Αφηρημένο

Ιστορικό

σημαφορίνες (SEMAs) αποτελούνται από μια μεγάλη οικογένεια εκκρινόμενων και αγκυροβολημένες στην μεμβράνη πρωτεΐνες που είναι σημαντικές στην νευρωνική pathfinding και καθοδήγηση νευράξονα σε επιλεγμένες περιοχές του αναπτυσσόμενου νευρικού συστήματος. Από αυτούς, SEMA7A έχει αναφερθεί ότι έχουν μια χημειοτακτική δραστικότητα σε νευρογένεση και να είναι ανοσορυθμιστή? Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά σχετικά με τη σημασία των SEMA7A στις συμπεριφορές του καρκινώματος του στόματος πλακωδών κυττάρων (OSCC).

Μέθοδοι

Εμείς αξιολογούνται έκφραση SEMA7A σε OSCC που προέρχονται από κυτταρικές σειρές και τα πρωτογενή δείγματα OSCC χρησιμοποιώντας ποσοτική ανάστροφης μεταγραφάσης αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης, ανοσοαποτύπωση, και ημιποσοτική ανοσοϊστοχημεία (sQ-IHC). Επιπλέον, τα κύτταρα knockdown SEMA7A (κύτταρα shSEMA7A) χρησιμοποιήθηκαν για τη λειτουργική πειράματα, συμπεριλαμβανομένων του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, διεισδυτικότητα, και προσδιορισμούς μετανάστευσης. Αναλύσαμε επίσης την κλινική συσχέτιση μεταξύ SEMA7A κατάσταση και την κλινική συμπεριφορά σε ασθενείς με OSCC

Αποτελέσματα

SEMA7A mRNA και πρωτεΐνης up-ρυθμίζονται σημαντικά (P & lt? 0,05). Στο OSCC που προέρχονται από κυτταρικές σειρές σε σύγκριση με την ανθρώπινη φυσιολογική στοματική κερατινοκύτταρα. Τα κύτταρα shSEMA7A παρουσίασαν μειωμένη κυτταρική ανάπτυξη με διακοπή του κυτταρικού κύκλου στην φάση G1, που προκύπτουν από τα πάνω ρύθμιση των αναστολέων κινάσης εξαρτώμενης από κυκλίνη (ρ21

Cip1 και ρ27

Kip1) και προς τα κάτω ρύθμιση κυκλινών (κυκλίνη D1 , κυκλίνη Ε) και εξαρτώμενων από κυκλίνη κινασών (CDK2, CDK4, και CDK6)? και μειωμένη διεισδυτικότητα και τη μετανάστευση δραστηριότητες από μειωμένη έκκριση μεταλλοπρωτεασών μήτρας (MMPs) (ΜΜΡ-2, προΜΜΡ-2, προ-ΜΜΡ-9), και η έκφραση του τύπου μεμβράνης ΜΜΡ 1- (ΜΤ1-ΜΜΡ). Βρήκαμε επίσης αδρανοποίηση των εξωκυτταρικών ρυθμίζονται οδούς κινάσης 1/2 και ΑΚΤ, ένα ανάντι μόριο σύλληψης του κυτταρικού κύκλου στην φάση G1, και μειωμένη έκκριση των ΜΜΡ στα κύτταρα shSEMA7A. SQ-IHC έδειξε ότι η έκφραση SEMA7A στις πρωτογενείς OSCCs ήταν σημαντικά (Ρ = 0,001) μεγαλύτερο από ότι στα φυσιολογικά αντίστοιχα και συσχετίστηκε με πρωτογενή καρκινική μέγεθος (Ρ = 0.0254) και η περιφερειακή μετάσταση λεμφαδένα (Ρ = 0.0002).

Συμπέρασμα

Τα στοιχεία μας παρέχει στοιχεία για ένα ουσιαστικό ρόλο της SEMA7A στην όγκων ανάπτυξη και μετάσταση στο OSCC και ανέφερε ότι SEMA7A μπορεί να διαδραματίσει έναν δυναμικό διαγνωστικό /θεραπευτικό στόχο για χρήση σε ασθενείς με OSCC.

Παράθεση: Saito Τ, Kasamatsu Α, Ogawara Κ, Miyamoto Ι, Saito Κ, Iyoda M, et al. (2015) Semaphorin7A Προώθηση των καρκινικών την ανάπτυξη και μετάσταση στο Ανθρώπινο τον καρκίνο του στόματος από τον κανονισμό του κύκλου G1 τηλέφωνα και Matrix μεταλλοπρωτεάσες: Πιθανή Συμβολή στην καρκινική αγγειογένεση. PLoS ONE 10 (9): e0137923. doi: 10.1371 /journal.pone.0137923

Επιμέλεια: Chih-Hsin Tang, η Κίνα Ιατρικού Πανεπιστημίου, Ταϊβάν

Ελήφθη: 1, Ιουνίου 2015? Αποδεκτές: 23 Αυγούστου του 2015? Δημοσιεύθηκε: 17 Σεπτεμβρίου του 2015

Copyright: © 2015 Saito et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

χρηματοδότηση:.. Οι συγγραφείς δεν έλαβαν καμία ειδική χρηματοδότηση για το έργο αυτό

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν αντικρουόμενα συμφέροντα

Εισαγωγή

σημαφορίνες (SEMAs), που εκκρίνεται και συνδέεται με τη μεμβράνη πρωτεΐνες, παροχή περιβαλλοντικών συνθήματα για να προκαλούν διάφορες αναπτυξιακές διαδικασίες, συμπεριλαμβανομένων νευρωνική κυτταρική μετανάστευση, καθοδήγηση νευραξόνων, αγγειογένεση, διακλάδωση μορφογένεση, και καρδιακή οργανογένεση [1]. Οι ανωμαλίες SEMA έχουν εμπλακεί στην παθογένεση των νευρολογικών διαταραχών, όπως η νόσος του κινητικού νευρώνα και τον εκφυλισμό του Alzheimer. SEMAs επίσης εκφράζονται στα ανοσοποιητικά συστήματα απόκριση, συμπεριλαμβανομένου Β κύτταρα, Τ κύτταρα, φυσικά κύτταρα φονείς, και μακροφάγα, και έχουν εμπλακεί στη ρύθμιση της οργανογένεσης, αγγειογένεση, την απόπτωση, και νεοπλασία [2].

SEMA1 -8 χαρακτηρίζονται από την παρουσία μια διατηρημένη περιοχή μεγάλο SEMA (-500 αμινοξέα) στο Ν-τερματικό πεδίο και διαφοροποιούνται με C-άκρο τους [3]. SEMA1 και SEMA2 βρίσκονται σε ασπόνδυλα, SEMA3-7 βρίσκονται σε σπονδυλωτά, και SEMA8 βρίσκεται σε ιούς [4]. SEMA4-7 υφίστανται κυρίως ως μορφές δεσμευμένες σε μεμβράνη, ενώ SEMA3 εκκρίνεται σαν ένα διαλυτό μόριο. Διαχεόμενο SEMAs μπορεί να προκαλέσει αυτοκρινείς /παρακρινής σηματοδότηση, ενώ είναι δεσμευμένη σε μεμβράνη μέλη της οικογένειας μπορούν να μεσολαβήσουν σήματα juxtacrine μικρής εμβέλειας.

Παρά το γεγονός ότι τα καρκινικά κύτταρα συνήθως εκφράζουν μη φυσιολογικά επίπεδα SEMAs, ο ρόλος των SEMA7A στην εξέλιξη του καρκίνου είναι σε μεγάλο βαθμό άγνωστη. SEMA7A, μία νέα διαμεμβρανική glycosylphosphatidylinisotol-αγκυροβολημένα πρωτεΐνη, εντοπίστηκε για πρώτη φορά στο ανοσοποιητικό σύστημα σε μυελοειδή και λεμφοειδή κύτταρα γράμμωσης [5-7] και λειτουργίες μέσω β-ιντεγκρινών σε πολλαπλά συστήματα [8]. Σας παρουσιάζουμε τα αποτελέσματα μιας ολοκληρωμένης ανάλυσης των μοριακών /κυτταρικών υποτύπων των SEMA7A σε πλακωδών κυττάρων καρκινώματος του στόματος (OSCC) που συνδέονται λειτουργικά και συμβάλλουν κλινικά στην καρκινική εξέλιξη και την πρόγνωση σε OSCCs.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθικοί κανόνες

Η επιτροπή δεοντολογίας του Graduate School of Medicine, University Chiba (αριθμός έγκρισης, 236), ενέκρινε το πρωτόκολλο της μελέτης, η οποία διεξήχθη σύμφωνα με τις αρχές της Διακήρυξης του Ελσίνκι. Όλοι οι ασθενείς με την προϋπόθεση γραπτή συγκατάθεση.

OSCC που προέρχονται από κυτταρικές γραμμές και δείγματα ιστών

Ανθρώπινο OSCC που προέρχονται από κυτταρικές σειρές (HSC-2, HSC-3, HSC-4, Sa3, Ca9- 22, SAS, KOSC-2, Ho-1-u-1, και Ho-1-Ν-1) ελήφθησαν από το Επιστημονικό Ερευνητικό Τράπεζα Ανθρώπινου Δυναμικού (Osaka, Japan) ή το Bioresource Κέντρου RIKEN (Ibaraki, Japan) μέσω το Εθνικό Πρόγραμμα Βιο-πόρων του Υπουργείου Παιδείας, Πολιτισμού, Αθλητισμού, Επιστημών και Τεχνολογίας στην Ιαπωνία. Σύντομη συνδυασμό προφίλ επανάληψη επιβεβαίωσε την κυτταρική ταυτότητα. Πρωτογενή καλλιεργημένα ανθρώπινα κανονικά από το στόμα κερατινοκύτταρα (HNOKs) ελήφθησαν από υγιείς στόματος δείγματα βλεννογόνου επιθηλίου που συλλέγονται από τους νέους ασθενείς στο Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Chiba. Τρεις ανεξάρτητες HNOKs ήταν πρωτεύοντος καλλιεργούμενου και διατηρήθηκαν σε στοματικά μέσον κερατινοκυττάρων (ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA) που αποτελείται από 5 ml πόσιμου συμπλήρωμα ανάπτυξης κερατινοκυττάρου (ScienCell Research Laboratories) και 5 ml διάλυμα πενικιλλίνης /στρεπτομυκίνης (ScienCell Research Laboratories) [9-12]. Όλα OSCC προερχόμενα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco (ϋΜΕΜ) (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ, USA) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) (Sigma-Aldrich) και 50 μονάδες /ml πενικιλλίνη και στρεπτομυκίνη (Sigma-Aldrich).

εκατόν πενήντα πρωτογενή δείγματα OSCC και τον ασθενή ταιριαστό φυσιολογικό επιθήλιο ελήφθησαν κατά τη διάρκεια χειρουργικών επεμβάσεων που εκτελούνται στο Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Chiba. Οι εκτομή ιστοί μονιμοποιήθηκαν σε διάλυμα φορμαλδεΰδης ρυθμισμένο σε 20% για παθολογική διάγνωση και ανοσοϊστοχημεία χρώσης (IHC). Πραγματοποιήσαμε ιστοπαθολογική διάγνωση του κάθε δείγματος OSCC σύμφωνα με τα κριτήρια του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας στο Τμήμα Παθολογίας του Chiba University Hospital [13]. Οι κλινικοπαθολογοανατομικές στάδια αυτά καθορίζεται με βάση την ταξινόμηση ΤΝΜ της Διεθνούς Ένωσης κατά του Καρκίνου [14].

έκφραση του mRNA ανάλυση

Το συνολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA ), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. cDNA δημιουργήθηκε με χρήση ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (Toyobo Life Science, Osaka, Japan) σύμφωνα με τις οδηγίες των κατασκευαστών. Πραγματικού χρόνου ποσοτική αλυσίδα ανάστροφης μεταγραφάσης-αντίδρασης πολυμεράσης (qRT-PCR) διεξήχθη σε 20-μΙ όγκου αντιδράσεως με χρήση του Thunderbird SYBR qPCR Mix (Toyobo) επί της συσκευής LightCycler 480 (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Οι γενικές συνθήκες ενίσχυσης πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15-18]. Οι εκκινητές σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας Primer 3Plus (on-line ελεύθερο λογισμικό, https://primer3plus.com/), το οποίο καθορίζει το πιο κατάλληλο σύνολο. Οι αλληλουχίες εναρκτήρα που χρησιμοποιούνται για qRT-PCR ήταν:

SEMA7A

, προς τα εμπρός, 5′-TGTGTATTCCCTCGGTGACA-3 ‘? αντίστροφη, 5’-GAGTGGAACAATGGCGTCTT-3 ‘? και

αφυδρογονάση της 3-φωσφορικής αφυδρογονάσης

(

GAPDH

), προς τα εμπρός, 5′-AACATCATCCCTGCCTCTACTGG-3 ‘? αντίστροφη, 5’-TTGAAGTCAGAGGAGACCACTG-3 ‘? και

ΜΜΡ2

, προς τα εμπρός, 5′-CCCCAAAACGGACAAAGAG-3 ‘? αντίστροφη, 5’-CTTCAGCACAAACAGGTTGC-3 ‘? και

ΜΜΡ9

, προς τα εμπρός, 5′-GAACCAATCTCACCGACAGG-3 ‘? αντίστροφη, 5’-GCCACCCGAGTGTAACCATA-3 ‘? και

τύπου μεμβράνης 1 ΜΜΡ

(

ΜΤ1-ΜΜΡ

), προς τα εμπρός, 5′-GCCTTGGACTGTCAGGAATG-3 ‘? αντίστροφη, 5’-AGGGGTCACTGGAATGCTC-3 ‘. Το ποσό μεταγραφή για SEMA7A εκτιμήθηκε από τις αντίστοιχες τυπικές καμπύλες και κανονικοποιούνται με τις

GAPDH

ποσό μεταγραφή καθορίζεται αντίστοιχα δείγματα.

Ανοσοαποτύπωσης ανάλυση

Τα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές με φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με κρύο φωσφορικά (PBS) και ήπια και εν συντομία φυγοκεντρούνται. Τα κυτταρικά σφαιρίδια επωάστηκαν στους 4 ° C για 30 λεπτά σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (7 Μ ουρία, 2 Μ θειουρία, 4% β /ο CHAPS και 10 mM Tris, ρΗ 7.4) με ένα κοκτέιλ αναστολέα πρωτεϊνάσης (Roche Diagnostics). Η συνολική συγκέντρωση πρωτεΐνης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας μία μέθοδο σύνδεσης χρώματος με βάση την δοκιμασία Bradford με Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).

εκχυλίσματα πρωτεΐνης υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση σε 4-12% Bis-Tris γέλη και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης (Invitrogen) και αποκλείστηκαν για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου με αποκλεισμό μιας (Nacalai Tesque, Inc., Kyoto, Japan). Οι μεμβράνες πλύθηκαν τρεις φορές με 0,1% Tween-20 σε ρυθμισμένο με Tris αλατούχο διάλυμα (TBS-T) και επωάστηκαν με αντι-SEMA7A μονοκλωνικό αντίσωμα (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) καθαρισμένο με συγγένεια ποντίκι, κουνέλι αντι- GAPDH πολυκλωνικό αντίσωμα (Santa Cruz Biotechnology), D1 πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού αντι-κυκλίνης (Santa Cruz Biotechnology), αντι-κυκλίνης πολυκλωνικό αντίσωμα Ε1 κουνελιού (Santa Cruz Biotechnology), αντι-ρ21 κουνελιού

Cip1 πολυκλωνικό αντίσωμα (Santa Cruz Biotechnology) , αντι-ΑΚΤ πολυκλωνικό αντίσωμα (Santa Cruz Biotechnology), κουνελιού αντι-φωσφορυλιωμένη-ΑΚΤ (ρΑΚΤ) πολύκλωνο αντίσωμα (Santa Cruz Biotechnology), τύπου-1 κουνελιού αντι μεμβράνη μεταλλοπρωτεϊνάσες μήτρας (ΜΤ1-ΜΜΡ) μονοκλωνικό αντίσωμα (Τεχνολογία Σηματοδότησης Κυττάρου , Danvers, ΜΑ, USA), αντι-εξωκυτταρικό σήμα κινάση ρυθμιζόμενη (ERK) 1/2 (Cell Signaling Technology), κουνελιού αντι-φωσφορυλιωμένη ERK1-/2 (pERK1 /2) (Cell Signaling Technology), αντι- κουνελιού ρ27

Kip1 πολυκλωνικό αντίσωμα (Cell Signaling Technology), κουνελιού αντι-εξαρτώμενη από κυκλίνη κινάση (ΟϋΚ) 2 μονοκλωνικό αντίσωμα (Cell Signaling Technology), το μονοκλωνικό αντίσωμα κουνελιού αντι-CDK4 (Cell Signaling Technology), και αντι-CDK6 μονοκλωνικό κουνέλι αντίσωμα (Cell Signaling Technology) όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Η μεμβράνη πλύθηκε με ΤΒδ-Τ και επωάστηκαν με υπεροξειδάση αρμορακίας-συζευγμένο αντι-κουνελιού ή αντι-ποντικού IgG ως δευτερεύον αντίσωμα (Promega, Madison, WI, USA), για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Τέλος, οι μεμβράνες ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας υπόστρωμα Super-Signal West Pico χημειοφωταύγειας (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA), και ανοσοκηλίδωση οπτικοποιήθηκε με έκθεση των μεμβρανών σε σύστημα ChemiDoc XRS Plus (Bio-Rad Laboratories). Οι εντάσεις σήματος ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα Lab εικόνας (Bio-Rad Laboratories). δεδομένα πρωτεΐνη πυκνομετρική SEMA7A κανονικοποιήθηκαν σε επίπεδα πρωτεΐνης GAPDH.

Η επιμόλυνση με το πλασμίδιο shRNA

κύτταρα OSCC προερχόμενα (SAS και KOSC-2) επιμολύνθηκαν με SEMA7A shRNA (shSEMA7A) ή τον έλεγχο shRNA ( shMock) φορείς (Santa Cruz Biotechnology) με Lipofectamine 3000 και Plus Αντιδραστήρια (Invitrogen), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα απομονώθηκαν από το μέσο καλλιέργειας που περιέχει 1 μg /ml πουρομυκίνη (Invitrogen). Αρκετές εβδομάδες μετά την επιμόλυνση, μία μικρή αποικία ήταν βιώσιμη. Οι αποικίες των κυττάρων συλλέχθηκαν, μεταφέρθηκαν σε πλάκες έξι φρεατίων, και να επεκταθεί σταδιακά σε πιάτα των 10 cm. Για να αξιολογηθεί η αποτελεσματικότητα των SEMA7A νοκ ντάουν, πραγματοποιήσαμε qRT-PCR και ανοσοαποτύπωση.

Κινητά ανάπτυξη

Για να αξιολογηθεί η επίδραση των SEMA7A νοκ ντάουν στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, αναλύσαμε την κυτταρική ανάπτυξη των κυττάρων shSEMA7A και shMock . Αυτά τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 6-cm πιάτα σε πυκνότητα 1 × 10

4 βιώσιμα κύτταρα. Στα ενδεικνυόμενα χρονικά σημεία, τα κύτταρα τρυψινοποιήθηκαν και μετρήθηκαν εις τριπλούν χρησιμοποιώντας αιμοκυτταρόμετρο.

ικανότητα εισβολής

δοκιμασία

Για να αξιολογηθεί η επίδραση της SEMA7A knockdown σε διεισδυτικότητα, συνολικά 2,5 × 10

5 κύτταρα επαναιωρούνται σε μέσο χωρίς ορό σπάρθηκαν επί Matrigel

® επικαλυμμένα Transwell

® ενθέματα (8 μm πόρους) (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA). Στο κάτω θάλαμο, 2 ml ϋΜΕΜ με 10% FBS προστέθηκε ως χημειοελκτικό. Αφού τα κύτταρα επωάστηκαν για 48 ώρες στους 37 ° C, το ένθετο πλύθηκε με PBS, και τα κύτταρα στην άνω επιφάνεια του ένθετου απομακρύνθηκαν με μπατονέτες. Κύτταρα προσκολλημένο στην κάτω επιφάνεια της μεμβράνης μονιμοποιήθηκαν με μεθανόλη και χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες. Ο αριθμός των κυττάρων που εισέβαλαν μέσω των πόρων σε πέντε τυχαία πεδία μετρήθηκε χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο φωτός σε μεγέθυνση Χ 100.

Μετανάστευση δοκιμασία

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες έξι φρεατίων με 10% FBS /DMEM μέχρι συρρέουσα μονοστιβάδα που σχηματίζεται. Χρησιμοποιώντας ένα άκρο μικροπιπέτας, μία πληγή δημιουργήθηκε στα μέσα της κάθε πλάκας. Επωάσαμε πλάκες στους 37 ° C σε 5% διοξείδιο του άνθρακα με μέσο ελεύθερο ορού. Τα αποτελέσματα εμφανίζονται δια μετρήσεως της περιοχής του τραύματος, που ήταν ελεύθερο από κύτταρα με τη χρήση του λογισμικού Lenaraf220b (https://www.vector.co.jp/soft/dl/win95/art/se312811.html). Η μέση τιμή υπολογίστηκε από δεδομένα που λαμβάνονται από έξι φρεάτια.

κυτταρικού κύκλου ανάλυση

Τα transmutants υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 200 ng /ml nocodazole (Sigma-Aldrich) για 16 ώρες για να συγχρονίσει τα κύτταρα στο η μετάβαση G2 /M [19-21]. Δεκαέξι ώρες μετά την αγωγή με νοκοδαζόλη, τα κύτταρα συλλέχθηκαν, πλύθηκαν με PBS, και ανιχνεύθηκαν με το κιτ αντιδραστηρίου DNA CycleTEST Plus (Becton-Dickinson). Προσδιορισμός με κυτταρομετρία ροής του περιεχομένου DNA αναλύθηκε με τη χρήση του BD Accuri

TM C6 κυτταρομετρητή ροής (Becton-Dickinson).

ζυμογραφία

Να ανιχνευθούν τα εκκρίνονται από τα κύτταρα MMPs shSEMA7A και shMock, πραγματοποιήσαμε μια δοκιμασία ζελατίνη ζυμογραφία (Primary Cell, Sapporo, Ιαπωνία), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή με μικρές τροποποιήσεις. Τα ρυθμισμένα μέσα αναμίχθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος SDS και διαχωρίστηκαν σε πηκτώματα ζελατίνης. Μετά την πλύση, οι γέλες επωάστηκαν για 32 ώρες στους 37 ° C στο ρυθμιστικό διάλυμα αντίδρασης ενζυματική. Οι πηκτές στη συνέχεια βάφτηκαν με Coomassie Brilliant Blue και αποχρωματίστηκε σε ένα διάλυμα μεθανόλης /οξικού οξέος με ήπια ανάδευση σε ένα πιάτο ανακίνηση. Οι MMPs ταυτοποιήθηκαν από την παρουσία της σαφούς μπάντες σε ένα φόντο με ομοιόμορφη χρώση.

Κυκλοεξιμίδιο (CHX) θεραπεία

CHX, ένα κοινό αντιδραστήριο για την αναστολή της πρωτεϊνικής σύνθεσης, έχει αναφερθεί σε ανενεργή οι λειτουργίες MMPs. Από διάφορες μελέτες έδειξαν ότι η Κ CHX κυμαίνεται από 1 έως 50 μg /ml [22-27], χρησιμοποιήσαμε CHX (WAKO, Osaka, Japan) σε συγκέντρωση 1 μg /ml για 48 ώρες. Μετά τη θεραπεία, πραγματοποιήθηκαν ανοσοαποτύπωση ανάλυση και zymography

Μεταβατική ρύθμιση προς τα πάνω σε SEMA7A νοκ ντάουν κύτταρα

Πρόσφατη μελέτη έχει αναφερθεί ότι ο TGF-β amp

1 (R &?. D Systems, Minneapolis , ΜΝ, USA) αυξάνει το επίπεδο έκφρασης του SEMA7A μέσω ενός SMAD2 /3-ανεξάρτητο μονοπάτι [28]. Δεδομένου ότι, έχουμε κατεργασμένα κύτταρα shSEMA με ΤΟΡ-β

1 σε συγκέντρωση 1 ng /mL για 12 ώρες. Μετά τη θεραπεία, η έκφραση του mRNA και ανοσοστύπωση αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν.

ποσοτικαί IHC

ποσοτικαί IHC (SQ-IHC) των 4-μm τμήματα των κλινικών δειγμάτων OSCC ενσωματωμένες σε παραφίνη διεξήχθη. Εν συντομία, μετά παραφινοποίησης, ενυδάτωση, η ενεργοποίηση του αντιγόνου, υπεροξείδιο του υδρογόνου και βαφής κλείδωμα, οι κλινικές τομές επωάστηκαν με αντι-SEMA7A μονοκλωνικό αντίσωμα (Santa Cruz Biotechnology) σε 4 ° C σε ένα υγρό θάλαμο όλη τη νύκτα. Κατά την επώαση με το πρωτεύον αντίσωμα, τα δείγματα πλύθηκαν τρεις φορές με PBS και υφίσταται κατεργασία με αντιδραστήριο Envision (DAKO, Carpinteria, CA, USA) που ακολουθείται από ανάπτυξη χρώματος σε τετραϋδροχλωρική 3,3′-διαμινοβενζιδίνη (ϋΑΚΟ). Τα πλακίδια στη συνέχεια βάφτηκαν αντίθετα ελαφρά με αιματοξυλίνη, αφυδατώθηκαν με αιθανόλη, καθαρίζονται με ξυλόλιο, και τοποθετημένα. Για να ποσοτικοποιηθεί η κατάσταση της πρωτεϊνικής έκφρασης SEMA7A σε κλινικά δείγματα, χρησιμοποιήσαμε τα συστήματα βαθμολόγησης τετραγωνικά-IHC περιγράφηκε προηγουμένως [19, 29-33]. Τα μέσα ποσοστά των θετικών καρκινικών κυττάρων προσδιορίστηκαν σε τουλάχιστον τρία τυχαία πεδία σε κάθε τμήμα, και η ένταση του SEMA7A-ανοσοαντίδρασης βαθμολογήθηκε ως εξής: 0+, κανένας? 1+, αδύναμη? 2+, μέτρια? και 3+, έντονη. Η ένταση χρώσης και οι κυτταρικοί αριθμοί πολλαπλασιάστηκαν για να παράγουν ένα SEMA7A τετραγωνικά-IHC βαθμολογίας. Να καθορίζουν τα σημεία αποκοπής των SEMA7A τετραγωνικά-IHC βαθμολογίες, αναλύσαμε τα τετραγωνικά-IHC βαθμολογίες των 150 ασθενών με χρήση λειτουργικού χαρακτηριστικού δέκτη (ROC) καμπύλη και το δείκτη Youden. Θήκες με βαθμολογία πάνω από 69,5 ορίστηκαν ως SEMA7A θετικά. Δύο ανεξάρτητες παθολόγους από το Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Chiba, κανείς από τους οποίους είχαν γνώση της κλινικής κατάστασης των ασθενών, κάνει αυτές τις αποφάσεις. Για να υπολογίσετε το ποσοστό επιβίωσης 5 ετών, που συμμετείχαν στην έρευνα της ζωής του κάθε ασθενούς και τον μήνα του θανάτου.

Η στατιστική ανάλυση

Για να συγκρίνετε τα επίπεδα έκφρασης SEMA7A, η στατιστική σημαντικότητα αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας το Mann-Whitney U . Οι σχέσεις μεταξύ των βαθμολογιών χρώση SEMA7A τετραγωνικά-IHC και κλινικοπαθολογοανατομικές προφίλ αξιολογήθηκαν με τη χρήση της χ

2 τεστ, το ακριβές τεστ του Fisher, έλεγχος τ, και Mann-Whitney U test. Το ποσοστό επιβίωσης 5 ετών αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία log-rank. P & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± το σταθερό σφάλμα της μέσης τιμής (SEM).

Αποτελέσματα

Αξιολόγηση της έκφρασης SEMA7A σε OSCC κυτταρικές γραμμές που παράγονται

Για να διερευνηθεί η κατάσταση έκφρασης του SEMA7A, πραγματοποιήσαμε qRT-PCR και ανοσοαποτύπωση αναλύσεις χρησιμοποιώντας εννέα OSCC που προέρχονται από κυτταρικές σειρές (HSC-2, HSC-3, HSC-4, Sa3, Ca9-22, SAS, KOSC-2, Ho-1-u -1, και ΗΟ-1-Ν-1) και HNOKs.

SEMA7A

mRNA ήταν ρυθμισμένα προς τα πάνω σημαντικά (Ρ & lt? 0,05) σε όλες τις OSCC κυτταρικές γραμμές που παράγονται σε σχέση με τα HNOKs (Σχήμα 1Α). Πραγματοποιήσαμε επίσης ανάλυση ανοσοκηλίδωσης για τη διερεύνηση της έκφρασης πρωτεΐνης SEMA7A στις OSCC κυτταρικές γραμμές που παράγονται και τις HNOKs (Σχήμα 1Β). Μια σημαντική αύξηση στην έκφραση πρωτεΐνης SEMA7A παρατηρήθηκε σε όλες τις OSCC κυτταρικές γραμμές που παράγονται σε σύγκριση με τις HNOKs.

(Α) Ποσοτικοποίηση των

SEMA7A

έκφραση mRNA σε OSCC κυτταρικές γραμμές που παράγονται από qRT- PCR ανάλυση. Σημαντική (

✽P & lt? 0,05, του Student t-test) πάνω ρύθμιση

SEMA7A

mRNA παρατηρείται σε επτά OSCC κυτταρικές γραμμές που παράγονται σε σχέση με τις HNOKs. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SEM των αποτελεσμάτων εις τριπλούν. (Β) Ανάλυση ανοσοαποτύπωσης των πρωτεϊνών στο SEMA7A OSCC προερχόμενων κυτταρικών σειρών και HNOKs. έκφραση SEMA7A πρωτεΐνη είναι ρυθμισμένα προς τα πάνω σε OSCC κυτταρικές γραμμές που παράγονται σε σύγκριση με εκείνη στα HNOKs. Η πυκνομετρική δεδομένα πρωτεΐνη SEMA7A κανονικοποιούνται τα επίπεδα πρωτεΐνης GAPDH. Οι τιμές εκφράζονται ως ποσοστό των HNOKs.

Η

Ίδρυση SEMA7A νοκ ντάουν κυττάρων

Επειδή παρατηρήθηκε συχνή up-ρύθμιση του SEMA7A σε OSCC που προέρχονται από τα κύτταρα (Σχήμα 1), επιμολύναμε SEMA7A shRNA ή shMock σε OSCC προερχόμενα κύτταρα (SAS και KOSC-2). Για να διερευνηθεί SEMA7A mRNA και πρωτεΐνης εκφράσεις σε κύτταρα shSEMA7A, qRT-PCR και αναλύσεις ανοσοστύπωση διεξήχθησαν (Σχ 2Α και 2Β, αντίστοιχα). Η

SEMA7A

έκφραση mRNA σε κύτταρα shSEMA7A ήταν σημαντικά (P & lt? 0,05) χαμηλότερη από ό, τι στα κύτταρα shMock (Σχήμα 2Α). Το επίπεδο της πρωτεΐνης SEMA7A στα κύτταρα shSEMA7A επίσης μειώθηκε σε σύγκριση με τα κύτταρα shMock (Σχήμα 2Β).

(Α) Έκφραση

SEMA7A

mRNA σε shMock και κύτταρα shSEMA7A (SAS και KOSC-2 προερχόμενο από επιμολύνσεις).

SEMA7A

έκφραση mRNA σε κύτταρα shSEMA7A είναι σημαντικά (

✽P & lt? 0,05, t-test του Student) χαμηλότερο σε σχέση με τα κύτταρα shMock. (Β) Ανάλυση ανοσοαποτύπωσης δείχνει ότι τα επίπεδα της πρωτεΐνης SEMA7A στα κύτταρα shSEMA7A επίσης μειώνονται σημαντικά σε σύγκριση με τα κύτταρα shMock.

Η

Λειτουργική ανάλυση της SEMA7A νοκ ντάουν κυττάρων

Για να διερευνηθεί η επίδραση της SEMA7A νοκ ντάουν στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, παρακολουθήσαμε την κυτταρική ανάπτυξη επί 168 ώρες. Κυτταρική ανάπτυξη σε κύτταρα shSEMA7A μειώθηκε σημαντικά (Ρ & lt? 0,05) σε σύγκριση με τα κύτταρα shMock (Σχήμα 3Α). Πραγματοποιήσαμε επίσης κυτταρικές δοκιμασίες εισβολής και της μετανάστευσης για να αξιολογήσει τις βιολογικές επιδράσεις των κυττάρων νοκ ντάουν SEMA7A. Σε μία δοκιμασία διεισδυτικότητα, ο αριθμός των κυττάρων που διεισδύουν σημαντικά shSEMA7A (Ρ & lt? 0,05) μειώθηκε σε σύγκριση με τα κύτταρα shMock (Σχήμα 3Β). Στον προσδιορισμό της μετανάστευσης, όταν παρακολουθείται οπτικά την περιοχή της ομοιόμορφης πληγών σε συρρέουσα καλλιέργεια κυττάρων, τα τραύματα στα κύτταρα shSEMA7A κλειστό σημαντικά (Ρ & lt? 0,05) από εκείνες που αργότερα στα κύτταρα shMock (Σχήμα 3C). Ως εκ τούτου, τα κύτταρα shSEMA7A έδειξε όχι μόνο μειώθηκε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, αλλά επίσης μειώθηκε διηθητικότητα και τη μεταναστευτική ικανότητες.

(Α) Κυτταρική δοκιμασία πολλαπλασιασμού των shMock και shSEMA7A κύτταρα (SAS και KOSC-2 που προέρχονται από επιμολύνσεις). Για να προσδιοριστεί η επίδραση της shSEMA7A επί του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, shMock και shSEMA7A κύτταρα σπάρθηκαν σε 6-cm πιάτα σε πυκνότητα 1 × 10

4 βιώσιμα κύτταρα /φρεάτιο. Η κυτταρική ανάπτυξη των κυττάρων shSEMA7A αναστέλλεται σημαντικά σε σύγκριση με τα κύτταρα shMock μετά από 4 ημέρες (96 ώρες). Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως το μέσο ± SEM τιμών από τρεις δοκιμασίες (

✽P & lt? 0,05, t-test του Student). (Β) δοκιμασία εισβολής shMock και shSEMA7A κύτταρα (SAS και KOSC-2 που προέρχονται από επιμολύνσεις). Για να αξιολογηθεί η επίδραση της SEMA7A knockdown σε διεισδυτικότητα, εμείς σπάρθηκε 2,5 × 10

5 κυττάρων στο μέσο του Matrigel χωρίς ορό

® επικαλυμμένα Transwell

® ενθέματα (8 μm πόρους) και προστέθηκε συμπληρωμένο με ορό μέσο στον κατώτερο θάλαμο ως χημειοελκτικό. Μετά από επώαση στους 37 ° C για 48 ώρες, τα κύτταρα που διείσδυσαν διαμέσου των πόρων σταθεροποιήθηκαν, χρωματίστηκαν και μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φωτός σε μεγέθυνση Χ 100. Ο αριθμός των κυττάρων shSEMA7A διεισδύουν μέσω των πόρων μειώνεται σημαντικά (

✽P & lt? 0,05, t-test του Student) σε σύγκριση με τα κύτταρα shMock. Η μέση τιμή υπολογίστηκε από δεδομένα που λαμβάνονται από τρεις χωριστούς θαλάμους. (C) δοκιμασία Μετανάστευσης της shMock και shSEMA7A κύτταρα (SAS και KOSC-2 που προέρχονται από επιμολύνσεις). Για να αξιολογηθεί η επίδραση της SEMA7A knockdown για τη μετανάστευση, ομοιόμορφη τραύματα έγιναν συρρέουσες καλλιέργειες των κυττάρων shSEMA7A και shMock και η έκταση του κλεισίματος παρακολουθήθηκε οπτικά κάθε 6 ώρες για 12 ώρες. Η μέση τιμή υπολογίστηκε από δεδομένα που λαμβάνονται από τρεις χωριστούς θαλάμους. Η περιοχή του τραύματος μειώθηκε σημαντικά (

✽P & lt? 0,05, Student t-test). Στην καλλιέργεια των κυττάρων shMock μετά από 12 ώρες, ενώ ένα κενό παρέμεινε στα κύτταρα shSEMA7A

Η

κύτταρον ανάλυση του κύκλου των κυττάρων shSEMA7A

από την κυτταρική ανάπτυξη του SEMA7A knockdown κυττάρων μειώθηκε (Σχήμα 3Α), διερευνήσαμε τις κατανομές κυτταρικού κύκλου χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής. Το ποσοστό των κυττάρων στην G1 φάση σε κύτταρα shSEMA7A ήταν σημαντικά (Ρ & lt? 0,05) ρ21 μεγαλύτερη από ότι στα κύτταρα shMock (Σχήμα 4Α) Εμείς αξιολογήθηκαν επίσης τα επίπεδα έκφρασης των πρωτεϊνών σύλληψης που σχετίζονται με G1, όπως CDKIs (

Cip1 και p27

Kip1), κυκλίνες και CDKs. Όπως ήταν αναμενόμενο, οι CDKIs ρυθμίστηκαν προς τα πάνω, και η κυκλίνη D1, κυκλίνη Ε, CDK2, CDK4, CDK6 και ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω σημαντικά (Ρ & lt? 0,05) στα κύτταρα shSEMA7A (Σχήμα 4Β). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα κύτταρα shSEMA7A ανέστειλε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό κατά διακοπή του κυτταρικού κύκλου στην φάση G1.

(Α) Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής διεξήχθη για να διερευνηθεί εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου στα κύτταρα shSEMA7A και shMock (SAS και KOSC- 2 που προέρχονται από επιμολύνσεις) μετά το συγχρονισμό στη φάση G2 /M για χρήση νοκοδαζόλη. Το ποσοστό των κυττάρων στην G1 φάση στα κύτταρα shSEMA7A αυξάνεται σημαντικά σε σύγκριση με τα κύτταρα shMock. (Β) ανοσοκηλίδωση ανάλυση δείχνει προς τα πάνω ρύθμιση του p21

Cip1 και p27

Kip1 και προς τα κάτω ρύθμιση της κυκλίνης D1, κυκλίνη Ε, CDK2, CDK4 και CDK6 στα shSEMA7Acells (SAS και KOSC-2 που προέρχονται από επιμολύνσεις ) σε σύγκριση με τα κύτταρα shMock.

η

μειωμένη έκκριση των MMPs και expressin της ΜΤ1-ΜΜΡ σε SEMA7A νοκ ντάουν κύτταρα

Δεδομένου ότι η διηθητικότητα και τη μεταναστευτική ικανότητες SEMA7A νοκ ντάουν κύτταρα μειώθηκαν (Σχήμα 3Β και 3C), αξιολογήσαμε MMPs μεσολάβηση πρωτεόλυση μήτρας με qRT-PCR και μια δοκιμασία ζυμογραφία ΜΜΡ.

ΜΜΡ2

και

ΜΜΡ9

εκφράσεις mRNA στα κύτταρα shSEMA7A ήταν σημαντικά (p & lt? 0,05) χαμηλότερη από ό, τι στα κύτταρα shMock (Σχήμα 5Α). Στα κύτταρα shSEMA7A, έκκριση ΜΜΡ2, προΜΜΡ-2 και προΜΜΡ-9 σαφώς μειώθηκε σε σύγκριση με τα κύτταρα shMock. CHX επεξεργασμένα κύτταρα shMock ανέστειλαν την έκκριση της ΜΜΡ-2, προΜΜΡ-2, και προ-ΜΜΡ-9. Τα επίπεδα των εκκρινόμενων ΜΜΡ αντιπροσωπεύθηκαν ως κανονικοποιημένος δείκτης έκκριση, η οποία υπολογίστηκε ως το ποσοστό των εκκρίνεται ΜΜΡ σε σχέση με εκείνη των κυττάρων shMock (Σχήμα 5Β). Εκτιμήσαμε επίσης ΜΤ1-ΜΜΡ από qRT-PCR και ανοσοκηλίδωση αναλύσεις (Σχήμα 6Α και 6Β, αντίστοιχα). Η

ΜΤ1-ΜΜΡ

έκφραση mRNA σε κύτταρα shSEMA7A ήταν σημαντικά (P & lt? 0,05) χαμηλότερη από ό, τι στα κύτταρα shMock (Σχήμα 6Α). Το επίπεδο της πρωτεΐνης ΜΤ1-ΜΜΡ στα κύτταρα shSEMA7A επίσης μειώθηκε σε σύγκριση με κύτταρα shMock (Σχήμα 6Β). CHX επεξεργασμένα κύτταρα shMock inihibited επίσης την έκφραση της έκφρασης ΜΤ1-ΜΜΡ. Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν έντονα ότι το SEMA7A ήταν ένα ουσιαστικό μόριο για την έκκριση και την έκφραση των ΜΜΡ ».

(Α) Εκφράσεις της ΜΜΡ-2 και mRNA ΜΜΡ9 σε κύτταρα shMock και shSEMA7A (SAS και KOSC-2 που προέρχεται από μορφομετατροπείς). ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ9 mRNA εκφράσεις σε κύτταρα shSEMA7A είναι σημαντικά (✽p & lt? 0,05, t-test του Student) μικρότερη από ό, τι στα κύτταρα shMock. (Β) εκκρίσεις των ΜΜΡ-2, προΜΜΡ-2 και προΜΜΡ-9 σε κύτταρα shMock και shSEMA7A αναλύθηκαν με ζυμογραφία ζελατίνης. Στα κύτταρα shSEMA7A, έκκριση ΜΜΡ2, προΜΜΡ-2 και προΜΜΡ-9 είναι σαφώς μειώθηκε σε σύγκριση με τα κύτταρα shMock. Επιπλέον, CHX κατεργασμένα κύτταρα shMock ανέστειλαν την έκκριση της ΜΜΡ-2, προΜΜΡ-2, και προ-ΜΜΡ-9. Η πυκνομετρική ΜΜΡ-2, προΜΜΡ-2 και προΜΜΡ-9 επίπεδα κανονικοποιούνται τα επίπεδα shMock.

Η

(Α) Εκφραση του

ΜΤ1-ΜΜΡ

mRNA σε κύτταρα shMock και shSEMA7A ( SAS και KOSC-2 που προέρχονται από επιμολύνσεις).

ΜΤ1-ΜΜΡ

έκφραση mRNA σε κύτταρα shSEMA7A είναι σημαντικά (

✽P & lt? 0,05, έλεγχος τ) μικρότερη από ό, τι στα κύτταρα shMock. (Β) Ανάλυση ανοσοαποτύπωσης, δείχνει ότι τα επίπεδα πρωτεΐνης ΜΤ1-ΜΜΡ στα κύτταρα shSEMA7A επίσης μειώθηκε αισθητά σε σύγκριση με τα κύτταρα shMock. CHX επεξεργασμένα κύτταρα shMock inihibited επίσης την έκφραση της έκφρασης ΜΤ1-ΜΜΡ. δεδομένα πρωτεΐνη πυκνομετρική ΜΤ1-ΜΜΡ κανονικοποιούνται με τα επίπεδα της πρωτεΐνης GAPDH.

Η

Η αδρανοποίηση των οδών ERK1 /2 και ΑΚΤ σε SEMA7A νοκ ντάουν κύτταρα

Είμαστε αξιολόγησε τα επίπεδα φωσφορυλίωσης των ERK1 /2 και AKT κατά shSEMA7A με ανοσοαποτύπωση ανάλυση. Τα επίπεδα του pERK1 /2 και πρωτεΐνη ρΑΚΤ μειώθηκε σημαντικά (ρ & lt? 0,05) στα κύτταρα shSEMA7A σύγκριση με κύτταρα shMock (Σχ 7Α και 7Β). Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι οι οδοί ERK1 /2 και ΑΚΤ σηματοδότησης ήταν εξασθενημένα συχνά στα κύτταρα shSEMA7A.

(Α, Β) Ανάλυση ανοσοαποτύπωσης, δείχνει ότι SEMA7A knockdown οδηγεί σε μειωμένα επίπεδα pERK1 /2 και ρΑΚΤ σύγκριση με το κύτταρα shMock (SAS και KOSC-2 που προέρχονται από επιμολύνσεις). Πυκνομετρική pERK1 /2, ERK1 /2, ρΑΚΤ, και τα δεδομένα πρωτεΐνη ΑΚΤ κανονικοποιούνται τα επίπεδα της πρωτεΐνης GAPDH.

Η

έκφραση SEMA7A στο SEMA7A νοκ ντάουν κύτταρα μετά από TGF-β

1 θεραπεία

για να διερευνηθεί η επίδραση του ΤΟΡ-β

1 επί της έκφρασης SEMA7A, υποβάλλαμε σε αγωγή τις επιμολύνσεις με ΤΟΡ-β

1. Η

SEMA7A

mRNA στο ΤΟΡ-β

1 αντιμετωπίζονται shSEMA7A κύτταρα ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα σε σύγκριση με ΤΟΡ-β

1 μη-επεξεργασμένα shSEMA7A κύτταρα (Σχήμα 8).

Τα επίπεδα mRNA του

SEMA7A

σε ΤΟΡ-β

1 επωάζεται shSEMA7A κύτταρα (SAS και KOSC-2) είναι σημαντικά αυξημένα (SAS, * Ρ = 0.0022, ** Ρ = 0.0021, † P = 0,0001, †† Ρ = 0.0005, t-test του Student) (KOSC-2, * Ρ = 0.0003, ** Ρ = 0.0003, † P = 0,0029, Ρ = †† 0,0045, t-test του Student) σε σύγκριση με εκείνη σε TGF -β

1 unincubated κύτταρα shSEMA7A.

η

επίπεδα φωσφορυλίωση των ERK1 /2 και ΑΚΤ σε SEMA7A νοκ ντάουν κύτταρα με /χωρίς TGF-β

1

Εμείς αξιολογηθεί η επίπεδα φωσφορυλίωση των ERK1 /2 και ΑΚΤ, καθώς και την έκφραση SEMA7A σε SEMA7A knockdown κυττάρων με /χωρίς ΤΟΡ-β

1 με ανάλυση ανοσοστυπώματος. Το επίπεδο της πρωτεΐνης SEMA7A στο ΤΟΡ-β

1 επεξεργασμένα κύτταρα shSEMA7A ήταν αυξημένη σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα shSEMA7A κύτταρα. Επιπλέον, ΤΟΡ-β

1 επεξεργασμένα κύτταρα shSEMA7A έδειξαν αυξημένη pERK και τα επίπεδα ρΑΚΤ σύγκριση με μη επεξεργασμένα shSEMA7A κύτταρα (Σχήμα 9).

ανάλυση ανοσοστυπώματος των επιπέδων φωσφορυλίωσης SEMA7A, ERK1 /2, και AKT. SEMA7A νοκ ντάουν αποτελέσματα σε μειωμένα επίπεδα pERK1 /2 και ρΑΚΤ σε σύγκριση με τα κύτταρα shMock (SAS και KOSC-2 που προέρχονται από επιμολύνσεις). ΤΟΡ-β

1 επεξεργασμένα κύτταρα shSEMA7A εμφανίζουν αυξημένο επίπεδο SEMA7A σύγκριση με ΤΟΡ-β

1 μη-επεξεργασμένα κύτταρα shSEMA7A. Το επίπεδο pERK1 /2 και ρΑΚΤ επίσης εμφανίζουν αυξημένη σε TGF-β

1 επεξεργασμένα κύτταρα shSEMA7A.

Η

Η αξιολόγηση της έκφρασης SEMA7A στην πρωτοβάθμια OSCCs

Για να διερευνήσουν την κατάσταση έκφρασης του SEMA7A στην πρωτοβάθμια OSCCs και η σχέση με τα κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά, αναλύσαμε την έκφραση της πρωτεΐνης SEMA7A στην πρωτοβάθμια OSCCs από 150 ασθενείς, χρησιμοποιώντας ένα σύστημα βαθμολόγησης τετραγωνικά-IHC. Η έκφραση της πρωτεΐνης SEMA7A πρωτογενούς OSCCs ήταν σημαντικά (P & lt? 0,05) υψηλότερη από ό, τι σε φυσιολογικούς ιστούς (Σχήμα 10Α-10C). Οι SEMA7A τετραγωνικά-IHC σκορ σε OSCCs και των παρακείμενων κανονικά από το στόμα ιστούς κυμαίνονταν 36,7 έως 203,8 (διάμεσος, 109,3) και 13,5 έως 87,5 (μέσος όρος 37,9), αντίστοιχα (Σχήμα 10C). Για να προσδιοριστεί το βέλτιστο σημείο αποκοπής των προσδιορισμένων τετραγωνικά-IHC βαθμολογίες, χρησιμοποιήσαμε την ανάλυση της καμπύλης ROC και το δείκτη Youden. Η καμπύλη περιοχή ανάλυση ROC κάτω από την καμπύλη (AUC) ήταν 0,91 (95% διάστημα εμπιστοσύνης [CI], 0,8749 – 0,9378, P & lt? 0,05) και το δείκτη Youden (ευαισθησία, 70,5%? Ειδικότητα, 96,7%, P & lt? 0,05) έδειξε ότι η τιμή αποκοπής ήταν 69,5 (Σχήμα 10Δ και 10Ε). Οι συσχετίσεις μεταξύ των κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά των ασθενών με OSCC και την κατάσταση της πρωτεϊνικής έκφρασης SEMA7A παρουσιάζονται στον Πίνακα 1. Μεταξύ των κλινικών ταξινομήσεις, οι SEMA7A θετικά OSCCs συσχετίστηκαν σημαντικά (P & lt? 0,05) με μεγαλύτερους όγκους, συχνά περιφερειακές λεμφαδένες κόμβο μετάσταση, και προηγμένες κλινικά στάδια. Τα ποσοστά επιβίωσης 5 ετών στα SEMA7A θετικά OSCCs (n = 106) και τις SEMA7A αρνητικά OSCCs (n = 44) ήταν 76,3% και 85,3%, αντίστοιχα.