Αφηρημένο

Ο καρκίνος του προστάτη είναι μια πολύ κοινή μορφή καρκίνου στους άνδρες. Παραδοσιακές θεραπείες για τον καρκίνο του προστάτη έχουν περιορισμένη αποτελεσματικότητα? Ως εκ τούτου, πρέπει να διερευνηθούν νέες θεραπευτικές στρατηγικές ή /και νέες ανοσοενισχυτικό ναρκωτικών. Κόκκινο ρύζι ζύμης (RYR) είναι ένα παραδοσιακό καρύκευμα τροφίμων κατασκευάζονται στην Ασία από τη ζύμωση άσπρου ρυζιού με

Monascus purpureus

Πήγε μαγιά. Συσσωρευμένα στοιχεία δείχνουν ότι RYR έχει αντικαρκινική δράση. Σε αυτή τη μελέτη, PC-3 κύτταρα (ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του προστάτη) χρησιμοποιήθηκαν για να διερευνήσει τις αντικαρκινικές επιδράσεις της ιονίζουσας ακτινοβολίας (IR) σε συνδυασμό με monascuspiloin (MP, μια κίτρινη χρωστική ουσία που απομονώνεται από

Monascus pilosus M93

– που έχουν υποστεί ζύμωση ρύζι) και να καθορίσει τα υποκείμενα των μηχανισμών αυτών των επιδράσεων

in vitro

και

in vivo

. Βρήκαμε ότι IR σε συνδυασμό με MP έδειξαν αυξημένη θεραπευτική αποτελεσματικότητα σε σύγκριση με είτε θεραπεία μόνη της σε PC-3 κύτταρα. Επιπλέον, η συνδυασμένη θεραπεία ενισχυμένη βλάβη του DNA και ενδοπλασματικό δίκτυο (ER) του στρες. Η συνδυασμένη θεραπεία που προκαλείται κυρίως αυτοφαγία σε κύτταρα PC-3, και το θάνατο των κυττάρων που προκαλείται από τη συνδυασμένη θεραπεία ήταν κυρίως το αποτέλεσμα της αναστολής της /mTOR μονοπατιών σηματοδότησης Akt. Σε μια

in vivo

μελέτη, η θεραπεία συνδυασμού έδειξε μεγαλύτερη ανάπτυξη επιδράσεις κατά του όγκου. Αυτά τα νέα ευρήματα υποδηλώνουν ότι η συνδυασμένη θεραπεία θα μπορούσε να είναι μια πιθανή θεραπευτική στρατηγική για τον καρκίνο του προστάτη

Παράθεση:. Chiu H-W, Fang W-Η, Chen Υ-L, Wu M-D, Yuan G-F, Ho S-Y, et al. (2012) Monascuspiloin Ενισχύει την ακτινοβολία ευαισθησία των κυττάρων του Ανθρώπου του καρκίνου του προστάτη με την τόνωση Ενδοπλασμικό Δίκτυο άγχος και προκαλώντας Autophagy. PLoS ONE 7 (7): e40462. doi: 10.1371 /journal.pone.0040462

Συντάκτης: Kevin Camphausen, ΝΙΗ, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 17 Απρίλη 2012? Αποδεκτές: 18η Μαΐου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 3 του Ιούλη του 2012

Copyright: © 2012 Chiu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από την Έρευνα και Ανάπτυξη Ινστιτούτο Βιομηχανίας Τροφίμων και την οικονομική στήριξη (101-EC-17-Α-01-04-0525) του Υπουργείου οικονομικών, το Εθνικό Επιστημονικό Συμβούλιο, την Ταϊβάν (NSC 100 έως 2314-Β- 006 -055), η Sinlau Christian Νοσοκομείο, Ταϊνάν, Ταϊβάν, Food and Drug Administration, Τμήμα, Εκτελεστικό Yuan (DOH101-FDA-41301) και στόχος για το Πανεπιστήμιο Έργο Αρχή. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

κόκκινο ρύζι ζύμης (RYR), επίσης γνωστή ως κόκκινη Koji ή «Hongqu», περιλαμβάνει κυρίως nonglutinous ρύζι, κόκκινη μαγιά, και παραπροϊόντα της ζύμωσης. RYR είναι ένα παραδοσιακό καρύκευμα τροφίμων που καταναλώνονται σε όλη την Ασία [1]. Παράγεται από τη ζύμωση του μύκητα φαγητό, ένα

Monascus

είδη, με ρύζι στον ατμό και έχει χρησιμοποιηθεί για περισσότερα από 600 χρόνια για να παράγουν κρασιά και άλλα προϊόντα ζύμωσης τροφίμων. Αρκετά είδη του μύκητα

Monascus

έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως στην κατασκευή κόκκινο κρασί και τυρί σόγιας κόκκινο [2].

Monascus

-fermented προϊόντα έχουν πολλά λειτουργικά δευτερογενείς μεταβολίτες, συμπεριλαμβανομένων monacolin K, citrinin, ankaflavin και monascin. Σε αρκετές πρόσφατες μελέτες, αυτές οι δευτερογενείς μεταβολίτες έχουν δείξει αντι-φλεγμονώδη, αντι-οξειδωτικό, και κατά του όγκου δραστηριότητες [3], [4]. Πολλές μελέτες έχουν επίσης ερεύνησαν την ικανότητα αντικαρκινική RYR, όπως στο παχύ έντερο, μαστό, πνεύμονα, και καρκίνου του προστάτη [3]. Οι κατηγορίες των δομών πολυκετιδίου που προκύπτουν από τη διαδικασία της ζύμωσης που ονομάζεται monacolins, και η κύρια monacolin βρέθηκαν σε RYR είναι μονακολίνη Κ [5]. Ωστόσο, RYR έδειξε μια πιο ισχυρή αναστολή της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων σε σύγκριση με monacolin K [6], [7]. Ωστόσο, οι άλλες πολυκετίδες σε RYR μπορεί να παρέχει ένα βοτανικό προσέγγιση στη θεραπεία του καρκίνου, που είναι άξιο περαιτέρω έρευνα.

Ο καρκίνος του προστάτη είναι η πιο συχνή κακοήθεια του κόσμου και η δεύτερη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο [8]. Πρώιμη σταδίου καρκίνου του προστάτη είναι ανδρογόνο-εξαρτώμενη και μπορεί να αντιμετωπιστεί αποτελεσματικά με θεραπεία απόσπασης ανδρογόνων, ακτινοβολία, και /ή χειρουργική επέμβαση. Ωστόσο, ο καρκίνος του προστάτη κύτταρα προχωρήσουν σε μια ανδρογόνο ανεξάρτητο κράτος, όπου μπορούν να προχωρήσουν και να οδηγήσει σε μετάσταση και το θάνατο [9]. Επειδή η χημειοθεραπεία και η ακτινοθεραπεία είναι σε μεγάλο βαθμό αναποτελεσματικές και ασθένειες μεταστατική αναπτύσσουν συχνά ακόμη και μετά από χειρουργική επέμβαση, υπάρχουν περιορισμένες θεραπευτικές επιλογές διαθέσιμες για τον καρκίνο του προστάτη [10]. Ως εκ τούτου, πρέπει να αναπτυχθούν νέες μεθόδους θεραπείας του καρκίνου του προστάτη. Συσσωρευμένα στοιχεία έχουν δείξει ότι η επίκτητη αντοχή σε θεραπεία με ακτινοβολία μπορεί να ξεπεραστεί με τη χρήση ενώσεων με μικρό μόριο που στοχεύουν βασικές πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην αντίσταση ακτινοβολίας [11]. Anticancer θεραπευτικές προσεγγίσεις, όπως ιονίζουσα ακτινοβολία (IR), μπορούν να ενεργοποιήσουν αποπτωτικό κυτταρικό μηχανισμό σε μη εξαρτώμενου από ανδρογόνα καρκίνου του προστάτη κύτταρα [12]. Ωστόσο, επίκτητη αντίσταση ακτινοβολία μπορεί να αναπτυχθεί σε καρκίνο του προστάτη ανθεκτικού στις ορμόνες που σχετίζονται με την αντίσταση απόπτωση [13]. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει επίσης ότι τα ελαττώματα στην αποπτωτική μηχανήματα συσχετίζεται με την αντίσταση των καρκινικών κυττάρων με την τρέχουσα θεραπευτικές παρεμβάσεις, συμπεριλαμβανομένων IR [14].

Autophagy είναι μια σημαντική καταβολική διαδικασία που είναι υπεύθυνη για την αποδόμηση και την ανακύκλωση μακρόβιων πρωτεΐνες, κυτταρικών αδρανών υλικών και κατεστραμμένα οργανίδια. Εκτός από την καλά τεκμηριωμένη ρόλο της αυτοφαγία στην κυτταρική επιβίωση, μια λειτουργία για την αυτοφαγία σε κυτταρικό θάνατο έχει από καιρό προτείνει [15]. Τα τελευταία χρόνια, ο ρόλος της αυτοφαγία ως εναλλακτικό μηχανισμό κυτταρικού θανάτου αποτέλεσε θέμα συζήτησης. Μελέτες βρίσκονται σε εξέλιξη για να καθορίσουν τις βέλτιστες στρατηγικές για να διαμορφώσουν αυτοφαγία για την πρόληψη και τη θεραπεία του καρκίνου και να εκμεταλλευτεί αυτοφαγία ως στόχο για την ανακάλυψη αντικαρκινικών φαρμάκων [16]. Η ενεργοποίηση της κινάσης ΡΙ3 /Akt μονοπάτι, μια πολύ γνωστή μέθοδος αναστολής της απόπτωσης, αναστέλλει επίσης autophagy [17]. Akt φωσφορυλιώνει στόχος της ραπαμυκίνης στα θηλαστικά (mTOR), η οποία έχει αναφερθεί ότι αναστέλλει την επαγωγή του autophagy [18]. Προηγούμενες μελέτες έχουν αποδείξει ότι η ενδοπλασματικό δίκτυο (ER) αντίδραση στο στρες, σε συνδυασμό με την αυτοφαγία, αντιπροσωπεύει ένα προσαρμοστικό μηχανισμό για τη στήριξη επιβίωση κυττάρου σε απόκριση σε μία μεγάλη ποικιλία από επιβλαβείς συνθήκες [19]. ER στρες ενεργοποιεί μια σειρά από μονοπάτια που συλλογικά ονομάζονται το ανοιγμένο Response πρωτεΐνης (UPR) σηματοδότησης. Τυπικά, UPR σηματοδότηση προάγει επιβίωση κυττάρου με τη βελτίωση της ισορροπίας μεταξύ του φορτίου πρωτεΐνης και την αναδίπλωση ικανότητα στο ER [20]. Ωστόσο, εάν τα κύτταρα εκτίθενται σε παρατεταμένη ή ισχυρή στρες ER, τα κύτταρα πεθαίνουν με απόπτωση [21]. Αυξανόμενες ενδείξεις έδειξε ότι ER στρες είναι επίσης ένα ισχυρό έναυσμα της αυτοφαγία [22]. Έτσι, η καλύτερη κατανόηση των οδών σηματοδότησης που ελέγχουν ER στρες που επάγεται από αυτοφαγία και την κυτταρική μοίρα θα ανοίξει ελπίζουμε νέες δυνατότητες για τη θεραπεία του καρκίνου.

(Α) Χημική δομή του βουλευτή. (Β) εξαρτάται από τη συγκέντρωση επιδράσεις του MP στη βιωσιμότητα των PC-3 κύτταρα. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5, 15, 25, 35 ή 45 μΜ MP για 48 ώρες. *,

σ

& lt? 0,05, βουλευτής έναντι του ελέγχου. (C) Τα κυτταροτοξικά αποτελέσματα σε κύτταρα κατεργασμένα με IR (4 Gy) και /ή ΜΡ (25 μΜ). #,

σ

& lt? 0,05, IR σε σχέση με συνδυασμένη θεραπεία. *,

σ

& lt? 0,05, MP σε σχέση με συνδυασμένη θεραπεία. (D) η ακτινοβολία καμπύλες επιβίωσης δόσης-απόκρισης της PC-3 κύτταρα με ή χωρίς ΜΡ. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Monascuspiloin (MP), μία κίτρινη χρωστική ουσία απομονώθηκε για πρώτη φορά από την ομάδα μας από το

Monascus pilosus M93

-fermented ρύζι, είναι δομικά παρόμοια με το γνωστό

Monascus

χρωστική monascin. Ωστόσο, οι μηχανισμοί που διέπουν τις επιδράσεις του βουλευτή σε συνδυασμό με IR για τον καρκίνο του προστάτη είναι σε μεγάλο βαθμό άγνωστη. Στην παρούσα μελέτη, PC-3 κύτταρα (ανεξάρτητο από ανδρογόνο καρκίνου του ανθρώπινου προστάτη κύτταρα) χρησιμοποιήθηκαν για να διερευνηθούν οι αντικαρκινικές επιδράσεις του IR σε συνδυασμό με MP

in vitro

και

in vivo

. Εξετάστηκαν οι τύποι κυτταρικού θανάτου που επάγεται από IR όταν συνδυάζεται με ΜΡ. Ερευνήσαμε επίσης τους πιθανούς μηχανισμούς πίσω από το θάνατο κυττάρου που διεγείρεται από IR ή /και ΜΡ στα κύτταρα PC-3.

Gy) και ΜΡ (25 μΜ). Οι ουρές υποδεικνύουν βλάβη του DNA. (Β) Η επίδραση της ΜΡ ή IR μόνα τους ή σε συνδυασμό για 48 ώρες κατά μέσο όρο ουρά DNA. #,

σ

& lt? 0,05, IR σε σχέση με συνδυασμένη θεραπεία. *,

σ

& lt? 0,05, βουλευτής έναντι συνδυασμένη θεραπεία

Η

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια

Το ανθρώπινο προστάτη καρκινική κυτταρική σειρά. PC-3 (ATCC CRL-1435) ελήφθη από την American Type Culture Collection (ATCC). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI 1640 (Gibco BRL, Grand Island, ΝΥ) συμπληρωμένο με αντιβιοτικά που περιέχει 100 U /ml πενικιλλίνη, 100 μg /ml στρεπτομυκίνη (Gibco BRL, Grand Island, ΝΥ) και 10% ορό εμβρύου μόσχου (HyClone, Νότια Logan, UT, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής). Τα κύτταρα επωάστηκαν σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 5% CO

2 στους 37 ° C. Εκθετικά αναπτυσσόμενα κύτταρα αποκολλήθηκαν χρησιμοποιώντας 0.05% θρυψίνη-ΕϋΤΑ (Gibco BRL, Grand Island, ΝΥ) σε μέσο RPMI 1640.

(Α) πρώιμη απόπτωση, ανιχνεύεται χρησιμοποιώντας ένα κιτ ανίχνευσης απόπτωσης αννεξίνης V, μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ροή κυτταρομετρία. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με IR (4 Gy) και ΜΡ (25 μΜ) για 48 ώρες. (Β) Ανάπτυξη Avós σε κύτταρα PC-3. Ανίχνευση του πράσινου και κόκκινου φθορισμού σε AO-χρωματισμένα κύτταρα χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής. (Γ) Ποσοτικοποίηση των Avós με ΑΟ-χρώση κύτταρα κατεργασμένα με IR (4 Gy) ή ΜΡ (25 μΜ) μόνη ή σε συνδυασμό με τη χρήση κυτταρομετρίας ροής. #,

σ

& lt? 0,05, IR σε σχέση με συνδυασμένη θεραπεία. *,

σ

& lt? 0,05, MP σε σχέση με συνδυασμένη θεραπεία. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. (D) EM μικροφωτογραφίες του PC-3 κύτταρα που υπέστησαν αγωγή με IR (4 Gy) και ΜΡ (25 μΜ) για 48 ώρες. Η

λευκά βέλη

σημείο να αυτοφαγικά κενοτόπια και autolysosomes. (Ε) κηλίδωση Western για LC3-Ι, LC3-ΙΙ, Ρ62 /SQSTM1 και Atg5-12 σε PC-3 κύτταρα. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με IR (4 Gy) και MP (25 μΜ) για 48 ώρες.

Η

μικροοργανισμών και την προετοιμασία των monascuspiloin (MP)

Monascus pilosus M93

ελήφθη από BCRC, FIRDI (Hsinchu, Ταϊβάν) και διατηρήθηκαν σε άγαρ δεξτρόζης πατάτας (PDA? Difco). Το στέλεχος απλώθηκε πάνω σε πλάκες PDA και καλλιεργήθηκαν στους 25 ° C για 7 ημέρες. Τα σπόρια πλύθηκαν κατόπιν έξω από την πλάκα PDA χρησιμοποιώντας αποστειρωμένο νερό και η συγκέντρωση του προκύπτοντος αιωρήματος σπορίων ρυθμίσθηκε σε 1 χ 10

6 /ml. Μετά τον εμπλουτισμό βήμα σπόρια, 1 ml αιωρήματος σπορίων εμβολιάστηκε μέσα σε 250 ml φιάλες ανακίνησης που περιέχει μέσο 50 ml RGY (3% άμυλο ρυζιού, 7% γλυκερόλη, 1,2% πολυπεπτόνη, 3% σκόνη σόγιας, 0,1% θειικό μαγνήσιο

4 και 0.2 % NaNO

3) και καλλιεργείται με ανακίνηση (150 rpm) στους 25 ° C για 3 ημέρες για να ληφθεί το ζωμό μυκήλιο του M93. Για την παραγωγή του RYR, πενήντα 450-ml γυάλινες φιάλες, που το καθένα περιέχει 75 g ρύζι και 75 ml D.I. νερό, αποστειρώθηκαν για 20 λεπτά στους 121 ° C. M93 ζωμός μυκήλιο (7,5 ml) και μέσο RGY (7,5 ml) προστέθηκαν σε κάθε φιάλη. Οι bottltes στη συνέχεια επωάστηκαν στους 25 ° C για 21 ημέρες (7.5 ml μέσου RGY προστέθηκε σε κάθε φιάλη στις 10

ης ημέρας της επώασης), και τα περιεχόμενα έπειτα λυοφιλοποιήθηκε για να απομακρυνθεί το νερό. Η RYR (1 kg) εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας 95% αιθανόλη (3 L) στους 25 ° C για 24 ώρες, και η αιθανόλη απομακρύνθηκε υπό κενό ξήρανση για να ληφθεί το ακατέργαστο εκχύλισμα RYR. Το ποσό των ΜΡ στα ακατέργαστα εκχυλίσματα μετρήθηκε χρησιμοποιώντας HPLC με RP-18 στήλη purospher® αστέρι (Merck). Η κινητή φάση αποτελείται από 60% ακετονιτρίλιο που περιέχει φωσφορικό 0,1% με ρυθμό ροής 1.0 ml /min. Η RYR (1 kg) στη συνέχεια εκχυλίζεται με 70% αιθανόλη (3 L) στους 25 ° C. Μετά από διήθηση, το εκχύλισμα αιθανόλης συμπυκνώθηκε και οξικό αιθυλεστέρα (ΕΑ) προστέθηκε για να ληφθεί μια EA-διαλυτό κλάσμα. Το ΕΑ-διαλυτό κλάσμα ήταν ένεση σε μία στήλη πυριτικής πηκτής (70-230, 230-400 mesh, Merck) και εκλούεται χρησιμοποιώντας κ-εξάνιο /οξικό αιθυλεστέρα (2:01). Για να ληφθεί ΜΡ, το εκλουόμενο κλάσμα συμπυκνώθηκε υπό ελαττωμένη πίεση και καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας παρασκευαστική χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας (silica gel 60 F-254, Merck) με

n

-εξάνιο /EtOAc (2:01).

Gy) και /ή MP (25 μΜ) για 48 ώρες.

Η

Οπτικές περιστροφές μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ψηφιακό πολωσίμετρο Jasco P-1020. Τα φάσματα υν ελήφθησαν σε MeOH χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο Jasco UV-240, και IR φάσματα (KBr ή σκέτο) ελήφθησαν χρησιμοποιώντας ένα φασματόμετρο FT-IR Perkin-Elmer System 2000. Η 1D (

1

13C, DEPT) και 2D (COSY, NOESY, HSQC, HMBC) φάσματα NMR χρησιμοποιώντας ΟϋΟ

3 και CD

3OD ως διαλύτες, καταγράφηκαν χρησιμοποιώντας ένα Varian Unity Plus 400 (400 MHz για

1 NMR, 100 MHz για

13C NMR) και Varian INOVA-500 (500 MHz για

1 NMR, 125 MHz για

13C NMR) φασματόμετρο. Οι χημικές μετατοπίσεις αναφέρονται στα εσωτερικά σήματα διαλύτη ΟϋΟ

3 (

1Η, δ 7.26?

13C, δ 77.0) και TMS χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικό πρότυπο. Χαμηλής ανάλυσης ESI-MS φάσματα λήφθηκαν χρησιμοποιώντας ένα API 3000 (Applied Biosystems), και υψηλής ανάλυσης ESI-MS φάσματα obstained χρησιμοποιώντας ένα φασματόμετρο Bruker 30e Daltonics APEX II.

Gy) ή ΜΡ (1 mg /kg χ 6) μόνη ή σε συνδυασμό. (Α) Το βάρος του σώματος σε γυμνά ποντίκια, μετρώνται μια φορά την εβδομάδα. (Β) Ο όγκος του όγκου σε γυμνά ποντίκια, μετρώνται κάθε δύο ημέρες. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως ο σχετικός όγκος του όγκου (μέση ± τυπικό σφάλμα) κανονικοποιημένη με τον αρχικό όγκο του όγκου μετρήθηκε την ημέρα 0. (C) Άμεση παρατηρήσεις των ποντικιών με όγκους. Μετά τα πειράματα, οι ποντικοί θυσιάστηκαν και οι όγκοι αφαιρέθηκαν. (D) Μέτρηση του βάρους του όγκου σε γυμνά ποντίκια μετά τη θυσία. (Ε) Ανοσοϊστοχημική (IHC) και αιματοξυλίνη και εοσίνη (Η &? Ε) χρώση των ιστών PC-3 ξενομοσχεύματος ποντικού. IHC χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστούν τα επίπεδα έκφρασης της LC3 και Ρ62 /SQSTM1 (× 100 στόχος μεγέθυνση).

Η

MP, απομονωμένα ως ένα κιτρινωπό λάδι, ανατέθηκε το μοριακό τύπο C

21H

28o

5Na με ESI-MS ([Μ + Na]

+

m /z

383) και HR-ESI-MS ([Μ + Na]

+,

m /z

383.1832). ΜΡ ήταν παρόμοια με εκείνη μίας γνωστής ένωσης, monascin, η δομή του MP προσδιορίστηκε να είναι (3

S

,3a

R

,9a

R

)-3a,4-dihydro-3-((

S

)-1-hydroxyhexyl)-9a-methyl-6-((E)-prop-1-enyl)-3

H

-furo [3, 2-

g

] ισοχρωμένιο-2,9 (8

Η

, 9α

Η

) -διόνη (Εικ. 1Α).

θεραπεία ακτινοβόλησης και η βιωσιμότητα των κυττάρων δοκιμασία

IR έγινε με 6 MV ακτίνες Χ χρησιμοποιώντας ένα γραμμικό επιταχυντή (Digital Μ Mevatron επιταχυντή, η Siemens Medical Systems, CA, USA) με ρυθμό δόση 5 Gy /min. Ένα επιπλέον 2 cm από ένα βλωμό ιστού ισοδύναμου τοποθετήθηκε στην κορυφή των φιαλών πλαστικό ιστοκαλλιέργειας για να εξασφαλιστεί ηλεκτρονική ισορροπία, και 10 cm από υλικό ιστού ισοδύναμου τοποθετήθηκε κάτω από τις φιάλες για να ληφθεί πλήρους πίσω σκέδασης. Τα επεξεργασμένα κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε 0.1 ml PBS. Κάθε εναιώρημα κυττάρων (0,02 ml) αναμίχθηκε με 0.02 ml trypan blue διάλυμα (0,2% σε PBS). Μετά από 1 ή 2 λεπτά, κάθε διάλυμα τοποθετήθηκε σε ένα αιμοκυτταρόμετρο και τα μπλε χρωματισμένα κύτταρα μετρήθηκαν ως μη άθικτο.

κλωνογονική δοκιμασία

Τα κύτταρα ακτινοβολήθηκαν χρησιμοποιώντας 2, 4 ή 6 Gy. MP προστέθηκε στα κύτταρα σε συγκεντρώσεις 15 ή 25 μΜ. Τα κύτταρα τρυψινοποιήθηκαν και μετρήθηκαν. Γνωστά αριθμοί κυττάρων στη συνέχεια απλώνονται εκ νέου σε τρυβλία καλλιέργειας 6 cm και επέστρεψαν στον επωαστή για να επιτραπεί ανάπτυξη αποικίας. Μετά από 7 ημέρες, οι αποικίες (που περιέχουν κύτταρα ≥50) βάφτηκαν με 0.5% κρυσταλλικό ιώδες διάλυμα για 30 λεπτά. Η απόδοση επιμετάλλωση (ΡΕ) είναι ο λόγος του αριθμού των αποικιών με τον αριθμό των κυττάρων που σπείρονται στην μη ακτινοβοληθέν ομάδα. Υπολογισμός των κλασμάτων επιβίωσης (ΔΤ) διεξήχθη χρησιμοποιώντας την εξίσωση: SF = αποικίες καταμετρώνται /(κύτταρα σπάρθηκαν × ΡΕ), χρησιμοποιώντας το άτομο ΡΕ

Προσδιορισμός πρώιμη απόπτωση

Η απόπτωση εκτιμήθηκε με. ποσοτικοποίηση της μετάθεσης του φωσφατιδυλοσερίνη στην κυτταρική επιφάνεια, ανιχνεύεται με ένα κιτ αννεξίνης V ανίχνευσης απόπτωσης (Calbiochem, San Diego, CA, USA), σύμφωνα με προηγούμενη αναφορά μας [23].

δοκιμασία Comet

Για την ανίχνευση της βλάβης του DNA σε μεμονωμένα κύτταρα, υιοθετήσαμε ένα κομήτη δοκιμασία. Εν συντομία, τα κύτταρα (2 χ 10

4) συλλέχθηκαν μετά από τις θεραπείες και επαναιωρήθηκαν σε 0.2 ml PBS που περιέχει 0,5% αγαρόζη χαμηλού σημείου τήξης. Ογδόντα πέντε μικρόλιτρα από το μίγμα εφαρμόστηκε σε διαφάνειες, τα οποία στη συνέχεια βυθίζεται σε διάλυμα κρύο λύσης (2,5 Μ NaCl, 0,1 Μ EDTA, 10 mM Tris, 1% Triton Χ-100 (ρΗ 10)). Η ηλεκτροφόρηση πραγματοποιήθηκε στα 300 mA και 25 V για 20 λεπτά. Μετά την ηλεκτροφόρηση, τα πλακίδια εξουδετερώθηκαν με 0,4 Μ ψυχρό ρυθμιστικό Tris-HCl (ρΗ 7.5) και στη συνέχεια χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας βρωμιούχο αιθίδιο. Κομήτες έγιναν ορατά με μικροσκόπιο φθορισμού (Olympus, Ιαπωνία). βλάβη στο DNA εκτιμήθηκε σε 100 κύτταρα όπου στιγμή ουρά (πολλαπλασιάζεται με το κλάσμα του DNA στην ουρά το μήκος της ουράς) ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας Image-Pro Plus (Media Cybernetics Inc.).

supravital χρώση των κυττάρων με πορτοκαλί της ακριδίνης για ανίχνευση αυτοφαγία

χρώση των κυττάρων με πορτοκαλί της ακριδίνης (Sigma Chemical Co.) πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με δημοσιευμένες διαδικασίες [23].

Ηλεκτρονική μικροσκοπία

τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα διάλυμα που περιέχει 2,5% γλουταραλδεΰδη και 2% παραφορμαλδεϋδη σε 0,1 Μ ρυθμιστικό κακοδυλικού, ρΗ 7,3, για 1 ώρα. Μετά τη σταθεροποίηση, τα δείγματα σταθεροποιούνται στη συνέχεια εις 1% ΟΣΟ

4 στο ίδιο ρυθμιστικό για 30 λεπτά. Εξαιρετικά λεπτές τομές στη συνέχεια παρατηρήθηκαν κάτω από ένα ηλεκτρονικό μικροσκόπιο (JEOL JEM-1200ΕΧ, Japan) στα 100 kV.

Western ανάλυση κηλίδος

συνολικής κυτταρικής πρωτεΐνης προϊόντα λύσης παρασκευάστηκαν με συλλογή κυττάρων σε πρωτεΐνες ρυθμιστικό εκχύλισης για 1 ώρα στους 4 ° C, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24]. Οι πυκνότητες των ζωνών ποσοτικοποιούνται χρησιμοποιώντας πυκνόμετρο υπολογιστή (AlphaImager

TM 2200 Σύστημα της Alpha Innotech Corporation, San Leandro, CA, USA). GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως ο έλεγχος φόρτωσης πρωτεΐνης. Αντισώματα για την ανίχνευση Akt, φωσφο-Akt, φωσφο-mTOR, φωσφο-ΑΜΡΚ, ΑΜΡΚ και φωσφο-p70S6K ελήφθησαν από την Cell Signaling Technology (Ipswich, MA, USA)? αντι-GAPDH ελήφθη από Abcam (Cambridge, ΜΑ, USA)? αντι-LC3 και αντι-Atg5-12 ελήφθησαν από Abgent (San Diego, CA, USA)? αντι-Ρ62 /SQSTM1 αντίσωμα ελήφθη από MBL (Nagoya, Japan), και αντι-mTOR και αντι-p70S6K ελήφθησαν από Epitomics (Burlingame, CA, USA).

In vivo δοκιμασίες ανάπτυξης όγκων χρησιμοποιώντας το PC -3 μοντέλο όγκου σε άτριχα ποντίκια

Όλα τα πειράματα σε ποντίκια διεξήχθησαν σύμφωνα με τις οδηγίες του ινστιτούτου μας (τον οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση των πειραματόζωων, Εθνική Cheng Kung University). Το πρωτόκολλο χρήση ζώων που αναφέρονται παρακάτω έχει ελεγχθεί και εγκριθεί από την Επιτροπή Θεσμικών Ζωικά Φροντίδα και Χρήση (IACUC) (Έγκριση No: 99138). Έξι έως οκτώ εβδομάδων αρσενικά γυμνά ποντίκια (BALB /cAnN.Cg-Foxn1

nu /CrlNarl) αποκτήθηκαν από το Εθνικό Κέντρο Εργαστήριο Ζώων (Ταϊβάν). Τα ζώα στεγάστηκαν πέντε ανά κλουβί στους 24 ± 2 ° C και 50% ± 10% σχετική υγρασία και υποβάλλεται σε ένα /σκότους 12-h φως 12 ωρών. Τα ζώα εγκλιματίστηκαν για 1 εβδομάδα πριν από την έναρξη των πειραμάτων και τρέφονται με μια δίαιτα τροφής Purina και νερό κατά βούληση. Οι όγκοι επάγονται με υποδόρια ένεση (s.c.) από PC-3 κύτταρα (2 χ 10

6 κύτταρα σε 0.1 ml PBS) σε μία θέση του δεξιού πλευρού. Οι όγκοι (οπτικοποιήθηκε ως μικρά οζίδια στις θέσεις της ένεσης) εμφανίστηκε ~ 7 ημέρες μετά την ένεση, και τα ζώα κατανεμήθηκαν τυχαία σε κάθε ομάδα. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή με: (1) όχημα (αραβοσιτέλαιο), (2) 1 mg /kg MP τρεις φορές την εβδομάδα για δύο εβδομάδες, (3) μια εφάπαξ δόση των 6 Gy IR, ή (4) μια θεραπεία συνδυασμού που περιλαμβάνει 1 mg /kg MP τρεις φορές την εβδομάδα για δύο εβδομάδες άρχισε αμέσως μετά από μία μόνο δόση 6 Gy IR. Mouse σωματικά βάρη μετρήθηκαν μία φορά την εβδομάδα και χρησιμοποιήθηκαν ως δείκτης συστημικής τοξικότητας της θεραπείας. Η ανάπτυξη του όγκου μετρήθηκε κάθε δύο ημέρες, και ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε σύμφωνα με τον τύπο που δείχνεται παρακάτω [25]:

Ο όγκος του όγκου (mm

3) = μεγαλύτερη διάμετρο (mm) × μικρή διάμετρο (mm )

2/2

τα δεδομένα εκφράζονται ως σχετικός όγκος του όγκου σε σύγκριση με τον όγκο προεπεξεργασία μετράται την ημέρα 0. Ο χρόνος όγκου του όγκου τετραπλασιασμό (TVQT, σε ημέρες) προσδιορίσθηκε με μία βέλτιστης προσαρμογής παλινδρόμησης ανάλυση. Η καθυστέρηση της ανάπτυξης του όγκου (TGD) χρόνος ορίζεται ως η διαφορά μεταξύ της TVQT των όγκων σε σύγκριση με εκείνη των μη επεξεργασμένων όγκων ελέγχου. Ο χρόνος TVQT και TGD υπολογίστηκαν για κάθε μεμονωμένο ποντικό, και στη συνέχεια τα μέσα δημιουργήθηκαν για κάθε ομάδα. ρυθμός αναστολής ανάπτυξης όγκου υπολογίσθηκε ως εξής: α. Αναστολή (%) = (μέση όγκο του όγκου των ποντικών αναφοράς άνευ αγωγής – όγκος του όγκου των επεξεργασμένων ποντίκια) /μέσο όγκο του όγκου των ποντικών αναφοράς άνευ αγωγής χ 100

Ανοσοϊστοχημική (IHC) χρώση ανάλυση

παραφίνη-ενσωματωμένες τομές ιστού (4 μm) ξηραίνονται, αποπαραφινοποιήθηκαν, και επανυδατώθηκαν. Μετά την προεπεξεργασία με μικροκύματα εντός κιτρικού ρυθμιστικού διαλύματος (ρΗ 6,0? Για ανάκτηση αντιγόνου), τα πλακίδια βυθίστηκαν σε υπεροξείδιο του υδρογόνου 3% επί 20 λεπτά για να εμποδίσει τη δραστηριότητα της ενδογενούς υπεροξειδάσης. Μετά εντατική πλύση με PBS, τα πλακίδια επωάστηκαν όλη τη νύχτα στους 4 ° C με το αντι-LC3 και /αντισώματα SQSTM1 (MBL, Ιαπωνία) αντι-Ρ62. Οι τομές στη συνέχεια επωάστηκαν με ένα δευτερογενές αντίσωμα για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και τα πλακίδια αναπτύχθηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ ανίχνευσης STARR TREK καθολική HRP (Biocare Medical, Concord, CA). Τέλος, τα πλακίδια επιχρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας αιματοξυλίνη. Κάθε slide σαρώθηκε σε χαμηλή ισχύ (χ 200).

Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση ± SD. Η στατιστική σημαντικότητα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας t-test του Student για τη σύγκριση μεταξύ των μέσων ή μονόδρομη ανάλυση της διακύμανσης με δοκιμή post-hoc του Dunnett [26]. Οι διαφορές θεωρήθηκαν σημαντικές όταν ρ & lt?. 0.05

Αποτελέσματα

Τα κυτταροτοξικά αποτελέσματα και τις καμπύλες επιβίωσης του βουλευτή και IR αντιμετωπίζονται μεμονωμένα ή σε συνδυασμό σε κύτταρα PC-3

Η βιωσιμότητα των κυττάρων παρατηρήθηκε σε διάφορες συγκεντρώσεις MP (0 έως 45 μΜ) για 48 ώρες (Εικ. 1Β). MP μειώνεται μάλλον την βιωσιμότητα των κυττάρων σε εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο. Μετά την επεξεργασία με 25 μΜ MP για 48 ώρες, η βιωσιμότητα των PC-3 κύτταρα μειώθηκε σε 60%. Το σχήμα 1C δείχνει τη βιωσιμότητα των ΜΡ και IR αντιμετωπίζονται μόνο ή σε συνδυασμό σε PC-3 κύτταρα. Σημαντικά ενισχυμένη τοξικότητα βρέθηκε για τη συνδυασμένη θεραπεία σε σύγκριση με ΜΡ και IR θεραπεία μόνη της σε PC-3 κύτταρα. Επιπλέον, το σχήμα 1Δ δείχνει τις καμπύλες επιβίωσης δόσης-απόκρισης ακτινοβολίας για PC-3 κύτταρα με ή χωρίς επεξεργασία ΜΡ. Οι καμπύλες επιβίωσης μετατοπίζονται δραματικά προς τα κάτω. ΜΡ (15 ή 25 μΜ) αυξήθηκε IR επαγόμενη κλωνογονικού κυτταρικό θάνατο σε κύτταρα PC-3. MP μείωσε σημαντικά το κλάσμα επιβίωσης σε έναν δοσοεξαρτώμενο τρόπο σε σύγκριση με IR μόνο. ​​

βλάβες του DNA προσδιορίστηκε με κομήτη δοκιμασίας και την έκφραση των πρωτεϊνών του στρες που συνδέονται με ER σε PC-3 κύτταρα που υπέστησαν αγωγή με ΜΡ και IR μόνα ή σε συνδυασμό

IR παίζει βασικό ρόλο στη θεραπεία του καρκίνου λόγω της ικανότητάς του να επάγει άμεσα βλάβη του DNA [27]. Το κομήτης δοκιμασία είναι ένα ευαίσθητο εργαλείο για την εκτίμηση της βλάβης του DNA και επιδιόρθωση σε κυτταρικό επίπεδο, που απαιτεί μόνο ένα μικρό αριθμό κυττάρων [28]. Στον κομήτη δοκιμασία για τα κύτταρα PC-3, έναν περιορισμένο ή καθόλου ουρά βρέθηκε στα δείγματα αναφοράς άνευ αγωγής, ενώ η ουρά αυξήθηκε μετά την ακτινοβόληση και συνδυασμένης θεραπείας (Εικ. 2Α). Το μήκος της ουράς αυξήθηκε σημαντικά μετά IR (4 Gy) σε σύγκριση με τους ελέγχους (Σχ. 2Β). Σημαντικά ενισχυμένη βλάβη στο DNA βρέθηκε για τη συνδυασμένη θεραπεία σε σύγκριση με IR μόνο. Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι η βλάβη του DNA που συμμετέχουν στις αντι-πολλαπλασιαστικά αποτελέσματα της συνδυασμένης θεραπείας σε PC-3 κύτταρα. Επιπλέον, πρόσφατα στοιχεία δείχνουν ότι ένας από τους μηχανισμούς με τους οποίους IR ενεργοποιεί ER στρες και το UPR είναι από την επαγωγή της βλάβης του DNA [29]. Ως εκ τούτου, για την ανίχνευση της έκφρασης πρωτεϊνών που σχετίζονται με το άγχος ER, εκτελέσαμε κηλίδωση Western με λύματα από PC-3 κύτταρα που λαμβάνουν κάθε μία από τις διαφορετικές θεραπείες (Σχ. 2C). Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι IRE1α και φωσφορυλίωση των eIF2α αυξάνεται με την συνδυασμένη θεραπεία σε σύγκριση με το βουλευτή ή IR θεραπεία μόνη της, επιβεβαιώνοντας έτσι ότι η συνδυασμένη θεραπεία οδήγησε ER στρες σε κύτταρα PC-3.

Μέτρηση της απόπτωσης και αυτοφαγία στο PC- 3 κύτταρα επεξεργασμένα με ΜΡ και IR μόνες ή σε συνδυασμό

Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α, πρώιμη απόπτωση σε κύτταρα PC-3 μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής με το κιτ ανίχνευσης απόπτωσης Annexin V. Ποσοτικά αποτελέσματα έδειξαν ότι η εμφάνιση της πρώιμης απόπτωσης στα κύτταρα PC-3 υποβάλλεται σε επεξεργασία με ΜΡ και /ή IR ήταν χαμηλή. Έτσι, αναλύσαμε περαιτέρω ότι ο θάνατος προγραμματισμένο κυτταρικό τύπο ΙΙ (αυτοφαγία). Χαρακτηρίζεται από το σχηματισμό πολλών όξινων κυστιδίων, οι οποίες ονομάζονται όξινες φυσαλιδώδους οργανίδια (Avos) [30]. Ακριδίνης πορτοκαλί χρώση (AO) ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής (Σχ. 3Β, 3C). Μια σημαντική αύξηση AO-θετικά κύτταρα βρέθηκε για κύτταρα που λαμβάνουν τη συνδυασμένη θεραπεία με σύγκριση με εκείνους που έλαβαν θεραπεία με IR ή MP μόνο. Επιπλέον, οι υπερδομές των PC-3 κύτταρα για κάθε ομάδα αγωγής παρατηρήθηκαν με ΕΜ φωτομικρογραφία (Σχ. 3D). Η συνδυασμένη θεραπεία οδήγησε επίσης σε ένα μεγάλο αριθμό κενοτόπια αυτοφαγικά και autolysosomes στο κυτταρόπλασμα. Επιπλέον, δεν υπήρχε συμπύκνωση χρωματίνης ή πυρηνικά πύκνωση, τα οποία είναι χαρακτηριστικά της απόπτωσης, παρουσιάστηκε σε οποιαδήποτε από τις κατεργασμένων κυττάρων. Για την ανίχνευση της έκφρασης πρωτεϊνών που σχετίζονται με αυτοφαγία-, εκτελέσαμε κηλίδωση Western με λύματα από PC-3 κύτταρα που λαμβάνουν κάθε μία από τις διαφορετικές θεραπείες (Σχ. 3Ε). Τα επίπεδα έκφρασης του LC3-ΙΙ, Ρ62 και πρωτείνες Atg5-12 αυξήθηκε με συνδυασμένη θεραπεία, γεγονός που υποδηλώνει ότι η συνδυασμένη θεραπεία που προκαλείται από αυτοφαγία σε PC-3 κύτταρα.

Η /mTOR μονοπάτι σηματοδότησης Akt εμπλέκεται στη συνδυασμένη θεραπεία επαγόμενη autophagy σε PC-3 κύτταρα

Προηγούμενες μελέτες έχουν αποδείξει ότι η οδός /mTOR Akt εμπλέκεται στη ρύθμιση autophagy [31]. Επομένως, για να διερευνηθεί κατά πόσο η /mTOR μονοπάτι σηματοδότησης Akt συμμετείχε στη συνδυασμένη θεραπεία που προκαλείται από αυτοφαγία, εκτελέσαμε western blotting για την ανίχνευση της κατάστασης φωσφορυλίωσης πρωτεΐνης (Σχ. 4). Εξετάστηκαν επίσης φωσφορυλιωμένων πρωτεϊνών που εμπλέκονται στα μονοπάτια σηματοδότησης Akt /mTOR. Η φωσφορυλίωση της Akt, mTOR και p70S6K μειώθηκε σε κύτταρα κατεργασμένα με τη συνδυασμένη θεραπεία σε σύγκριση με MP ή IR θεραπεία μόνη της.

Η ανάπτυξη του όγκου σε γυμνά ποντίκια κατεστάλη με IR και ΜΡ

επόμενο αξιολογηθεί η αντινεοπλασματική ανάπτυξης επίδραση του IR και ΜΡ

in vivo

. Οι όγκοι επάγονται από s.c. ένεση του PC-3 κύτταρα σε γυμνούς ποντικούς. Μετρήσαμε το σωματικό βάρος των ποντικών σε εβδομαδιαία βάση και τον όγκο του όγκου κάθε δεύτερη ημέρα. Τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης έδειξαν ότι καμία από τις θεραπευτικές αγωγές που παράγονται κάθε απώλεια σωματικού βάρους, η οποία μπορεί να είναι ένα σημάδι τοξικότητας (Εικ. 5Α). Η συνδυασμένη θεραπεία κατέστειλε τον όγκο του όγκου και του βάρους του όγκου σε γυμνά ποντίκια σε σύγκριση με MP ή IR θεραπείες μόνο (Σχ. 5Β, 5C, 5D). Όπως φαίνεται στον Πίνακα 1, ο χρόνος όγκος του όγκου τετραπλασιασμό (TVQT) της ομάδας ελέγχου μετρήθηκε την ημέρα 10 (10.3 ± 2.4). Ο χρόνος καθυστέρησης ανάπτυξης όγκου (TGD) για την 10 ημέρα θεραπείας του ΜΡ μόνη της ήταν 10,4 ± 4,2 ημέρες, η οποία ήταν σημαντικά διαφορετική από ό, τι για την ομάδα ελέγχου (

ρ & lt?

0,05). IR μόνο παρήγαγε μια TGD χρόνο 17,8 ± 6,2 ημέρες (

p & lt?

0,05 σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου). Η συνδυασμένη θεραπεία οδήγησε σε μια εποχή TGD από 52,3 ± 7,1 ημέρες (

p & lt?

0,05, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου ή MP μόνο). Η θεραπεία συνδυασμού IR και ΜΡ οδήγησε σε αναστολή της ανάπτυξης του όγκου κατά 71% την Ημέρα 10. Έτσι, η συνδυασμένη θεραπεία έχει αντινεοπλασματική δράση ανάπτυξης

in vivo

.

Στη συνέχεια, η ιστολογική εξέταση αναλύθηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (η &? Ε) χρώση (Σχήμα 5Ε).. Ο όγκος της συνδυασμένης θεραπείας αποτελούνταν από κύτταρα με τα χαμηλότερες αναλογίες πυρήνα-προς-κυτόπλασμα από ΜΡ ή IR θεραπεία μόνο. Επιπλέον, τα πρότυπα LC3 και την έκφραση ρ62 σε PC-3 όγκοι εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας χρώση IHC. LC3 και Ρ62 αυξήθηκαν σε όγκους από τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με τη συνδυασμένη θεραπεία σε σύγκριση με το βουλευτή ή IR θεραπεία μόνη της.

Συζήτηση

Πρόσφατα, αναφέρθηκε ότι RYR, μια παραδοσιακή κινεζική βότανο φαγητό και μοντέρνα συμπλήρωμα διατροφής, αποδεικνύεται

in vitro

αποτελέσματα, συμπεριλαμβανομένης της αναστολής του πολλαπλασιασμού και διέγερση απόπτωσης σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου [6]. Επιπλέον, RYR μείωσε σημαντικά τους όγκους των όγκων των όγκων ξενομοσχεύματος προστάτη [32]. Ο συνδυασμός IR με άλλους παράγοντες που επιτυγχάνουν ραδιοευαισθητοποίησης δυναμικό έχει γίνει σημαντικές παρεμβάσεις για τους ασθενείς με καρκίνο του προστάτη [33]. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν επίσης ότι τα φυσικά προϊόντα, όπως τα νέα ραδιοευαισθητοποιητές για τη θεραπεία των ορμονο-ανθεκτικό καρκίνο προστάτη που είναι ανθεκτικό σε θεραπεία με ακτινοβολία [11], [34]. Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε για πρώτη φορά ότι MP ευαισθητοποιεί ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη PC-3 κύτταρα σε υπέρυθρες τόσο

in vitro

και

in vivo

στο γυμνό μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού (Σχ. 1, 5). Για το μεγαλύτερο μέρος της ιστορίας της θεραπείας του καρκίνου, η απόπτωση ήταν πιθανά ο μόνος μηχανισμός κυτταρικού θανάτου που προκαλείται από φάρμακα. Πιο πρόσφατα, έχει αναφερθεί ότι ένας τύπος II προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος, αυτοφαγία, μπορεί να συμμετέχει σε καρκίνο θεραπεία του καρκίνου που προκαλείται από τον κυτταρικό θάνατο. Πρόσφατα ευρήματα, συμπεριλαμβανομένων των εργαστηριακών μας, έχουν δείξει ότι τα ενεργοποιημένα αυτοφαγία είναι ένα ογκοκατασταλτικό [23], [24], [35]. Εδώ, τα κύτταρα PC-3 υποβάλλεται σε επεξεργασία με συνδυασμένη θεραπεία που προκαλείται από αυτοφαγία δυνητικά συνέβη όταν το αποπτωτικό μονοπάτι του PC-3 κύτταρα παρεμποδίστηκε (Εικ. 3). Στο

in vivo

μελέτη του PC-3 όγκους ξενομοσχεύματος, LC3 και ρ62 αυξήθηκαν μετά την συνδυασμένη θεραπεία (Σχ. 5Ε).

Ακτινοβολία παίζει βασικό ρόλο στη θεραπεία λόγω της ικανότητάς του να επάγει άμεσα βλάβη του DNA, ιδιαίτερα DNA δίκλωνα σπασίματα, οδηγώντας έτσι σε κυτταρικό θάνατο [27]. Στην τρέχουσα μελέτη μας, σημαντικά ενισχυμένη βλάβη του DNA βρέθηκε στην ομάδα συνδυασμένης θεραπείας σε σύγκριση με IR ή MP μόνο (Σχ. 2Α, 2Β). Ωστόσο, η λεπτομέρεια του μηχανισμού δεν είναι ακόμη πλήρως κατανοητή. Είναι πιθανό ότι MP παρεμβαίνει στην επεξεργασία και την επισκευή του IR-επαγόμενης DNA δίκλωνα σπασίματα. Εναλλακτικά, βουλευτής μπορεί να παρεμβαίνει με ένα βήμα μετα-επισκευής που αφορούν την πραγματική αντιστροφή της γH2AX, όπως αποφωσφορυλίωση ή την υποβάθμιση και /ή ανταλλαγή των ιστονών του γH2AX [36]. Πρόσφατα στοιχεία δείχνουν ότι ένας από τους μηχανισμούς με τους οποίους IR ενεργοποιεί ER στρες είναι η επαγωγή της βλάβης του DNA [29]. Έτσι, τα διαλείμματα διπλής έλικας του DNA μπορεί να χρησιμεύσει ως ένας σύνδεσμος μεταξύ IR και ER ενεργοποίηση του στρες. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι IRE1α και φωσφορυλίωση eIF2α αυξήθηκε με συνδυασμένη θεραπεία, δείχνοντας ότι η συνδυασμένη θεραπεία επαγόμενης ER στρες σε PC-3 κύτταρα (Σχ. 2C). ER-στρες μπορεί να ενεργοποιήσει μονοπάτια που εμπλέκονται στην απόπτωση και την αυτοφαγία [22] σηματοδότησης. Στα κύτταρα των θηλαστικών, ER στρες έχει αποδειχθεί ότι διευκολύνει το σχηματισμό αυτοφαγοσώματα, και επαγωγή autophagy επιτρέπει την απομάκρυνση των τοξικών misfolded πρωτεϊνών [37]. Ullman et al.