγκριση με 12,2% χωρίς θεραπεία ή με απλού παράγοντα μόνο (ρ & lt? 0,05). (Σχήμα 3D)

Ο καρκίνος του παγκρέατος κύτταρο γραμμές υποβλήθηκαν σε θεραπεία με GDC0941 μόνο, AZD6244 μόνος ή GDC0941-AZD6244 σε συνδυασμό για 72 ώρες. Κυτταρικής απόπτωσης ανιχνεύθηκε με κυτταρομετρία ροής. Α, Β: συνδυασμοί vs. χωρίς θεραπεία ομάδες (* ρ τιμές & lt? 0,05), οι συνδυασμοί έναντι απλούς παράγοντες (* ρ τιμές & lt? 0,05), απλούς παράγοντες εναντίον μη επεξεργασμένα ομάδες (* ρ τιμές & lt? 0,05). C, D: συνδυασμοί vs. χωρίς θεραπεία ομάδες (* ρ τιμή & lt? 0,05) και συνδυασμούς εναντίον απλούς παράγοντες (* ρ τιμή & lt? 0,05)

Η

Επιδράσεις της ΡΙ3Κ και ΜΕΚ αναστολές σε κυτταρική σηματοδότηση.

για να εκτιμηθεί η επίδραση των δύο φαρμάκων σε κατάντη δράστες των οδών ΡΙ3Κ και ΜΕΚ, χρησιμοποιήσαμε ανάλυση Western blot να παρατηρήσει συνολική έκφραση της πρωτεΐνης και την κατάσταση φωσφορυλίωσης. Τα συνολικά επίπεδα πρωτεΐνης ERK, S6 και 4Ε-ΒΡ1 παρέμεινε αμετάβλητη μετά από θεραπεία με GDC0941 και AZD6244 σε κάθε κυτταρικές σειρές (Σχήμα 4). ρ-ERK, ρ-S6 και ρ-4E-BP1 φάνηκε να κατασταλεί με θεραπεία συνδυασμού GDC0941 και AZD6244. Ωστόσο, παρατηρούνται αλλαγές στο ΑΚΤ έκφραση ακόλουθες επεξεργασίες συνδυασμού φαρμάκων και πυκνομετρική ανάλυση χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση των επιπέδων έκφρασης. Χρησιμοποιήσαμε την αναλογία του p-ΑΚΤ /ΑΚΤ που παράγεται από κάθε δόση για σύγκριση. Μετά ρ-ΑΚΤ /επίπεδα ΑΚΤ ομάδων θεραπείας κανονικοποιήθηκαν προς την αναλογία του μη επεξεργασμένου ομάδα, η θεραπεία συνδυασμού παρατηρήθηκε για την καταστολή ρ-ΑΚΤ επίπεδα κατά 90% την κυτταρική γραμμή BxPC-3, κατά 6% στην MIAPaCa-2 κυτταρική γραμμή, κατά 29% την κυτταρική γραμμή PANC-1, και κατά 8% την κυτταρική γραμμή Capan-2. Ο συνδυασμός των δύο φαρμάκων μειώνεται ρ-ΕΚΚ (Τ202 /Y204), ρ-ΑΚΤ (S473), ρ-S6 (S240 /244) και ρ-4E-BP1 (S65) έκφραση σε σύγκριση με την αρχική τιμή σε όλες τις κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν. Ενώ τα επίπεδα ρ-ΑΚΤ και ρ-ERK εκφράστηκαν διαφορικά στις τέσσερις κυτταρικές γραμμές, η μελέτη μας έδειξε ότι τα επίπεδα βασικής γραμμής του ρ-ΑΚΤ δεν προέβλεψαν απόκριση στον αναστολέα ΡΙ3Κ, ούτε αρχικά επίπεδα ρ-ΕΚΚ προβλέπουν απόκριση στο ΜΕΚ αναστολέα.

Και οι τέσσερις παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές υποβλήθηκαν σε θεραπεία με το GDC0941-AZD6244 συνδυασμού για 24 ώρες, κυτταρολύματα στη συνέχεια συλλέχθηκαν για την ανίχνευση ρ-ΑΚΤ (S473) /ΑΚΤ, ρ-ΕΚΚ (Τ202 /Y204) /ERK, π-S6 (S240 /244) /S6 και p-4E-BP1 (S65) /4E-BP1.

η

Για να κατανοήσουμε τις φαινοτυπικές διαφορές δει στην ΜΙΑ PaCa-2 (ευαίσθητο να GDC0491 και AZD6244) και PANC-1 (ανθεκτικό σε κυτταρικές γραμμές, οι οποίες φιλοξενούν τη μετάλλαξη KRAS GDC0491 και AZD6244), εξετάσαμε τις διαφορές στην κατάντη επενεργητές τους ακόλουθους GDC0941 και χορήγηση AZD6244 (Σχήμα 5). Σε αμφότερες τις κυτταρικές γραμμές, GDC0941 κατέστειλε φωσφορυλίωση του ΑΚΤ, AZD6244 μειωμένα επίπεδα ρ-ΕΚΚ, και ο συνδυασμός των δύο φαρμάκων καταστέλλεται τόσο π-ΑΚΤ και τα επίπεδα ρ-ΕΚΚ. GDC0941 και AZD6244 είχαν παρόμοια επίδραση στην ΑΚΤ και ERK στις δύο κυτταρικές σειρές. Είναι ενδιαφέρον, ο αντίκτυπος από τις δύο αναστολέων επί π-S6 και τα επίπεδα ρ-4E-BP1 ήταν, εναλλακτικά, κυτταρική σειρά ειδικών. Για παράδειγμα, GDC0941 και AZD6244 μόνο και σε συνδυασμό ανέστειλε σημαντικά ρ-S6 και τα επίπεδα ρ-4E-BP1expression σε κύτταρα ΜΙΑ PaCa-2, σε σύγκριση με την ελάχιστη καταστολή που παρατηρείται σε PANC-1 κύτταρα (Σχήμα 5). Ούτε GDC0941 ούτε AZD6244 μόνη κατέστειλε ρ-S6 και ρ-4E-ΒΡ1 σε PANC-1 κύτταρα, υποδηλώνοντας ότι και οι δύο τελεστές μπορούν να χρησιμεύσουν ως βιοδείκτες που σχετίζονται με ανταπόκριση στη θεραπεία. Τα επίπεδα έκφρασης του ρ-S6 και ρ- 4Ε-ΒΡ1 σημαντικά κατασταλεί από τη θεραπεία συνδυασμού σε κύτταρα ΜΙΑ PaCa-2, και αυτό ήταν σύμφωνο με φαινοτυπικές αποκρίσεις του κυττάρου γραμμής προς τη συνδυαστική θεραπεία.

Τόσο ΜΙΑ PaCa -2 και PANC-1 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 400 nm GDC0941, 200 ηΜ AZD6244 ή ενός συνδυασμού σε αυτές τις δόσεις για 24 ώρες. πρωτεΐνες των κυττάρων στη συνέχεια συλλέχθηκαν για την ανίχνευση ρ-ΑΚΤ (S473) /ΑΚΤ, ρ-ΕΚΚ (Τ202 /Y204) /ERK, ρ-S6 (S240 /244) /S6 και ρ-4E-BP1 (S65) /4E-BP -1.

η Επιδράσεις

Anti-όγκου των PI3K και ΜΕΚ αναστολές

in vivo.

η

για να ανιχνεύσει την επίδραση της GDC0941 και AZD6244 στην αύξηση του όγκου

in vivo

, χρησιμοποιήσαμε GDC0941, AZD6244, και ένας συνδυασμός GDC0941and AZD6244 για τη θεραπεία ποντικούς BxPC-3 ξενομοσχεύματος για 18 ημέρες. Σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (όχημα), οι όγκοι του όγκου μειώθηκε σημαντικά στις ομάδες AZD6244 και συνδυασμού (ρ = 0,037 και ρ = 0,032, αντίστοιχα), αλλά όχι στην GDC0941group σε σύγκριση με τον έλεγχο (Σχήμα 6Α). Με βάση τις καμπύλες Kaplan-Meier (Σχήμα 6Β), υπήρξε μια στατιστικά διαφορά σημασία στην επιβίωση μεταξύ των τεσσάρων ομάδων (ρ = 0,005)

Α:. 1 × 10

6 BxPC-3 καρκίνου του παγκρέατος κύτταρα εγχύθηκαν υποδορίως στο δεξί πλευρό θηλυκών γυμνών ποντικών. Οι ποντικοί έλαβαν έκδοχο (0,5% μεθυλοκυτταρίνη /0.2% Tween-20), 50 mg /kg GDC0941 QD, 25 mg /kg AZD6244 BID, ή 50 mg /kg GDC0941 QD συν 25 mg /kg AZD6244 BID το στόμα για 18 ημέρες. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SE. * Ρ τιμές προσδιορίστηκαν με μη ζευγαρωμένο t-test. Β:. Kaplan-Meier καμπύλες επιβίωσης των ξενομοσχευμάτων παραλαβή του οχήματος, GDC0941 μόνο, AZD6244 μόνο και GDC0941-AZD6244 σε συνδυασμό

Η

Συζήτηση

Αν και στοχευμένη θεραπεία έχει γίνει μια επικρατούσα προσέγγιση για τον καρκίνο θεραπεία, η κλινική ανάπτυξη στοχευμένων παραγόντων σε καρκίνο του παγκρέατος δεν ήταν επιτυχής. Λόγω της υψηλής συχνότητας του KRAS μεταλλάξεις στον καρκίνο του παγκρέατος, KRAS έχει στοχεύουν άμεσα σε προ-κλινικές και κλινικές δοκιμές, αλλά τα αποτελέσματα ήταν απογοητευτικά. Υπό το πρίσμα αυτών των προκλήσεων, οι ερευνητικές προσπάθειες έχουν εστιάσει εκ νέου στη στόχευση των κατάντη οδούς KRAS, PI3K και ΜΕΚ. Το όφελος από τον αποκλεισμό ενός ατόμου μονοπάτι έχει σε μεγάλο βαθμό περιορίζεται από την παρουσία της αντισταθμιστικής βρόχου ανάδρασης μεταξύ της PI3K και ΜΕΚ. Για παράδειγμα, η αναστολή της ΜΕΚ οδού έχει ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση της οδού ΡΙ3Κ [11], και η ενεργοποίηση ΡΙ3Κ μεσολαβεί η αντίσταση στην αναστολή της ΜΕΚ [22]. Για να παρακαμφθεί αυτή η αντισταθμιστική ανάδρασης, ταυτόχρονη αποκλεισμό των δύο οδών έχει δοκιμαστεί, και συνέργεια σε αποτελέσματα κατά των όγκων ανιχνεύθηκε, παρέχοντας το σκεπτικό για τη φάση Ι των κλινικών δοκιμών. Επιπλέον, τα πρώτα σημάδια της κλινικό όφελος έχουν αναφερθεί σε προχωρημένο καρκίνο από μια αναδρομική ανάλυση σε ασθενείς που λαμβάνουν παράγοντες που στοχεύουν τις δύο οδούς [23].

Σε αντίθεση με εργαστούν σε άλλους τύπους όγκων, προκλινική αξιολόγηση της προς τα κάτω ρύθμιση τόσο οι πορείες σε καρκίνο του παγκρέατος έχουν περιοριστεί [19,24]. Η μελέτη μας είναι σημαντική από πολλές απόψεις. Πρώτον, έχουμε έδειξε ότι η ευαισθησία του παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές προς την κατεύθυνση είτε της ΡΙ3Κ ή ΜΕΚ αναστολείς δεν είναι KRAS εξαρτάται. Ενώ διαφέρουν ως προς την κατάσταση KRAS, BxPC-3 και ΜΙΑ PaCa-2 κύτταρα έχουν άγριου τύπου PI3K και PTEN, και οι δύο ήταν ευαίσθητα σε δύο αναστολείς, η οποία είναι συνεπής με παλαιότερα δημοσιευμένες εκθέσεις [22,25]. Δεύτερον, η μελέτη μας έδειξε ότι η ΡΙ3Κ και ΜΕΚ αναστολή είτε μόνες είτε σε συνδυασμό μπορεί να επάγει απόπτωση. Στο παρελθόν, τα φάρμακα που στοχεύουν ΡΙ3Κ ή ΜΕΚ θεωρήθηκαν για να έχουν περισσότερο από ένα κυτταροστατική δράση, αλλά πρόσφατη αναφορά υποδεικνύει ότι η επίδραση αυτή είναι αποπτωτικά [26] Τρίτον, η μελέτη μας έδειξε συνέργεια στην καταστολή της ανάπτυξης κυττάρου και διέγερση απόπτωσης σε δύο ευαίσθητα κυτταρικές γραμμές (BxPC-3 και ΜΙΑ PaCa-2) με το σχήμα συνδυασμού. Επιπλέον, η ήπια αναστολή στην ανάπτυξη των κυττάρων και την επαγωγή απόπτωσης παρατηρήθηκαν με τον συνδυασμό φαρμάκων σε ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές (PANC-1 και Capan-2). Παρά το γεγονός ότι ο βαθμός όφελος από τη θεραπεία συνδυασμού ήταν μέτρια και για τις δύο ανθεκτικές κυτταρικές σειρές, περαιτέρω κατανόηση του οφέλους αυτού δικαιολογείται για αυτή την καταστροφική ασθένεια. Η μελέτη μας υποστηρίζει μια παρόμοια προκλινική μελέτη για τον καρκίνο του παγκρέατος η οποία έδειξε ότι το όφελος της θεραπείας ενός αναστολέα της ΜΕΚ ενισχύθηκε με έναν αναστολέα ΑΚΤ [24].

Ένα κρίσιμο στοιχείο της στοχευμένη ανάπτυξη θεραπείας είναι να καθορίσει μοριακούς δείκτες που προβλέπουν η ανταπόκριση στη θεραπεία. Οι μεταβολές μονοπάτι ΡΙ3Κ συμπεριλαμβανομένων HER2 ενίσχυση, οι μεταλλάξεις PI3KCA ή απώλεια του ΡΤΕΝ έχουν βρεθεί να σχετίζονται με την ευαισθησία να GDC0941 στον καρκίνο του μαστού κυτταρικές γραμμές

in vitro

και

in vivo

[27]? Ωστόσο, οι παραπάνω γενετικές εναλλαγές σπάνια υπάρχουν σε όγκους του παγκρέατος [21]. Η μελέτη μας δείχνει ότι οι μεταγενέστεροι π-ΑΚΤ καταστέλλεται από GDC0941 δεν προβλέπουν την ευαισθησία των κυττάρων, ούτε μειωτικά p-ERK προβλέψουμε την ευαισθησία στην AZD6244. Αυτή η παρατήρηση είναι σύμφωνη με προηγούμενες αναφορές [27].

Για την περαιτέρω κατανόηση των μοριακών γεγονότων που συμβαίνουν μετά την ταυτόχρονη αποκλεισμό στις δύο KRAS μεταλλαγμένο κυτταρικές σειρές, συγκρίναμε την έκφραση της πρωτεΐνης στο PANC-1 (ανθεκτικό) και ΜΙΑ PaCa- 2 (ευαίσθητο) κυτταρικές σειρές. Αυτές οι δύο κυτταρικές σειρές διαφέρουν στην φαινοτυπική απάντησή τους αναστολείς PI3K και ERK, παρά την υπόθαλψη παρόμοιες μεγάλες γενετικές εναλλαγές. Και οι δύο κυτταρικές σειρές που αναφέρθηκαν να περιέχουν μεταλλάξεις KRAS, μεταλλάξεις ρ53, αγρίου τύπου Ρ16 και άγριου τύπου DPC-4 [21]. Ενώ στη μελέτη μας αποδείξαμε ότι η καταστολή της ρ-ΑΚΤ από τον αναστολέα ΡΙ3Κ και ρ-ΕΚΚ από τον αναστολέα ΜΕΚ επιτεύχθηκαν στις δύο κυτταρικές σειρές, κύτταρα PANC-1 παρουσίασαν μόνο ένα ελάχιστο καταστολή της ρ-S6 και ρ-4E-BP1 όταν αγωγή είτε με την ΡΙ3Κ ή αναστολέας ΜΕΚ μόνο. Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι οι αναστολείς της ΡΙ3Κ ή ΜΕΚ μόνο είναι σε θέση να καταστείλουν την άμεση αντίστοιχη κατάντη μεσολαβητών (ΑΚΤ και ERK) τους σε PANC-1 κύτταρα, αλλά δεν είναι σε θέση να ρυθμίζουν προς τα κάτω τις περαιτέρω κατάντη μεσολαβητών (π-S6 και ρ-4E-BP1 ). Και οι δύο δείκτες, ως εκ τούτου, συνδέονται στενά με την ευαισθησία στους δύο αναστολείς PI3K και ΜΕΚ. Σε ένα πολύπλοκο δίκτυο σηματοδότησης, η ικανότητα ενός παράγοντα στόχο να αναστέλλει τη διαδικασία φωσφορυλίωσης της κατάντη στόχους της συχνά δεν μεταφράζεται σε φαινοτυπικές αλλαγές. Για παράδειγμα, Serra et al ανέφεραν την ταυτοποίηση μερικών γονιδίων η οποία μπορεί να προάγουν την κυτταρική επιβίωση στα πλαίσια του αποκλεισμού ΡΙ3Κ, και μεταξύ αυτών των γονιδίων, ριβοσωμική S6 κινάσες RPS6KA2 (RSK3) και RPS6KA6 (RSK4) είναι που επικυρώνεται περαιτέρω για τη συμβολή αντίσταση ΡΙ3Κ

in vitro

και

in vivo

μέσω εξασθένησης της αποπτωτικής διαδικασίας και προς τα πάνω ρύθμιση της πρωτεΐνης μετάφραση [28]. Η παρατήρησή μας αντηχεί με τις αναδυόμενες ενδείξεις ότι οι μεταγενέστεροι cap-εξαρτώμενη μετάφραση μπορεί να είναι ένας καλύτερος δείκτης απάντηση σε αυτές τις στοχευμένες παράγοντες [29,30].

4E-BP1 παίζει σημαντικό ρόλο στο καπάκι-εξαρτώμενη μετάφραση. Θα συνδέεται με το συγκρότημα πώματος elF4E-mRNA για την αναστολή cap-εξαρτώμενη μετάφραση και φωσφορυλιωμένη 4E-BP1 στη συνέχεια πέφτει έξω από το συγκρότημα της μετάφρασης, έτσι την έναρξη της μετάφρασης μπορεί να ξεκινήσει [31]. mTORC1, ένας τελεστής κατάντη της οδού PI3K, μπορεί να φωσφορυλιώνει 4E-BP1 να κινήσει τη διαδικασία της μετάφρασης [32]. Ο κρίσιμος ρόλος της 4Ε-BP1 ως βασικό τελεστή των οδών ΑΚΤ και σηματοδότησης ERK σε όγκους έχει κομψά μελετηθεί από Εκείνη et al [29]. Επιπλέον, υψηλά επίπεδα έκφρασης του 4Ε-ΒΡ1 έχουν βρεθεί να έχουν προγνωστική αξία σε διάφορους τύπους όγκων [33-37]. Ως εκ τούτου, η περαιτέρω διερεύνηση της στόχευσης 4E-BP1 θα πρέπει να διερευνηθούν στο μέλλον για πολλούς τύπους καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου, και ιδιαίτερα, του καρκίνου του παγκρέατος.

Εν ολίγοις, έχουμε διερευνήσει το πλεονέκτημα της ταυτόχρονης αποκλεισμό της οδού από την PI3K και ΜΕΚ αναστολείς μόνο και σε συνδυασμό για τον καρκίνο του παγκρέατος. Συνέργεια στη μείωση της κυτταρικής ανάπτυξης παρατηρήθηκε και τα αποτελέσματα δεν ήταν KRAS εξαρτάται. Επίμονη φωσφορυλίωση S6 και 4Ε-ΒΡ1 φάνηκε να σχετίζονται με την αντίσταση στους αναστολείς ΡΙ3Κ και ΜΕΚ. Οι μελλοντικές έρευνες για τις εναλλακτικούς μηχανισμούς της φωσφορυλίωσης 4Ε-BP1 και στόχευση της 4Ε-BP1 στον καρκίνο του παγκρέατος δικαιολογημένη.