Αφηρημένο

Οι μέθοδοι που βασίζονται στην αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης πραγματικού χρόνου (PCR) μπορεί να επιταχύνει τη διάγνωση της εν τω βάθει ασπεργίλλωση, αλλά περιορίζονται από την έλλειψη τυποποίησης. Αξιολογήσαμε την εμπορικώς διαθέσιμη δοκιμασία MycAssay ™ Aspergillus για τη διάγνωση της διηθητικής ασπεργίλλωση σε ασθενείς χωρίς καρκίνο αιματολογικές. Εμείς προοπτικά συλλέχθηκαν 322 δείγματα του κατώτερου αναπνευστικού (Νοέμβριος 2009-Ιανουάριος 2011) από 175 ασθενείς με λοίμωξη του κατώτερου αναπνευστικού συστήματος και τις ακόλουθες προϋποθέσεις προδιαθέτουν: στερεά καρκίνου (16,8%), η κίρρωση (16,8%), θεραπεία με κορτικοστεροειδή (71,7%), τον ιό HIV λοίμωξη (15,6%), η χρόνια αποφρακτική πνευμονοπάθεια (COPD, 52,6%), τη μεταμόσχευση συμπαγών οργάνων (νεφρών [1,2%], καρδιά [3%], το ήπαρ [4,6%]), ή κανένα (3,5%). Δείγματα λήφθηκαν όταν ενδείκνυται κλινικά και αναλύονται στο εργαστήριο μικροβιολογίας.

Aspergillus

DNA εκχυλίζεται και ενισχύεται μέσω της MycXtra® και MycAssay ™ Aspergillus.

Aspergillus

spp. απομονώθηκε από 65 δείγματα (31 ασθενείς). Σύμφωνα με τον Ευρωπαϊκό Οργανισμό για την Έρευνα και Θεραπεία του Καρκίνου και τα κριτήρια Bulpa (για ασθενείς με ΧΑΠ), 15 είχαν πιθανές εν τω βάθει ασπεργίλλωση. Αποτελέσματα MycAssay ™ Aspergillus ήταν αρνητικά (n = 254), τα θετικά (n = 54), ή απροσδιόριστο (n = 14). Η ευαισθησία, η ειδικότητα, η θετική προγνωστική αξία, αρνητική προγνωστική αξία, και η αναλογία διαγνωστικές πιθανότητες του MycAssay ™ (πρώτο δείγμα /κάθε δείγμα) ήταν 86,7 /93, 87,6 /82,4, 34,1 /34,1, 92,2 /100, και 48 /68,75. Οι διαφορές μεταξύ του ποσοστού των δειγμάτων με θετικές προσδιορισμούς PCR (63%) και το ποσοστό των δειγμάτων με

Aspergillus

spp. απομόνωσης (75%) δεν ήταν στατιστικά σημαντική (

P

= 0,112). Ο μέσος χρόνος από την καλλιέργεια του δείγματος προς οπτικοποίηση της ανάπτυξης μυκήτων ήταν 3 ημέρες, σε σύγκριση με ~ 4 ώρες για MycAssay ™ Aspergillus PCR. MycAssay ™ Aspergillus έδειξε υψηλή ευαισθησία για τη διάγνωση της εν τω βάθει ασπεργίλλωση σε ασθενείς χωρίς καρκίνο αιματολογικές. Ευαισθησία αυξημένη όταν χρησιμοποιήθηκαν πολλαπλά δείγματα. Σε σύγκριση με την καλλιέργεια μυκήτων, PCR μείωσε σημαντικά το χρόνο από τη διάγνωση

Παράθεση:. Γουινέα J, Padilla C, Escribano P, Muñoz P, Padilla Β, Gijón P, et al. (2013) Αξιολόγηση της MycAssay ™ Aspergillus για Διάγνωση για τη διηθητική πνευμονική ασπεργίλλωση σε ασθενείς χωρίς καρκίνο Αιματολογικές. PLoS ONE 8 (4): e61545. doi: 10.1371 /journal.pone.0061545

Επιμέλεια: David R. Άνδεις, Πανεπιστήμιο του Wisconsin Medical School, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 21, Δεκέμβρη 2012? Αποδεκτές: 11, Μαρ, 2013? Δημοσιεύθηκε: 19 Απρ., 2013

Copyright: © 2013 Γουινέα et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από τις επιχορηγήσεις από το Fondo de Investigación Sanitaria (FIS) cp09 /00055 και PI09 /1257 (Instituto de Salud Carlos III) και από επιχορηγήσεις από Myconostica. Jesús Γουινέα (MS09 /00055) και Pilar Escribano (CD09 /00230) υποστηρίζονται από τη FIS. Οι MycXtra® και MycAssayTM Aspergillus κιτ που χρησιμοποιείται για την εκτέλεση της μελέτης ήταν ευγενική υποστήριξη Izasa (Βαρκελώνη, Ισπανία). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι οι εξαρτήσεις MycXtra® και MycAssayTM Aspergillus ευγενικά παρέχεται από Izasa ( Βαρκελώνη, Ισπανία). Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Επεμβατικές ασπεργίλλωση είναι μια ευκαιριακή λοίμωξη που επηρεάζει ασθενείς με διάφορους βαθμούς της ανοσοκαταστολής. Ασθενείς με βαθιά και παρατεταμένη ουδετεροπενία παραδοσιακά είχαν τον υψηλότερο κίνδυνο εν τω βάθει ασπεργίλλωση [1], [2], [3], [4], [5]. Άλλες ομάδες υψηλού κινδύνου περιλαμβάνουν λήπτες μεταμόσχευσης στερεού οργάνου, ασθενείς με χρόνια αποφρακτική πνευμονοπάθεια (ΧΑΠ), οι ασθενείς που λαμβάνουν κορτικοστεροειδή ή άλλα ανοσοκατασταλτικά φάρμακα, και σε ασθενείς με κίρρωση του ήπατος [6], [7].

Ο αριθμός των ασθενών χωρίς αιματολογικές κακοήθειες που επηρεάζονται από την εν τω βάθει ασπεργίλλωση αυξάνεται. Η θνησιμότητα σε αυτή την ομάδα είναι υψηλή, ίσως λόγω του χαμηλού δείκτη υποψίας για τη μόλυνση και τη συνακόλουθη καθυστέρηση στη διάγνωση [8], [9], [10], [11]. Ως ένα ευνοϊκό αποτέλεσμα εξαρτάται από την έγκαιρη και κατάλληλη αντιμυκητιασική θεραπεία, η ταχεία διάγνωση είναι ολοένα και πιο σημαντικό

Ανίχνευση γαλακτομαννάνης στον ορό έχει αποδειχθεί χρήσιμη για τη διάγνωση της εν τω βάθει ασπεργίλλωση σε ουδετεροπενικούς ασθενείς.? δυστυχώς, η ευαισθησία του είναι κάτω από 50% σε ασθενείς χωρίς ουδετεροπενία [12], [13], [14], [15], [16]. Ανίχνευση γαλακτομαννάνης σε βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα (BAL) δείγματα είναι πιο ευαίσθητη από την ανίχνευση σε δείγματα ορού, αν και τα δείγματα BAL δεν είναι πάντα διαθέσιμες [15]. Η απομόνωση του

Aspergillus

σε χαμηλότερες δείγματα αναπνευστικού συστήματος από μη ουδετεροπενικούς ασθενείς είναι συχνά η πρώτη μικροβιολογική απόδειξη διηθητικής πνευμονική ασπεργίλλωση. Ωστόσο, όπως ο πολιτισμός είναι αργή, ανίχνευση

Aspergillus

σε κλινικά δείγματα καθυστερεί.

Οι μέθοδοι που βασίζονται στην αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης πραγματικού χρόνου (PCR) μπορεί να επιταχύνει τη διάγνωση της εν τω βάθει ασπεργίλλωση, αλλά είναι περιορίζεται από την έλλειψη τυποποίησης [17], [18]. MycAssay ™ Aspergillus είναι ένα πρόσφατα στο εμπόριο τεχνική PCR σε πραγματικό χρόνο για την ανίχνευση του

Aspergillus

DNA σε δείγματα της κατώτερης αναπνευστικής οδού. Η δοκιμασία αυτή έχει μελετηθεί κυρίως σε δείγματα BAL ασθενών με αιματολογικές κακοήθειες ή εκείνων που έχουν εισαχθεί σε μονάδες εντατικής θεραπείας [19].

Στην παρούσα μελέτη, αξιολογήσαμε τη δοκιμασία MycAssay ™ Aspergillus στο αναπνευστικό δείγματα, συμπεριλαμβανομένων των BAL, αυθόρμητη πτυέλων και βρογχική αναρρόφηση, για τη διάγνωση της εν τω βάθει ασπεργίλλωση σε ασθενείς χωρίς καρκίνο αιματολογικών.

Υλικά και Μέθοδοι

ασθενείς και κλινικά δείγματα

από Νοέμβριος 2009-Ιανουάριος 2011 , θα προσληφθούν 175 ασθενείς με ένα ή περισσότερα δείγματα του κατώτερου αναπνευστικού που υποβλήθηκαν στο μικροβιολογικό εργαστήριο. Οι περισσότεροι από τους ασθενείς (96,5%) είχαν κλινική υποψία λοίμωξη του κατώτερου αναπνευστικού και τουλάχιστον ένα επεμβατική πνευμονική ασπεργίλλωση παράγοντας ξενιστή, με εξαίρεση τον καρκίνο αιματολογικές. Ένα σύνολο 322 δείγματα συλλέχθηκαν. Δείγματα με απροσδιόριστα αποτελέσματα επανεξετάστηκαν, και το δεύτερο αποτέλεσμα επιλέχθηκε. Δείγματα που δείχνει ένα επιβεβαιωτικό απροσδιόριστο αποτέλεσμα PCR αποκλείστηκαν από την ανάλυση (n = 14? 4,3%). Ο αριθμός των δειγμάτων που μελετήθηκαν /συλλέγονται ήταν ως ακολούθως: αυθόρμητη πτύελα (n = 142/145), βρογχική αναρρόφηση (n = 104/111), BAL (n = 61/65), και προστατευμένο καθετήρας βούρτσα (n = 1/1 ).

Δύο ασθενείς είχαν ένα μόνο δείγμα, το καθένα με ένα απροσδιόριστο αποτέλεσμα, και εξαιρέθηκαν από την ανάλυση. Οι υπόλοιποι 173 ασθενείς ταξινομήθηκαν ως έχει ή δεν έχει την επεμβατική πνευμονική ασπεργίλλωση ή άλλη λοίμωξη της μήτρας, σύμφωνα με τα αναθεωρημένα κριτήρια του Ευρωπαϊκού Οργανισμού για την Έρευνα και Θεραπεία του Καρκίνου (EORTC) [20], [21] ή τα κριτήρια Bulpa του (αποκλειστικά για τους ασθενείς με ΧΑΠ) [20], [21]. Ο αποικισμός ορίστηκε ως η απομόνωση του

Aspergillus

spp. στο κατώτερο αναπνευστικό δείγματα σε ασθενείς που δεν πληρούν την EORTC ή τα κριτήρια Bulpa του. Κίρρωση συμπεριλήφθηκε ως παράγοντας υποδοχής, δεδομένου ότι εν τω βάθει ασπεργίλλωση έχει βρεθεί σε βαρέως πάσχοντες ασθενείς με κίρρωση και χωρίς άλλες καταστάσεις που προδιαθέτουν [8]. Οι καταστάσεις που προδιαθέτουν για διηθητική ασπεργίλλωση ήταν ενεργά στερεά καρκίνου (16,8%), η κίρρωση (16,8%), κορτικοστεροειδή κατανάλωσης (71,7%), λοίμωξη HIV (15,6%), η ΧΑΠ (52,6%), τη μεταμόσχευση συμπαγών οργάνων (νεφρού [1,2%] , η καρδιά [3%], το ήπαρ [4,6%]), ουδετεροπενία (4,6%), ή κανένα (3,5%). Ένα μεγάλο ποσοστό των ασθενών (90%) κατανάλωναν αντιβιοτικά όταν το δείγμα συλλέχθηκε.

ελήφθησαν Όλα τα δείγματα μόνο όταν ενδείκνυται κλινικά, και ζητήθηκε καμία επιπλέον δείγματα για τη μελέτη. Τα δείγματα προοπτικά συλλέγονται και τα διαγράμματα των ασθενών είχαν αναδρομικά. Οι κλινικοί γιατροί δεν γνώριζαν την PCR αποτέλεσμα, το οποίο δεν είχε περιληφθεί ως μικροβιολογικό διαγνωστικό κριτήριο.

Η επεξεργασία των δειγμάτων, γονιδιωματική

Aspergillus

εξαγωγή DNA και ενίσχυσης χρησιμοποιώντας MycAssay ™ Aspergillus

τα δείγματα χωρίστηκαν για καλλιέργεια μυκήτων και για την εκχύλιση του DNA. Όλα τα δείγματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για

Aspergillus

ανίχνευση DNA, και οι περισσότεροι (n = 298/308? 97%) καλλιεργήθηκαν στις δύο βακτήρια και μύκητες μέσα ενημέρωσης. δείγματα BAL (1 mL) φυγοκεντρήθηκαν στις 3000

g

για 10 λεπτά. Τα συμπυκνωμένα σφαιρίδια που ελήφθησαν υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για καλλιέργεια μυκήτων και ραβδώσεις σε πλάκες μέσα καλλιέργειας. Πτυέλων και βρογχική αναρρόφηση μετατράπηκαν σε υγρό με την προσθήκη ακετυλοκυστεΐνη (Pharmazam, Ισπανία) και προστίθενται στις πλάκες άγαρ χρησιμοποιώντας ένα αποστειρωμένο βρόχο (10 μL). Οι μυκητιακές μέσα καλλιέργειας άγαρ Sabouraud-δεξτρόζης με χλωραμφαινικόλη και άγαρ έγχυσης εγκεφάλου-καρδιάς με αντιβακτηριακούς παράγοντες. Τα μέσα βακτηριακής καλλιέργειας ήταν άγαρ αίματος προβάτου και άγαρ σοκολάτας. Νηματοειδών μυκήτων απομονώσεις ταυτοποιήθηκαν σύμφωνα με πρότυπες μορφολογικές διαδικασίες.

Τα δείγματα για την εκχύλιση του DNA φυλάχθηκαν κατεψυγμένα στους -20 ° C μέχρι την ανάλυση της παρτίδας. Πυκνά βλεννώδης δείγματα, όπως πτύελα και βρογχικό αναρρόφηση, μετατράπηκαν σε ρευστό από την προσθήκη του Αντιδραστηρίου BBL ™ MycoPrep ™ (Becton Dickinson, Shannon, Ιρλανδία). Αυτά τα δείγματα και τα δείγματα BAL (1 mL) στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν στα 3000

g

για 20 λεπτά. Τα σφαιρίδια που ελήφθησαν υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για

Aspergillus

εξαγωγή του DNA χρησιμοποιώντας το κιτ εγχειρίδιο MycXtra® μυκητιασική DNA εκχύλισης (Myconostica, τώρα μια εταιρεία Lab21, Cambridge, UK), η οποία περιλαμβάνει ένα μηχανικό βήμα αναστάτωση. BAL υπερκείμενα αποθηκεύονται για τον προσδιορισμό γαλακτομαννάνη.

Καθαρίστηκε εξάγεται γονιδιωματικής

Aspergillus

DNA ενισχύθηκε περαιτέρω με τη χρήση του κιτ MycAssay ™ Aspergillus (Myconostica, τώρα μια εταιρεία Lab21, Cambridge, UK) στην Κηφείδη SmartCycler ® πλατφόρμα (Cepheid, Sunnyvale, California, USA). MycAssay ™ Aspergillus έχει σχεδιαστεί για την ανίχνευση του γονιδιακού DNA από 18 διαφορετικούς

Aspergillus

ειδών (συμπεριλαμβανομένων των

Α. Fumigatus

,

Α. Flavus

,

Α. Terreus

, και

Α. niger

) με τη χρήση μοριακών φάρων. Η δοκιμασία στοχεύει το γονίδιο 18S rRNA και περιέχει ένα εσωτερικό έλεγχο φυτικής προέλευσης για την αποφυγή ψευδώς αρνητικών αποτελεσμάτων λόγω της παρουσίας αναστολέων της PCR.

Εν συντομία, 10 μL του εκχυλισμένου DNA αναμίχθηκε με τα αντιδραστήρια της ενίσχυσης σε ένα τελικό όγκο αντίδρασης 25 μL. Αποτελέσματα PCR για κάθε δείγμα αναφέρθηκαν ως αρνητικός (δείγματα χωρίς

Aspergillus

ενίσχυση DNA με θετική ενίσχυση του εσωτερικού ελέγχου), θετική (δείγματα με

Aspergillus

ενίσχυση του DNA), ή απροσδιόριστο (δείγματα με αρνητικό

Aspergillus

ενίσχυση του DNA και την αποτυχία της ενίσχυσης του εσωτερικού ελέγχου). Το κιτ εκχύλισης MycXtra® DNA και MycAssay ™ Aspergillus εφαρμόστηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή [22]. Το σημείο διέλευσης (Cp) ήταν ο αριθμός του κύκλου κατά την οποία η δοκιμή PCR σε πραγματικό χρόνο έγινε θετική

Η ανάλυση των δεδομένων

Κανένας από τους ασθενείς δεν είχε αποδειχθεί επεμβατική πνευμονική ασπεργίλλωση.? μόνο πιθανές εν τω βάθει ασπεργίλλωση θεωρήθηκε ως μια πραγματική μόλυνση. Υπολογίσαμε την ευαισθησία, ειδικότητα, θετική προγνωστική αξία (PPV), αρνητική προγνωστική αξία (NPV), λόγος πιθανότητας για ένα θετικό αποτέλεσμα (LR +), λόγος πιθανότητας για ένα αρνητικό αποτέλεσμα (LR-), και διαγνωστικές λόγος πιθανοτήτων (DOR) της η PCR για τη διάγνωση της εν τω βάθει πνευμονική ασπεργίλλωση. Όπως πολλαπλά δείγματα της αναπνευστικής οδού μελετήθηκαν σε αρκετούς ασθενείς, τα διαγνωστικά αξίες της PCR υπολογίστηκαν με βάση τόσο τα αποτελέσματα του πρώτου δείγματος υποβάλλονται στο εργαστήριο μικροβιολογίας και τα αποτελέσματα οποιουδήποτε δείγματος από τον ίδιο ασθενή. PCR και καλλιέργεια μυκήτων έχουν περιγραφεί και σε σύγκριση με τη χρήση του τεστ chi-square και ένα πρότυπο διωνυμική μέθοδο για τον υπολογισμό των διαστημάτων εμπιστοσύνης 95%.

Ηθική δήλωση

Αυτή η μελέτη εγκρίθηκε από την τοπική επιτροπή δεοντολογίας (Comité Ético de Investigación Clínica (CEIC-Α1)). Οι συμμετέχοντες έδωσαν γραπτή συγκατάθεση τους να συμμετάσχουν στη μελέτη. Όλα τα στοιχεία των ασθενών ήταν ανώνυμα μετά τη συλλογή.

Αποτελέσματα

Οι 173 ασθενείς που μελετήθηκαν ήταν κυρίως άνδρες (76,3%) και είχαν μέση ηλικία 60,8 ± 19,5 (2-96) ετών. Οι ασθενείς ταξινομήθηκαν ως έχοντες πιθανές εν τω βάθει ασπεργίλλωση (n = 15? 8,7%), είναι δυνατόν διηθητική ασπεργίλλωση (n = 3? 1,7%),

Aspergillus

αποικισμού (κλινικά μη σημαντική

Aspergillus

απομόνωση [n = 21? 12.2%], της πνευμονικής λοιμώξεων από Scedosporium [n = 1? 0,6%]), ή μη επεμβατική μόλυνση μούχλα. Οι 15 ασθενείς με πιθανές εν τω βάθει ασπεργίλλωση συνοψίζονται στον Πίνακα 1. Κατά τη στιγμή της συλλογής του δείγματος, όλοι οι ασθενείς είχαν πυρετό που δεν ανταποκρίνονται στα αντιβιοτικά ευρέος φάσματος, και το 80% που απαιτείται εισαγωγή σε μονάδα εντατικής θεραπείας. Ένα υψηλό ποσοστό (40%) είχαν ΧΑΠ ως υποκείμενο προδιαθέτουν κατάσταση. Σε 14 από τους 15 περιπτώσεις, το πνεύμονα ήταν το μόνο όργανο μολυνθεί. Ορός αποφασιστικότητα γαλακτομανάνης ήταν θετική μόνο σε 5 (35,7%) από τους 14 ασθενείς στους οποίους εφαρμόστηκε.

Η

Aspergillus

spp. απομονώθηκαν σε 63/308 (22%) δείγματα από 31 ασθενείς. Η κατανομή των ειδών έχει ως εξής:

A. fumigatus

(n = 45),

A. niger

(n = 10),

A. terreus

(n = 7),

A. flavus

(n = 5), και άλλα (n = 3) spp.

Aspergillus

spp. απομονώθηκε σε ένα ή περισσότερα κλινικά δείγματα από τους 15 ασθενείς με πιθανές εν τω βάθει ασπεργίλλωση.

MycAssay ™ Aspergillus ήταν θετική σε 54/254 (17,5%) δείγματα, και σε τουλάχιστον ένα δείγμα από 14 από τους 15 ασθενείς με διηθητική ασπεργίλλωση. τιμές Cp θετικών προσδιορισμών PCR ήταν χαμηλότερες σε δείγματα από ασθενείς με πιθανή ασπεργίλλωση σε σχέση με δείγματα από ασθενείς με κλινικά μη σημαντικές

Aspergillus

(30.18 ± 3.3 vs. 33 ± 2,66?

P

= 0.001). Το εύρημα αυτό έδειξε ένα υψηλότερο φορτίο

Aspergillus

spp. σε ασθενείς με εν τω βάθει ασπεργίλλωση σε σχέση με εκείνους που δεν έχουν.

Όπως ήταν αναμενόμενο, το ποσοστό των δειγμάτων με

Aspergillus

απομόνωση ή με θετικά αποτελέσματα PCR ήταν υψηλότερη σε ασθενείς με διηθητική ασπεργίλλωση (Πίνακας 2). Συμφωνία μεταξύ καλλιέργεια μυκήτων και PCR ήταν υψηλή σε όλα τα δείγματα και σε δείγματα από ασθενείς με ή χωρίς διηθητική ασπεργίλλωση (83,9%, 86,5%, και 83,5%, αντίστοιχα). Αποκλίσεις ως επί το πλείστον βρέθηκαν σε δείγματα αποδίδοντας

Aspergillus

χωρίς ενίσχυση DNA (περίπου το 10% των δειγμάτων). Είναι ενδιαφέρον, οι περισσότερες διαφορές βρέθηκαν σε δείγματα από ασθενείς χωρίς εν τω βάθει ασπεργίλλωση (PCR αρνητικά /κουλτούρα θετικά αποτελέσματα, 86%? ΡΟΚ-θετικών /πολιτισμός-αρνητικά αποτελέσματα, 94,4%). Τα δείγματα με ΡΟΚ-θετικών /κουλτούρα αρνητικά αποτελέσματα έδειξαν υψηλότερες τιμές Cp από τα δείγματα στα οποία ο πολιτισμός και PCR ήταν συγκλίνουσες. Η ανάλυση των δειγμάτων από ασθενείς με διηθητική ασπεργίλλωση έδειξε ότι η αναλογία των δειγμάτων στα οποία η PCR αποτέλεσμα ήταν θετικό (63%) δεν διέφερε από την αναλογία των δειγμάτων στα οποία

Aspergillus

spp. απομονώθηκε (75%) (

P

= 0,615). Τα αποτελέσματα της σύγκρισης της PCR και καλλιέργεια μυκήτων με BAL, πτύελα, και βρογχική αναρρόφηση δείγματα παρουσιάζονται στον Πίνακα 3. Η απόδοση της PCR και καλλιέργεια μυκήτων δεν διέφερε με τον τύπο του δείγματος που μελετήθηκαν (

P

& gt ? 0,05)

Η

Η ευαισθησία, η ειδικότητα, PPV, NPV, LR +, LR- και DOR της MycAssay ™ Aspergillus και καλλιέργεια μυκήτων για τη διάγνωση της εν τω βάθει πνευμονική ασπεργίλλωση πραγματοποιούνται σε χαμηλότερο. τα δείγματα της αναπνευστικής οδού ασθενών παρουσιάζονται στους πίνακες 4 και 5. Ευαισθησία ήταν υψηλότερη όταν μελετήθηκαν πολλαπλών δειγμάτων ανά ασθενή? Ωστόσο, η ανάλυση πολλαπλών δειγμάτων δεν επηρέασε εξειδίκευση σε οποιοδήποτε βαθμό. Για να μελετηθεί το πώς η διαγνωστική αξία του PCR θα μπορούσε να επηρεαστεί σε διαφορετικές καταστάσεις, οι ασθενείς χωρίστηκαν στις ακόλουθες ομάδες: οι ασθενείς με ΧΑΠ (n = 91), οι ασθενείς με λοίμωξη δεν βελτιώνεται με αντιβιοτικά (n = 28), και οι ασθενείς στη μονάδα εντατικής θεραπείας με πνευμονία (η = 35). Η ευαισθησία και η ειδικότητα παρέμεινε ανεπηρέαστη από αυτή την διαστρωμάτωση. αποτελέσματα MycAssay ™ Aspergillus ήταν διαθέσιμα περίπου 4 ώρες μετά τη λήψη του δείγματος. Αντίθετα, ο αριθμός των ημερών για την οπτικοποίηση της ανάπτυξης μυκήτων στα μικροβιολογικά πλάκες καλλιέργειας ήταν ως ακολούθως: μέση τιμή, η = 4.3 ± 4.1? διάμεσος, η = 3? και λειτουργία, n = 2.

Η

Σε 14 από τους 15 ασθενείς με πιθανή επεμβατική πνευμονική ασπεργίλλωση, τα δείγματα ελήφθησαν πριν από την έναρξη της αντιμυκητιασική θεραπεία, και υπάρχουν επιπλέον δείγματα μελετήθηκαν κατά τη διάρκεια της αντιμυκητιασική θεραπεία. Σειριακά δείγματα από το υπόλοιπο ασθενή (. Νο 15, Πίνακας 1) μελετήθηκαν? από τα πέντε δείγματα που λαμβάνονται κατά τη διάρκεια της αντιμυκητιασική θεραπεία, τρεις ήταν θετικά για MycAssay και δύο ήταν αρνητικές. Είναι ενδιαφέρον ότι, αφού τα δείγματα έγινε αρνητική για MycAssay, την κλινική κατάσταση του ασθενούς βελτιώθηκε. Από τους τρεις ασθενείς με πιθανές εν τω βάθει ασπεργίλλωση, ένα έλαβε βορικοναζόλη και να βελτιωθεί, και τα δύο δεν έχουν λάβει αντιμυκητιασική θεραπεία και πέθανε. Το αποτέλεσμα της MycAssay ™ Aspergillus ήταν αρνητική για τα δείγματα από τους τρεις ασθενείς με πιθανές εν τω βάθει ασπεργίλλωση.

Συζήτηση

Το φάσμα των ασθενών σε κίνδυνο διηθητικού πνευμονική ασπεργίλλωση έχει επεκταθεί τα τελευταία χρόνια, λόγω της η αύξηση του αριθμού των ασθενών με προδιάθεση όρους διαφορετικούς από αιματολογικές διαταραχές. Η επέκταση αυτή έχει απεικονισθεί στις μελέτες που διεξήχθησαν σε μεγάλα τριτοβάθμια νοσοκομεία όπου συλλογή περίπτωση δεν περιορίστηκε στις μονάδες αιματολογίας θάλαμο και εντατική φροντίδα και όπου ένας μεγάλος αριθμός αυτοψίες εκτελούνται [6], [8], [23].

Διηθητική ασπεργίλλωση σε ασθενείς με μη-αιματολογικές κακοήθειες χαρακτηρίζεται από υψηλή θνησιμότητα (60-100%) [6], [10], [11], η οποία πιθανώς αντανακλά τους περιορισμούς της τρέχουσας διαγνωστικά εργαλεία που βασίζονται στην ακτινολογία ή μικροβιολογία και το χαμηλό δείκτη κλινικής υποψίας.

η διάγνωση της εν τω βάθει ασπεργίλλωση βασίζεται σε ένα συνδυασμό των συμβατών κλινικών ευρημάτων σε ασθενείς με παράγοντες κινδύνου, μαζί με ιστοπαθολογικές ενδείξεις της εισβολής, ακτινολογικά ευρήματα, απομόνωση

Aspergillus

spp σε χαμηλότερα δείγματα της αναπνευστικής οδού, ή την ανίχνευση των κυκλοφορούντων βιοδεικτών στα υγρά. Ιστοπαθολογία είναι απαραίτητη για να ληφθεί ένα οριστική διάγνωση, αν και βιοψίες πνεύμονα σπάνια λαμβάνονται [24]. Σε σύγκριση με τον πολιτισμό και διαγνωστικές εξετάσεις μοριακής, η ακρίβεια των ιστομορφολογικά διάγνωση είναι στην καλύτερη περίπτωση το 80% [25]. Τα ακτινολογικά ευρήματα που είναι κοινά σε ασθενείς με ουδετεροπενία και εν τω βάθει ασπεργίλλωση είναι σπάνια σε μη ουδετεροπενικούς ασθενείς [8], [26]. Πολιτισμού δείγματα της κατώτερης αναπνευστικής οδού από ασθενείς με κλινική υποψία εξακολουθεί να χρησιμοποιείται ευρέως, αν και είναι βραδεία και περιορίζεται από τη χαμηλή ευαισθησία και ειδικότητα [27]. Επιπλέον, η ανίχνευση των κυκλοφορούντων γαλακτομαννάνης σε δείγματα ορού από μη ουδετεροπενικούς ασθενείς έχει χαμηλή ευαισθησία για τη διάγνωση της εν τω βάθει ασπεργίλλωση [6], [14], [16].

Σε αυτό το σενάριο, η ανάπτυξη της γρήγορη, ευαίσθητη και ειδική διαγνωστική διαδικασίες για την ανίχνευση

Aspergillus

σε δείγματα της αναπνευστικής οδού από ασθενείς χωρίς αιματολογικές κακοήθειες είναι ελκυστική. Ένα από τα πιο ενθαρρυντικά νέες διαδικασίες είναι DNA

Aspergillus

ανίχνευση με PCR δοκιμασίες σε πραγματικό χρόνο. Στη μελέτη μας, τα αποτελέσματα της PCR ήταν διαθέσιμα το συντομότερο 4 ώρες μετά τη συλλογή του δείγματος, το οποίο είναι ένα must ταχύτερη ανάκαμψη από ό, τι των 3 ημερών οφείλει να τηρεί την ανάπτυξη των

Aspergillus

στον πολιτισμό. Ωστόσο, ο χρόνος από την καλλιέργεια του δείγματος και ανίχνευση της ανάπτυξης μυκήτων μπορεί να μειωθεί με την επιθεώρηση πλάκες κάθε μέρα, ακόμη και το Σαββατοκύριακο. Επιπλέον, η ταυτόχρονη ενίσχυση του DNA σε δείγματα της αναπνευστικής οδού και καλλιέργεια μυκήτων θα μας επιτρέψουν να εντοπίσει απομονώσεις σε επίπεδο είδους και να εκτελέσει αντιμυκητιακή δοκιμή ευαισθησίας σε απομονωμένα στελέχη.

Ανίχνευση

Aspergillus

DNA σε δείγματα BAL είναι ενθαρρυντικό και επιβεβαιώνει τη διάγνωση της εν τω βάθει ασπεργίλλωση σε περισσότερους ασθενείς από τις συμβατικές διαδικασίες [28]. Έχει μελετηθεί κυρίως σε ασθενείς με αιματολογικές διαταραχές [29], [30], [31]. Μια πρόσφατη μετα-ανάλυση έδειξε μια ευαισθησία και ειδικότητα των 0,91 και 0,92, αντίστοιχα, αλλά τόνισε την έλλειψη τυποποίησης [32]. Παρ ‘όλα αυτά, ο ρόλος της PCR σε δείγματα της αναπνευστικής οδού από μη-αιματολογικές ασθενών απαιτεί περαιτέρω αξιολόγηση. δείγματα BAL συλλέχθηκαν σε 4 από τους 15 ασθενείς με πιθανές εν τω βάθει ασπεργίλλωση. Σε όλες τις περιπτώσεις, οι συγκεντρώσεις γαλακτομαννάνη BAL ήταν πάνω από 0,5 ng /ml.

Η έλλειψη τυποποίησης του

Aspergillus

PCR μέχρι σήμερα έχει εμποδίσει την εισαγωγή του στο καθορισμό κριτηρίων για πιθανή ασπεργίλλωση [20 ]. MycAssay ™ Aspergillus είναι ένα εμπορικά διαθέσιμο πραγματικού χρόνου PCR για την ανίχνευση των πιο κλινικά σχετικές

Aspergillus

είδη [22]. Ως ένα πλήρως τυποποιημένη δοκιμή σήμανση CE με πλήρη έλεγχο της ποιότητας κατασκευής, MycAssay ™ Aspergillus πληροί τις απαιτήσεις για την τυποποίηση του

Aspergillus

PCR αναγκαίο να επιβεβαιωθεί η διάγνωση της εν τω βάθει ασπεργίλλωση. MycAssay ™ Aspergillus είχε προηγουμένως προσδιορίστηκε σε δείγματα BAL [19], δείγματα πτυέλων [33], [34], και δείγματα ιστών [35]. MycAssay μπορεί να πραγματοποιηθεί στην κλινική μικροβιολογικό εργαστήριο από προσωπικό εκπαιδευμένο στην τεχνολογία μοριακής βιολογίας? το εκτιμώμενο κόστος της δοκιμής ανά αποφασιστικότητα στην Ισπανία είναι € 25-30.

Εμείς αξιολογούνται MycAssay ™ Aspergillus σε χαμηλότερα δείγματα της αναπνευστικής οδού (συμπεριλαμβανομένης της BAL, αυθόρμητη πτυέλων και βρογχική αναρρόφηση) από ασθενείς με καταστάσεις που προδιαθέτουν εκτός από αιματολογικές κακοήθειες και κλινική υποψία της εν τω βάθει ασπεργίλλωση. Βρήκαμε ότι τα τρία είδη δειγμάτων κατώτερου αναπνευστικού συστήματος που μελετήθηκαν ήταν κατάλληλο για την ανίχνευση

Aspergillus

spp. DNA. χρυσό πρότυπο μας ήταν κλινικά σε ότι κατατάσσονται οι ασθενείς με βάση τα κριτήρια που προτείνει η EORTC [20], [21] ή με Bulpa [20], [21]. Η ευαισθησία της PCR ήταν υψηλό και αυξάνεται όταν μελετήθηκαν πολλά δείγματα ανά ασθενή? ειδικότητα δεν επηρεάστηκε από συμπεριλαμβανομένων των πολλαπλών δειγμάτων ανά ασθενή. Ευαισθησία ήταν επίσης υψηλό σε ασθενείς με ΧΑΠ, μια κατάσταση προδιάθεσης σε ένα μεγάλο ποσοστό των ασθενών που μελετήθηκαν. MycAssay ™ Aspergillus έδειξαν ένα υψηλό ΚΠΑ, γεγονός που υποδηλώνει ότι ένα PCR-αρνητικό αποτέλεσμα σε κάθε δείγμα κατώτερης αναπνευστικής οδού από έναν ασθενή χωρίς καρκίνο αιματολογικές θα μπορούσε να αποδειχθεί χρήσιμη για τον αποκλεισμό των εν τω βάθει ασπεργίλλωση. Σε αντίθεση, η PPV της δοκιμασίας ήταν χαμηλή. Μια εξήγηση για αυτό το εύρημα είναι ότι MycAssay ™ Aspergillus είναι σε θέση να ανιχνεύσει

Aspergillus

DNA σε δείγματα από ασθενείς αποικίσει ή από ασθενείς με άλλες μορφές ασπεργίλλωση, συμπεριλαμβανομένης της χρόνιας και της αλλεργικής πνευμονικής ασπεργίλλωσης [36], [37] ( Πίνακας 5). Μια άλλη εξήγηση μπορεί να είναι η χαμηλή επικράτηση των χωροκατακτητικών πνευμονική ασπεργίλλωση που βρέθηκαν στον πληθυσμό της μελέτης.

Ο κύριος περιορισμός της μελέτης μας είναι ότι δεν ήμασταν σε θέση να συμπεριλάβει ιστολογικά αποδεδειγμένες περιπτώσεις επειδή δεν βιοψίες πνεύμονα συλλέχθηκαν ή μετά τη σφαγή έγιναν οι εξετάσεις. Αυτό είναι ένα κοινό περιορισμός σε μελέτες που αξιολογούν το ρόλο των νέων διαγνωστικών εργαλείων για τη διάγνωση της διηθητική ασπεργίλλωση. Ως εκ τούτου, οι ασθενείς διαγνώστηκαν με διηθητική ασπεργίλλωση βασίζονται σε μικροβιολογικά ή ακτινολογικών δεδομένων. Το γεγονός ότι

Aspergillus

απομονώθηκε από δείγματα της κατώτερης αναπνευστικής οδού σε όλους τους ασθενείς θα μπορούσε να εξηγήσει την υψηλή συσχέτιση βρέθηκε μεταξύ καλλιέργεια μυκήτων και PCR. Σε ασθενείς μας, MycAssay ™ Aspergillus δεν μας επιτρέπουν να διαγνώσει νέες περιπτώσεις που θα μπορούσε να χαθεί με την καλλιέργεια μυκήτων. Ένας άλλος περιορισμός είναι ότι κατατάσσονται ασθενείς μας χρησιμοποιώντας τα κριτήρια EORTC, οι οποίες αναπτύχθηκαν ειδικά για τους ασθενείς με καρκίνο. κριτήρια EORTC επιλέχθηκαν με την απουσία συγκεκριμένων κριτηρίων για τους ασθενείς με μη-καρκίνου.

Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι MycAssay ™ Aspergillus πραγματοποιήθηκε σε δείγματα της κατώτερης αναπνευστικής οδού έδειξαν υψηλή ευαισθησία για τη διάγνωση της εν τω βάθει ασπεργίλλωση σε ασθενείς χωρίς καρκίνο αιματολογικές. Ευαισθησία αυξάνεται όταν αναλύθηκαν πολλαπλά δείγματα. Ευαισθησία ήταν υψηλή για τους ασθενείς με ΧΑΠ, η οποία είναι μια αναδυόμενη πληθυσμός κίνδυνος σε ορισμένα νοσοκομεία. MycAssay ™ Aspergillus αποδείχθηκε ιδιαίτερα χρήσιμη για να αποκλεισθεί η διάγνωση της διηθητικής ασπεργίλλωσης και μείωσε σημαντικά το χρόνο για τη διάγνωση σε σύγκριση με τα συμβατικά καλλιέργεια μυκητιασική. MycAssay ™ Aspergillus θα πρέπει να χρησιμοποιείται ταυτόχρονα με καλλιέργεια μυκήτων από δείγματα της κατώτερης αναπνευστικής οδού, προκειμένου να παρέχουν πρόσθετα στοιχεία για την αντιμυκητιακή ευαισθησία και διασφαλίζει την ακριβή ταυτοποίηση των απομονωμένων.

Ευχαριστίες

Θα θέλαμε να ευχαριστήσουμε Thomas O’Boyle για την επεξεργασία και την επιμέλεια του άρθρου. Εκτιμούμε τις πολύτιμες προτάσεις του David W. Denning μετά την κριτική επανεξέταση του χειρογράφου. Η μελέτη αυτή παρουσιάστηκε το μέρος στο 21ο Ευρωπαϊκό Συνέδριο Κλινικής Μικροβιολογίας και Λοιμωδών Νοσημάτων (ECCMID) και 27ο Διεθνές Συνέδριο για την Χημειοθεραπεία (ΔΠΔ), Μιλάνο, Ιταλία, 2011 (Ρ-2095).