Αφηρημένο

Οι ινοβλάστες στο μικροπεριβάλλον του όγκου αποτελεί καθοριστικό παράγοντα στην εξέλιξη του καρκίνου και μπορεί να είναι ένα πολλά υποσχόμενο στόχο για την θεραπεία του καρκίνου. Η ινσουλίνη αυξητικού παράγοντα πρωτεΐνη σύνδεσης 7 (IGFBP7) είναι γνωστή ως καταστολέας όγκων σε καρκίνο του παχέος εντέρου (CRC). Η παρούσα μελέτη διερεύνησε την επαγωγική μηχανισμό της έκφρασης IGFBP7 σε ινοβλάστες από υπερκείμενο από την κυτταρική σειρά CRC, SW620. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η έκφραση του IGFBP7 ήταν ρυθμισμένη στους ινοβλάστες όταν έλαβαν θεραπεία με υπερκείμενο SW620 και εξωγενούς ΤΟΡ-β1. Η IGFBP7 που προκαλείται από υπερκείμενο SW620 ή ΤΟΡ-β1 ανεστάλη εν μέρει από την ΤΟΡ-β1 ειδικό αντίσωμα AF και ανταγωνιστή υποδοχέα ΤΟΡ-β1 SB431542. Τα γονίδια σηματοδότηση στόχευση Wnt, c-myc, CCND1 και οι πρωτεΐνες Dvl2 /3, ήταν όλα τα επάνω ρυθμισμένη σε ινοβλάστες που εκφράζουν υψηλά επίπεδα IGFBP7, και η αυξητική ρύθμιση θα μπορούσε να ανασταλεί τόσο από το Wnt ανταγωνιστή σηματοδότησης Dickkopf-1 ( DKK1) και από τον ανταγωνιστή του υποδοχέα ΤΟΡ-β1 SB431542. Εν κατακλείδι, τα κύτταρα CRC προωθούν την υψηλή έκφραση του IGFBP7 σε ινοβλάστες, πιθανότατα μέσω της από κοινού ρύθμισης του ΤΟΡ-β και σηματοδότηση Wnt με τρόπο που εξαρτάται Smad2 /3-Dvl2 /3. Στο σύνολό τους, τα στοιχεία αυτά δείχνουν ότι οι ινοβλάστες θα μπορούσε να είναι ένα μυθιστόρημα θεραπευτικός στόχος στη θεραπεία των όγκων

Παράθεση:. Rao C, Lin SL, Ruan WJ, Wen Η, Wu DJ, Ντενγκ Η (2014) υψηλή έκφραση της IGFBP7 σε ινοβλάστες Induced από κύτταρα του καρκίνου του παχέος εντέρου είναι συν-Ρυθμιζόμενη από τον TGF-β και σηματοδότηση Wnt σε Smad2 /3-Dvl2 /3-εξαρτώμενο τρόπο. PLoS ONE 9 (1): e85340. doi: 10.1371 /journal.pone.0085340

Επιμέλεια: Neil A. Hotchin, Πανεπιστήμιο του Birmingham, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 7 Ιουλίου 2013? Αποδεκτές: 4 Δεκ 2013? Δημοσιεύθηκε: 10 Ιανουαρίου 2014

Copyright: © 2014 Rao et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της επαρχίας Zhejiang (LY12H16027), το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (30.870.971) και το μείζον πρόγραμμα του Εθνικού Ιδρύματος Φυσικών Επιστημών της Κίνας (81090420, 81090421). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι μια από τις πιο κακοήθεις όγκοι που απειλούν την επιβίωση του ανθρώπου παγκοσμίως, καταλαμβάνοντας την τρίτη θέση μεταξύ όλων των κακοήθων όγκων [1]. Η εισβολή και η μετάσταση των καρκινικών κυττάρων είναι η κύρια αιτία θανάτου. Οι περισσότεροι έρευνα έχει επικεντρωθεί στον εαυτό του όγκου, αλλά ο σημαντικός ρόλος του μικροπεριβάλλοντος στην πρόοδο του όγκου έχει έρθει επίσης να αναγνωριστεί.

Ένας όγκος μπορεί να θεωρηθεί ως μια πληγή που δεν επουλώνεται, την εισβολή και τη μετάσταση δεν καθορίζεται μόνο από τα καρκινικά κύτταρα, αλλά και από την στρώματος του όγκου [2]. Μικρο-μεταστάσεις σχηματίζουν πολύ πριν μπορεί να διαγνωστεί ένας όγκος, και την αλληλεπίδραση με όγκο στρώματος παίζει σημαντικό ρόλο κατά τη διάρκεια της προόδου του όγκου. Οι ινοβλάστες είναι ένα από τα πιο σημαντικά συστατικά των κυττάρων του στρώματος του όγκου, όπου αποκτούν πάντοτε ένα ενεργοποιημένο φαινότυπο [3]. Ακριβώς όπως και στην ίνωση, ινοβλάστες σε όγκους παραμένουν επίμονα ενεργοποιημένο? εκκρίνουν και διαμορφώνουν την εξωκυτταρική μήτρα (ECM) στο στρώμα το οποίο παίζει σημαντικό ρόλο κατά τη διάρκεια της προόδου του όγκου [3] – [5].

IGFBP7 είναι μία εκκρινόμενη πρωτεΐνη η οποία είναι γνωστό ότι είναι ένας καταστολέας όγκων στο μαστό , του εγκεφάλου, του παχέος εντέρου, του πνεύμονα, του ήπατος και του παγκρέατος [6] – [11]. Είναι ένα κύτταρο-συγκολλητική γλυκοπρωτεΐνη -30 kD [12]. In vivo, διαφορετικές μορφές έκφρασης του IGFBP7 βρέθηκαν σε διαφορετικούς τύπους όγκων. έκφραση IGFBP7 είναι χαμηλή σε γλοιοβλάστωμα, καρκίνο πνεύμονα, καρκίνο του παγκρέατος και καρκίνο του ήπατος [6], [9], [10], [13], ενώ τόσο αυξημένη και μειωμένη έκφραση IGFBP7 έχουν αναφερθεί στον καρκίνο του μαστού και του προστάτη [14] – [17]. Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι ο ρόλος των IGFBP7 σε καρκινικά κύτταρα είναι πολύπλοκη, αν και μελέτες για IGFBP7 σε κύτταρα στρώματος του όγκου ίδιοι είναι σπάνιες. Σε μια αναφορά, IGFBP7 βρέθηκε για την προώθηση της αγγειογένεσης σε ενδοθηλιακά κύτταρα [18], αν και ο ακριβής ρόλος των IGFBP7 σε ινοβλάστες είναι ακόμα άγνωστη.

Κατά τη διάρκεια των αλληλεπιδράσεων με όγκο στρώματος, ινοβλάστες μπορούν να επηρεαστούν από παρακρινείς σηματοδότηση που παράγεται από τα καρκινικά κύτταρα. Μεταξύ αυτών των signalings, ΤΟΡ-β θεωρείται ότι είναι η πιο ισχυρή ένα. ΤΟΡ-β-ενεργοποιημένων ινοβλαστών δημιουργήσει μια σημαντική προ-εισβολής και pro-αγγειογένεση θέση για την ανάπτυξη του όγκου [19] – [21]. Έχει αναφερθεί ότι η σηματοδότηση ΤΟΡ-β δρα κυρίως μέσω των Smad οδών [22]. Κατά την ενεργοποίηση, συνδέτη ΤΟΡ-β συνδέεται με την ΤΟΡ-β υποδοχέα Ι /ΙΙ (TβRI /II), και τα φωσφορυλιωμένα προσλαμβάνει TβRI και φωσφορυλιώνει Smads υποδοχέα ρυθμιζόμενη (R-Smads). Η TβRII-ALK5 συγκρότημα ενεργοποιεί Smad2 /3, ενώ η TβRII-ALK1 συγκρότημα ενεργοποιεί Smad1 /05.08. Μόλις ενεργοποιηθεί, R-Smads φωσφορυλιώνουν και σχηματίζουν σύμπλοκα με Smad4, και να προχωρήσουμε εντός του πυρήνα για τη ρύθμιση μεταγραφικής δραστικότητα [23].

Εκτός σηματοδότηση ΤΟΡ-β, σηματοδότηση Wnt παίζει επίσης σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη CRC . Οι εκθέσεις έχουν επισημάνει ότι περίπου 90% των περιπτώσεων CRC οφείλονται σε μεταλλάξεις του μονοπατιού σηματοδότησης Wnt [24]. Κατά την κανονική ενεργοποίηση Wnt, συνδετήρες Wnt προσδένονται σε υποδοχείς Frizzled και LRP (πρωτεΐνη χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνης υποδοχέα που σχετίζονται) να προωθήσει τη φωσφορυλίωση LRP σε ϋνΙ-εξαρτώμενο τρόπο [25], [26]. Στη συνέχεια, το ρ-LRP προσλαμβάνει Axins από το συγκρότημα αποικοδόμηση με την κυτταρική μεμβράνη, βοηθώντας β-κατενίνης για να ξεφύγουν αποικοδόμηση. Τα συσσωρευμένα β-κατενίνης κινείται από το κυτταρόπλασμα στον πυρήνα, και σχηματίζει ένα σύμπλοκο ενεργοποίησης μεταγραφής με TCF /LEF. Η /LEF-β-κατενίνης πυρηνικό συγκρότημα TCF ενεργοποιεί τη μεταγραφή του Wnt σηματοδότησης γονιδίων στόχων, όπως η c-myc, CCND1, FGF20, DKK1 και WISP1, που ρυθμίζουν τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση [26] κυττάρων -. [29]

σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε το υπερκείμενο από SW620, μια κυτταρική γραμμή CRC η οποία προέρχεται από την μεταστατικού όγκου ενός καρκινώματος του παχέος εντέρου, και HELF η οποία είναι μία από τις κανονικές κυτταρικές σειρές ινοβλαστών. Το γεγονός ότι και οι δύο SW620 και HELF είναι IGFBP7 αρνητικές κυτταρικές σειρές καθιστά την ερμηνεία των ευρημάτων μας πιο ξεκάθαρη. Ο σκοπός της παρούσας μελέτης είναι να εξετάσει το πρότυπο έκφρασης των IGFBP7 σε ινοβλάστες και ο μηχανισμός πίσω από αυτό.

Υλικά και Μέθοδοι

αντιδραστηρίων και αντισώματα

TGF-β1 ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη αγοράστηκε από την PeproTech, ΗΠΑ. AF (ΤΟΡ-β1 αντίσωμα εξουδετέρωσης) και DKK1 ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης αγοράστηκαν από την R Αυτό μπορεί να είναι το αποτέλεσμα της αντίστασης των ινοβλαστών στα κύτταρα του όγκου. Ποια είναι η σημασία της υψηλής έκφρασης IGFBP7 σε ινοβλάστες; Προς το παρόν, αυτό είναι δύσκολο να εκτιμηθεί, επειδή υπάρχει μικρή έρευνα για το ρόλο της IGFBP7 σε στρώματος του όγκου. IGFBP7 βρέθηκε εντόνως εκφρασμένο στα αγγεία των γλοιώματος [34]? αυτό μπορεί να αλληλεπιδράσει με εξωκυτταρικές πρωτεΐνες μήτρας να επάγει την προσκόλληση και τη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων [35], [36]. Pen και συνεργάτες ανέφεραν επίσης ότι IGFBP7 σε ενδοθηλιακά κύτταρα μπορούν να επάγουν αγγειογένεση [18]. Άλλοι βρήκαν ότι IGFBP7 συμμετέχει πιθανώς στην ενεργοποίηση και τον πολλαπλασιασμό των ινοβλαστών [37]. Αυτές οι παρατηρήσεις υποδεικνύουν ότι IGFBP7 σε κύτταρα όγκου σε στρώμα μπορεί να παίζει ένα εντελώς διαφορετικό ρόλο από IGFBP7 στα στρωματικά κύτταρα των όγκων. αδημοσίευτα στοιχεία μας έδειξαν ότι IGFBP7 μπορεί να συσχετίζεται με την ενεργοποίηση των ινοβλαστών, αλλά η λεπτομερής σημασία της υψηλής έκφρασης του σε ινοβλάστες είναι ακόμη άγνωστη και απαιτεί περαιτέρω έρευνα.

Τα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι η έκφραση σε ινοβλάστες IGFBP7 είναι στενά συνδεδεμένη με ο TGF-β που εκκρίνεται από τα κύτταρα CRC. Επίσης, η έκφραση του IGFBP7 δεν είναι μόνο εξαρτώμενη από τον χρόνο, αλλά και δοσοεξαρτώμενη σχέση με ΤΟΡ-β. Το αντίσωμα και ο αναστολέας του ΤΟΡ-β επιβεβαίωσε αυτό το αποτέλεσμα. Έχει αναφερθεί ότι η σηματοδότηση ΤΟΡ-β έχει επίσης ρυθμιστεί η έκφραση των IGFBP7 στα ενδοθηλιακά κύτταρα του εγκεφάλου [18], ένα περαιτέρω παράδειγμα ενός διαμερίσματος στρώμα κυττάρων. Και γνωρίζουμε, TGF-β /Smad3 σηματοδότηση έχει θεωρηθεί ως καταστολέας όγκου κατά την διάρκεια της προόδου του όγκου αφού ΤΟΡ-β επαγόμενη CDKN1A (Ρ16), και CDKN2B (Ρ15) έκφραση συσχετίζεται με αναστολή όγκου [38]. Ωστόσο, άλλες έρευνα διαπιστώνει ότι CTGF και ΡΑΙ-1, ο μεταγενέστερος γονίδιο στόχος του ΤΟΡ-β /σηματοδότηση Smad3, συσχετίζεται με υψηλό κίνδυνο μετάστασης στον καρκίνο του μαστού [39]. Προτείνει TGF-β /Smad3 μπορεί να προωθήσει αντίστροφα την εισβολή και τη μετανάστευση στην προχωρημένο στάδιο σχηματισμού όγκων [40], [41]. Ως εκ τούτου, εικάζουν ότι ο ΤΟΡ-β εκκρίνεται από τα καρκινικά κύτταρα που προάγουν την έκφραση IGFBP7 σε ινοβλάστες μπορεί να μειώσει τον ρόλο καταστολέα όγκου για ινοβλάστες σε ιστό όγκου.

Η σχέση του IGFBP7 και σηματοδότηση Wnt δεν έχει διερευνηθεί, και η μελέτη μας είναι η πρώτη που δείχνει ότι σηματοδότηση Wnt μπορεί να ρυθμίζει την έκφραση του IGFBP7 σε ινοβλάστες. Έχει αναφερθεί ότι η σηματοδότηση Wnt /β-κατενίνης ρυθμίζει τη διαφοροποίηση των ινοβλαστών, γεγονός που υποδηλώνει ότι σηματοδότηση Wnt /β-κατενίνης είναι ένας σημαντικός ρυθμιστής του φαινοτύπου των ινοβλαστών [42]. Αυτό υποδηλώνει ότι σηματοδότηση Wnt μπορεί να επηρεάσει IGFBP7 μέσω μεσολάβηση της κατάστασης διαφοροποίησης των ινοβλαστών.

σηματοδότηση Wnt είναι γνωστό ότι ενεργοποιείται όταν οι ινοβλάστες ενεργοποιούνται από ΤΟΡ-β [43]. Εδώ παρατηρήσαμε ότι Wnt σηματοδότηση ενεργοποιείται κατά τη διάρκεια της επαγωγής IGFBP7 σε ινοβλάστες από τον TGF-β. Είναι περίεργο το γεγονός ότι εκτός από την c-Myc και CCND1, η έκφραση της DKK1 ήταν επίσης ρυθμίζεται προς τα πάνω από τον TGF-β. Γνωρίζουμε ότι DKK1 είναι μια κανονική ανταγωνιστής της Wnt σηματοδότησης. Αυτά τα ευρήματα δημοσιεύονται είναι, επομένως, σε αντίθεση με τα αποτελέσματά μας. Ακόμα, επιπλέον, θα πρέπει να σημειώσουμε ότι DKK1 είναι επίσης το γονίδιο στόχος του σηματοδότηση Wnt [28]. Αυτό μπορεί να είναι ένας αρνητικός μηχανισμός ανάδρασης μεταξύ των δύο αυτών οδών σηματοδότησης. Αυτά τα δύο σήματα μπορούν να συνεργαστούν κατά την επαγωγή IGFBP7 σε ινοβλάστες. Όσον αφορά για το πώς συνεργάζονται: βρήκαμε ότι συνδέθηκαν με Smad2 /Dvl3. Υπάρχουν διάφορες εξηγήσεις για την αλληλεπίδραση μεταξύ αυτών των δύο οδών σηματοδότησης. Ένας τρόπος αλληλεπίδρασης μεταξύ Wnt /β-κατενίνης και ΤΟΡ-β /Smads σημάτων είναι η αλληλεπίδραση μεταξύ Smads και β-κατενίνης /TCF4 [44]. Ένας άλλος τρόπος μπορεί να γίνει με Wnt5a επαγωγή του σχηματισμού της MARK2 /Dvl3 /Smad4 συγκρότημα [45]. Ακόμα ένας τρόπος μπορεί να είναι Wnt3A προώθηση ενός καρκίνου που σχετίζεται ινοβλάστες φαινότυπο σε ινοβλάστες, εν μέρει μέσω της /Smad2 ενεργοποίηση σηματοδότησης ΤΟΡ-β από ένα β-κατενίνης εξαρτώμενη μηχανισμός [46], υποδεικνύοντας ότι Wnt και σηματοδότηση ΤΟΡ-β συνδέονται από Smad. Από τα αποτελέσματά μας, σε ινοβλάστες, η ενεργοποίηση των Wnt επάγεται από ΤΟΡ-β ήταν πιο πιθανό μέσω της πάνω ρύθμιση Smad και Dvl3. Ως εκ τούτου, στο συμπέρασμα ότι Dvl3 μπορεί να είναι ένα μυθιστόρημα σημείο cross-talk μεταξύ TGF-β και οδών σηματοδότησης Wnt σε ινοβλάστες. Smad2 /3 και Dvl2 /3 μπορεί να σχηματίζει κάποιο είδος ένωσης που θα μπορούσαν να συνδέσουν ΤΟΡ-β και σηματοδότηση Wnt (Σχήμα 5F). Έχει αναφερθεί ότι ο ΤΟΡ-β και σηματοδότηση Wnt συν-ρυθμίζει τον προσδιορισμό των μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων μοίρες σε μαστικά κύτταρα, συμπεριλαμβανομένης της πρόκλησης καρκίνου βλαστικών κυττάρων. Ως εκ τούτου, ο συνδυασμός των δύο αυτών οδών σηματοδότησης μπορεί να είναι ένας μηχανισμός πίσω από ορισμένες συνθήκες, όπως ινώδεις ασθένειες [47] – [49].

Σας γνωρίζουμε ότι η παρακρινείς μόρια που εκκρίνονται από τα κύτταρα CRC κατά τη διάρκεια των αλληλεπιδράσεων στρώματος του όγκου σηματοδότησης περιλαμβάνουν TGF -β, Wnt και ορισμένοι άλλοι παράγοντες, και ότι αυτά μπορούν να αλλάξουν τα γειτονικά ινοβλάστες. Γνωρίζουμε επίσης ότι ινοβλάστες σε στρώμα όγκου είναι υπεύθυνη για τη σύνθεση των MMPs και των ινών κολλαγόνου. MMPs κύτταρα βοήθεια όγκου εισβάλλουν τη βασική μεμβράνη, ενώ ίνες κολλαγόνου παρέχουν τα καρκινικά κύτταρα με μια βολική φυσική υπόστρωμα πάνω από το οποίο να μεταναστεύσουν [50]. Αυτός είναι ο λόγος που έχουν ινοβλάστες στο στρώμα του όγκου κληθεί «Distant εισβολείς και migrators» [51].

Συνολικά, η αλληλεπίδραση με όγκο στρώματος είναι μια σύνθετη διαδικασία. Κατά τη διάρκεια αυτής της διαδικασίας, τα καρκινικά κύτταρα μπορεί να εκκρίνουν παράγοντες να μεταβάλλει την διαφοροποίηση των φυσιολογικών ινοβλαστών, και η μεταβολή των ινοβλαστών σε αντάλλαγμα εκκρίνουν παράγοντες που επηρεάζουν την εξέλιξη της εισβολής των όγκων και της μετανάστευσης. Έχουμε παρουσίασε στοιχεία που δείχνουν το μηχανισμό για το πώς IGFBP7 μπορούν να συμμετέχουν σε αυτή την αλληλεπίδραση, και αυτή την αλληλεπίδραση, τονίζοντας τη συμμετοχή των ινοβλαστών στρωματικών όγκων, θα μπορούσε να αποτελέσει το επίκεντρο μιας νέας θεραπευτικής προσέγγισης για την αντιμετώπιση του καρκίνου.

Συμπληρωματικές πληροφορίες

Σχήμα S1.

ΗΤ29-S και Lovo-S επάγει υψηλή έκφραση του IGFBP7 σε ινοβλάστες. Ημι-ποσοτική ανάλυση του επιπέδου έκφρασης mRNA IGFBP7 προσδιορίστηκε με RT-PCR σε ινοβλάστες που εκτίθενται σε ΗΤ29-S (Α) και Lovo-S (Β) για 0, 2, 4 και 6 ημέρες. Το επίπεδο του mRNA κανονικοποιήθηκε με εκείνο του GAPDH στα ίδια κυτταρικά εκχυλίσματα. *

P

& lt? 0,05 μεταξύ ΗΤ29-S /Lovo-S-αγωγή ινοβλαστών και την ομάδα ελέγχου (0 ημέρα)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0085340.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2.

β-κατενίνης ενεργοποιείται κατά τη διάρκεια της πάνω ρύθμιση IGFBP7 σε ινοβλάστες. Α Οι ινοβλάστες υποβλήθηκαν σε θεραπεία με SW620-S ή ΤΟΡ-β για 6 ημέρες και την έκφραση της πρωτεΐνης Wnt σηματοδότησης β-κατενίνης ανιχνεύθηκε σε ινοβλάστες με στύπωμα Western. Η έκφραση πρωτεΐνης ομαλοποιήθηκε με εκείνη της β-ακτίνης στο ίδιο κυτταρικό εκχύλισμα. *

P

& lt? 0,05 μεταξύ TGF β1-επεξεργασία-ινοβλάστες και ομάδα ελέγχου. B. ινοβλάστες υποβλήθηκαν σε αγωγή με SW620-S ή ΤΟΡ-β για 6 ημέρες και β-κατενίνης (κόκκινο) και DAPI (μπλε) ανιχνεύθηκαν σε ινοβλάστες με μικροσκοπία ανοσοφθορισμού (Αρχική μεγέθυνση χ 1000)

doi:. 10.1371 /περιοδικό .pone.0085340.s002

(ΔΕΘ)

πίνακα S1.

Q-PCR Αστάρια

doi:. 10.1371 /journal.pone.0085340.s003

(DOC)

Ευχαριστίες

Θα θέλαμε να ευχαριστήσουμε για το Δρ Brian Eyden (Manchester) για την αγγλική γλώσσα επεξεργασία, την τόνωση της συζήτησης και την αναθεώρηση του χειρογράφου. Θέλουμε να ευχαριστήσουμε τον καθηγητή Μάο-De Lai και μέλη του εργαστηρίου για βοήθεια και συμβουλές σε όλο αυτό το έργο.