Αφηρημένο

Ιστορικό

καρκίνωμα Clear κυττάρων νεφρικών κυττάρων (ccRCC) είναι ο πιο κοινός τύπος καρκίνου του νεφρού. Μία από τις διεργασίες διαταραχθεί σε αυτόν τον τύπο καρκίνου είναι εναλλακτικό μάτισμα, αν και τα φαινόμενα που υπόκεινται σε αυτές τις διαταραχές παραμένουν άγνωστα. Το εναλλακτικό μάτισμα αποτελείται από επιλεκτική αφαίρεση ιντρονίων και σύνδεση υπολειμματικής εξώνια του πρωτογενούς μεταγράφου, για την παραγωγή μορίων mRNA των διαφορετική αλληλουχία. εκτροπές Συγκόλληση μπορεί να οδηγήσει σε καρκινική μεταμόρφωση λόγω σύνθεση εξασθενημένη παραλλαγών ματίσματος με ογκογόνο δυναμικό. Σε αυτή την εργασία υποθέσαμε ότι διαταράσσεται εναλλακτικό μάτισμα σε ccRCC μπορεί να προκύψουν από ακατάλληλη έκφραση των παραγόντων ματίσματος, οι μεσολαβητές των αντιδράσεων μάτισμα.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Χρησιμοποιώντας πραγματικό χρόνο PCR και Western κηλίδας ανάλυση αναλύσαμε την έκφραση των επτά παράγοντες ματίσματος που ανήκουν σε SR οικογένεια πρωτεϊνών (SF2 /ASF, SC35, SRp20, SRp75, SRp40, SRp55 και 9G8), και ένα μη-SR παράγοντα, hnRNP Α1 (ετερογενής ριβονουκλεοπρωτεΐνης Α1 πυρηνικών) σε 38 ζεύγη δείγματα ccRCC όγκου ελέγχου. Επιπλέον, αναλύσαμε τα πρότυπα ματίσματος πέντε γονιδίων που εμπλέκονται στην καρκινογένεση και εν μέρει ρυθμίζεται από αναλύονται παράγοντες ματίσματος:. RON, λειτουργίας του CEACAM1, Rac1, κασπάσης-9, και GLI1

Συμπεράσματα /Σημασία

Βρήκαμε ότι η έκφραση του mRNA των παραγόντων ματίσματος διαταράχθηκε σε όγκους σε σύγκριση με αντίστοιχους μάρτυρες, ομοίως όπως τα επίπεδα του SF2 /ASF και πρωτεΐνες hnRNP Α1. Οι συντελεστές συσχέτισης μεταξύ των επιπέδων έκφρασης των ειδικών παραγόντων ματίσματος αυξήθηκαν σε δείγματα όγκων. Επιπλέον, εναλλακτικό μάτισμα του πέντε ανάλυσης των γονιδίων επίσης διαταραχθεί σε ccRCC δείγματα και μάτισμα μοτίβο των δύο από αυτούς, κασπάση-9 και λειτουργίας του CEACAM1 συσχετίζεται με την έκφραση του SF2 /ASF σε όγκους. Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η διαταραγμένη έκφραση των παραγόντων ματίσματος σε ccRCC μπορεί ενδεχομένως να οδηγήσει σε εξασθενημένη εναλλακτικό μάτισμα των γονιδίων που ρυθμίζουν την ανάπτυξη του όγκου και με αυτό τον τρόπο να συμβάλει στη διαδικασία της καρκινογένεσης

Παράθεση:. Piekielko-Witkowska Α, Wiszomirska Η, Wojcicka Α , Poplawski Ρ, Boguslawska J, Tanski Ζ, et al. (2010) Διαταραχή έκφραση παραγόντων Συγκόλληση στον Καρκίνο των νεφρών επηρεάζει εναλλακτικό μάτισμα των Ρυθμιστικών Αρχών απόπτωση, ογκογονίδια, και καταστολείς όγκων. PLoS ONE 5 (10): e13690. doi: 10.1371 /journal.pone.0013690

Επιμέλεια: Juan Valcarcel, Centre de Regulació Genòmica, Ισπανία

Ελήφθη: 30, Ιουνίου, 2010? Αποδεκτές: 7η Οκτωβρίου, 2010? Δημοσιεύθηκε: 27 του Οκτώβρη 2010

Copyright: © 2010 Piekielko-Witkowska et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Το έργο υποστηρίχθηκε από: η πολωνική επιτροπή μέλος Επιστημονικών Ερευνών Επιχορηγήσεις NN401354733 (σε APW) και NN401073636 (σε AN), και το Ιατρικό Κέντρο του Μεταπτυχιακή Εκπαίδευση χορηγούν 501-2-25-01 /09 (για να APW). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

νεφροκυτταρικό καρκίνωμα (RCC) είναι η πιο κοινή στερεό βλάβη του νεφρού και αντιπροσωπεύει περίπου 3% όλων των ανθρώπινων κακοηθειών. Κάθε χρόνο στην Ευρώπη είναι περίπου 40 000 νέες περιπτώσεις διαγιγνώσκονται RCC και περίπου 20 000 ασθενείς πεθαίνουν από τη νόσο [1]. Η συντριπτική πλειονότητα (80%) των περιπτώσεων RCC είναι ιστολογικά ταξινομούνται ως καρκινώματα σαφής κύτταρο νεφρικών κυττάρων (ccRCC), προερχόμενο από εγγύς σωληνάρια του νεφρού. Η μοριακή βάση του ccRCC δεν είναι πλήρως κατανοητός. Αν και έχουν προταθεί διάφορες μοριακών δεικτών, κανένας από αυτούς δεν έχει εγκριθεί για κλινική χρήση ρουτίνας [2].

Ένα από τα κυτταρικών διαδικασιών, συχνά διαταράσσεται σε καρκίνους, είναι εναλλακτικό μάτισμα, η διαδικασία επιλεκτική απομάκρυνση ιντρονίων και ενώνει υπολειμματικών εξώνια, στο οποίο παράγονται τα μόρια mRNA των διαφόρων αλληλουχιών. Η ανώμαλη εναλλακτικό μάτισμα μπορεί να οδηγήσει σε καρκινική μεταμόρφωση [3]. Διαταραγμένη εναλλακτικό μάτισμα διαφόρων γονιδίων αναφέρθηκε επίσης σε ccRCC. Για παράδειγμα, στην προηγούμενη εργασία μας βρήκαμε ccRCC ειδικά ισορροπημένη έκφραση των παραλλαγών ματίσματος τύπου 1 iodothyroine deiodinase (DIØ1) [4], [5] και αμετάφραστες περιοχές του υποδοχέα ορμόνης του θυρεοειδούς TRβ1 [6]. Αρκετές άλλες αναφορές που δείχνουν ccRCC-ειδική διαταραχές του εναλλακτικού ματίσματος περιλαμβάνουν μεταβολές στην επεξεργασία mRNA του Mcl-1 [7], TCF-4 [8], survivin [9], και OGG1 [10]. Ασυνήθιστα ματισμένες παραλλαγές των γονιδίων που περιγράφονται παραπάνω είναι σπάνια αποτελέσματα των μεταλλάξεων στα γονίδια που κωδικοποιούν για ματισμένα μεταγραφήματα και οι πηγές των διαταραχών σε εναλλακτικό μάτισμα είναι συνήθως άγνωστη.

Το εναλλακτικό μάτισμα είναι μια περίπλοκη διαδικασία, που περιλαμβάνει έναν σημαντικό αριθμό πρωτεϊνών που περιλαμβάνουν παράγοντες ματίσματος ονομάζεται σερίνη-αργινίνη πρωτεΐνες πλούσιες (SR πρωτεΐνες) [11]. Η οικογένεια των πρωτεϊνών SR αποτελείται από τουλάχιστον είκοσι μέλη της οποίας επτά: SF2 /ASF (που κωδικοποιείται από το γονίδιο: SFRS1), SC35 (γονίδιο: SFRS2), SRp20 (γονίδιο: SFRS3), SRp75 (γονίδιο: SFRS4), SRp40 (γονίδιο : SFRS5), SRp55 (SFRS6) και 9G8 (SFRS7) αποτελούν την ομάδα των «κλασικών» πρωτεΐνες SR. Οι παράγοντες αυτοί δεσμεύονται σε αλληλουχίες ονομάζονται ενισχυτές μάτισμα, που βρίσκεται στα εξόνια (ESES, εξονικούς ενισχυτές splicing) ή σε ιντρόνια (ISEs, ιντρονικές ενισχυτές splicing). Η πρόσδεση των πρωτεϊνών SR να ενισχυτές μάτισμα προάγει έγκλεισης εξωνίου. Η αντίδραση ματίσματος ρυθμίζεται επίσης από έναν μεγάλο αριθμό παραγόντων μη-SR, όπως hnRNPs (ετερογενής πυρηνική ριβονουκλεοπρωτεΐνες) οι οποίες συνδέονται κυρίως με αλληλουχίες των σιγαστήρων ματίσματος και δρουν ως καταστολείς ματίσματος [12]. Έτσι, το τελικό αποτέλεσμα του εναλλακτικού ματίσματος είναι ένα αποτέλεσμα της δράσης συναυλία ανταγωνιστικά δρώντες παράγοντες ματίσματος. Ένα ζευγάρι των παραγόντων ματίσματος που εμφανίζουν απέναντι δραστηριότητες είναι SF2 /ASF (ένα SR πρωτεΐνης) και hnRNP Α1 (ετερογενής πυρηνικής ριβονουκλεοπρωτεΐνης Α1? Μια μη-SR πρωτεΐνη) [13]. Περίσσεια του SF2 /ASF προωθεί εγγύς ‘επιλογή θέσης ματίσματος, ενώ από hnRNP Α1 ευνοεί άπω 5’ 5 θέση ματίσματος. Ειδικά τα μέλη της οικογένειας SR μπορούν επίσης να δρουν ανταγωνιστικά (π.χ. SF2 /ASF και SRp20 [14], ή SF2 /ASF και SC35 [15]). Έτσι, τα σχετικά επίπεδα των ειδικών παραγόντων ματίσματος συμβάλλουν στην ρύθμιση του εναλλακτικού ματίσματος, ειδικό για τον τύπο ιστού και το αναπτυξιακό στάδιο.

Είναι γνωστό ότι διαταραχές στην εναλλακτικό μάτισμα μπορεί να συμβάλλει στην καρκινογένεση λόγω της παραγωγής του όγκου καταστολής ή ογκογόνο παραλλαγές των μεταγραφών γονιδίων, που επηρεάζουν τον πολλαπλασιασμό, κυτταρική κινητικότητα, και την απόπτωση επιδεκτικότητα [16]. Ακατάλληλα συγκολλημένα παραλλαγές μεταγραφής μπορεί επίσης να χρησιμεύσει ως βιοδείκτες όγκων [17]. Το αυξανόμενο σώμα της στοιχεία δείχνουν ότι οι παράγοντες ματίσματος μπορεί να εμπλέκονται άμεσα στη διαδικασία της καρκινογένεσης, που ενεργεί ως πρωτο-ογκογονίδια [18] ή τη ρύθμιση μάτισμα και τη δραστηριότητα των πρωτο-ογκογονιδίων [19], καταστολείς όγκων [18] και οι ρυθμιστικές αρχές απόπτωση [20 ]. Διαταραχές έκφραση των παραγόντων ματίσματος αναφέρθηκε σε διάφορους τύπους καρκίνων [11]. Σε πρόσφατο έγγραφο μας έδειξαν ότι η έκφραση των δύο παραγόντων ματίσματος, SF2 /ASF και hnRNP Α1 έχει διαταραχθεί σε ccRCC [4], αλλά με τις γνώσεις μας, η έκφραση των παραγόντων ματίσματος και μια ομάδα ποτέ δεν είχε αναλυθεί σε ccRCC.

σε αυτή την εργασία υποθέσαμε ότι οι παρατηρούμενες διαταραχές εναλλακτικό μάτισμα σε ccRCC μπορεί να είναι συνέπεια των αλλαγών στην έκφραση των παραγόντων ματίσματος, ειδικότερα, των εκτροπών των ποσοτικών σχέσεων μεταξύ τους. Για την αντιμετώπιση αυτού του προβλήματος, αναλύσαμε την έκφραση των επτά κλασικών παραγόντων ματίσματος: SF2 /ASF, SC35, SRp20, SRp75, SRp40, SRp55, 9G8 και ένας μη-SR παράγοντα, hnRNP Α1. Επιπλέον, για να διερευνήσει τις συνέπειες της διαταραχθεί έκφραση παραγόντων ματίσματος, αναλύσαμε ύπαρξη και έκφραση των μεταγραφημάτων του πέντε γονίδια που εμπλέκονται στην ογκογένεση, που είναι γνωστό ότι συγκολλημένα εναλλακτικά και μερικώς ρυθμίζονται από τις αναλύονται παράγοντες ματίσματος. Βρήκαμε ότι η έκφραση των παραγόντων ματίσματος καθώς και εναλλακτικό μάτισμα που αναλύθηκαν γονίδια διαταραχθεί σε πλειονότητα των δειγμάτων που αναλύθηκαν ιστού. Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η διαταραγμένη έκφραση των παραγόντων ματίσματος σε ccRCC μπορεί ενδεχομένως να οδηγήσει σε εξασθενημένη εναλλακτικό μάτισμα των γονιδίων που ρυθμίζουν την ανάπτυξη του όγκου και συνεπώς συμβάλλουν στην διαδικασία της καρκινογένεσης.

Υλικά και Μέθοδοι

δείγματα ιστών

Τα δείγματα ιστού ελήφθησαν από μονομερή νεφροεκτομές πραγματοποιήθηκε σε ασθενείς με καρκίνο σαφή κυττάρων των νεφρικών κυττάρων (38 ασθενείς) με την άδεια της Επιτροπής Ηθικής του Ανθρώπου Σπουδών (το Ιατρικό Κέντρο του Μεταπτυχιακή Εκπαίδευση). Τα δείγματα χωρίστηκαν σε δύο ομάδες: καρκινικούς ιστούς (n = 38, Τ) και τους ιστούς ελέγχου (ζεύγη φυσιολογικό ιστό από τον αντίθετο πόλο του κακοήθους νεφρού χωρίς ιστολογική ένδειξη όγκου? N = 38, C). Σαφές καρκινικό κύτταρο νεφρικών κυττάρων διαγνώστηκε με ιστολογία σύμφωνα με τα κριτήρια του ΠΟΥ [21]. Οι όγκοι χωρίστηκαν σε τρεις ομάδες, ανάλογα με το βαθμό της διαφοροποίησης:. G1 (καλά διαφοροποιημένο), G2 (ενδιάμεσο βαθμό διαφοροποίησης), G3 (κακώς διαφοροποιημένο καρκίνοι)

RNA απομόνωση

Σύνολο κυτταρικό RNA απομονώθηκε από περίπου 100 mg κατεψυγμένου ιστού χρησιμοποιώντας GeneMATRIX Οικουμενική RNA Καθαρισμός Kit (EURx, Γκντανσκ, Πολωνία), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

Αντίστροφη μεταγραφή

600 ng ολικού RNA μεταγράφηκε αντίστροφα χρησιμοποιώντας RevertAidTM Η Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, Βίλνιους, Λιθουανία) και ολιγο-dT εκκινητές σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Για μετέπειτα ανάλυση PCR χρησιμοποιήθηκε 1 μΐ cDNA. Για πραγματικό χρόνο PCR αντιδράσεις ελήφθη 1 μΐ 5χ αραιωμένου cDNA.

PCR ανάλυση του εναλλακτικού ματίσματος

αντίδραση PCR διεξήχθη επί 1 μΙ 5χ αραιωμένου cDNA χρησιμοποιώντας Perpetual OptiTaq DNA Polymerase θερμής εκκίνησης ( EURx, Γκντανσκ, Πολωνία) υπό συνθήκες 95 ° C, 10 min. (Αρχική μετουσίωση), που ακολουθείται από 35 κύκλους: [95 ° C, 30 s? 58 ° C, 30 s? 72 ° C, 30 s], τελική επιμήκυνση: 61 ° C, 10 min. Ακολουθίες ειδικούς εκκινητές (Πίνακας S1) ελήφθησαν από τα προηγουμένως δημοσιευμένες αναφορές για: RON [19], κασπάση-9 [22], CEACAM-1 [23], Rac1 [24], και GLI1 [25]. Τα προϊόντα PCR ηλεκτροφορήθηκαν σε πήκτωμα αγαρόζης 1-2% που βάφτηκε με βρωμιούχο αιθίδιο.

Real-time PCR

ημι-ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου πραγματοποιήθηκε με τη χρήση LightCycler® 480 DNA SYBR Green Ι Μεταπτυχιακό (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) εις τριπλούν σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Οι αλληλουχίες των εκκινητών φαίνονται στον Πίνακα S2. Προϋποθέσεις για πραγματικού χρόνου PCR ήταν ως ακολούθως: αρχική μετουσίωση: 95 ° C, 10 λεπτά, 45 κύκλοι:. (95 ° C, 15 s, 57 ° C, 15 s? 72 ° C, 15 s)? ακολουθούμενη από ανάλυση καμπύλης τήξης: (95 ° C, 5 λεπτά? 65 ° C, 1 λεπτό? συνεχής ανάγνωση του φθορισμού από 65 ° C έως 97 ° C με ρυθμό κλιμάκωσης 0.11 ° C /s και 5 αποκτήσεις ανά κάθε ° C). Τα αποτελέσματα ήταν ομαλοποιημένη στην έκφραση 18sRNA ξενιστή-γονίδιο

RN18S1

. Η σταθερότητα της έκφρασης του 18sRNA ελέγχθηκε και επιβεβαιώθηκε στην αρχική προ-ανάλυση 32 ζεύγη δειγμάτων ελέγχου και του όγκου σε σύγκριση με την έκφραση ACTB (Σχήμα S1). Οι εκκινητές ACTB δημοσιεύτηκαν αλλού [6].

εκχύλιση πρωτεϊνών και blot ανάλυση Western

Για την ανάλυση Western, ελήφθησαν δώδεκα αντιπροσωπευτικά ζεύγη δειγμάτων όγκου και ελέγχου. Τα δείγματα ιστού ομογενοποιήθηκαν σε ένα ρυθμιστικό που περιέχει 150 mM NaCl, 1% Triton Χ-100, 50 mM Tris-HCl ρΗ 8,0, κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Sigma-Aldrich, Saint Louis, ΜΟ), και 0.5 mM PMSF. Το ομογενοποίημα επωάστηκε με ανακίνηση για 2 ώρες στους 4 ° C και φυγοκεντρήθηκε στις 12.000 rpm για 20 λεπτά, στους 4 ° C. Το ληφθέν υπερκείμενο χρησιμοποιήθηκε για ανάλυση συγκέντρωσης πρωτεΐνης με Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) σύμφωνα με το πρότυπο πρωτόκολλο. Τα εκχυλίσματα πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν σε κλάσματα 30 μΐ και αποθηκεύεται στους -70 ° C.

Για SF2 /ASF κηλίδωση Western, 30 μ§ πρωτεϊνικού εκχυλίσματος επιλύθηκε με 10% SDS-PAGE. Μετά την ηλεκτροφόρηση οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης που στη συνέχεια μπλοκάρει τη διάρκεια της νύχτας στους 8 ° C σε 5% άπαχο γάλα εντός ρυθμιστικού TBS-Τ (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1% Tween-20? ΡΗ 7.6) . Οι μεμβράνες πλύθηκαν τρεις φορές σε ΤΒδ-Τ για 10 λεπτά σε RT, και επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 8 ° C με αντι-SF2 /ASF αντίσωμα αραιωμένο 1 (Cat Νο .: 32 – 4500, Invitrogen, Carlsbad, CA.): 500 σε ρυθμιστικό ΤΒδ-Τ με 5% άπαχο γάλα. Μετά από πλύση 3 φορές για 10 λεπτά με ΤΒδ-Τ, οι μεμβράνες επωάστηκαν για 1 ώρα σε RT με δευτερογενές αντίσωμα αντι-ποντικού συζευγμένο με υπεροξειδάση αρμορακίας κατσίκα (1:10000, DakoCytomation, Glostrup, Denmark), και πλύθηκαν 3 φορές για 10 min με ΤΒδ-Τ.

κηλίδωση Western της hnRNP Α1 έγινε όπως για ανάλυση /ASF SF2 χρησιμοποιώντας 15 μα εκχυλίσματος πρωτεΐνης και αντι-hnRNP Α1 αντίσωμα (αρ. κατ .: ab10685, Abcam plc, Κέμπριτζ, UK).

οι πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν από ένα σύστημα ανίχνευσης ενισχυμένης χημειοφωταύγειας-(SuperSignal West Pico χημειοφωταύγειας Substrate, Pierce Biotechnology, Rockford, IL) σύμφωνα με πρότυπες διαδικασίες. Ακολούθως, οι μεμβράνες απογυμνώθηκαν, μπλοκάρει και επωάστηκαν με αντι-β-ακτίνης αντίσωμα (αρ. Κατ. Ab6276, Abcam plc, Cambridge, UK) αραιωμένο σε ρυθμιστικό 1:10000 ΤΒδ-Τ για 1 ώρα σε RT, πλύθηκαν τρεις φορές σε ρυθμιστικό ΤΒδ-Τ και περαιτέρω επεξεργασία όπως περιγράφεται για τη διαδικασία SF2 /ASF.

Η ποσότητα της συγκεκριμένης πρωτεΐνης εκτιμήθηκε πυκνομετρικώς μετά από κανονικοποίηση προς την έκφραση του β-ακτίνης.

Πρόβλεψη του παράγοντα ματίσματος μοτίβα πρόσδεσης

Ανάλυση της λειτουργίας του CEACAM1 εξόνιο 7 ακολουθίας έγινε με το λογισμικό ESE finder [26]. Για την πρόβλεψη των θέσεων δέσμευσης SF2 /ASF, χρησιμοποιήθηκαν δύο μήτρες: «SF2 /ASF /IgM-BRCA1» και «SF2 /ASF». Αυτές οι δύο μήτρες προέκυψαν σε διαφορετικό πλαίσιο (διαφορετικό μικρογονίδια και το μέγεθος των τυχαίων βιβλιοθηκών αλληλουχίας σε SELEX [27]). Τα κατώτατα όρια που χρησιμοποιούνται για την πρόβλεψη ήταν: 1.956 (SF2 /ASF), 1.867 (SF2 /ASF /IgM-BRCA1), 2.383 (SC35), 2.670 (SRP40) και 2.676 (SRp55). Η αλληλουχία του εξονίου 7 προήλθε από λειτουργίας του CEACAM1 παραλλαγή μεταγραφής 1 (Acc. Νο. NM_001712.3).

Στατιστική ανάλυση

Η δοκιμή Shapiro-Wilk χρησιμοποιήθηκε για να καθοριστεί κανονικότητα της κατανομής των δεδομένων. Κανονικά κατανεμημένα δεδομένα αναλύθηκαν με paired t-test και μη παραμετρικά δεδομένα με Wilcoxon συμφωνημένα δοκιμή ζεύγη.

p & lt?

0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. Οπτικοποίηση του πίνακα συσχέτισης έγινε χρησιμοποιώντας corrplot στην πλατφόρμα R [28].

Αποτελέσματα

Η έκφραση του mRNA των παραγόντων ματίσματος έχει διαταραχθεί σε τουλάχιστον το ήμισυ των δειγμάτων ccRCC

Συγκόλληση παράγοντες που ανήκουν στην ομάδα των πρωτεϊνών SR περιλαμβάνουν ένα μεγάλο αριθμό δομικά και λειτουργικά σχετικές πρωτεΐνες [11]. Στη μελέτη μας επικεντρώθηκε στην ομάδα των «κλασικών» SR πρωτεΐνες, δηλαδή SF2 /ASF (που κωδικοποιείται από το γονίδιο: SFRS1), SC35 (SFRS2), Sp20 (SFRS3), SRp75 (SFRS4), SRp40 (SFRS5), SRp55 (SFRS6 ) και 9G8 (SFRS7). Αναλύσαμε επίσης την έκφραση ενός μη-SR παράγοντας ματίσματος, hnRNP Α1 που γενικά πιστεύεται ότι δρα ως ανταγωνιστής των πρωτεϊνών SR.

Χρησιμοποιώντας PCR πραγματικού χρόνου βρήκαμε ότι το πρότυπο έκφρασης των παραγόντων ματίσματος διέφερε μεταξύ μεμονωμένων ασθενών, καθώς και μεταξύ των δειγμάτων ελέγχου και του όγκου σε ένα συγκεκριμένο ασθενή. mRNA έκφραση όλων των παραγόντων που αναλύθηκαν ματίσματος διαταράχθηκε σε περίπου 50-60% (ανάλογα με το συντελεστή μάτισμα αναλύθηκαν) των δειγμάτων όγκου σε σύγκριση με συζευγμένες φυσιολογικούς ιστούς (Εικ. 1). Αυτές οι αλλαγές της έκφρασης οφείλονταν σε υποβαθμίσουν τα ή προς τα άνω ρύθμιση των γονιδίων και αναλύθηκαν μας επέτρεψε να διαιρέσει όλα τα δείγματα όγκων σε τρεις πισίνες: D, U, και Ν στην οποία η έκφραση των γονιδίων ήταν μειωτικά, ρυθμίζεται αυξητικά ή δεν έχει αλλάξει, αντίστοιχα. Η κατεύθυνση των αλλαγών δεν συσχετίζονται με το βαθμό του όγκου της διαφοροποίησης (Εικ. 1Α).

Α. Αλλαγές στην έκφραση συγκεκριμένων ζευγών δειγμάτων ελέγχου και των όγκων. Το διάγραμμα έγινε με βάση τα δεδομένα από πραγματικού χρόνου PCR ανάλυση (Εικόνα S2). Χρώματα αντιπροσωπεύουν ποσοστό έκφρασης μεταξύ των δειγμάτων ελέγχου και των όγκων. Πράσινο: ρύθμιση προς τα κάτω σε δείγματα όγκων. Κόκκινο: ρύθμιση προς τα πάνω σε δείγματα όγκων. Λευκό: καμία διαφορά στα επίπεδα έκφρασης. διαβάθμιση όγκου (G1, G2, G3) παρουσιάζεται. Β Κατανομή των αλλαγών στην έκφραση του mRNA των παραγόντων ματίσματος. D: ομάδα δειγμάτων με ογκο-ειδικών μειορύθμιση της έκφρασης? U: ομάδα δειγμάτων με ογκο-ειδικών προς τα πάνω ρύθμιση της έκφρασης? Ν: Η ομάδα των δειγμάτων που δεν διαφέρουν στην έκφραση μεταξύ των δειγμάτων ελέγχου και των όγκων. Το όριο του 30% διαφορά σε έκφραση μεταξύ των δειγμάτων ελέγχου και όγκου χρησιμοποιούνται για την ταξινόμηση των δειγμάτων.

Η

Ο αριθμός των δειγμάτων σε κάθε ομάδα ποίκιλε από η = 8 για D και η = 14 για U (για hnRNP Α1) έως η = 17 για D και η = 4 για U (για SRp40) (Εικ. 2). Για την πλειοψηφία των δειγμάτων με αλλοιωμένη έκφραση, πισίνα D ήταν το πιο άφθονο (34-45% του συνόλου των δειγμάτων που αναλύθηκαν). Η μόνη εξαίρεση ήταν η έκφραση της hnRNP Α1 που ήταν προς τα κάτω σε μόνο το 21% των δειγμάτων και υπερεκφράζεται σε 37% του συνόλου των δειγμάτων που αναλύθηκαν. Αρνητική ρύθμιση των γονιδίων σε πισίνες D που κυμαινόταν από 1,9 φορές (SRp20) έως 2,6 φορές (SC35 SRp75 ad), σε σύγκριση με τα δείγματα ελέγχου. Γονίδια σε πισίνες U ήταν ρυθμισμένη προς τα πάνω από 1,4 φορές (9G8) σε 2,4 φορές (SF2 /ASF), σε σύγκριση με τα δείγματα ελέγχου

Η έκφραση του κάθε παράγοντα ματίσματος εμφανίζεται σε δύο ομάδες δειγμάτων:. Με όγκου-ειδικά μειορύθμιση (D) (αριστερά) και προς τα πάνω ρύθμιση (U) (δεξιά). Το όριο του 30% διαφορά σε έκφραση μεταξύ των δειγμάτων ελέγχου και όγκου χρησιμοποιούνται για την ταξινόμηση των δειγμάτων. C: δείγματα ελέγχου, Τ: δείγματα όγκων. Τα δεδομένα δίνονται ως μέσος ± S.E .. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση paired t-test. * P & lt? 0,05? ** P & lt? 0,01? *** P & lt?. 0.001

Η

Ποσοτικές σχέσεις μεταξύ των παραγόντων ματίσματος διαφέρουν μεταξύ των δειγμάτων όγκου και ελέγχου

Για να διερευνήσουν κατά πόσον οι αλλαγές στην έκφραση των παραγόντων ματίσματος συσχετίζονται, αναλύσαμε αναλογίες μεταξύ των επιπέδων έκφρασης των παραγόντων ματίσματος καθώς και αναλογίες μεταξύ συγκεκριμένων ζευγών παραγόντων ματίσματος (Εικ. 3). Βρήκαμε ότι το πρότυπο των συσχετίσεων διέφερε μεταξύ των δειγμάτων ελέγχου και των όγκων, με γενική τάση για αυξημένη συντελεστές συσχετισμού σε δείγματα όγκων (Σχ. 3Α). Τα ισχυρότερα αλλαγές στο συσχετισμό παρατηρήθηκαν για hnRNP Α1. Για παράδειγμα, δεν υπήρχε σημαντική συσχέτιση μεταξύ hnRNP Α1 και SRp20, hnRNP Α1 και SRp75, και hnRNP Α1 και 9G8 σε δείγματα ελέγχου, ενώ σε δείγματα όγκων η έκφραση αυτών των γονιδίων συσχετίζονται σημαντικά. Επίσης, η συσχέτιση μεταξύ SF2 /ASF και το υπολειπόμενο έξι αναλύονται παράγοντες ματίσματος ήταν ισχυρότερη σε δείγματα όγκων.

Α. Matrix δείχνει συντελεστές συσχέτισης μεταξύ της έκφρασης του mRNA της ανέλυσε τους παράγοντες ματίσματος. Το οικόπεδο δημιουργήθηκε με βάση Pearson συντελεστές συσχέτισης μεταξύ των τιμών έκφραση των παραγόντων ματίσματος. αριθμός των ασθενών 16 αφαιρέθηκε από την ανάλυση λόγω της απόκλισης από την κανονική κατανομή. Για SC35 (γονίδιο: SFRS2) Spearman μη παραμετρική συσχέτιση χρησιμοποιήθηκε ως δεδομένα δεν ήταν κανονικά κατανεμημένες σε αυτή την ομάδα. Οι τιμές των Pearson ή Spearman r δίνεται κάτω από το διάγραμμα τελεία. Τα ονόματα των γονιδίων παράγοντες ματίσματος »σε παρένθεση. P & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. Β mRNA αναλογίες έκφραση των παραγόντων ματίσματος που είναι γνωστό ότι δρουν ανταγωνιστικά. Τα δεδομένα δίνονται ως μέση ± S.E. (Για SF2 /ASF: hnRNP Α1 και hnRNP A1: SC35) ή ως μέσες τιμές και το 95% CI (για SC35: SRp55 τα δεδομένα δεν είχαν κανονικά κατανεμημένες σε αυτή την ομάδα). Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ζεύγη t τεστ (για για SF2 /ASF: hnRNP Α1 και hnRNP A1: SC35) ή Wilcoxon τεστ ζεύγους (για SC35: SRp55). . N = 37 για το C, η = 37 για Τ, ** ρ & lt?

Η

Υπάρχουν 0,01 ζεύγη των παραγόντων ματίσματος που είναι γνωστό ότι λειτουργούν ανταγωνιστικά [13] – [15], [29] . Ως εκ τούτου, αναλύσαμε αναλογίες από τους ακόλουθους ειδικούς παράγοντες ματίσματος: SF2 /ASF: hnRNP Α1, SF2 /ASF: SRp20, SF2 /ASF: SC35, SRp40: SRp55, SC35: SRp55, και hnRNP Α1: SC35. Βρήκαμε ότι για τα τρία ζεύγη των ματίσματος Παράγοντες οι αναλογίες διέφεραν σημαντικά σε δείγματα όγκων όταν συγκρίθηκαν με τα δείγματα ελέγχου (Σχ. 3Β). Η SF2 /ASF: αναλογία hnRNP Α1 μειώθηκε σε δείγματα όγκων κατά περίπου 26% (1,07 ± 0,06 Τ.Α. για C vs 0,78 ± 0,06 Τ.Α. για την T? P = 0,0022). Η αναλογία των SC35: SRp55 αυξήθηκε σε δείγματα όγκων κατά περίπου 40% (μέση τιμή 1.12, εύρος 0,60 – 5,91 για το C? Διάμεση 1,57, εύρος 0,59 έως 12,29 για την T? P = 0,0073). Για το λόγο hnRNP A1: SC35 υπήρχε ένα μικρό (15,3%) αλλά στατιστικά σημαντική αύξηση σε όγκους σε σύγκριση με τα δείγματα ελέγχου (0.77 ± 0.05 SE για το C vs 0,89 ± 0,064 SE για την T? P = 0.0197)

Η έκφραση της πρωτεΐνης του SF2 /ASF και hnRNP Α1 έχει διαταραχθεί σε ccRCC

Για να ελέγξετε εάν οι αλλαγές στο αποτέλεσμα επίπεδο mRNA σε ταυτόχρονη διαταραχές της έκφρασης πρωτεΐνης πραγματοποιήσαμε ανάλυση Western blot των δύο παραγόντων ματίσματος, SF2 /ASF και hnRNP Α1 επί δώδεκα αντιπροσωπευτικά ζεύγη δειγμάτων ελέγχου και των όγκων (Σχ. 4). Πράγματι βρήκαμε σημαντικές διαφορές μεταξύ των επιπέδων πρωτεΐνης των παραγόντων ματίσματος σε δείγματα ελέγχου και του όγκου. Ομοίως όπως στην περίπτωση της ανάλυσης του mRNA, οι αλλαγές ήταν μεταβλητή, αλλά δεν σχετίζεται με την έκφραση του mRNA. Στην πλειονότητα των δειγμάτων που αναλύθηκαν σε συνδυασμό ιστού η έκφραση του παράγοντα ματίσματος μειώθηκε σε δείγματα Τ σε σύγκριση με τα δείγματα C (SF2 /ASF: 9 ζεύγη? HnRNP A1: 8 ζεύγη).

βαθμούς Όγκων της διαφοροποίησης εμφανίζονται ( G1, G2, G3). Western blots του SF2 /ASF (Α) και hnRNP Α1 (Β) χρησιμοποιήθηκαν για ημι-ποσοτική ανάλυση των ζωνών πρωτεΐνης μετά από κανονικοποίηση σε β-ακτίνη. Γκρι μπάρες αντιπροσωπεύουν δείγματα ελέγχου. Μαύρες μπάρες αντιπροσωπεύουν δείγματα όγκων.

Η

Σε αρκετές δείγματα πρόσθετες ή μετατοπισμένες ζώνες ήταν ορατές, ειδικά σε κηλίδες του SF2 /ASF (Σχ. 4Α). Μια τέτοια εικόνα είναι χαρακτηριστική για διαφορετικά φωσφορυλιωμένη μόρια SF2 πρωτεΐνης /ASF [30].

Το εναλλακτικό μάτισμα γονιδίων που εμπλέκονται στην ογκογένεση και ρυθμίζεται από παράγοντες ματίσματος έχει διαταραχθεί σε ccRCC

ρυθμίζει /ASF SF2 εναλλακτικό μάτισμα ενός σημαντικού αριθμού γονιδίων, συμπεριλαμβανομένων RON πρωτο-ογκογονιδίου [19], κασπάση-9 [22] ρυθμιστής της απόπτωσης, και Rac1, μέλος της Ras οικογένειας των πρωτο-ογκογονιδίων (ρυθμίζεται από SF2 /ASF και SRp20) [14 ]. Για να διερευνηθεί αν οι μεταβολές σε ποσότητες των παραγόντων ματίσματος που ακολουθείται από αλλαγές σε εναλλακτικές επεξεργασία των γονιδίων στόχων, αναλύσαμε τα πρότυπα ματίσματος τους (Εικ. 5). Επιπλέον, αναλύσαμε τα προφίλ μάτισμα δύο επιπλέον γονίδια:. GLI1 ογκογονιδίου [25] και ογκοκατασταλτικά λειτουργίας του CEACAM1 [23] των οποίων η διαταραγμένη μάτισμα είναι γνωστό ότι συμβάλλει στην εξέλιξη του όγκου

A. PCR ανάλυση των εναλλακτικών τρόπων ματίσματος σε δώδεκα ζεύγη ελέγχου (C) και δείγματα ιστού όγκου (Τ). 1) RON? 2) CEACAM-1? 3) Rac1? 4) Η κασπάση-9? 5) GLI1. Οι θέσεις των εκκινητών που χρησιμοποιούνται για PCR φαίνεται σε σχέση με εξόνια. Τα εναλλακτικά συγκολλημένα εξώνια σκιασμένο. Οι διαβαθμίσεις της διαφοροποίησης του όγκου εμφανίζονται (G1, G2, G3). B. Γράφημα που δείχνει αναλογίες έκφραση των παραλλαγών ματίσματος όπως προσδιορίζεται με πυκνομετρική ανάλυση των ηλεκτροφόρηση προϊόντων PCR. Σημείωση διαφορετικές κλίμακες άξονα. Γκρι μπάρες αντιπροσωπεύουν δείγματα ελέγχου. Μαύρες μπάρες αντιπροσωπεύουν δείγματα όγκων.

Η

Βρήκαμε ότι τα επίπεδα των διαφόρων παραλλαγών ματίσματος της ανάλυσης των γονιδίων διέφερε μεταξύ της πλειοψηφίας των δώδεκα αναλύονται ζεύγη ελέγχου και τα δείγματα όγκων στις οποίες το επίπεδο της πρωτεΐνης του SF2 /ASF και hnRNP Α1 αναλύθηκε (Σχ. 5Β). Έκφραση των RON πρωτο-ογκογονιδίου παραλλαγές ματίσματος Ρον και ΔRon διέφεραν μεταξύ των δειγμάτων των συγκεκριμένων βαθμών διαφοροποίησης. Σε όλα τα δείγματα G3 όγκου ο λόγος ΔRon /Ron ήταν υψηλότερη από ό, τι σε ζεύγη δειγμάτων ελέγχου. Σε δείγματα G1 αναλογία όγκου-ειδικά ΔRon /Ron ήταν υψηλότερη ή παρόμοια σε σύγκριση με τον έλεγχο δειγμάτων. Σε δείγματα που λαμβάνονται από τον αριθμό των ασθενών 13 και οι δύο ισομορφές ήταν απούσα σε δείγματα όγκου και ελέγχου. Σε δείγματα όγκων που ταξινομούνται ως G2 ο λόγος ΔRon /Ron ήταν μεταβλητή: σε δύο δείγματα όγκων ήταν παρόμοια με αυτή σε συνδυασμό ελέγχων, σε ένα δείγμα ήταν υψηλότερη από ό, τι σε ζεύγη έλεγχο και σε ένα δείγμα ήταν χαμηλότερα από ό, τι σε ζεύγη έλεγχο. πρότυπα ματίσματος της λειτουργίας του CEACAM1 δεν εξαρτάται από το βαθμό διαφοροποίησης των δειγμάτων όγκου. Σε επτά ζεύγη δείγμα η αναλογία λειτουργίας του CEACAM1-S /λειτουργίας του CEACAM1-L ήταν υψηλότερη σε όγκους σε σύγκριση με τα δείγματα ελέγχου. Σε δύο ζεύγη δείγμα λειτουργίας του CEACAM1-S δεν ανιχνεύθηκε. μοτίβο μάτισμα του Rac1 ήταν παρόμοια με πλειοψηφία των δειγμάτων που αναλύθηκαν. Ο λόγος Rac1b /Rac1 ήταν υψηλότερη στα δείγματα ελέγχου από ό, τι σε ζεύγη όγκους σε έντεκα που αναλύθηκαν ζεύγη ιστού. Επτά από αναλύονται ζευγών δειγμάτων αποκάλυψε υψηλότερη αναλογία της κασπάσης-9b /κασπάσης-9α σε όγκους σε σύγκριση με τα δείγματα ελέγχου ανεξάρτητα των βαθμών διαφοροποίησης. μάτισμα του σχήματος του GLI1 ήταν η πιο μεταβλητή. Η αναλογία των GLI1-FL /GLI1-ΔΝ σε επτά δείγματα όγκων ήταν υψηλότερη από ό, τι σε ζεύγη ελέγχους. Σε δύο ζεύγη δειγμάτων δεν υπήρχαν διαφορές μεταξύ των αναλογιών που αναλύθηκαν παραλλαγές ματίσματος? Ωστόσο, πρόσθετες λωρίδες ήταν ορατές, γεγονός που υποδηλώνει την παρουσία της δεν προσδιορίζονται παραλλαγές ματίσματος.

Για να βρείτε πιθανή σύνδεση μεταξύ των αλλαγών στην έκφραση του SF2 /ASF και μάτισμα του SF2 /ASF γονιδίων ρυθμιζόμενων πραγματοποιήσαμε ανάλυση συσχέτισης Pearson μεταξύ των έκφραση των παραγόντων ματίσματος και ο εξώνιο στόχος ματίσματος (Εικ. 6). Θετική συσχέτιση (r = 0,6915, p = 0,0127) μεταξύ Κασπάση-9α και πρωτεΐνης /ASF SF2 παρατηρήθηκε σε καρκινικά αλλά όχι σε δείγματα ελέγχου (r = 0,004644, p = 0,9886). Βρήκαμε επίσης μια θετική συσχέτιση (r = 0,6187, p = 0,0320) μεταξύ της λειτουργίας του CEACAM1-L και πρωτεΐνη SF2 /ASF σε όγκους, αλλά όχι σε δείγματα ελέγχου (r = 0,4482, p = 0,1439). Εμείς δεν βρήκε καμία συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης του SF2 /ASF (ή hnRNP Α1) πρωτεΐνες και τις παραλλαγές ματίσματος του Ρον, Rac1 ή GLI-1 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

ανάλυση συσχέτισης Pearson πραγματοποιήθηκε με δεδομένα από δώδεκα ζεύγη των δειγμάτων ελέγχου και καρκινικού ιστού. P & lt?. 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Η

Ενώ είναι γνωστό ότι οι SF2 /ASF ρυθμίζει μάτισμα της κασπάσης-9 [22], δεν υπάρχουν στοιχεία που να δείχνουν ότι λειτουργίας του CEACAM1-L είναι ένας στόχος του SF2 /ASF ή οποιωνδήποτε άλλων παραγόντων ματίσματος. Ωστόσο, διαπιστώθηκε ότι το εξόνιο 7 του λειτουργίας του CEACAM1 περιέχει cis-δράσης μάτισμα ρυθμιστικά στοιχεία [23]. Ως εκ τούτου αναλύσαμε την αλληλουχία του εξονίου λειτουργίας του CEACAM1 7 χρησιμοποιώντας μήτρες για αλληλουχίες πρόβλεψη που απαιτείται για τη δέσμευση του ματίσματος παράγοντες SF2 /ASF, SC35, SRp40, ΚΑΙ SRp55 (Εικ. 7). Αυτή η ανάλυση αποκάλυψε διάφορα μοτίβα υψηλής βαθμολογία για SF2 /ASF, δύο μοτίβα για SC35, τρία μοτίβα για SRp40, και ένα μοτίβο για SRP55.

Πρόβλεψη μοτίβα έγινε με το λογισμικό ESE Finder [26] με τη χρήση μητρών για πρόβλεψη των αλληλουχιών που απαιτούνται για την πρόσδεση των παραγόντων ματίσματος. Για την πρόβλεψη των θέσεων δέσμευσης SF2 /ASF, χρησιμοποιήθηκαν δύο μήτρες: «SF2 /ASF /IgM-BRCA1» (λευκές ράβδοι) και «SF2 /ASF» (γκρι ράβδοι). Αυτές οι δύο μήτρες προέκυψαν σε διαφορετικό πλαίσιο (διαφορετικό μικρογονίδια και το μέγεθος των τυχαίων βιβλιοθηκών αλληλουχίας σε SELEX [27]). Μόνο μοτίβα υψηλής βαθμολογίας παραπάνω όρια για SF2 /ASF (1.956), SF2 /ASF /IgM-BRCA1 (1.867), SC35 (2.383), SRP40 (2.670), και SRp55 (2.676) εμφανίζεται. Η νουκλεοτιδική αλληλουχία του λειτουργίας του CEACAM1 εξόνιο 7 δίνεται στο x-άξονα.

Η

Συζήτηση

Στην εργασία αυτή δείχνουμε ότι η έκφραση του mRNA των οκτώ παραγόντων ματίσματος έχει διαταραχθεί σε ccRCC. Η έκφραση της πρωτεΐνης των δύο παραγόντων ματίσματος, είναι γνωστό ότι δρουν ανταγωνιστικά, SF2 /ASF και hnRNP Α1 είναι επίσης διαταραχθεί. Αυτές οι εκτροπές συνοδεύονται από διαταραγμένη εναλλακτικό μάτισμα των εξαρτώμενων SF2 /ASF γονίδια, RON, κασπάση-9, και Rac1. Όγκου-ειδικά διαταραχές του εναλλακτικού ματίσματος βρέθηκαν επίσης για GLI1 ογκογονίδιο και καταστολέα λειτουργίας του CEACAM1 όγκου.

Οι αλλαγές στην προ-mRNA μάτισμα είναι ένα κοινό φαινόμενο σε ανθρώπινες κακοήθειες. Σύμφωνα με τα ευρήματά μας, improperties στην έκφραση των παραγόντων ματίσματος συμβαίνουν σε τουλάχιστον μισό (50-60%) των δειγμάτων που αναλύθηκαν, αν και οι διαταραχές είναι διαφορετικές και έχουν ως αποτέλεσμα τόσο από πάνω και προς τα κάτω ρύθμιση των παραγόντων ματίσματος (Εικ. 1 και 2). Η κατεύθυνση των αλλαγών δεν είναι ειδικό για τους βαθμούς όγκου της διαφοροποίησης αφού τόσο επάνω και προς τα κάτω ρύθμιση παρατηρήθηκαν σε όλες τις διαβαθμίσεις. Είναι αξιοσημείωτο ότι, αν και οι περισσότερες από τις δημοσιεύσεις που αναφέρονται σε όγκο συγκεκριμένες αύξηση της έκφρασης παραγόντων ματίσματος, το ποσοστό των δειγμάτων στα οποία εμφανίζεται η διαταραγμένη έκφραση είναι σπάνια εμφανίζεται. Κάρνι et al. [18] ανέφεραν ότι μεταξύ 50 δειγμάτων που αναλύθηκαν ccRCC περισσότερο από 2 φορές υπερέκφραση του SF2 mRNA /ASF παρατηρήθηκε σε λιγότερο από το 5% των δειγμάτων. Σύμφωνα με την ανάλυσή μας, το ποσοστό των δειγμάτων με περισσότερους από 2-φορές υπερέκφραση ήταν λίγο υψηλότερη (8%), αλλά αυτή η διαφορά μπορεί να προκύπτει από σχετικά μικρό αριθμό των δειγμάτων που αναλύθηκαν.

Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε ότι τα πρότυπα του mRNA και η έκφραση πρωτεΐνης των παραγόντων ματίσματος διέφερε μεταξύ των ασθενών και επίσης μεταξύ των δειγμάτων ελέγχου και του όγκου σε ένα δεδομένο ασθενή. Αυτό είναι σε συμφωνία με προηγούμενη μελέτη μας δείχνει τα πρότυπα ματίσματος του τύπου 1 ιωδοθυρονίνης deiodinase [4] και με άλλες μελέτες όγκου-ειδικά και ειδικά για τον ασθενή, δείχνοντας ότι ccRCC χαρακτηρίζεται από μοριακή ετερογένεια και μπορεί να διαχωριστεί σε υποομάδες γονιδιακή έκφραση [31] – [33]. Στη μελέτη του Zhao et al. [33] οι εν λόγω υποομάδες έκφραση συσχετίζεται με την επιβίωση μετά από χειρουργική επέμβαση, αλλά, ομοίως όπως στη μελέτη μας, δεν συσχετίζεται με τους βαθμούς του όγκου. Δυστυχώς, στην περίπτωση της μελέτης μας οι ασθενείς δεν δόθηκε συνέχεια έτσι δεν είναι δυνατό να αναλυθεί τυχόν συσχετίσεις μεταξύ των προφίλ έκφρασης και την επιβίωση των ασθενών. Klein et al. [34] αναλύονται ενιαίο υπολειμματικά καρκινικά κύτταρα από διάφορους τύπους όγκων (αλλά όχι του νεφρού προέλευσης) και βρέθηκε υψηλή ετερογένεια της έκφρασης γονιδίου μεταξύ συγκεκριμένων καρκινικών κυττάρων. Αυτά τα κύτταρα ήταν ετερογενή, ανεξάρτητα από το αν διέμεναν στο ίδιο διαμέρισμα ή μέσα σε διαφορετικές τοποθεσίες παλιννόστησης. Ασθενής συγκεκριμένη μεταβολή στην έκφραση του γονιδίου αναφέρθηκε επίσης για καρκίνο του μαστού και του προστάτη [35], [36]

Αυτή η μεταβλητότητα της γονιδιακής έκφρασης είναι ένα ενδιαφέρον θέμα, και θα πρέπει να εξεταστεί τουλάχιστον δύο πιθανές προελεύσεις:. Ότι οι παραλλαγές αντανακλούν την ειδικότητα όγκου ή ότι αντανακλούν μεμονωμένα χαρακτηριστικά των ασθενών που έχουν ως αποτέλεσμα μια ειδική εικόνα της γονιδιακής έκφρασης στον όγκο. Η πρώτη κατάσταση περιγράφηκε για καρκίνο του ήπατος στην οποία χωριστές όγκους από έναν μόνο ασθενή έδειξε δραματικές διαφορές στα πρότυπα γονιδιακής έκφρασης [37]. Από την άλλη πλευρά, Περού et al. [35] ανέφεραν ότι τα πρότυπα γονιδιακής έκφρασης διαφορετικών δειγμάτων καρκίνου του μαστού που λαμβάνεται από έναν ασθενή ήταν περισσότερο όμοια μεταξύ τους παρά με δείγματα που λαμβάνονται από άλλους ασθενείς. Δεν είναι σαφές ποια κατάσταση αφορά τη μελέτη μας, όπως αναλύσαμε μόνο δείγματα ανά ασθενή. Όπως έχουμε δείξει πρόσφατα, ωστόσο, ccRCC όγκοι μπορεί επίσης να αποκαλύψει περισσότερο ομοιογενή πρότυπα γονιδιακής έκφρασης [6]. Σε αυτή την μελέτη, στην οποία θα χρησιμοποιηθεί εν μέρει το ίδιο υλικό με το έγγραφο αυτό, βρήκαμε εξαιρετικά συνεπής ccRCC όγκου συγκεκριμένες διαταραχές της οδού θυρεοειδικών ορμονών: μείωση των β1 υποδοχέων των θυρεοειδικών ορμονών (TRβ1) mRNA και πρωτεϊνών, απώλεια τύπου 1 iodothyonine deiodinase πρωτεΐνης και μείωσε το επίπεδο των θυρεοειδικών ορμονών, τριιωδοθυρονίνη (Τ3).