Αφηρημένο

Εισαγωγή

Παρά τις βελτιώσεις στις στρατηγικές θεραπείας για το κεφάλι και το λαιμό ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα (HNSCC), τα αποτελέσματα δεν έχουν βελτιωθεί σημαντικά? τονίζοντας τη σημασία του εντοπισμού νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων για τη στόχευση αυτής της ασθένειας. Για την αντιμετώπιση αυτής της πρόκλησης, προχωρήσαμε στην αξιολόγηση του ρόλου του σιδήρου στην HNSCC.

Πειραματικός Σχεδιασμός

Τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων του σιδήρου που σχετίζονται με αξιολογήθηκαν σε κυτταρικές σειρές HNSCC χρησιμοποιώντας ποσοτική RT-PCR. Cellular φαινοτυπικά αποτελέσματα αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας βιωσιμότητας (MTS), κλωνογονική επιβίωση, BrdU, και προσδιορισμούς σχηματισμού όγκου. Η προγνωστική σημασία των πρωτεϊνών σιδήρου σχετίζονται προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημεία.

Αποτελέσματα

Σε ένα πάνελ των κυτταρικών γραμμών HNSCC, αιμοχρωμάτωση (HFE) ήταν ένας από τους πιο υπερεκφρασμένης γονίδια που εμπλέκονται στη ρύθμιση του σιδήρου.

In vitro

νοκ ντάουν της HFE σε κυτταρικές σειρές HNSCC μειώθηκε σημαντικά εψιδίνης (HAMP) έκφραση και η ενδοκυτταρική περιεκτικότητα σε σίδηρο. Αυτό με τη σειρά του, οδήγησε σε σημαντική μείωση στη βιωσιμότητα των κυττάρων HNSCC, κλωνογονικότητας, τη σύνθεση του DNA, και σηματοδότηση Wnt. Αυτές οι κυτταρικές αλλαγές αντιστράφηκαν επανεισάγοντας σιδήρου πίσω σε κύτταρα HNSCC μετά HFE knockdown, υποδεικνύοντας ότι σιδήρου διαμεσολάβηση αυτού του φαινοτύπου. Να συμπίπτει, αγωγή κυττάρων HNSCC με ένα χηλικοποιητή του σιδήρου, την ολαμίνη του ciclopirox (CPX), μείωσε σημαντικά τη βιωσιμότητα και κλωνογονική επιβίωση. Τέλος, οι ασθενείς με υψηλή HFE έκφραση παρουσίασαν μειωμένη επιβίωση συγκριτικά με τους ασθενείς με χαμηλή HFE έκφρασης.

Συμπεράσματα

Τα στοιχεία μας προσδιορίσει HFE ως δυνητικά μυθιστόρημα προγνωστικός δείκτης σε HNSCC που προωθεί την εξέλιξη του όγκου

μέσω

HAMP και αυξημένα επίπεδα ενδοκυτταρικού σιδήρου, οδηγώντας σε αυξημένη κυτταρικό πολλαπλασιασμό και το σχηματισμό όγκων. Ως εκ τούτου, τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι οι χηλικές ενώσεις του σιδήρου μπορεί να έχει ένα θεραπευτικό ρόλο στη διαχείριση HNSCC

Παράθεση:. Lenarduzzi Μ, Hui ABY, Yue S, Ito Ε, Shi W, Williams J, et al. (2013) αιμοχρωμάτωση Ενισχύει την εξέλιξη του όγκου

μέσω

Η αναβάθμιση του ενδοκυτταρικού σιδήρου στον καρκίνο κεφαλής και τραχήλου. PLoS ONE 8 (8): e74075. doi: 10.1371 /journal.pone.0074075

Επιμέλεια: Seema Σινγκ, Πανεπιστήμιο της Νότιας Αλαμπάμα Mitchell Ινστιτούτο Καρκίνου, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 18 Ιουν, 2013? Αποδεκτές: 22 Ιουλ 2013? Δημοσιεύθηκε: 26 Αυγούστου του 2013

Copyright: © 2013 Lenarduzzi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο έχει υποστηριχθεί από τα ταμεία από το Οντάριο Institute of Cancer Research, το καναδικό Ινστιτούτο Έρευνας Υγείας, και τον Δρ Mariano Ελιά Έδρα Κεφαλής και τραχήλου Cancer Research. Οι συγγραφείς, επίσης, αναγνωρίζουν με ευγνωμοσύνη τη φιλανθρωπική στήριξη από το Wharton Οικογένεια, ομάδα του Joe, και ο Gordon Tozer. Michelle Lenarduzzi είναι αποδέκτης των υποτροφιών από την πρωτοβουλία του Ιδρύματος Στρατηγικής Εκπαίδευσης Terry Fox για την Αριστεία στην ακτινοβολία Ερευνών του 21ου αιώνα (EIRR21) στο καναδικό Ινστιτούτα Ερευνών Υγείας (CIHR), η Υποτροφία Οντάριο Graduate (OGS) και η Ιατρική Βιοφυσική Αριστείας βραβείο. Υποστήριξη παρέχεται επίσης από την Campbell Οικογένεια Ινστιτούτο για την Έρευνα του Καρκίνου και του Υπουργείου Υγείας και τη Μακροχρόνια Σχεδιασμού. CIHR – https://www.cihr-irsc.gc.ca/e/193.html, EIRR21 – https://www.eirr21.utoronto.ca/, OGS – https://osap.gov.on.ca /OSAPPortal/en/A-ZListofAid/TCONT003465.html. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Κεφάλι και ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα τραχήλου (HNSCC) είναι η 6η πιο κοινή μορφή καρκίνου σε όλο τον κόσμο, με διαγνωσμένη ~ 650.000 νέες περιπτώσεις και ~ 350.000 θανάτους ετησίως [1,2]. Η πλειοψηφία των ασθενών με τοπικά προχωρημένη νόσο, και παρά τις νέες θεραπευτικές προσεγγίσεις, οι ελεύθερες ποσοστά επιβίωσης 5 ετών νόσο έχουν παραμείνει στάσιμες κατά 30-40% [3]. Αυτά τα φτωχά αποτελέσματα υπογραμμίζουν τη σημασία της ανάπτυξης νέων θεραπευτικών στρατηγικών για τη στόχευση αυτής της ασθένειας.

Ο σίδηρος είναι ένα ουσιαστικό στοιχείο που εμπλέκονται σε πολλές βασικές διαδικασίες συμπεριλαμβανομένου του DNA και τη σύνθεση της αίμης, σηματοδότηση Wnt, και τον κυτταρικό μεταβολισμό [4,5]. Πολλά καρκινικά κύτταρα εμφανίζουν αυξημένη ζήτηση για σίδηρο, προκειμένου να διατηρηθεί υψηλή σύνθεση κυτταρικού κύκλου εργασιών και το DNA τους. Κατά συνέπεια, τα γονίδια που εμπλέκονται στη ρύθμιση του σιδήρου είναι συχνά απορυθμισμένη σε καρκίνους. Εδώ, αναφέρουμε την υπερέκφραση της αιμοχρωμάτωση (HFE) σε HNSCC, και να αποδείξει την ικανότητά του να αλλάξει ενδοκυτταρικό σίδηρο και να αυξήσει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων.

αιμοχρωμάτωση είναι trans-μεμβράνης γλυκοπρωτεΐνης, παρόμοια με τον τύπο μορίου κύρια κατηγορία ιστοσυμβατότητας 1 ( MHC) που συνδυάζεται με Β

2-μικροσφαιρίνη για ενδοκυτταρική μεταφορά προς τη μεμβράνη του πλάσματος [6]. Κατά τη μεμβράνη, HFE μπορεί να συνδεθεί με είτε υποδοχέα τρανσφερίνης 1 (TRF1) ή τον υποδοχέα τρανσφερίνης 2 (TFR2). Οι θέσεις σύνδεσης του HFE και οι επικαλύψεις τρανσφερίνης δεσμεύεται σιδήρου σε TFR1 [7], ρυθμίζοντας έτσι την πρόσληψη του σιδήρου στα κύτταρα. Ωστόσο, πιο πρόσφατα στοιχεία δείχνουν, επίσης, ότι ένα κεντρικό ρόλο του HFE είναι να τονωθεί η έκφραση του σιδήρου ρυθμιστικών ορμονών, εψιδίνης (HAMP), είτε μέσω της σύνδεσης με TFR2 [8], ή ανεξάρτητα [9]. Η λειτουργία του HAMP είναι να εσωτερικεύσει και να υποβαθμίζει φερροπορτίνη (FPN), το μόνο κυτταρική εξαγωγέας σιδήρου [10]? οδηγώντας σε αύξηση στα ενδοκυτταρικά επίπεδα του σιδήρου με αναστολή απελευθέρωσης σιδήρου [10]. Ως παράδειγμα, η υπερέκφραση του HFE σε μακροφάγα και κυτταρικές γραμμές αδενοκαρκινώματος κόλου ανέστειλε την εκροή των κυτταρικών σιδήρου [11,12].

Από την άλλη πλευρά, οι γενετικές μεταλλάξεις στο

HFE

οδηγήσει στην κατάσταση υπερφόρτωσης σιδήρου, κληρονομική αιμοχρωμάτωση (HH). Η πιο κοινή μορφή της HH προκαλείται από μια απλή μετάλλαξη ζεύγους βάσεων σε HFE η οποία οδηγεί σε C282Y υποκατάσταση [6], η οποία διαταράσσει την αλληλεπίδραση μεταξύ HFE με Β

2-μικροσφαιρίνη, και ως εκ τούτου την καθοδήγηση του HFE στο κύτταρο μεμβράνη. Οι ασθενείς με HH έχουν δυσανάλογα χαμηλά επίπεδα HAMP [8], τονίζοντας τη σημασία της HFE για HAMP. Χαμηλή HAMP αποτέλεσμα την απελευθέρωση του σιδήρου από δικτυοενδοθηλιακά μακροφάγα, και επιτρέπει τη συνεχή απορρόφηση του σιδήρου από το έντερο, οδηγώντας σε περίσσεια σιδήρου σε κυκλοφορία [13]. Κατά συνέπεια, τα κυκλοφορούντα τρανσφερίνης γίνεται κορεσμένο, με αποτέλεσμα τη συσσώρευση σιδήρου στα παρεγχυματικά κύτταρα διαφόρων τελικών οργάνων, με αποτέλεσμα κίρρωση, διαβήτης, καρδιομυοπάθεια, και τον καρκίνο [13,14].

Σε αυτό παρούσα μελέτη, αναφέρουμε τα πάνω έκφραση του HFE σε HSNCC, που με τη σειρά αυξημένα κυτταρικά επίπεδα της HAMP, και ενδοκυτταρικό σίδηρο. Διαταράσσοντας ενδοκυτταρικά επίπεδα σιδήρου, HFE μπορεί να προωθήσει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, της σύνθεσης DNA, σηματοδότηση Wnt, και σχηματισμό όγκων

.

Η

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Όλα τα πειράματα σε ζώα διεξήχθησαν σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές της Επιτροπής Φροντίδας ζώων στο Δίκτυο Υγείας του Πανεπιστημίου (Τορόντο, Καναδάς). Το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την επιτροπή Animal Care στο Δίκτυο Υγείας του Πανεπιστημίου (Αριθμός Πρωτοκόλλου: 342,19).

Τα δείγματα ασθενών συλλέχθηκαν από 26 ασθενείς HNSCC, με την έγκριση από το Διοικητικό Συμβούλιο Πανεπιστήμιο Δίκτυο Υγείας Θεσμικών Έρευνας Ηθικής, (REB έγκριση # 07-0521-CE). Τα δείγματα αυτά περιλαμβάνονται αντίστοιχη ομάδα 12 υποτροπιάζον και 14 μη υποτροπή ασθενείς, με μέσο χρόνο παρακολούθησης 3 ετών. Οι κλινικές λεπτομέρειες σχετικά με αυτούς τους 26 ασθενείς που παρέχονται στον Πίνακα S1. Γραπτή ή προφορική συγκατάθεση δεν θα μπορούσε να ληφθεί από τους ασθενείς λόγω της περιόδου της ομάδα μας (2003-2007). Ως εκ τούτου, Πανεπιστήμιο Δίκτυο Υγείας Θεσμικών Διοικητικό μας Συμβούλιο Δεοντολογίας Έρευνας παραιτηθεί από την απαίτηση για γραπτή συγκατάθεση από τους συμμετέχοντες της μελέτης αυτής.

Cells Γραμμές και αντιδραστήρια

Το ανθρώπινο υποφάρυγγα κυτταρική σειρά HNSCC FaDu λήφθηκε από την American Type Culture Collection (Manassas, VA), και καλλιεργήθηκαν σύμφωνα με τις προδιαγραφές του κατασκευαστή. Το ανθρώπινο λάρυγγα πλακωδών κυττάρων γραμμές, UTSCC-8 και UTSCC-42α (είδος δώρα από το R Grénman, Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Turku, Turku, Φινλανδία) [15,16] διατηρήθηκαν με ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (Wisent, Inc) και 100 mg /L πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη. Τα κανονικά από το στόμα επιθηλιακά κύτταρα (ΝΟΕ) αγοράστηκαν εμπορικά και καλλιεργήθηκαν στο συνιστώμενο μέσο (Celprogen). Όλα τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε επωαστήρα 37 ° C με υγροποιημένο 5% CO

2, επικυρωμένη στο Κέντρο Εφαρμοσμένης Γονιδιωματική (Νοσοκομείο για Άρρωστα Παιδιά, Toronto, Canada) χρησιμοποιώντας το AmpF /STR Identifier Ενίσχυση PCR Kit (Applied Biosystems) , και συνήθως ελέγχονται για μόλυνση από μυκόπλασμα χρησιμοποιώντας το κιτ ανίχνευσης Mycoalert (Lonza Group Ltd).

Ποσοτικοποίηση του mRNA

Ολικό RNA εκχυλίσθηκε από κυτταρικές σειρές χρησιμοποιώντας το κιτ καθαρισμού Σύνολο RNA (Norgen), έπειτα μεταγράφηκε ανάστροφα χρησιμοποιώντας Superscript II Reverse Transcriptase (Invitrogen Καναδάς), σύμφωνα με τις προδιαγραφές. αξιολογήθηκαν φερροπορτίνη (FPN), εψιδίνης (HAMP), αιμοχρωμάτωση (HFE), υποδοχέα τρανσφερίνης 1 (TFR1), φερριτίνη βαριά αλυσίδα (FTH1), φερριτίνη ελαφριά αλυσίδα (FTL) και τα μιτοχόνδρια φερριτίνη (FTMT): επίπεδα μεταγραφή γονιδίων σιδήρου ρυθμίζουν με qRT-PCR, χρησιμοποιώντας SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems), και το ΑΒΙ PRISM 7900 Sequence Detection System (Applied Biosystems Inc, Foster City, CA), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17]. Οι αλληλουχίες εκκινητή χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη αυτή όλα παρατίθενται στον Πίνακα S2.

πειράματα επιμόλυνσης

Οι βιολογικές επιδράσεις του HFE διερευνήθηκαν χρησιμοποιώντας siRNAs που στοχεύουν HFE. siHFE1 (Hs_HFE_5 FlexiTube siRNA) και siHFE2 (Hs_HFE_2 FlexiTube siRNA) αγοράστηκαν από την Qiagen. Μια ομελέτα siRNA (Hs_Control_ss Flexitube siRNA) χρησίμευσε ως αρνητικός μάρτυρας. Όλες οι επιμολύνσεις πραγματοποιήθηκαν σε πλήρες μέσο χωρίς αντιβιοτικά χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 και 20 ηΜ siRNA, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18].

Αντιδραστήρια

Ciclopirox ολαμίνη (CPX), δεφεροξαμίνη μεσυλικό άλας (DFO), σίδηρος κιτρικό αμμώνιο (FAC) ελήφθησαν από την Sigma-Aldrich.

βιωσιμότητα και κλωνογενείς δοκιμασίες

Η βιωσιμότητα των κυττάρων που επιμολύνθηκαν με HNSCC siHFE + ακτινοβολία (RT), ή κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με CPX, ήταν προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας CellTiter 96 μη ραδιενεργού Κυττάρου Δοκιμασία Πολλαπλασιασμού (MTS) (Promega Biosciences), σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Η ικανότητα σχηματισμού αποικίας των κυττάρων HNSCC επιμολυσμένα με siHFE + RT, ή κύτταρα που κατεργάζονται με CPX + RT προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας την δοκιμασία κλωνοποίησης όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19]. Εν συντομία, 48 ώρες μετά την επιμόλυνση με siHFE ή 72 ώρες μετά τη θεραπεία με CPX, τα κύτταρα FaDu επανα-εμβολιάστηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων και επωάζονται στους 37

0C υπό 5% CO

2 για 10-12 ημέρες. Οι πλάκες στη συνέχεια πλύθηκαν και χρωματίστηκαν με 0.1% κρυσταλλικό ιώδες σε 50% μεθανόλη, και ο αριθμός των αποικιών στη συνέχεια μετρήθηκαν. Το κλάσμα των επιζώντων κυττάρων υπολογίστηκε με σύγκριση της siHFE εναντίον siCTRL ή CPX εναντίον CTRL.

κυτταρομετρίας ροής

Η κυτταρομετρία ροής αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν σε Cytometer FACSCalibur Flow (BD Biosciences), αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση FlowJo 7,5 λογισμικού (Tree Star, San Carlos, CA, USA), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17].

Labile Iron

Η κυτταρική ασταθές πισίνα σίδηρο μετρήθηκε χρησιμοποιώντας καλσεΐνης-ακετοξυμεθυλεστέρα (καλσεΐνη-ΑΜ), όπως καθορίζεται από τον κατασκευαστή (Invitrogen). Τα επιμολυσμένα κύτταρα επωάστηκαν με 1 μΜ καλσεΐνης-ΑΜ για 15 λεπτά στους 37 ° C. Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS, στη συνέχεια μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18].

Ενσωμάτωσης BrdU

ενσωμάτωσης BrdU μετρήθηκε χρησιμοποιώντας Exalpha Βιολογικά BrdU Colorimetric ELISA Kit. Εν συντομία, επιμολυσμένα κύτταρα επωάστηκαν με το αντιδραστήριο BrdU για 24 ώρες, σταθερό, χρωματίστηκαν και αναλύθηκαν σύμφωνα με τις προδιαγραφές του κατασκευαστή, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18].

ROS Πειράματα

Η ενδοκυτταρική αντιδραστικά είδη οξυγόνου επίπεδα (ROS) μετρήθηκε με τη χρήση της μη ειδικής 5- (και 6-) χλωρομεθυλ-2 ‘, 7’-διοξική dichlorodihydrofluorescein (CM-H2DCFDA? διέγερση 488 nm, εκπομπή 525 nm) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Invitrogen). Τα επιμολυσμένα κύτταρα επωάστηκαν με 5 μΜ του CM-H2DCFDA για 30 λεπτά στους 37 ° C. Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS, στη συνέχεια μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής [18].

Western Blot

FaDu κύτταρα επιμολύνθηκαν με siHFE ή ελέγχου, 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα λύθηκαν σε 1 Μ Tris -ΗΟΙ (ρΗ 8), 5Μ NaCl, και 1% ΝΡ40 συν το κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Roche Diagnostics). Η συγκέντρωση πρωτεΐνης εκτιμήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17]. Οι μεμβράνες ανιχνεύθηκαν με αντι-Β-κατενίνης μονοκλωνικό αντίσωμα κουνελιού (Cell σηματοδότηση 8814) ή αντι-HFE μονοκλωνικό αντίσωμα (Abnova) που ακολουθείται από δευτερογενή αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση (Abcam). GAPDH και η έκφραση πρωτεΐνης α-τουμπιουλίνης χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχοι φόρτωσης. Western blots ήταν ποσοτικά με το Adobe Photoshop Pixel Ποσοτικοποίηση Plug-In (Richard Rosenman Διαφήμιση & amp? Σχεδιασμού).

Πειράματα Iron διάσωσης

FaDu κύτταρα επιμολυσμένα με siHFE ή τον έλεγχο? 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία είτε με 5 μΜ του DFO, 5 μΜ του FACS ή αρνητικό μάρτυρα (DMSO). Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία FaDu με ή χωρίς 2 Gy του RT. Πέντε ημέρες μετά την επιμόλυνση, η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε όπως περιγράφεται παραπάνω.

κύτταρα όγκου Δοκιμασία Σχηματισμού

FaDu επιμολύνθηκαν με siCTRL ή siHFE. Σαράντα οκτώ ώρες αργότερα, τα βιώσιμα κύτταρα συλλέχθηκαν και 2.5×10

5 κύτταρα εναιωρήθηκαν σε 100 μι μέσου και εγχύθηκε ενδομυϊκά στην αριστερή γαστροκνήμιο μυ των 8-10 εβδομάδων σε ηλικία θηλυκών σοβαρή συνδυασμένη ανοσοανεπάρκεια (SCID) BALB /c ποντίκια. Η ανάπτυξη του όγκου παρακολουθήθηκε με μέτρηση της διαμέτρου του όγκου συν πόδι (TLD) δύο έως τρεις φορές την εβδομάδα? ποντίκια θυσιάστηκαν όταν η TLD έφθασε το 13 mm όπως ένα βάναυσο καταληκτικό σημείο.

όγκου Σχηματισμός Δοκιμασία με CPX

Για τη μελέτη CPX, δύο εβδομάδες μετά από FaDu εμφύτευση των κυττάρων του όγκου, όπως περιγράφεται παραπάνω, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε θεραπεία καθημερινά από Δευτέρα έως Παρασκευή από του στόματος καθετηριασμό με CPX (25 mg /kg) σε νερό ή όχημα ελέγχου για ένα σύνολο δύο εβδομάδων. Η ανάπτυξη του όγκου παρακολουθήθηκε με μέτρηση της διαμέτρου του όγκου συν πόδι (TLD) τρεις φορές την εβδομάδα? ποντίκια θυσιάστηκαν όταν η TLD έφθασε το 13 mm όπως ένα βάναυσο καταληκτικό σημείο.

Η ανοσοϊστοχημεία του σιδήρου Πρωτεΐνες

Έκφραση

της TFR1 και HFE αξιολογήθηκε σε 26 πρωτοβάθμια διαγνωστικά τμήματα βιοψίας HNSCC χρησιμοποιώντας ανάκτησης αντιγόνου μικροκυμάτων σε συνδυασμό με το επίπεδο-2 Ultra Streptavidin System, και αντι-HFE (Sigma HPA017276, 1/300 αραίωση), ή αντι-TFR1 (Sigma HPA028598, 1/500 αραίωση), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17]. Εν συντομία, 4-um τομές deparaffin, κατεργάζεται με ένα αντιδραστήριο ανάκτηση αντιγόνου, αποκλείστηκαν με 3% υπεροξείδιο υδρογόνου και επωάστηκαν είτε με αντι-HFE ή αντι-TFR1 στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Την επόμενη ημέρα, οι τομές επωάστηκαν με βιοτινυλιωμένο δευτερεύον αντίσωμα και στρεπταβιδίνη για να ολοκληρωθεί η χρώση. Κυτταροπλασματική χρώση αντι-HFE ή αντι-TFR1 βαθμολογήθηκε από 0 έως 3 με βάση την ένταση χρώσης που ορίστηκε ανάλογα: 0 (καμία χρώση)? 1 (ήπια αυξημένη χρώση σε σύγκριση με το αντίστοιχο κανονικό επιθήλιο)? 2 (μέτρια αυξημένη χρώση) και 3 (έντονη αυξημένη χρώση).

Στατιστική Ανάλυση

Όλα τα πειράματα έχουν πραγματοποιηθεί τουλάχιστον τρεις ανεξάρτητες φορές, και τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος + τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής (SEM). Η σύγκριση μεταξύ των δύο ομάδων θεραπείας αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το

t

test του Student. εφαρμόστηκαν δύο όψεων δοκιμές. Τα αποτελέσματα θεωρήθηκαν σημαντικά εάν η τιμή ρ ήταν μικρότερη από ή ίση με 0,05. Ανάλυση και γραφικές παραστάσεις ολοκληρώθηκαν χρησιμοποιώντας Graphpad Prism (GraphPad Software, Inc).

Αποτελέσματα

HFE υπερεκφράζεται σε κυτταρικές σειρές HNSCC σε σύγκριση με το ΝΟΕ κυτταρική σειρά

Για την αναγνώριση διαφορικά εκφρασμένα γονίδια που ρυθμίζουν σιδήρου σε HNSCC, βασικά επίπεδα έκφρασης του mRNA σε τρεις κυτταρικές γραμμές HNSCC συγκρίθηκε με εκείνες σε μια ΝΟΕ χρησιμοποιώντας qRT-PCR. HFE παρατηρήθηκε να έχουν το υψηλότερο επίπεδο έκφρασης της & gt? 80-πλάσια υπερέκφραση σε HNSCCs εναντίον της ΝΟΕ κυτταρική σειρά (Εικόνα 1Α). Φερριτίνη (FTH1) είχε το δεύτερο υψηλότερο επίπεδο της υπερέκφρασης στο FaDu και τα κύτταρα UTSCC 42α, σε σύγκριση με τον ΝΟΕ. Αξίζει να σημειωθεί ότι, TFR1 εμφανίστηκε επίσης να υπερεκφράζεται ελαφρά το HNSCC σε σύγκριση με το ΝΟΕ κυτταρική σειρά.

(Α) ανάλυση qRT-PCR του FPN, HAMP, HFE, TFR1, FTH1, FTL και έκφραση FTMT στην FaDu, UTSCC 42α και καρκινικές κυτταρικές σειρές UTSCC8 HNSCC, κανονικοποιημένη σε αυτά τα γονίδια σε κύτταρα ΝΟΕ. κύτταρα (Β) FaDu διαμολύνθηκαν με 20 ηΜ siCTRL ή siHFE1. Η βιωσιμότητα των κυττάρων αξιολογήθηκε σε κύτταρα FaDu με την δοκιμασία MTS 24-72 ώρες μετά την επιμόλυνση. κύτταρα (C) FaDu διαμολύνθηκαν με 20 ηΜ siCTRL ή siHFE1, τότε ακτινοβολείται 48 ώρες μετά τη διαμόλυνση (4 Gy). Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε με τον προσδιορισμό MTS 5 ημέρες μετά την επιμόλυνση. (D) Κλωνογόνος επιβίωση των κυττάρων μετρήθηκε FaDu 10 έως 12 ημέρες μετά την εκ νέου σπορά κύτταρα κατεργασμένα με siCTRL (20 ηΜ) ή siHFE1 (20 ηΜ) για 72 ώρες. (Ε) Cell βιωσιμότητα των κυττάρων ΝΟΕ εκτιμήθηκε με δοκιμασία MTS 24, 48 και 72 ώρες μετά την επιμόλυνση με 20 ηΜ siCTRL ή siHFE1. κύτταρα (F) ΝΟΕ διαμολύνθηκαν με 20 ηΜ siCTRL ή siHFE1 ή 2 ?, κατόπιν ακτινοβολείται 48 ώρες μετά τη διαμόλυνση (4 Gy). Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε με τον προσδιορισμό MTS 5 ημέρες μετά την επιμόλυνση. * P & lt? 0.05, ** P & lt?. 0,005, P = NS (όχι σημαντική)

Η

In vitro επιδράσεις της HFE κάτω ρύθμιση

Για να εκτιμηθεί η βιολογική σημασία της HFE υπερέκφραση, knockdown πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε κύτταρα HNSCC χρησιμοποιώντας μια προσέγγιση siRNA. Παρατεταμένη knockdown επιτεύχθηκε σε κύτταρα FaDu για μέχρι και 72 ώρες με τη χρήση δύο ανεξάρτητων siRNAs που στοχεύουν HFE τόσο της μεταγραφής και τα επίπεδα της πρωτεΐνης (Σχήματα S1A και S1B). κύτταρα HNSCC επέδειξε μια σημαντική μείωση στην βιωσιμότητα των κυττάρων με ή χωρίς ακτινοβολία μετά την επιμόλυνση με siHFE σύγκριση με siCTRL (Σχήμα 1Β-C, S1c-Ε). Επιπλέον, η ικανότητα των κυττάρων HNSCC να σχηματίσουν αποικίες ήταν σημαντικά μειωμένη, με ή χωρίς ακτινοβολία μετά την επιμόλυνση με siHFE σε σύγκριση με την siCTRL (Εικόνα 1 D, S1F-G). Σε αντίθεση, η βιωσιμότητα των κυττάρων ΝΟΕ με ή χωρίς ακτινοβολία παρέμεινε αμετάβλητη μετά από επιμόλυνση με siHFE σε σύγκριση με την siCTRL (Σχήμα 1Ε-Ρ, S1H). Συνολικά, αυτές οι παρατηρήσεις έδειξαν ότι μειώνοντας HFE μειωμένη κατά προτίμηση βιωσιμότητας και ικανότητας κλωνισμού σε HNSCC σε σύγκριση με τα κύτταρα ΝΟΕ. Για την καλύτερη κατανόηση του μηχανισμού (ες) υπεύθυνη για διαμεσολάβηση αυτού του φαινοτύπου, ερευνήσαμε την ικανότητα των HFE να ρυθμίζει την κυτταρική σιδήρου.

HFE ρυθμίζεται HAMP και την ασταθή πισίνα σιδήρου στα κύτταρα HNSCC

Για να προσδιορίσετε αν HFE συμμετείχε στη ρύθμιση εψιδίνης (HAMP), μετρήσαμε τα επίπεδα mRNA των HAMP από qRT-PCR μετά από επιμόλυνση με siHFE. κύτταρα FaDu έδειξαν σημαντική μείωση στο επίπεδο μεταγραφής HAMP mRNA (& lt? 0,5-φορές) για έως και 72 ώρες μετά την επιμόλυνση με siHFE σε σύγκριση με την siCTRL (Εικόνα 2Α). Επιπλέον, η ασταθής πισίνα σιδήρου (LIP) επίσης μειώθηκε σημαντικά (κατά ~ 20%) μετά από HFE knockdown σε κύτταρα HNSCC σύγκριση με siCTRL (Σχήμα 2Β). Σε αντίθεση, δεν υπήρχε σημαντική μεταβολή στο χείλος σε κύτταρα ΝΟΕ με siHFE διαμόλυνση (Σχήμα 2C). Συνολικά, αυτά τα πειράματα απέδειξαν την ικανότητα του HFE να μεταβάλλουν τα επίπεδα του κυτταρικού σιδήρου κατά προτίμηση σε HNSCC σύγκριση με κύτταρα ΝΟΕ. Για να καθοριστεί εάν τα επίπεδα ενδοκυτταρικού σιδήρου συμμετείχαν στην μεσολάβηση αυτών των φαινοτύπων siHFE, πραγματοποιήσαμε μια σειρά πειραμάτων διάσωσης σιδήρου.

(Α) qRT-PCR των επιπέδων HAMP στις 24, 48 και 72 ώρες μετά την επιμόλυνση με 20 nm το καθένα siHFE1, ή siHFE2, σε σχέση με την πολλαπλή μεταβολή στην siCTRL-επεξεργασμένα κύτταρα. (Β) Κυτταρική ασταθές πισίνα σιδήρου (LIP) σε κύτταρα FaDu και UTSCC8 επιμολυσμένα με 20 ηΜ κάθε του siCTRL ή siHFE, ανιχνεύθηκε με κυτταρομετρία ροής με καλσεΐνη-ΑΜ σε 24-72 ώρες μετά την επιμόλυνση. (C) Κυτταρική LIP των κυττάρων ΝΟΕ επιμολυσμένα με 20 nM της siCTRL ή siHFE, ανιχνεύεται με κυτταρομετρία ροής με καλσεΐνη-ΑΜ σε 24-72 ώρες μετά την επιμόλυνση. * P & lt? 0.05, ** P & lt?. 0,005, P = NS (όχι σημαντική)

Η

Iron μεσολαβεί το κυτταρικό πολλαπλασιασμό των HFE

Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε σε κύτταρα HNSCC αντιμετωπίζονται με siHFE μόνο, siHFE με δεφεροξαμίνη χηλικοποιητή του σιδήρου (DFO), ή σε συνδυασμό με siHFE διαλυτού σιδήρου (FAC), αμφότερα με και χωρίς RT (Σχήματα 3Α & amp? S2A-Β). Αυτές οι μελέτες κατέδειξαν ότι η προσθήκη του DFO μειωθεί περαιτέρω βιωσιμότητα των κυττάρων μετά HNSCC HFE knock-down, η οποία εντελώς διασώθηκε με την προσθήκη FAC? RT δεν είχε σημαντική διαφορετική επίδραση σε αυτή τη διαδικασία. Αυτά τα ευρήματα επιβεβαίωσαν ότι ο σίδηρος ήταν ένας κρίσιμος μεσολαβητής αυτών των επιδράσεων. Στη συνέχεια προχωρήσαμε να αξιολογηθούν τα αποτελέσματα της siHFE επί μεταγενέστερες διεργασίες σιδήρου-εξαρτώμενη.

(Α) κύτταρα FaDu διαμολύνθηκαν με 20 ηΜ το καθένα από siCTRL ή siHFE1, έπειτα υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 5 υΜ του DFO, ή 5 μΜ του FAC , 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, ακολουθούμενη από ± RT (4 Gy), 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε με τον προσδιορισμό MTS 5 ημέρες μετά την επιμόλυνση. ενσωμάτωση (Β) BrdU αξιολογήθηκε σε κύτταρα FaDu 5 ημέρες μετά τη διαμόλυνση με 20 ηΜ κάθε του siCTRL ή siHFE1, ± RT (4 Gy, 48 ώρες μετά την επιμόλυνση). κύτταρα (C) FaDu διαμολύνθηκαν με 20 ηΜ κάθε του siCTRL ή siHFE, ± RT (4 Gy, 48 ώρες μετά την επιμόλυνση). Ολικό κυτταρικό επίπεδο ROS ανιχνεύθηκε με κυτταρομετρία ροής με CM-H2DCFDA 24-72 ώρες μετά RT. (D) κηλίδωση Western της Β-κατενίνης μετρήθηκε σε κύτταρα FaDu 24-72hr μετά την επιμόλυνση με siCTRL (20 ηΜ) ή siHFE1 (20 ηΜ)? εικόνων (άνω), τον ποσοτικό προσδιορισμό (παρακάτω). * P & lt? 0.05, ** P & lt? 0.005, *** P & lt? 0,0005, Ρ = NS (όχι σημαντική)

Η

Η δοκιμασία ενσωμάτωσης BrdU χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση των αλλαγών στη σύνθεση του DNA. κύτταρα επιμολυσμένα με HNSCC siHFE κατέδειξαν μία σημαντική μείωση (60%) σε ενσωμάτωσης BrdU σε σύγκριση με siCTRL-επεξεργασμένα κύτταρα (Σχήμα 3Β, S2C). Αντιθέτως, καμία σημαντική αλλαγή στην ενσωμάτωση BrdU παρατηρήθηκε για τα κύτταρα που επιμολύνθηκαν με ΝΟΕ siHFE σύγκριση με siCTRL-αγωγή (Σχήμα S2D). Η κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση μεταβολών στα επίπεδα ROS μετά siHFE. Όπως ήταν αναμενόμενο, τα κύτταρα FaDu κατέδειξε μία σημαντική μείωση στα επίπεδα ROS μετά από επιμόλυνση με siHFE σύγκριση με siCTRL, με και χωρίς RT (Σχήματα 3C και S2E). Τέλος, η οδός Wnt εξετάστηκε αναλύοντας αλλαγές στη Β-κατενίνης. κύτταρα επιμολυσμένα με FaDu siHFE κατέδειξαν μία σημαντική μείωση (~ 40%) στα επίπεδα Β-κατενίνης για έως 72 ώρες σε σύγκριση siCTRL επεξεργασμένα κύτταρα (Σχήμα 3D).

siHFE μειώνει οριακά σχηματισμό όγκων in vivo

στη συνέχεια, θα αξιολογηθούν οι επιπτώσεις της HFE knock-down σε

in vivo

μοντέλο όγκου. Ογκογονικότητα μετρήθηκε

in vivo

χρησιμοποιώντας ποντίκια SCID εγχύθηκαν ενδομυϊκά με κύτταρα επιμολυσμένα με FaDu siHFE ή siCTRL. Καταστολή της siHFE μειώθηκε οριακά το σχηματισμό όγκου σε σύγκριση με τον αρνητικό μάρτυρα, αισθητή σε μεταγενέστερα χρονικά σημεία (& gt? 27 ημέρες). (Σχήμα S2F)

σίδηρος χηλικό παράγοντα CPX μειωμένο πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε κυτταρικές σειρές HNSCC

Λαμβάνοντας υπόψη τις προκλήσεις στην θεραπευτική εφαρμογή μιας στρατηγικής siRNA, κύτταρα HNSCC υποβλήθηκαν σε θεραπεία με κλινικά εγκεκριμένο χηλικό παράγοντα σιδήρου, Ciclopirox ολαμίνη (CPX), για να καθορίσει εάν θα μπορούσε να ανακεφαλαιώνει ο φαινότυπος siHFE. Θεραπεία κυτταρικών γραμμών HNSCC με 5 υΜ του CPX ως αποτέλεσμα τη σημαντική μείωση του σχηματισμού αποικιών, με ή χωρίς RT, σε σύγκριση με τα κύτταρα υπό αγωγή με όχημα (Εικόνα 4Α, S3A-Β). Σε αντίθεση, CPX είχε πολύ μικρότερη επίδραση στη βιωσιμότητα του ΝΟΕ σε σύγκριση με κύτταρα FaDu (Σχήμα 4Β). Δυστυχώς, η χορήγηση CPX για 2 εβδομάδες σε 25 mg /kg απέτυχαν να μειώσουν την ανάπτυξη του όγκου στο μοντέλο ξενομοσχεύματος FaDu (Σχήμα S3C).

(Α) Κλωνογόνος επιβίωση των κυττάρων μετρήθηκε FaDu 10 έως 12 ημέρες μετά την εκ νέου σπορά των κυττάρων που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αιθανόλη (5 υΜ) ή CPX (5 υΜ) για 72 ώρες, ακολουθούμενη από RT (0, 2, 4 ή 6 Gy). (Β) Κυτταρική βιωσιμότητα των κυττάρων FaDu και ΝΟΕ εκτιμήθηκε με δοκιμασία MTS 72 ώρες μετά τη θεραπεία με CPX (2,5 υΜ, 5 υΜ ή 10 μΜ). * P & lt? 0.05, ** P & lt? 0.005, *** P & lt? 0,0005, Ρ = NS (όχι σημαντική)

Η

πρωτεΐνες σιδήρου είναι απο-ρυθμίζονται σε δείγματα ιστών πρωτογενή HNSCC

η ανοσοϊστοχημεία (IHC) χρησιμοποιήθηκε για να επιβεβαιώσει οπτικά την έκφραση της HFE και TFR1 στους ιστούς HNSCC. Έντονη ανοσο-έκφραση των δύο HFE και TFR1 παρατηρήθηκε στο κυτταρόπλασμα των καρκινικών κυττάρων, αλλά όχι στο διπλανό στρώμα ή διηθητικά λεμφοκύτταρα (Σχήμα 5Α και 5Β). Αντίθετα, ελάχιστη ανοσο-έκφραση της HFE και TFR1 παρατηρήθηκε σε μια κανονική λάρυγγα (Σχήμα 5C-D), επιβεβαιώνοντας την υψηλότερη έκφραση του HFE και TFR1 σε HNSCC εναντίον φυσιολογικών ιστών. Όταν η έκφραση της HFE ή TFR1 διαχωρίστηκαν μεταξύ τους μεταξύ υψηλής (IHC ≥2)

vs

χαμηλά. (IHC & lt? 2) επίπεδα, οι πρώην ομάδες παρουσίασαν μικρότερη συνολική επιβίωση σε σύγκριση με το τελευταίο (Σχήμα 5Ε-F ? p = 0.08)? αν και η στατιστική σημαντικότητα δεν επιτεύχθηκε λόγω του μικρού μεγέθους του δείγματος. Ομοίως, η μέση βαθμολογία IHC τόσο για HFE και TFR1 ήταν υψηλότερη στις υποτροπιάζον έναντι μη υποτροπιάζουσα δείγματα ασθενούς (Σχήμα S4A-Β), αλλά ήταν στατιστικά σημαντική μόνο για HFE έκφραση (p = 0.04).

(Α) αντιπροσωπευτική εικόνα της HFE ανοσοϊστοχημική έκφραση από ένα πρωτεύον βιοψία HNSCC? βέλη δείχνουν τα καρκινικά κύτταρα εμφανίζουν κυτταροπλασματική σήμα. (Β) Μια αντιπροσωπευτική εικόνα της TFR1 ανοσοϊστοχημική έκφραση από ένα πρωτεύον βιοψία HNSCC? βέλη δείχνουν τα καρκινικά κύτταρα που εμφανίζουν το σήμα κυτταροπλασματική μεμβράνη. (Γ) Μια αντιπροσωπευτική εικόνα της HFE ανοσοϊστοχημική έκφραση από ένα κανονικό λάρυγγα. (D) Ένα αντιπροσωπευτική εικόνα των TFR1 ανοσοϊστοχημικής έκφρασης από ένα κανονικό λάρυγγα. (Ε) Kaplan-Meier οικόπεδο συνολικής επιβίωσης για τους ασθενείς HNSCC διαχωρίστηκαν μεταξύ τους με βάση την υψηλή (≥2)

vs

. χαμηλή (& lt? 2) βαθμολογίες HFE ανοσοϊστοχημεία. (F) Kaplan-Meier οικόπεδο συνολικής επιβίωσης για τους ασθενείς HNSCC διαχωρίστηκαν μεταξύ τους με βάση την υψηλή (≥2)

vs

. χαμηλή (& lt? 2). βαθμολογιών TFR1 ανοσοϊστοχημεία

Η

Συζήτηση

Εδώ, αναφέρουμε για πρώτη φορά ότι HFE υπερέκφραση φαίνεται να είναι ένα νέο μηχανισμό υπεύθυνο για την εξέλιξη HNSCC της νόσου. Η υπερέκφραση του HFE σε HNSCC οδηγεί σε αυξημένη εψιδίνης, η οποία με τη σειρά του προωθεί τη συσσώρευση ενδοκυτταρικού σιδήρου, με αποτέλεσμα την αυξημένη σύνθεση DNA, αυξημένα επίπεδα ROS, σηματοδότηση Wnt, όλες οδήγηση πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και κλωνογονικότητας, με σίδηρο ως κρίσιμος μεσολαβητής σε αυτή τη διαδικασία (Σχήμα 6). Μια πιθανή θεραπευτική στρατηγική σε αυτό το πλαίσιο είναι η χρησιμοποίηση ενός χηλικοποιητή του σιδήρου ολαμίνη του ciclopirox (CPX), η οποία μείωσε κατά προτίμηση κλωνογονική επιβίωση και τη βιωσιμότητα σε κύτταρα HNSCC, με ελάχιστες επιδράσεις επί των ΝΟΕ. Επιπλέον, HFE και TFR1 υπερέκφραση έδειξε μια τάση προς χειρότερη έκβαση, η οποία συλλογικά τεκμηριώνει τον κρίσιμο ρόλο της απορρύθμισης του σιδήρου σε εξέλιξη HNSCC.

Schema δείχνει ότι HFE overexpresion οδηγεί δεσμευτική Β2Μ για τη διακίνηση της κυτταρικής μεμβράνης. HFE αυξάνει HAMP είτε απευθείας είτε μέσω TFR2. HAMP τότε εξέρχεται από το κύτταρο, μέσω ενός άγνωστου μηχανισμού, και με τη σειρά υποβαθμίζει FPN, η οποία οδηγεί σε συσσώρευση σιδήρου. Συλλογικά, αυτό έχει ως αποτέλεσμα αυξημένη σύνθεση DNA, αυξημένα ROS και σηματοδότηση Wnt, όλα οδηγώντας πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και κλωνογονικότητας. Κουτιά με κόκκινο χρώμα υποδηλώνουν τα στοιχεία καταδεικνύεται σε αυτήν την τρέχουσα μελέτη.

Η

Πρόσθετα στοιχεία για την καταλληλότητα των εν λόγω σιδήρου που ρυθμίζουν γονίδια παρέχονται από εξέταση των δημοσίως διαθέσιμων βάσεων δεδομένων HNSCC (www.oncomine.org) [20 ], επιβεβαιώνοντας σημαντική υπερέκφραση τόσο HFE [21], και TFR1 [21-23] στο HNSCC δείγματα ασθενών, αποδεικνύοντας ότι αυτό είναι πράγματι ένα κοινά απορυθμίζεται μονοπάτι σε αυτή την ασθένεια. Επιπλέον, HFE επίσης υπερεκφράζεται σε άλλους καρκίνους συμπεριλαμβανομένου του εγκεφάλου [24], και καρκινώματα νεφρικών κυττάρων [25]. Για τον εντοπισμό δυνητικών μηχανισμό (ες) που οδηγεί σε υπερέκφραση τους, η βάση δεδομένων HNSCC TCGA χρησιμοποιώντας το λογισμικό του Καρκίνου cBIO Γονιδιωματική Πύλη [26] ανακρίθηκε από τη σύγκριση των επιπέδων μεταγραφής του όγκου προς τον αριθμό αντιγράφων του DNA σε 295 διακριτά σύνολα δεδομένων του ασθενούς. Η πλειοψηφία αυτών των HNSCCs ήταν διπλοειδή για

HFE

? ως εκ τούτου, χρωμοσωμική μεταβολή δεν φαίνεται να είναι υπεύθυνη για την υπερέκφραση της. Ωστόσο, η ενίσχυση του

TFR1

γονίδιο παρατηρήθηκε στο 18% των δειγμάτων HNSCC, το οποίο αντιστοιχούσε σε αυξημένα επίπεδα έκφρασης TFR1 mRNA, υποδεικνύοντας γονιδιωματική μεταβολή ως ένας μηχανισμός για TFR1 υπερέκφραση σε HNSCC. Δεδομένου του σύνθετου δικτύου των πρωτεϊνών που εμπλέκονται στη ρύθμιση του σιδήρου [27], είναι σαφές ότι πολλαπλοί μηχανισμοί είναι υπεύθυνοι για την απορρύθμιση του σιδήρου σε ανθρώπινους καρκίνους. Για παράδειγμα mTOR, η οποία συχνά ενεργοποιείται σε HNSCC [28] έχει πρόσφατα συνδεθεί με τη σταθερότητα TFR1 και ρύθμιση του σιδήρου [29], παρέχοντας ένα ακόμη μηχανισμό για την απελευθέρωση του σιδήρου στην HNSCC. Ως εκ τούτου, είναι πιθανό πολλές διαφορετικές μηχανισμούς αντιπροσωπεύοντας το HFE υπερέκφραση σε HNSCC, οδηγώντας σε διαταραχή του σιδήρου

αιμοχρωμάτωση (HFE) είναι μια διαμεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη, εκφράζεται ευρέως σε όλο το ανθρώπινο σώμα [30].? ένας από τους κύριους ρόλους του είναι να ρυθμίζει εψιδίνης (HAMP) [8], η οποία με τη σειρά της, εσωτερικεύει και υποβαθμισμένες φερροπορτίνη (FPN) (βλέπε Εικόνα 6) [10]. HAMP εξέρχεται κάπως το κύτταρο, τότε συνδέεται με FPN στην πλασματική μεμβράνη, προκαλώντας φωσφορυλίωση τυροσίνης που οδηγεί στην εσωτερικοποίηση FPN. Μόλις εσωτερίκευση, FPN είναι de-φωσφορυλιωμένη, τότε ubiquitylated και αποικοδομείται μέσω της οδού λυσοσωμικής [31]. Τελικά, η υποβάθμιση της FPN από HAMP οδηγεί σε ενδοκυτταρική κατακράτηση του σιδήρου.

Υπό φυσιολογικές συνθήκες, HAMP είναι προφανώς εκκρίνεται από το ήπαρ σε ανταπόκριση στις αλλαγές των επιπέδων σιδήρου στο πλάσμα. Ωστόσο, πρόσφατα στοιχεία δείχνουν ότι HAMP μπορεί να παίζει ένα παθολογικό ρόλο σε ανθρώπινες κακοήθειες? για παράδειγμα, η χαμηλή και υψηλή FPN HAMP έχουν συσχετιστεί με φτωχή πρόγνωση στον καρκίνο του μαστού [32]. Αυξημένα επίπεδα mRNA HAMP συσχετίζεται με χαμηλή έκφραση FPN σε ορθοκολικό καρκίνωμα [33]. Ο ακριβής μηχανισμός (ες) σύμφωνα με την οποία αυξημένα HAMP συμβάλλει στην καρκινογένεση παραμένει να διευκρινιστεί? Ωστόσο, είναι αντιληπτό ότι θα μπορούσε να HAMP εκκρίνονται από τα καρκινικά κύτταρα να υποβαθμίσει FPN, αυξάνοντας έτσι τα επίπεδα ενδοκυτταρικού σιδήρου, όπως προτείνεται από τα δεδομένα μας. Στην πραγματικότητα, τα επίπεδα στον ορό HAMP αυξημένα έχουν συσχετιστεί με μεταστάσεις νεφρικών καρκίνωμα [34]? επίσης, έχουν υψηλά επίπεδα ουρικής HAMP έχουν παρατηρηθεί σε ασθενείς με πολλαπλό μυέλωμα [35], και οι δύο υποδηλώνοντας παθολογική έκκριση HAMP από τα καρκινικά κύτταρα. Περαιτέρω, κύτταρα HeLa παροδικά διαμολυσμένα με πλασμίδιο που περιέχει FPN και εκτίθενται σε HAMP, οδήγησε σε εσωτερίκευση των FPN [10], αποδεικνύοντας ότι οι όγκοι ανταποκρίνονται σε HAMP με παρόμοιο τρόπο όπως ηπατοκύτταρα ή τα μακροφάγα.

Το ρυθμιστικό δίκτυο σίδερο περιέχει πάνω από 151 χημικά είδη και 107 αντιδράσεις βήματα [27], έτσι ρυθμίζεται στενά. Το φαινόμενο των καρκινικών κυττάρων απαιτεί περισσότερο σίδηρο για τη διατήρηση υψηλών σύνθεση κυτταρικού κύκλου εργασιών και το DNA τους παρατηρείται σε πολλές διαφορετικές κακοήθειες.