Αφηρημένο

Ιστορικό

παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκίνωμα (PDAC) παραμένει μια σημαντική αιτία θανάτου από καρκίνο. Αλλαγές στην απόπτωση σηματοδότησης στον παγκρεατικό καρκίνο αποτέλεσμα στην αντίσταση χημειοθεραπεία και επιθετική ανάπτυξη και μετάσταση. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να χαρακτηρίσει το μονοπάτι απόπτωσης στον καρκίνο του παγκρέατος υπολογιστικά μέσω της αξιολόγησης των πειραματικών δεδομένων από τεχνολογιών υψηλής απόδοσης και δημόσιες βάσεις δεδομένων. Ως εκ τούτου, η ανάλυση γονιδιακής έκφρασης του μικροτομή ιστού παγκρεατικού όγκου εφαρμόστηκε σε ένα μοντέλο της οδού απόπτωσης που λαμβάνεται με την πρόβλεψη υπολογιστική αλληλεπίδραση πρωτεΐνης.

Μεθοδολογία Principal Εκτίμηση

Η απόπτωση γονιδίων /σχετίζονται οδού συναρμολογήθηκαν από ηλεκτρονικό βάσεις δεδομένων. Για να εκτιμηθεί η έκφραση αυτών των γονιδίων κατασκευάσαμε ένα εικονικό υπο-συστοιχίας από μια ολόκληρη ανάλυση του γονιδιώματος από μικροδιατομή ιστό μητρική όγκου. Για να αποκτήσετε ένα μοντέλο του μονοπατιού της απόπτωσης, οι αλληλεπιδράσεις των μελών του μονοπατιού της απόπτωσης αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας δημόσιες βάσεις δεδομένων και υπολογιστικά πρόβλεψη των αλληλεπιδράσεων πρωτεΐνης. δεδομένα γονιδιακής έκφρασης εφαρμόστηκαν στο μοντέλο απόπτωσης οδού. 19 γονίδια βρέθηκαν διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια και 12 είχαν ήδη γνωστά παθοφυσιολογικό ρόλο σε PDAC, όπως Survivin /BIRC5, BNIP3 και TNF-R1. Επιπλέον εμείς επικυρωμένη διαφορική έκφραση IL1R2 και Livin /BIRC7 με RT-PCR και ανοσοϊστοχημεία. Η εφαρμογή των δεδομένων γονιδιακής έκφρασης σε χάρτη απόπτωση μονοπάτι προτεινόμενες δύο ελαττώματα υψηλότερο επίπεδο της οδού στο επίπεδο των υποδοχέων θανάτου κυττάρου και εντός της ενδογενούς καταρράκτη σηματοδότησης συνεπής με αναφορές στην απόπτωση σε PDAC. πρόβλεψη αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης έδειξε περαιτέρω πιθανές νέες αλληλεπιδράσεις μεταξύ των μεμονωμένων μελών του μονοπατιού, οι οποίες καταδεικνύουν την πολυπλοκότητα του μονοπατιού της απόπτωσης.

Συμπεράσματα /Σημασία

Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι η υπολογιστική αξιολόγηση των δημόσιων προσβάσιμα ένα δεδομένων θα μπορούσε να δοθεί αποδεκτό εικονική εικόνα του μονοπατιού της απόπτωσης. Με αυτή την προσέγγιση μπορούμε να προσδιορίσουμε δύο υψηλότερες ατέλειες επίπεδο του μονοπατιού της απόπτωσης σε PDAC. Θα μπορούσαμε επίσης για πρώτη φορά, τον εντοπισμό IL1R2 όσο το δυνατόν γονίδιο υποψήφιος στις PDAC

Παράθεση:. Ruckert F, G Dawelbait, Winter C, Hartmann Α, Denz Α, Ammerpohl O, et al. (2010) Εξέταση σηματοδοτήσει απόπτωση στον καρκίνο του παγκρέατος από Μεταγωγή Ανάλυση Υπολογιστική Signal. PLoS ONE 5 (8): e12243. doi: 10.1371 /journal.pone.0012243

Επιμέλεια: Syed A. Αζίζ, Health Canada, Καναδάς

Ελήφθη: 25 Ιούν 2010? Αποδεκτές: 20, Ιούλ του 2010? Δημοσιεύθηκε: 19, Αυγ 2010

Copyright: © 2010 Ruckert et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από την Deutsche Krebshilfe και το πρόγραμμα MedDrive38 της ιατρικής σχολής του Technische Universität Dresden. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκίνωμα (PDAC) είναι η 8η πιο κοινή μορφή καρκίνου στο δυτικό κόσμο [1]. θνησιμότητας ισούται σχεδόν συχνότητα εμφάνισης της 6.3 /100.000 [2]. Παρά συνδυασμένη θεραπεία τροπικότητα καρκίνωμα του παγκρέατος δείχνει μια ικανοποιητική ανταπόκριση στη θεραπεία [3]. Πρόσφατα, μια ολοκληρωμένη γονιδιωματική ανάλυση των

Jones

et al. θα μπορούσε να προσδιορίσει την απόπτωση ως έναν πυρήνα μονοπάτι σηματοδότησης σε καρκίνο του παγκρέατος. Η οδός ήταν γενετικά τροποποιημένα στις περισσότερες από 24 πρωτογενείς παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές [4]. Clinicopathologically, αυτή η ελαττωματική σηματοδότηση της αποπτώσεως συμβάλλει στην κακή ανταπόκριση του όγκου στη χημειοθεραπεία, ιονίζουσα ακτινοβολία και ανοσοθεραπεία [5] και επηρεάζει την ικανότητα μεταστατικά και το ρυθμό ανάπτυξης του όγκου [6], [7]. Ως εκ τούτου, η κατανόηση της αντίστασης απόπτωση αποτελεί προϋπόθεση για τη βελτίωση της θεραπείας του καρκίνου.

Η απόπτωση, ή το πρόγραμμα κυτταρικού θανάτου, μπορεί να ενεργοποιηθεί από διάφορους μηχανισμούς, κατά την εξωγενή και ενδογενή οδό. Ενώ η ενεργοποίηση των υποδοχέων κυτταρικού θανάτου οδηγεί στην εμπλοκή της εξωγενούς οδού, η ενδογενής οδός ενεργοποιείται από μιτοχόνδρια κατά τη διάρκεια του κυτταρικού στρες, τόσο με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση κασπασών [8].

Σήμερα, η οδός της απόπτωσης είναι ένας από τις καλύτερες διερευνήθηκαν ενδοκυττάριων οδών. Ωστόσο, η ερμηνεία των πειραματικών δεδομένων παρεμποδίζεται από την πληθώρα των μορίων και σύνθετες αλληλεπιδράσεις της οδού σηματοδότησης. Στην παρούσα μελέτη προσπαθήσαμε να προσεγγίσουμε το μονοπάτι κυτταρικού θανάτου στον καρκίνο του παγκρέατος από μια υπολογιστική ανάλυση των πειραματικών δεδομένων από τις τεχνολογίες highthroughput και δημόσιες βάσεις δεδομένων. Προσπαθήσαμε να χρησιμοποιήσουν τη μεγάλη ποσότητα πληροφοριών για να διαμορφώσει την ενδοκυτταρική ροή πληροφοριών του μονοπατιού της απόπτωσης στον καρκίνο του παγκρέατος. Για μια γραφική απεικόνιση του σχεδιασμού της μελέτης βλέπε Εικόνα 1.

Η

Η εφαρμογή των δεδομένων γονιδιακής έκφρασης σε ένα μοντέλο του μονοπατιού της απόπτωσης που λαμβάνονται από τις βάσεις δεδομένων της αλληλεπίδρασης των πρωτεϊνών και πρόβλεψη πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων έδειξε ένα σταθερό μοτίβο της υψηλότερης ελαττώματα επίπεδο στην ενδογενή οδό και στο επίπεδο των υποδοχέων κυτταρικού θανάτου που μπορεί ενδεχομένως να οδηγήσει στον φαινότυπο αντίστασης απόπτωσης σε καρκίνο του παγκρέατος.

Αποτελέσματα

Υπολογιστική κατασκευή του μονοπατιού της απόπτωσης χάρτη

οι αλληλεπιδράσεις των 103 συνδέονται απόπτωση γονίδια από αναζήτηση βάση δεδομένων μας αξιολογήθηκαν αρχικά δια διαλογής βάσεων δεδομένων αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης-πρωτεΐνης. Η αναζήτηση οδήγησε σε 940 γνωστές αλληλεπιδράσεις. Αυτές οι αλληλεπιδράσεις αντιπροσωπεύονται πειραματικά αποδειχθεί αλληλεπιδράσεις μεταξύ συγκεκριμένων πρωτεϊνών. Αυτά τα δεδομένα χρησιμοποιήθηκαν για την κατασκευή ενός χάρτη οδό, όπως αναφέρθηκε παραπάνω (Σχήμα 2).

Οι κόμβοι σε αυτές τις γραφικές παραστάσεις αντιπροσωπεύουν υποδοχείς, συνδέτες, τελεστές, κινάσες και παράγοντες μεταγραφής, ενώ κάθε άκρο περιγράφει μια σχέση μεταξύ αυτών των ειδών . Στο άνω μέρος του σχήματος η επαγωγή απόπτωσης άμεση φαίνεται (Α), ενώ στο κάτω μέρος, η διαμόρφωση μέσω γονιδιακής έκφρασης απεικονίζεται (Β). Μαύρο αλληλεπιδράσεις σηματοδοτούν γνωστές αλληλεπιδράσεις πρωτεϊνών από τις βάσεις δεδομένων. Για την καλύτερη θέα που δεν εμφανίζουν όλα τα 940 γνωστές αλληλεπιδράσεις, ανατρέξτε S3 αρχείου για μια λίστα όλων των αλληλεπιδράσεων. Μπλε άκρες σηματοδοτούν υπολογιστικά προβλεπόμενες αλληλεπιδράσεις για όλα τα 103 απόπτωση σχετίζεται γονίδια με ένα υψηλό επίπεδο αποδείξεων.

Η

Σε ένα δεύτερο στάδιο προσπαθήσαμε να βρούμε προηγουμένως άγνωστες αλληλεπιδράσεις μεταξύ των 103 γονιδίων της απόπτωσης που σχετίζονται. Ως εκ τούτου, έπρεπε να εκχωρήσει τις διαρθρωτικές οικογένειες με τα γονιδιακά προϊόντα, διότι οι περισσότερες από τις δομές ήταν προηγουμένως άγνωστη. Η δομική εργασία και την οικογένεια ταξινόμησης για τα γονίδια που σχετίζονται αποπτωτικών είχε ως αποτέλεσμα την ανάθεση των 53 γονιδίων. Εφαρμόζοντας την αξιολόγηση της διατήρησης διεπαφή για πιθανές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των προϊόντων αυτών 53 γονίδια που οδήγησε σε 21 νέες αλληλεπιδράσεις (για παραδείγματα βλ αρχείου S2, για ολόκληρη δεδομένα δείτε S3 αρχείου).

Οι νέες αλληλεπιδράσεις αντιπροσωπεύουν υποτιθέμενο αλληλεπιδράσεις που δεν είναι ακόμα αποδειχθεί πειραματικά. Όλες οι νέες αλληλεπιδράσεις εφαρμόστηκαν στο πρώτο χάρτη του μονοπατιού κυτταρικού θανάτου (Σχήμα 2).

Αποτελέσματα GeneChip

Κατασκευάσαμε ένα εικονικό υπο-συστοιχίας για τον εντοπισμό αλλαγών της γονιδιακής έκφρασης των 93 αποπτωτικών γονιδίων για τα οποία θα μπορούσε να ληφθεί ένα αναγνωριστικό. Για την αξιολόγηση της απόδοσης αυτής της προσέγγισης συγκρίναμε τα αποτελέσματα για το αποπτωτικών γονιδίων που με ολόκληρο το γονιδίωμα και την ανάλυση εικονικό υπο-συστοιχίας. Των 23 σετ καθετήρα ταυτίζεται με την ανάλυση εικονικό υπο-συστοιχίας μόνο 18 εντοπίστηκαν σε όλη την ανάλυση του γονιδιώματος. Οι μέσες εντάσεις έκφραση των probesets ανιχνευθούν μόνο από υπο-συστοιχίας ανάλυσης ήταν 125 σε σύγκριση με 346 για σύνολα ανιχνευτή ανιχνεύονται με τις δύο μεθόδους, υποδεικνύοντας ότι η ανάλυση εικονική υποδιάταξης ήταν περισσότερο ευαίσθητη. Τα 23 probesets αντιπροσωπεύονται 19 διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων (Σχήμα 3). Από αυτούς, 11 γονίδια υπερεκφράζονται και 8 υποεκφράζεται σε PDAC σύγκριση με μικροτομή κανονική πόρου κύτταρα. Μεταξύ των δεκαεννέα γονίδια, 12 είχαν ήδη αναφερθεί από άλλες ομάδες στο PDAC (Πίνακας 1).

Η θερμότητα χάρτη της 19ης μικροτομή PDACs (με κόκκινη), 13 δείγματα μικροτομή φυσιολογικά κύτταρα των πόρων (που σημειώνονται πράσινο), και 13 καθιερωμένες κυτταρικές γραμμές παγκρεατικού όγκου (που σημειώνονται ματζέντα) χρησιμοποιώντας το σετ γονιδίων 93 διαφορικού και Ευκλείδεια πίνακα αποστάσεων. Κανονικά στρωματικά κύτταρα χρησίμευσε ως εσωτερικός έλεγχος ποιότητας (σήμανση μπλε).

Η

Η επαλήθευση της διαφορικής έκφρασης

Έχουμε επιλέξει δύο γονίδια, Livin /BIRC7 και IL1R2, για την επικύρωση από την ποσοτική RT-PCR και /ή ανοσοϊστοχημεία. Επιβεβαιώσαμε μια σημαντική ρύθμιση προς τα πάνω σε κύτταρα PDAC ή IL1R2 (

σ

= 0,035) και LIVIN /BIRC7 (

σ

= 0,01) (Σχήμα 4 Α, Β). Παράλληλα με RT-PCR 16 δείγματα από ασθενείς με PDAC και 16 φυσιολογικούς ιστούς του παγκρέατος χρωματίστηκαν για Livin /BIRC7. 89% των κυττάρων PDAC ελέγχθηκαν θετικά για Livin /BIRC7, σε αντίθεση με μόνο το 62% των των κανονικών πόρου κύτταρα (

σ

= 0,001). PDAC ιστός έδειξε επίσης πιο εντατική χρώση από το κανονικό ιστό, και τα αποτελέσματα ήταν στατιστικώς σημαντικά (

ρ

& lt? 0.001). (Εικόνα 4 C, D)

Τα γραφήματα εμφανίζουν τα αποτελέσματα της ποσοτικής RT-PCR σε φυσιολογικό ιστό του παγκρέατος και του παγκρέατος αδενοκαρκίνωμα του Livin /BIRC7 (t-test με ρ = 0,01) (Α) και IL1R2 (t-test με ρ = 0.035) (Β). Ανοσοϊστοχημική χρώση για Livin /BIRC7 σε καλοήθεις πάγκρεας και διηθητικό αδενοκαρκίνωμα. Παγκρεατικό καρκίνωμα (βέλος) που δείχνει την εντατική κυτταροπλασματική χρώση (αρχική μεγέθυνση χ 100) (C). Καλοήθης πορογενές επιθήλιο δείχνει μια αξιοσημείωτη χρώση αμυδρά (βέλος) (αρχική μεγέθυνση χ 40) (D). * Υποδηλώνει p-value & lt?. 0.05

Η

Συζήτηση

Ο καρκίνος του παγκρέατος είναι μια κακοήθεια με πολύ κακή πρόγνωση και δεν υπάρχει σημαντική βελτίωση στη θεραπεία κατά τη διάρκεια των τελευταίων 30 ετών [1]. Πρόσφατα, μια ολοκληρωμένη γονιδιωματική ανάλυση προσδιορίζονται απόπτωσης ως πυρήνας μονοπάτι σηματοδότησης σε καρκίνο του παγκρέατος [4].

Η οδός της απόπτωσης είναι ένα από τα καλύτερα διερευνήθηκαν ενδοκυττάριων οδών. Ωστόσο, η οδός περιλαμβάνει ένα πλήθος μορίων σηματοδότησης και εμφανίζει σύνθετες αλληλεπιδράσεις. Αυτό αφήνει τα αποτελέσματα των πειραματικών μελετών δύσκολο να ερμηνευθούν. Στην παρούσα μελέτη προσπαθήσαμε να προσεγγίσουμε το μονοπάτι κυτταρικού θανάτου στον καρκίνο του παγκρέατος από μια υπολογιστική ανάλυση των πειραματικών δεδομένων από τις τεχνολογίες υψηλής απόδοσης και με την αξιολόγηση των δημόσιων βάσεων δεδομένων. Με τη βοήθεια αυτών των τεχνολογιών προσπαθήσαμε να κατανοήσουμε καλύτερα τη μεγάλη ποσότητα των πληροφοριών και να κάνει δηλώσεις σχετικά με διαταραχές στη ροή πληροφοριών στην οδό της απόπτωσης στον καρκίνο του παγκρέατος. Τα αποτελέσματα συγκρίθηκαν με τις προηγούμενες εκδόσεις στην απόπτωση στον καρκίνο του παγκρέατος.

103 γονιδίων που σχετίζονται απόπτωση ταυτοποιήθηκαν από την αναζήτηση της βάσης δεδομένων. Για την εκτίμηση των αλληλεπιδράσεων μεταξύ των ταυτοποιημένων γονιδίων που σχετίζονται απόπτωση αξιολογήσαμε τις βάσεις δεδομένων και υπολογιστικά προβλεπόμενες αλληλεπιδράσεις πρωτεϊνών. Το γεγονός ότι η οδός της απόπτωσης είναι ένα από τα πιο γνωστά μονοπάτια αντικατοπτρίστηκε από τη μεγάλη ποσότητα του πειραματικού αποδεδειγμένη αλληλεπιδράσεων πρωτεΐνης σε δημόσιες βάσεις δεδομένων. Η προσέγγισή μας απέδωσε 940 αλληλεπιδράσεις και θα μπορούσαμε ακόμη εντοπίσει 21 προηγουμένως άγνωστες αλληλεπιδράσεις υπολογιστικά από την ακολουθία με βάση και τη δομή που βασίζεται σε πρόβλεψη των πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων. Ειδικά MCL-1, CASP 3, TRADD, 4η Σεπτεμβρίου, ΟΕΕ, ηρεμία και TRAF 6 έδειξε διακλαδώσεων στον καταρράκτη σηματοδότησης προηγουμένως άγνωστη. Παρά το γεγονός ότι δεν μπορέσαμε να πειραματικά απόδειξη αυτές τις αλληλεπιδράσεις, αυτό είναι μια απόδειξη για την πολυπλοκότητα της ροής πληροφοριών εντός αυτής της οδού. Με τον καθορισμό των υποδοχέων θανάτου των κυττάρων ως σημείο εκκίνησης για την οδό σηματοδότησης κατασκευάσαμε ένα μοντέλο του μονοπατιού για να απεικονίσει τις αλληλεπιδράσεις.

ανάλυση γονιδιακής έκφρασης των γονιδίων απόπτωσης που σχετίζεται πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα εικονικό υπο-συστοιχίας σε ένα σύνολο μικροδιατομή ιστού από την κανονική παγκρεατικό πόρο και PDAC. Συγκρίνοντας τα δεδομένα από την υπο-συστοιχίας με ανάλυση συνόλου του γονιδιώματος αποκάλυψε σημαντικά περισσότερο ανιχνευτή ορίζεται να εκφράζονται διαφορικά με τη χρήση της προσέγγισης εικονικό υπο-συστοιχίας. Είναι ενδιαφέρον ότι τα σετ καθετήρα δεν ταυτοποιήθηκαν με ανάλυση συνόλου του γονιδιώματος εμφανίζονται μικρότερες τιμές έκφρασης, καταδεικνύοντας ότι η κατασκευή ενός εικονικού υπο-συστοιχίας θα μπορούσαν να οδηγήσουν σε αυξημένη ευαισθησία για την ανίχνευση στο κατώτερο άκρο των εντάσεων γονιδιακής έκφρασης. Αυτό οφείλεται κυρίως στο μικρότερο αριθμό των σετ ανιχνευτή που δοκιμάστηκαν, μειώνοντας το δυνατό θόρυβο των διακυμάνσεων κατά τη διάρκεια της ανάλυσης. Ανάλυση

Η γονιδιακή έκφραση έδειξε 19 διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων. Από αυτούς, 11 γονίδια υπερεκφράζονται και 8 υποεκφράζεται σε PDAC σύγκριση με μικροτομή κανονική πόρου κύτταρα. Μεταξύ των δεκαεννέα γονίδια, 12 είχαν ήδη αναφερθεί από άλλες ομάδες στο PDAC.

Σουρβιβίνη, Livin, MCL-1, και DcR3 ήταν ρυθμισμένη προς τα πάνω και έδειξε πολύ καλά σύμφωνα με τις προηγούμενες εκθέσεις (βλ S1 αρχείου). TNF-R1, BNIP3, και κασπάση 9 ρυθμίστηκαν προς τα κάτω, οι εν λόγω γονίδια έδειξε επίσης καλή συμφωνία με προηγούμενες μελέτες (βλέπε S1 File).

Ωστόσο, ΧΙΑΡ, ένα μέλος της οικογένειας ΙΑΡ πρωτεϊνών ήταν μειωτικά στην ανάλυσή μας σε αντίθεση με προηγούμενες μελέτες. Αυτή η διαφορά μπορεί να οφείλεται στην ετερογένεια του όγκου, μια θεμελιώδης πτυχή όλων των συμπαγών όγκων [9]. Θα μπορούσε, επίσης, να οφείλεται στις διαφορές στα σχέδια της μελέτης, επειδή οι περισσότερες από τις προηγούμενες μελέτες για ΧΙΑΡ χρησιμοποιείται παγκρέατος κυτταρικές γραμμές καρκινώματος, ενώ χρησιμοποιείται μικροτομή μητρική ιστό του όγκου.

Ωστόσο, τα δεδομένα μας απέδωσε ενδιαφέροντα αποτελέσματα, όπως εμείς βρέθηκε δύο μεγάλες εστίες dysregulations εντός του μονοπατιού κυτταρικού θανάτου.

Ένα από τα σημαντικότερα εστιών ήταν στο επίπεδο των υποδοχέων των κυττάρων. Σε γενικές γραμμές, φαίνεται να υπάρχει μια ρύθμιση προς τα κάτω των υποδοχέων θανάτου των κυττάρων, και μια ρύθμιση προς τα άνω του δολώματος-υποδοχέων εκεί. Η προς τα κάτω ρύθμιση του υποδοχέα του κυτταρικού θανάτου TNRF-1 και την προς τα πάνω ρύθμιση του Fas-δόλωμα υποδοχέα DcR3 στα δεδομένα μας είχε ήδη αναφερθεί παλαιότερα [10]. Αυτή η απορύθμιση έχει ως στόχο να βοηθήσει ο όγκος αποφύγει το ανοσοποιητικό σύστημα, λόγω της μειωμένης ευαισθησίας έναντι αποπτωτικών συνδέτες [11], [12].

Ένα άλλο δόλωμα υποδοχέα, IL1R2, επιλέχθηκε για περαιτέρω επικύρωση, λόγω ρύθμιση προς τα άνω της αυτός ο υποδοχέας δεν έχει αναφερθεί προηγουμένως. Με τη βοήθεια της ποσοτικής RT-PCR θα μπορούσαμε, για πρώτη φορά επικυρωθεί ένα προς τα πάνω ρύθμιση του IL1R2 σε καρκίνο του παγκρέατος. IL1, ο συνδετήρας του IL1R2 είναι γνωστό ότι εκκρίνεται από καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος [13]. Έχει σημαντικές φυσιολογικές λειτουργίες σε φλεγμονή και πολλαπλασιασμό αλλά μπορούν επίσης να προκαλέσουν απόπτωση μέσω της ενεργοποίησης του IRAK και MyD88 [14], [15], [16]. Ενώ το μικροπεριβάλλον θα μπορούσαν να επωφεληθούν από την αγγειογενετική και τις πολλαπλασιαστικές ιδιότητες της IL1, το δόλωμα-υποδοχέα μπορεί να προστατεύσει παγκρέατος από την απόπτωση που επάγεται από την ανοσολογική απόκριση [17].

Η δεύτερη σημαντική εστίαση της dysregulations βρέθηκε στο επίπεδο μεταμιτοχονδριακού ρυθμιστικές πρωτεΐνες, οι αναστολείς των πρωτεϊνών απόπτωσης (ΙΑΡ). Αυτή η ομάδα πρωτεϊνών αναστέλλει την λειτουργία των κασπασών και της αποπτωσώματος και έτσι παρεμβαίνει τόσο με την εξωγενή και ενδογενή οδό. Οι ΙΑΡ είναι ήδη γνωστό για το σημαντικό τους ρόλο στην καρκινογένεση άλλων φορέων του όγκου και επίσης PDAC [18], [19]. Στη μελέτη μας, βρήκαμε μια ρύθμιση προς τα άνω της Σουρβιβίνης /BIRC5 και Livin /BIRC7 σε μικροτομή όγκο ιστού και θα μπορούσαμε να επικυρώσει την απορύθμιση των Livin /BIRC7 από ποσοτική RT-PCR και IHC.

Οι dysregulations στην ομάδα του ΙΑΡ μπορεί να έχει μια υψηλή κλινική σημασία, επειδή η ενδογενής οδός μεσολαβεί κανονικά την κυτταροτοξική δράση της ακτινοβολίας και πολλά χημειοθεραπευτικά [20], [21].

η υπολογιστική ανάλυση της οδού απόπτωσης σε PDAC καθίσταται έτσι μία καλή σύμφωνα των αποτελεσμάτων μας με προηγούμενες πειραματικές αναφορές επί της απόπτωσης στον καρκίνο του παγκρέατος. Χρησιμοποιώντας τα υπάρχοντα πρωτογενή δεδομένα από τις τεχνολογίες υψηλής απόδοσης, θα μπορούσαμε να αναπαράγουν εν μέρει πειραματικά δεδομένα. Αυτά τα δεδομένα τέθηκε στο πλαίσιο του συγκροτήματος ενδοκυτταρικής σηματοδότησης απόπτωσης με ανάλυση υπολογιστική αλληλεπίδραση. Παρά το γεγονός ότι μια μεγάλη ποσότητα πληροφοριών μπορεί να αξιολογηθεί γρήγορα και περιγραφική με την προσέγγισή μας, είναι οικονομικά δύσκολο να αποδειχθεί πειραματικά τα ευρήματα. Αυτό πρέπει να θεωρηθεί ως σημαντικό μειονέκτημα της προσέγγισης μας.

Εν κατακλείδι, η παρούσα μελέτη δείχνει ότι η υπολογιστική αξιολόγηση των δεδομένων από την ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης και δημόσιες βάσεις δεδομένων θα μπορούσε να δοθεί μια αποδεκτή εικονική εικόνα του μονοπατιού της απόπτωσης. Η σύγκριση των δεδομένων μας με τις προηγούμενες εκδόσεις που παρέχονται καλή σύμφωνα. Με την προσέγγιση αυτή θα μπορούσε να εντοπίσει τα ελαττώματα στο επίπεδο των υποδοχέων κυτταρικού θανάτου και του αναστολέα της απόπτωσης πρωτεϊνών, οι οποίες θα μπορούσαν να αποτελούν τη βάση τον φαινότυπο των διακριτών αντίσταση απόπτωσης σε PDAC. Θα μπορούσαμε περαιτέρω για πρώτη φορά τον εντοπισμό IL1R2 δυνατό υποψήφιο γονίδιο.

Υλικά και Μέθοδοι

πρόβλεψη Αλληλεπίδραση της απόπτωσης μελών μονοπάτι

Η οδός της απόπτωσης που συνδέονται με γονίδια που συναρμολογούνται από ηλεκτρονικές βάσεις δεδομένων, όπως το

Εγκυκλοπαίδεια του Κιότο γονιδίων και γονιδιωμάτων

(www.genome.ad.jp/kegg),

Γονιδιακή βάση δεδομένων του National Center for Biotechnology Information

(www.ncbi .nlm.nih.gov) και

GeneMAPP

(www.genmapp.org). Λέξεις-κλειδιά για την αναζήτηση ήταν «κυτταρικό θάνατο» «απόπτωση», «μονοπάτι κυτταρικού θανάτου», «υποδοχέα κυτταρικό θάνατο» (βλ S1 File).

Για την αξιολόγηση των αλληλεπιδράσεων των συνδεδεμένων απόπτωση πρωτεϊνών που αρχικά ερωτηθούν οι βάσεις δεδομένων με γνωστή αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-πρωτεΐνης, όπως NetPro (www.molecularconnections.com), SCOPPI (www.scoppi.org) και HPRD (www.hprd.org).

Για να βρείτε νέες αλληλεπιδράσεις χρησιμοποιήσαμε δύο διαφορετικές μεθόδους. Πρώτον, χρησιμοποιήσαμε την πρόβλεψη δομή που βασίζεται αλληλεπιδράσεων πρωτεΐνης (βλέπε S2 File). Οι περισσότεροι από τους 103 γονιδίων απόπτωσης που σχετίζεται ήταν άγνωστης δομής. Χρησιμοποιήσαμε αρχικά τη βάση δεδομένων Γονιδιωματική Threading (GTD) ως μέθοδος φορές αναγνώριση για την εκχώρηση των διαρθρωτικών οικογένειες των γονιδιακών προϊόντων [22]. Τομείς των πρωτεϊνών στη συνέχεια ορίζεται από τα διαρθρωτικά ταξινόμηση πρωτεϊνών, SCOP. Οι δύο περιοχές θεωρούνται αλληλεπιδρώντας εάν υπάρχουν τουλάχιστον 5 ζεύγη υπόλειμμα εντός 5 Α, σε συμφωνία με τους ορισμούς διεπαφή [23]. θεωρήθηκαν μόνο τομέα-αναθέσεις με ορισμένες και υψηλή εμπιστοσύνη από GTD. Να προβλέψει πιθανές αλληλεπιδράσεις των δύο δοθεί τομείς που χρησιμοποιείται στη συνέχεια για SCOPPI [24]. Αυτή η βάση δεδομένων που προβλέπεται εμφανές αλληλεπιδράσεις τομέα-τομέα, η οποία χρησίμευσε ως δομικά πρότυπα για την αρχική ανατεθεί περιοχές μας. Οι δύο πρωτεΐνες θεωρείται ότι αλληλεπιδρά αν κάθε περιέχει έναν τομέα όπου υπάρχει μια δομική ενδείξεις για μια τέτοια αλληλεπίδραση τομέα-τομέα, σύμφωνα με SCOPPI. Οι πιθανές αλληλεπιδράσεις αξιολογήθηκαν με ανάλυση της διατήρησης διεπαφής. Πληροφορίες των υπολειμμάτων στο περιβάλλον ήταν και πάλι ελήφθη από τη βάση δεδομένων SCOPPI. Η αρχική αλληλουχία πρωτείνης ευθυγραμμίζονται κατά την αλληλουχία του προτύπου SCOPPI, μια διατήρηση του περισσότερο από το 30% των υπολειμμάτων διεπαφής θεωρήθηκε ότι είναι επαρκής για να μοιράζονται το ίδιο εταίρο αλληλεπίδρασης.

Δεύτερον, χρησιμοποιήσαμε μια πρόβλεψη ακολουθία που βασίζεται αλληλεπιδράσεων πρωτεΐνης (βλέπε S2 File). Ως εκ τούτου, χρησιμοποιήσαμε NetPro, έναν εμπειρογνώμονα σε επιμέλεια και σχολιασμένη βάση δεδομένων που περιέχει περίπου 100.000 αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-πρωτεΐνης, για την πρόβλεψη της αλληλεπίδρασης των πρωτεϊνών μας στην ερώτηση. Χρησιμοποιώντας αυτή την πληροφορία ορθόλογα και BLAST ψάξαμε για ομόλογο αλληλεπιδράσεις (& gt? 80% ταυτότητα αλληλουχίας) για ένα δεδομένο ζεύγος πρωτεΐνη. Παρέχουμε μόνο νέες αλληλεπιδράσεις οι οποίες δεν επιβεβαιώθηκαν πριν με NetPro ή HPRD [25], [26]. Για την κατασκευή της οδού χάρτη μας, θέτουμε τους κυτταρικούς υποδοχείς θανάτου ως σημεία εκκίνησης του καταρράκτη σηματοδότησης. Πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν ορίστηκαν ως μεταγενέστερος πρωτεΐνες σηματοδότησης. Πρωτεΐνες οι οποίες είναι γνωστές συνδετήρες υποδοχέα κυτταρικό θάνατο εμφανίστηκαν ως εξω-κυτταρικές πρωτεΐνες.

Gene έκφραση ανάλυση

Για την κατασκευή των δεδομένων εικονικής υποδιάταξης θέτει E-Μπειραμ-950 και Ε-MEXP- 1121 χρησιμοποιήθηκε [27], [28].

Affymetrix σύνολο ανιχνευτών αναγνωριστικά ελήφθησαν από Ensembl με αποτέλεσμα 189 αναγνωριστικά probeset για 93 γονίδια. Για 10 γονίδια θα μπορούσαν να ληφθούν δεν αναγνωριστικό (βλ S1 αρχείου). Τα αρχεία Cel που λαμβάνεται από την 5,0 λογισμικό Affymetrix MAS χρησιμοποιήθηκαν για περαιτέρω ανάλυση. Τα αρχεία Cel φορτώθηκαν σε dChip2006 (https://www.dchip.org), στη συνέχεια κανονικοποιούνται, και τις αξίες της έκφρασης υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας το μοντέλο μμ /ΜΜ. Οι τιμές έκφρασης των 189 probesets εξήχθησαν και περαιτέρω εξερευνηθεί χρησιμοποιώντας SAM (https://www-stat.stanford.edu/~tibs/sam/) και Excel (Microsoft, Redmond, WA). Εμείς σκόραρε γονίδια όπως διαφορικά εκφρασμένων εφόσον πληρούνται τα ακόλουθα κριτήρια: α αλλαγή φορές & gt? 2 και η τιμή Q & lt? 5%. χάρτες θερμότητας παρήχθησαν χρησιμοποιώντας dChip.

Αντίστροφη Μεταγραφή αντίδραση πολυμεράσης (RT-PCR)

1 ng του cDNA χρησιμοποιήθηκε για δοκιμασία TaqMan (Applied Biosystems, Weiterstadt, Γερμανία). Τα γονίδια ενισχύθηκαν με PCR TaqMan καθολική Master Mix σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, με μια ΑΒΙ PRISM 5700 Sequence Detection System, χρησιμοποιώντας γονίδιο ειδικό εκκινητή και ανιχνευτές. Η γονιδιακή έκφραση ποσοτικοποιήθηκε με τη συγκριτική CT-Μέθοδος, ομαλοποιώντας CT-τιμές σε ένα γονίδιο καθαριότητα (β-ακτίνη) και τον υπολογισμό των τιμών σχετικών έκφρασης χρησιμοποιώντας τους ακόλουθους εκκινητές: RT-PCR: BIRC7 /Livin: Πράξη GAC CAG CCC TGA TTC C και CTC CAG GGA ΑΑΑ CCC ACT ΤΤ? Ακτίνη: AAG CCA CCC CAC TTC TCT ΟΤΑ Α και ΑΑΤ GCT ATC ACC TCC CCT ΟΤΟ T? IL1R2:. ATC AGC ΤΤΟ TCT GGG GTC ΑΑ και GGT ΑΓΓ CGC TCT CTA TGT GG [29]

Η ανοσοϊστοχημεία

Για ανοσοϊστοχημεία, ένα μικροσυστοιχιών ιστού (TMA) που περιέχει 16 δείγματα PDAC κατασκευάστηκε. Από αυτό TMA 5 μm τομές παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας σιλανοποιημένης διαφάνειες (Menzel Glaser, Braunschweig, Germany). Ανοσοϊστοχημεία για Livin /BIRC7 διεξήχθη χρησιμοποιώντας το στρεπταβιδίνης-βιοτίνης-υπεροξειδάσης μέθοδος όπως περιγράφηκε προηγουμένως και ανάκτηση αντιγόνου διεξήχθη σε ένα φούρνο μικροκυμάτων (250 W για 30 λεπτά σε ένα διάλυμα κιτρικού ρΗ 6.0) [30], [31]. Το πρωτογενές αντίσωμα που χρησιμοποιήθηκε ήταν ένα μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού κατά της πρωτεΐνης /BIRC7 Livin (# 40958, Active Motif, Rixensart, Belgium). Φυσιολογικού βλεννογόνου του παχέος εντέρου και ορθοκολικού καρκινώματος χρησιμοποιήθηκαν ως θετικός έλεγχος. Ως αρνητικός έλεγχος δείγματα επωάστηκαν χωρίς το πρωτεύον αντίσωμα. Στη συνέχεια τα πλακίδια εν συντομία με αιματοξυλίνη. Χρωματίζονται και μη χρωματισμένα κύτταρα ή PDAC πόρου κύτταρα μετρήθηκαν και ο δείκτης δημιουργήθηκε. Η ένταση χρώσης αξιολογήθηκε ημι-ποσοτικά από έναν παθολόγο (ΑΗ) χωρίς γνώση της ιστοπαθολογικής και μοριακών δεδομένων σε 3 βαθμίδες (αρνητική, μέτρια και ισχυρά).

Στατιστική ανάλυση

Για στατιστική ανάλυση χρησιμοποιήθηκαν η δοκιμή t και η chi πλατεία-τεστ «SPSS 13.0» για τα Windows.

Λογοτεχνία αναζήτηση

για την καλύτερη αξιολόγηση αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση παρατηρήθηκε στα δεδομένα μας, πραγματοποιήσαμε μια ολοκληρωμένη βιβλιογραφία αναζήτηση σε μοριακή ελαττώματα απόπτωσης σε καρκίνο του παγκρέατος. Κλειδιά ήταν το όνομα του γονιδίου ή πρωτεΐνης μαζί με τον όρο «παγκρεατικό καρκίνωμα», «καρκίνος του παγκρέατος», «καρκίνος του παγκρέατος» ή «παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκίνωμα». Συμπεριλήφθηκαν μελέτες σχετικά με το επίπεδο του γονιδιώματος, η γονιδιακή έκφραση και /λειτουργικές μελέτες πρωτεΐνης επί του ιστού του όγκου και /ή κυτταρικές σειρές. Οι βιβλιογραφική έρευνα περιελάμβανε τις δημοσιεύσεις μέχρι το Νοέμβριο του 2009. Δείτε το αρχείο, επίσης, S1.

Υποστήριξη Πληροφορίες

S1 αρχείου.

Δεδομένα από ενδελεχή βιβλιογραφική έρευνα μας για το ρόλο των γονιδίων της απόπτωσης που σχετίζεται με τον καρκίνο του παγκρέατος. Ο πίνακας εμφανίζει όλα τα γονίδια, τα οποία θεωρήθηκαν στη μελέτη μας. Παρακαλείστε να σημειώσετε ότι για τις περισσότερες από τις μελέτες σχετικά με το επίπεδο του DNA, το οποίο σημαίνει μελέτες μετάλλαξης, δεν ποσοτική έκφραση δήλωση σχετικά έγινε. Συμπεριλήφθηκαν μελέτες σχετικά με το επίπεδο του γονιδιώματος, η γονιδιακή έκφραση και /λειτουργικές μελέτες πρωτεΐνης επί του ιστού του όγκου και /ή κυτταρικές σειρές. Η βιβλιογραφική έρευνα περιελάμβανε τις δημοσιεύσεις μέχρι το Δεκέμβριο του 2009. (- /- = λιγότερο /ελαφρώς μικρότερη έκφραση σε σχέση με το φυσιολογικό ιστό? +/- = Έκφραση ανάλογα με δείγμα /κυτταρική σειρά, χωρίς να είναι δυνατόν γενική κατάσταση? 0 = καμία διαφορά της έκφρασης φυσιολογικό ιστό /κανονική λειτουργία της πρωτεΐνης σε πειραματικές μελέτες? ++ /+ = υψηλότερη /ελαφρώς υψηλότερη έκφραση σε σχέση με το φυσιολογικό ιστό? = καμία ποσοτική δήλωση σε αυτή τη μελέτη)

doi: 10.1371 /journal.pone.0012243.s001.

(1.49 MB DOC)

αρχείου S2.

Χαρακτηριστικά της πρόβλεψης αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης μας (Α). Παραδείγματα δομικών μοντέλων τρεις πιθανές νέες αλληλεπιδράσεις στο μονοπάτι κυτταρικού θανάτου (περισσότερο από 30% ταυτότητα αλληλουχίας και διεπαφή). Η δομική ευθυγράμμιση μεταξύ προτύπου και την αλληλεπίδραση πρωτεϊνικές δομές είναι & lt? 2 Angstrom. 1 = Τεχνών-Απόλλων? 2 = p16-ΕΚΚ? 3 = p16-JNK (Β)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0012243.s002

(2,16 MB PPT)

αρχείου S3.

πρωτεΐνη αλληλεπιδράσεις από την αναζήτηση βάση δεδομένων μας και ανάλυση πρόβλεψης αλληλεπίδραση μας. Φύλλο μία δείχνει ήδη γνωστές αλληλεπιδράσεις από την αναζήτηση της βάσης δεδομένων μας. Φύλλο δύο συναυλίες υποθετικό αλληλεπιδράσεις, προτείνει το μοντέλο μας πρόβλεψη αλληλεπίδρασης

doi:. 10.1371 /journal.pone.0012243.s003

(0,09 MB XLS)

Ευχαριστίες

Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από την Deutsche Krebshilfe και το πρόγραμμα MedDrive38 της ιατρικής σχολής του Technische Universität Dresden. Θα θέλαμε να ευχαριστήσουμε Beatrix Jahnke για τεχνική υποστήριξη.