Αφηρημένο

Μη Μικρό-Cell-καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) αντιπροσωπεύει περίπου το 85% όλων των καρκίνων του πνεύμονα και παραμένει ελάχιστα κατανοητή. Ενώ μονοπάτια λειτουργική κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης οργάνων, συμπεριλαμβανομένων Sonic Hedgehog (Shh) και τους σχετικούς παράγοντες μεταγραφής Gli (Gli1-3) σηματοδότησης, έχουν πρόσφατα βρεθεί να επανενεργοποιηθεί στο NSCLC, λειτουργικός ρόλος τους παραμένει ασαφής. Εδώ, υποθέσαμε ότι η Shh /Gli1-3 θα μπορούσε να μεσολαβήσει NSCLC αυτόνομο πολλαπλασιασμό και τη σηματοδότηση των επιθηλιακών /στρωματικών όγκων στον ιστό. Σε αυτό το πλαίσιο, έχουμε ερευνήσει τη δραστηριότητα της Shh /Gli1-3 σηματοδότηση στα NSCLC τόσο, ο καρκίνος και στρωματικά κύτταρα. Αναφέρουμε εδώ ότι η αναστολή της σηματοδότησης Shh επάγει μία σημαντική μείωση στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων NSCLC. Αυτό το αποτέλεσμα μεσολαβείται από Gli1 και Gli2, αλλά όχι Gli3, μέσω της ρύθμισης της κυκλίνης D1 και έκφραση κυκλίνης D2. Ενώ εξωγενούς Shh δεν ήταν σε θέση να επάγει σηματοδότηση είτε Α549 πνεύμονα αδενοκαρκινώματος ή κύτταρα πλακώδους καρκινώματος πνεύμονα H520, αμφότερα τα κύτταρα βρέθηκαν να εκκρίνουν συμπλοκοποιητή Shh, η οποία επάγεται πολλαπλασιασμό ινοβλαστών, την επιβίωση, τη μετανάστευση, εισβολή, και τη σύνθεση κολλαγόνου. Επιπλέον, η Shh που εκκρίνεται από NSCLC προκαλεί την παραγωγή προ-αγγειογόνος και μεταστατικών παράγοντες σε ινοβλάστες πνεύμονα. Τα αποτελέσματά μας παρέχουν έτσι αποδείξεις ότι η Shh παίζει σημαντικό ρόλο στη διαμεσολάβηση επιθηλιακά /μεσεγχυματικά αλληλοπαρεμβολών σε NSCLC. Ενώ αυτόνομη Gli δραστηριότητας ελέγχει τον πολλαπλασιασμό NSCLC, αυξημένη Shh έκφρασης με NSCLC συνδέεται με την ενεργοποίηση των ινοβλαστών σε σχετιζόμενο με τον όγκο στρώματος. Η μελέτη μας υπογραμμίζει τη σημασία της μελέτης στρωματικά κύτταρα που σχετίζονται στο πλαίσιο των NSCLC όσον αφορά τις νέες πρόγνωση και θεραπευτικές επιλογές

Παράθεση:. Bermudez O, Hennen Ε, Koch Ι, Lindner Μ, Eickelberg O (2013) Gli1 Μεσολαβεί Lung Cancer Cell διάδοσης και Sonic Hedgehog που εξαρτώνται μεσεγχυματικά ενεργοποίηση των κυττάρων. PLoS ONE 8 (5): e63226. doi: 10.1371 /journal.pone.0063226

Επιμέλεια: Masaru Katoh, Εθνικό Κέντρο Καρκίνου, Ιαπωνία

Ελήφθη: 9 Οκτωβρίου, 2012? Δεκτές: 1 Απρίλη του 2013? Δημοσιεύθηκε: May 7, 2013

Copyright: © 2013 Bermudez et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από το Helmholtz Association. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η πιο θανατηφόρα καρκίνο σε όλο τον κόσμο. Επί του παρόντος, δεν υπάρχουν αποτελεσματικές θεραπευτικές επιλογές για τον καρκίνο του πνεύμονα και το ποσοστό επιβίωσης 5 ετών είναι μόνο 14% των ασθενών με τη θεραπεία [1] .Η έλλειψη αποτελεσματικής μακροχρόνιας θεραπείας σχετίζεται με την πολυπλοκότητα του καρκίνου του πνεύμονα και, συνεπώς, με την ανάγκη για την καλύτερη κατανόηση της βιολογίας του πνεύμονα καρκινογένεσης. Λίγη προσοχή έχει μέχρι σήμερα απευθύνεται στο μικροπεριβάλλον του όγκου-γύρω, η οποία αποτελεί την σχετιζόμενο με τον όγκο στρώμα και ενεργεί ως ενεργός συμμετέχων στην ογκογένεση. Κατά τα τελευταία χρόνια, όλο και περισσότερες ενδείξεις έχει επισημάνει τη σημασία του στρώματος κατά την κίνηση του όγκου, της προόδου και το μεταβολισμό πολλών τύπων καρκίνου [2] – [7]. Ομοίως, σηματοδότηση στα στρωματικά κύτταρα έχει αποδειχθεί ότι είναι απαραίτητη για την κακοήθη εξαλλαγή των επιθηλιακών κυττάρων [2], [5], [6].

οδών που εμπλέκονται στην οργανογένεση και πνεύμονα διακλάδωσης μορφογένεση, συμπεριλαμβανομένων Hedgehog ( λδ) σηματοδότησης, έχουν πρόσφατα αναγνωριστεί ως βασικών παραγόντων σε καρκίνους του ανθρώπου [8]. Υπάρχουν τρεις Hedgehog (Hh) γονιδίων σε θηλαστικά, με Sonic hedgehog (Shh) ως το πιο ευρέως εκφραζόμενο γονίδιο. Εκκρινόμενο Shh δεσμεύεται στους υποδοχείς Patched (Ptch) που υπάρχει στην κυτταροπλασματική μεμβράνη του κυττάρου υποδοχής. Η πρόσδεση της Shh να Ptch απελευθερώνει την καταστολή που ασκεί το Ptch για λειαίνονται, ένας υποδοχέας επτά διαμεμβρανικών ζωής, όπως πρωτεΐνη απαραίτητη για τη μεταγωγή των σκαντζόχοιρος σηματοδοσίας. Smoothened διευκολύνει την αλληλεπίδραση των διαφορετικών κατάντη τελεστές Hedgehog στην πρωτογενή βλεφαρίδες, με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση των παραγόντων μεταγραφής Gli [9]. Στους ανθρώπους, οι τρεις Gli πρωτεΐνες ψευδαργύρου-δακτύλου (Gli1, Gli2 και Gli3) ενορχηστρώνει Hedgehog-ειδική απόκριση στο κύτταρο με ρύθμιση της έκφρασης γονιδίων. Γονίδια του μονοπατιού σκαντζόχοιρος ίδιο συμπεριλαμβανομένων Gli1 και Ptch1 είναι στόχοι της Gli, που αντιπροσωπεύουν ένα βρόχο ανάδρασης που χρησιμεύουν ως ένδειξη της δραστηριότητας σκαντζόχοιρος [10]. Η ενεργοποίηση των ανθρώπινων κανονικών μονοπατιού Hh εξαρτάται από την έκφραση των υποδοχέων Ptch (Ptch1, Ptch2) και το δόλωμα υποδοχέα Hhip (Hedgehog-πρωτεΐνη αλληλεπίδρασης) [11]. Ενδοκυτταρικές πρωτεΐνες που ρυθμίζουν τη σταθερότητα Gli, όπως SUFU (καταστολέα της λιωμένο) και SPOP (κηλίδα-τύπου POZ πρωτεΐνης) διαδραματίζουν επίσης σημαντικό ρόλο στον προσδιορισμό της δραστικότητας Gli και έτσι την ενεργοποίηση της κανονικής οδού σκαντζόχοιρος [12]. Κατά τα τελευταία χρόνια, μελέτες ανέδειξαν την ύπαρξη ενός μη-κανονικό Hedgehog μονοπάτι που δεν απαιτεί την πλήρη άξονα Shh-Ptch-ΠΕΑ-Gli. Ένα μη κανονικά Hedgehog σηματοδότησης που εξαρτώνται από την ΠΕΑ αλλά ανεξάρτητα από Gli, που ρυθμίζουν tubulogenesis και την απόπτωση, έχει περιγραφεί στα ενδοθηλιακά κύτταρα [13] .Με ώρα, παράγοντες μεταγραφής Gli εμφανίζονται ως μια ενοποιητική πλατφόρμα πολλών εισόδων σηματοδότησης, για τη θέσπιση δεύτερου είδους των μη κανονικών σηματοδότησης Hedgehog, εξαρτάται από Gli αλλά ανεξάρτητα από ΠΕΑ. Αυτή είναι η περίπτωση του παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκίνωμα, όπου Gli μεταγραφή ρυθμίζεται από ΤΟΡ-β και Κ-ras [14].

Η οδός σηματοδότησης Hedgehog παίζει έναν κρίσιμο ρόλο κατά την ανάπτυξη των σπονδυλωτών ελέγχουν την κυτταρική ανάπτυξη, την επιβίωση, τη μοίρα και το πρότυπο του σχεδίου του σώματος. Μεταβολές στην Shh πορεία κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης των πνευμόνων επηρεάζουν επιθηλιακά αλληλεπιδράσεις /μεσεγχυματικά και να οδηγήσει σε διακλάδωση ελαττώματα μορφογένεση, αλλοιώνοντας τη λειτουργία των πνευμόνων. Ενώ Shh σηματοδότηση είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη των πνευμόνων, ο ρόλος που αυτή η οδός σηματοδότησης μπορεί να παίξει σε ενήλικες στους πνεύμονες παρέμεινε ασαφής και είναι μόλις τώρα αρχίζουν να διερευνηθεί. Πρόσφατες μελέτες έχουν αναδείξει τη σημασία της σκαντζόχοιρος σηματοδοσίας στο Ιδιοπαθής πνευμονική ίνωση, μια θανατηφόρος νόσος άγνωστης αιτιολογιών. Bolaños et al ανέφεραν ότι τα διάφορα συστατικά της οδού σκαντζόχοιρος υπερεκφράζεται στους πνεύμονες ΙΠΙ και ινοβλάστες ΙΠΙ. Επιπλέον, ινοβλάστες από ΙΠΙ πνεύμονες βρέθηκαν να ανταποκριθεί στην Shh και αυτή η απάντηση συσχετίζεται με την ενεργοποίηση των ινοβλαστών

στο

vitro

[15]. Μια ανεξάρτητη μελέτη που διεξήχθη από Cigna κ.ά. [16] έδειξε ότι οι πρωτογενείς ανθρώπινοι ινοβλάστες από την κανονική και IPF πνεύμονα εκφράζουν τα κύρια συστατικά του μονοπατιού σηματοδότησης Hedgehog, που συνδέονται με τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την έκφραση των δεικτών μυοϊνοβλαστικά σε ινοβλάστες. Ενώ οι μελέτες αυτές αναδεικνύουν τη σημασία της Hedgehog σηματοδότησης σε πνευμονική ίνωση, ο ρόλος αυτής της οδού σε διάφορες μορφές του καρκίνου του πνεύμονα παραμένει ασαφής. καρκίνων του πνεύμονα ταξινομούνται σύμφωνα με ιστολογικό τύπο: οι δύο πιο συνηθισμένες μορφές καρκίνου του πνεύμονα είναι καρκίνωμα μη μικρού κυττάρου του πνεύμονα (NSCLC) και μικρού κυττάρου-καρκινώματος (SCLC). NSCLC και SCLC όχι μόνο παρουσιάζουν διαφορές στο μέγεθος και την εμφάνιση των καρκινικών κυττάρων, αλλά επίσης διαφορετική πρόγνωση και την κλινική διαχείριση. Λόγω της ετερογένειας του κάθε υποτύπου καρκίνου του πνεύμονα, επιπλέον ιστολογικές και μοριακό χαρακτηρισμό, απαιτείται να επιλέξετε μια πιο συγκεκριμένη θεραπεία. Παραδοσιακά, NSCLC ελέγχθηκαν και θεραπεία για EGFR και K-

ras

μεταλλάξεις. Ωστόσο, η εμφάνιση της αντίστασης σε αυτές τις θεραπείες και την περιγραφή των νέων μοριακών υπογραφών τόνισαν την ανάγκη ενός καλύτερου όγκου μοριακό προφίλ-σκηνοθεσία θεραπεία. Μερικές μελέτες έχουν περιγράψει τη σχέση μεταξύ νέων μοντέλων της γονιδιακής έκφρασης σε συγκεκριμένα υποσύνολα NSCLC [17], [18], και άλλοι προτείνουν την εφαρμογή των νέων όγκων μοριακό προφίλ σε μελλοντικές θεραπείες. Για παράδειγμα, η αξιολόγηση της έκφρασης ΜΜΡ2 και β-κατενίνη έχει προταθεί να έχει ένα δυναμικό στη διάγνωση NSCLC με διαφορετικά χαρακτηριστικά κλινικοπαθολογική [19]. Σε SCLC, ενός όγκου με πρωτόγονα χαρακτηριστικά νευροενδοκρινική, Shh βρέθηκε να ενεργοποιείται σε νευροενδοκρινή προγονικά κύτταρα και σε κύτταρα όγκου σε ποντικούς [20], [21]. Αν και αυτές οι μελέτες υποστηρίζουν ένα juxtacrine /αυτοκρινή ενεργοποίηση του Hh σε SCLC, δεν είναι σαφές πώς αυτή οδός ενεργοποιείται σε NSCLC, το πιο διαδεδομένο υπότυπο του καρκίνου του πνεύμονα. Δεδομένων των κλινικών και βιολογικών διαφορών μεταξύ NSCLC και SCLC, υποθέσαμε ότι ο μηχανισμός της ενεργοποίησης της Shh σε NSCLC είναι διαφορετική από SCLC. Επιδιώξαμε να διερευνηθεί η δραστηριότητα της Shh σηματοδότησης σε NSCLC και στα δύο καρκίνο και στρωματικά κύτταρα. Προκειμένου να εκτιμηθεί η σημασία της Shh σηματοδότησης στα κύτταρα NSCLC, έχουμε εκτελούνται νοκ ντάουν από τους τρεις παράγοντες Gli μεταγραφής (Gli1-3), τα οποία μεσολαβούν στην ενδοκυτταρική σηματοδότηση Shh, και μελέτησαν την επίδραση αυτών επί του πολλαπλασιασμού των NSCLC. Επιπλέον, έχουμε αξιολογηθεί πώς NSCLC κύτταρα και ινοβλάστες πνεύμονα ανταποκρίθηκε στην εξωγενή Shh από την άποψη της πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση των κυττάρων, την εισβολή, και εξωκυττάρια μήτρα αναδιαμόρφωση.

Αποτελέσματα

Η κυκλοπαμίνη, ένας σκαντζόχοιρος αναστολέα, Μειώνει NSCLC Διάδοση και βιωσιμότητα

Ένα από τα πλέον δυσμενή χαρακτηριστικά των καρκίνων είναι η απορρύθμιση στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Επομένως, έχουμε μελετήσει το ρόλο που μπορεί να έχει Shh στον πολλαπλασιασμό NSCLC, χρησιμοποιώντας κύτταρα από αδενοκαρκίνωμα και κυττάρων από πλακώδες καρκίνωμα, το πρώτο και το δεύτερο πιο συχνό τύπο του καρκίνου του πνεύμονα, αντίστοιχα. Αρχικά, χρησιμοποιήθηκε κυκλοπαμίνη, ένα φυτό που προέρχεται από στεροειδές αλκαλοειδές που αναστέλλει smoothened (SMO), ένας υποδοχέας συζευγμένος με G πρωτεΐνη που μετάγει σήμα Shh στο κύτταρο, να εμποδίσει Shh μονοπάτι σε κύτταρα NSCLC. Όταν υποβλήθηκε σε επεξεργασία με κυκλοπαμίνη, κύτταρα αδενοκαρκινώματος Α549 και H520 ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα του πνεύμονα έδειξαν μια σημαντική μείωση του αριθμού των κυττάρων ιδιαίτερα κατά πλέον χρονικά σημεία (Σχήματα 1Α και Β). Η κυκλοπαμίνη επίσης μειωμένη επιβίωση των κυττάρων (μεταβολική δραστηριότητα αξιολογήθηκε με τη δοκιμασία ΜΤΤ) (Σχήματα 1Α και Β) και αυτό το αποτέλεσμα ήταν πιο σημαντική με αυξανόμενες δόσεις του αναστολέα (Εικόνα S1A και Σχήμα S3E). Για να αποκλειστεί ότι η κυκλοπαμίνη δεν προκαλέσει μια κυτταροτοξική μη ειδική επίδραση στα κύτταρα NSCLC, η απόπτωση καθορίστηκε κατά την αγωγή με κυκλοπαμίνη. Παρά το γεγονός ότι η κυκλοπαμίνη προκάλεσε μια ελαφρά αύξηση στην έκταση των αποπτωτικών κυττάρων, η αναλογία των αποπτωτικών κυττάρων δεν ήταν στατιστικά διαφορετική μεταξύ αντιμετωπίζονται-κύτταρα και τα μη-επεξεργασμένα κύτταρα (Σχήμα S1B και Σχήμα S3F). Προκειμένου να επιβεβαιωθεί το συγκεκριμένο αποτέλεσμα της κυκλοπαμίνης στον πολλαπλασιασμό NSCLC και τη βιωσιμότητα, SMO αποσιώπηση διεξήχθη. SMO knockdown προκάλεσε μια μείωση τόσο Α549 και H520 τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και η βιωσιμότητα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι παρεμπόδιση του Hedgehog οδού μέσω αναστολής ΠΕΑ, μειώνει τον πολλαπλασιασμό NSCLC και η βιωσιμότητα.

Lung κύτταρα αδενοκαρκινώματος Α549 (Α) και τα κύτταρα H520 πνεύμονα πλακώδους καρκινώματος (Β) καλλιεργήθηκαν σε παρουσία ή απουσία 10 μΜ κυκλοπαμίνης για 5 ημέρες. Ο πολλαπλασιασμός εκτιμήθηκε με μέτρηση των κυττάρων και την κυτταρική επιβίωση με δοκιμασία ΜΤΤ. * P & lt? 0,1? ** P & lt? 0,05. (Γ) Το Hedgehog-απόκρισης μεταγραφικοί παράγοντες Gli1, Gli2 ή Gli3 χτυπήθηκαν κάτω με siRNA σε κύτταρα Α549. RT-qPCR διεξήχθη για να επιβεβαιωθεί η ειδική σίγηση του κάθε Gli και να εκτιμηθεί η έκφραση του υποδοχέα Ptch1 Hedgehog. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως φορές διαφορές των επιπέδων mRNA (2

∧∧Ct) σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με ένα αρνητικό έλεγχο siRNA (NC siRNA) που δεν έχουν ομολογία σε σπονδυλωτά μεταγραφικό. ** P & lt? 0,05, *** p & lt? 0,01. Ο αντίκτυπος της αποσιώπησης Gli1, Gli2 ή Gli3 στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων Α549 αξιολογήθηκε με απαρίθμηση κυττάρων (D) και στην κυτταρική επιβίωση με ΜΤΤ δοκιμασία (Ε). Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως ποσοστό ως σχετικός πολλαπλασιασμός και η σχετική επιβίωση σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με τον αρνητικό μάρτυρα siRNA (NC). * P & lt? 0,1. Οι (F) Εκπρόσωπος φάσης-αντίθεσης μικροσκοπικές εικόνες μετά από 72 ώρες από siRNA που παρουσιάζονται. (G) RT-qPCR διεξήχθη για να αξιολογηθεί το αποτέλεσμα του siRNA της Gli1, Gli2 και Gli3 στην έκφραση του G1 /S κυκλίνες φάση D (Cyc D1, Cyc D2, Cyc D3) και κυκλίνης Ε (Cyc Ε1). Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως πλάσια των επιπέδων mRNA (2

∧∧Ct) σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με ένα αρνητικό έλεγχο siRNA (NC siRNA) που δεν έχουν ομολογία σε σπονδυλωτά μεταγραφικό. * P & lt? 0,1? ** P & lt? 0,05. (H) στύπωμα Western της κυκλίνης D2 σε κύτταρα Α549 επιμολύνονται με Gli siRNA ή με έναν αρνητικό μάρτυρα siRNA (NC). Κηλίδωση των β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

Η σίγαση του Gli1 Μειώσεις NSCLC πολλαπλασιασμό με διαμόρφωση Κυκλίνη D Έκφραση

Παρόλο Η κυκλοπαμίνη έχει βρεθεί να επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε άλλους τύπους καρκινικά κύτταρα, ο συγκεκριμένος μηχανισμός με τον οποίο Σσσς σηματοδότηση ρυθμίζει NSCLC τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων παραμένει άπιαστο. Για παράδειγμα, δεν είναι γνωστό πώς κάθε ένα από τα 3 ανθρώπινης Shh-παράγοντες μεταγραφής Gli συμβάλλει στον πολλαπλασιασμό NSCLC. Για να απαντηθεί αυτό το ερώτημα, χρησιμοποιήσαμε μικρά RNAs παρεμβολής (siRNA) για φίμωση Gli1, Gli2 και Gli3. Κατά μια συγκεκριμένη και σημαντική μείωση των επιπέδων mRNA του Gli1 που δεν επηρεάζει ούτε τα επίπεδα Gli3 mRNA (Σχήμα 1C) Gli2 ή, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και η κυτταρική βιωσιμότητα μειώθηκε σε κύτταρα αδενοκαρκινώματος Α549 (Σχήμα 1 D-F). Προειδοποίησης, η αποσιώπηση των Gli1 προκάλεσε μείωση των επιπέδων Ptch1 mRNA (Σχήμα 1C). Επειδή η μεταγραφή του Ptch1 εξαρτάται Gli1, η μείωση των επιπέδων mRNA Ptch1 χρησιμεύει ως πρόσθετος έλεγχος που δείχνει ότι η αποσιώπηση της Gli1 ήταν βιολογικά αποτελεσματική. Η ειδική σίγηση του Gli2, που μείωσαν τα επίπεδα Gli2 mRNA και δεν μειώνεται ούτε επίπεδα Gli3 mRNA (Σχήμα 1C) Gli1 ή, μειωμένη ελαφρώς Α549 αριθμός των κυττάρων και η βιωσιμότητα των κυττάρων, αν και όχι σε στατιστικά σημαντικό τρόπο (Σχήμα 1 D και Ε). Τέλος, το siRNA της Gli3 που προκάλεσε μια σημαντική μείωση στα επίπεδα Gli3 mRNA αλλά όχι μια μείωση στην Gli1 ή επίπεδα Gli2 mRNA (Σχήμα 1 C), δεν μείωσε Α549 πολλαπλασιασμό αδενοκαρκινώματος κύτταρο ή η κυτταρική βιωσιμότητα (Σχήμα 1 D και Ε) και αντ ‘αυτού προκάλεσε μικρή αύξηση του αριθμού των κυττάρων των κυττάρων αδενοκαρκινώματος Α549 (Σχήμα 1 D), μαζί με μια αύξηση στα επίπεδα Gli1 mRNA (Σχήμα 1 C). Σε κύτταρα καρκινώματος πλακώδους πνεύμονα H520 (Σχήμα S3) και σε μεγάλα κύτταρα καρκινώματος κυττάρων (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται), η ειδική σίγηση του Gli1, Gli2 ή Gli3 είχε παρόμοια επίδραση στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την έκφραση της κυκλίνης. Είναι σημαντικό ότι, η έκφραση του Shh που σχετίζονται με τα γονίδια και κυκλίνες κατόπιν Gli1, Gli2 και Gli3 σίγηση δεν οφειλόταν σε Hprt1 έκφραση επειδή ένα παρόμοιο μοτίβο έκφρασης βρέθηκε όταν 3 ανεξάρτητα γονίδια αναφοράς που χρησιμοποιήθηκαν σε Α549 (Εικόνα S2) και σε κύτταρα H520 ( Εικόνα S4).

για να διερευνήσουν πώς η αποσιώπηση της Shh πολλαπλασιασμό αδενοκαρκινώματος επιπτώσεις οδού του πνεύμονα, έχουμε αξιολογήσει τις αλλαγές στην έκφραση των κυκλινών D και Ε εμπλέκονται στην G1 /S μετάβαση του κυτταρικού κύκλου, κατά Gli ρύθμιση προς τα κάτω. Ενδιαφέροντος, η siRNA της Gli1 και Gli2 προκάλεσε μια σημαντική μείωση της κυκλίνης D2 και μια μικρή μείωση στα επίπεδα κυκλίνης D1 mRNA (Σχήμα 1G). Η μείωση στην έκφραση της κυκλίνης D2 κατά Gli1 και Gli2 knockdown παρατηρήθηκε στο mRNA, αλλά επίσης και στο επίπεδο πρωτεΐνης (Εικόνα 1). Λαμβάνοντας υπόψη ότι Gli2 θα μπορούσε να επηρεάσει την κυκλίνη D έκφραση, υποθέσαμε ότι σε συνδυασμό με Gli1, αυτός ο παράγοντας μεταγραφής θα μπορούσε να ρυθμίσει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε σημαντικό βαθμό. Για να επιβεβαιωθεί αυτή η υπόθεση, έχουμε συνειδητοποιήσει το διπλό αποσιώπηση των παραγόντων μεταγραφής Gli. Ενώ η ενιαία αποσιώπηση των Gli2 δεν μειώνουν σημαντικά τη βιωσιμότητα των κυττάρων, η διπλή αποσιώπηση των Gli1 και Gli2 έκανε (Σχήμα S1c). Σε κύτταρα καρκινώματος πλακώδους H520 πνεύμονα, ο ειδικός knockdown του Gli1 και Gli2 με siRNA βρέθηκε να μειώνει κατά παρόμοιο τρόπο έκφρασης κυκλίνης D1 και D2 κυκλίνη (Σχήμα S3A). Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι ο αποκλεισμός της Shh μονοπατιού σηματοδότησης, είτε με κυκλοπαμίνη ή παρεμβαίνοντας με τον παράγοντα μεταγραφής Gli1 μειώνει τον πολλαπλασιασμό των NSCLC.

NSCLC κύτταρα δεν Ενεργοποίησε Σσσς Διαδρομή Μετά Εξωγενείς Σσσς Θεραπεία

Δεδομένου ότι ο αποκλεισμός της οδού Shh μειώνει τον πολλαπλασιασμό των NSCLC, ερευνήσαμε εάν η εξωγενής Shh παράγει μία αύξηση στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε αυτά τα κύτταρα. Lung κύτταρα αδενοκαρκινώματος Α549 και κύτταρα πλακώδους καρκινώματος H520 θεραπεία με ανασυνδυασμένη ανθρώπινη Shh δεν έδειξε αλλαγή είτε στον αριθμό κυττάρων (Σχήματα 2Α και D) ή στην κυτταρική επιβίωση (Σχήματα 2Β και Ε). Επιπλέον, τα κύτταρα δεν παρουσιάζουν κανένα μορφολογική μεταβολή κατά την αγωγή (Σχήματα 2C και F). Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι τα κύτταρα NSCLC δεν αποκρίνονται στην Shh. Για να είναι έγκυρη θεραπεία Shh χρησιμοποιήσαμε πρωτογενή κύτταρα εμβρύου ποντικού από τους οφθαλμούς των άκρων, ιστό που έχει δειχθεί ότι είναι αποκρίσιμα σε Shh. Κατά την αγωγή Shh, αυτά τα κύτταρα παρουσίασαν σημαντική αύξηση Gli1 και Ptch1 mRNA επίπεδα (60 φορές και 9-πλάσια αύξηση αντίστοιχα, σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα κύτταρα? Σχήμα S5). Όταν τα κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε αγωγή με Shh, μια πολύ μικρή αύξηση (1,65 φορές) στα επίπεδα mRNA Gli1 στις 8 ώρες και των επιπέδων της πρωτεΐνης Gli1 στις 24 ώρες ανιχνεύτηκε. Ωστόσο, σε μακρύτερα χρονικά σημεία δεν υπήρχαν σημαντικές μεταβολές είτε Gli1 ή έκφραση Ptch1 (Σχήματα 3Α και Β). Για H520 κύτταρα, οποιαδήποτε σημαντική αλλαγή, είτε Gli1 ή Ptch1 σε επίπεδο mRNA και πρωτεΐνης παρατηρήθηκε (Σχήματα 3C και D). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι,

in vitro

, και οι δύο τύποι κυττάρων NSCLC, σε σύγκριση με τις γνωστές Shh-αποκριτικά κύτταρα, δεν ανταποκρίνονται ιδιαίτερα στην εξωγενή Shh.

Lung κύτταρα αδενοκαρκινώματος Α549 (Α-Γ ) και κύτταρα πνεύμονα καρκίνωμα πλακωδών H520 (D-F) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία ή όχι με ανασυνδυασμένη Shh (500 ng /ml). Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εκτιμήθηκε με μέτρηση κυττάρων (Α, D) και την κυτταρική επιβίωση μέσω δοκιμασίας ΜΤΤ (Β, Ε) στους χρόνους που υποδεικνύονται. Αντιπροσωπευτικά αντίθεσης φάσης μικροσκοπικές εικόνες των κυττάρων Α549 (C) και των κυττάρων H520 (F) που φαίνεται.

Η

κύτταρα NSCLC υποβλήθηκαν σε θεραπεία ή όχι με ανασυνδυασμένη Shh (500 ng /ml) στους υποδεικνυόμενους χρόνους . RT-qPCR διεξήχθη για να αξιολογήσει τα επίπεδα Gli1 και Ptch1 mRNA κατά την κατεργασία σε κύτταρα Α549 (Α) και τα κύτταρα H520 (C). Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως φορές διαφορές των επιπέδων mRNA (2

∧∧Ct) σε σύγκριση με μη κατεργασμένα κύτταρα για κάθε χρονικό σημείο. κηλίδα Western διεξήχθη για να αξιολογηθεί επίπεδα πρωτεΐνης Gli1 και Ptch1 σε κύτταρα Α549 (Β) και σε κύτταρα H520 (D) αγωγή ή όχι με Shh. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Η έκκριση της ανθρώπινης Shh αξιολογήθηκε στα υπερκείμενα των Α549 και H520 κύτταρα με ELISA (Ε) και επιβεβαιώθηκε με κηλίδα western με χρήση ενός αντισώματος που αναγνωρίζει την εκκρινόμενη δραστική μορφή της Shh (ένθετο Ε). Το στύπωμα western πραγματοποιήθηκε με υπερκείμενο H520 (H520 sup.) Και με ανασυνδυασμένη Shh (Rec. Shh) χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. (F) Η εξουδετέρωση του γονιδίου Shh από siRNA πραγματοποιήθηκε σε κύτταρα H520. Shh έκκριση αξιολογήθηκε με ELISA και εκφράζονται σε εκατοστιαία αναλογία ως σχετική έκκριση σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με ένα αρνητικό έλεγχο siRNA (NC) που δεν έχουν ομολογία σε σπονδυλωτά μεταγραφικό. ** Ρ & lt? 0,05 (G) μετά την φίμωση της Shh, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία NSCLC ή όχι με ανασυνδυασμένη Shh (500 ng /ml). RT-qPCR διεξήχθη για να αξιολογήσει τα επίπεδα Gli και Ptch1 mRNA. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως πτυχή των διαφορών mRNA (2

∧∧Ct) σε κατεργασμένα κύτταρα σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα κύτταρα.

Η

NSCLC κύτταρα εκκρίνουν Σσσς ρίζας

Χρησιμοποιώντας ένα ειδικό δοκιμασία ELISA για ανθρώπινη Shh, βρήκαμε ότι τα κύτταρα αδενοκαρκινώματος Α549 και πιο έντονα H520 προϊόντα πλακώδες καρκίνωμα Shh (170 και 2800 pg /ml, αντίστοιχα, Σχήμα 3Ε). Αυτή η έκκριση μπορεί να σχετίζεται με ενδογενή παραγωγή Shh από αυτά τα NSCLC κύτταρα επειδή η συγκέντρωση της Shh στο μέσο του κάθε τύπου κυττάρων ήταν πολύ χαμηλή, συγκρίσιμη με το φόντο (νερό).

Για να επιβεβαιωθούν αυτά τα αποτελέσματα και να διερευνηθεί εάν αυτές οι NSCLC κύτταρα παράγουν επίσης τις άλλες μορφές συνδέτη σκαντζόχοιρος, έχουμε αξιολογήσει την έκφραση του Sonic, Desert (Dhh) και του Ινδικού Hedgehog (Ihh) στο Α549 και H520 κύτταρα. Αν και δεν μπορούσαν να ανιχνεύσουν με RT-qPCR Dhh και Ihh, διαπιστώσαμε ότι Sonic Hedgehog εκφράστηκε σε Α549 και H520 κύτταρα, που εκφράζεται περισσότερο σε αυτές τις τελευταίες (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Με βάση αυτά τα ευρήματα, έχουμε έτσι επικεντρώθηκε στην Shh σε όλη την μελέτη μας. Επιπλέον, επειδή τα κύτταρα H520 παράγουν και να εκκρίνουν σημαντικές ποσότητες συνδέτη Shh, αποφασίσαμε να επικεντρωθούμε σε αυτές τις NSCLC κύτταρα για περαιτέρω μελέτες που σχετίζονται με την έκκριση Shh. Για να εκτιμηθεί με μεγαλύτερη ακρίβεια την παρουσία της δραστικής μορφής της Shh σε υπερκείμενο H520, Western Blot εκτελέστηκε με ένα αντίσωμα που αναγνωρίζει την επεξεργασμένη δραστική μορφή της Shh (Ν-Shh). Η παρουσία του Ν-τερματικού πεπτιδίου που εκκρίνεται Shh στο υπερκείμενο των κυττάρων H520 τον τρόπο αυτό επιβεβαιώθηκε (ένθετο Σχήμα 3Ε).

Επειδή τα κύτταρα H520 εκκρίνουν ένα σημαντικό ποσό της Shh αλλά δεν αποκρίνονται σε εξωγενή Shh, στοχεύσαμε να διερευνήσει εάν αυτή η έλλειψη απόκρισης που σχετίζεται με τον κορεσμό της ενδογενούς δραστηριότητας Hedgehog σε αυτά τα κύτταρα. Για το λόγο αυτό, έχουμε πραγματοποιήσει την αποσιώπηση του γονιδίου Shh στα H520 κύτταρα. Μετά την knockdown της Shh, ότι μειώνεται κατά 70% την έκκριση της Shh σε H520 κύτταρα (Σχήμα 3F), εξωγενές Shh αυξημένα επίπεδα mRNA Gli1 σε αυτά τα κύτταρα (Εικόνα 3G). Η αύξηση αυτή, καθώς και μια μικρή αύξηση στα επίπεδα Ptch1 mRNA (Σχήμα 3G) δείχνουν ότι τα κύτταρα H520 μπορεί να ανταποκριθεί στις Shh όταν τα ενδογενή επίπεδα της Shh μειώθηκε.

πνεύμονα ινοβλάστες έντονα Απάντηση σε εξωγενείς Shh

Δεδομένου ότι τα κύτταρα NSCLC μπορεί να εκκρίνουν συνδέτη Shh, αλλά δεν ανταποκρίνονται σε μεγάλο βαθμό σε εξωγενείς Shh, ερευνήσαμε αν Shh μπορούσε παρά την ενεργοποίηση των γειτονικών στρωματικών κυττάρων. Πράγματι, ινοβλάστες πνεύμονα σε επεξεργασία με Shh ποντίκι εμφάνισε μια ισχυρή ενεργοποίηση Hedgehog οδού κατά την αγωγή: Τα επίπεδα mRNA Gli1 αυξηθεί μέχρι 800 φορές και τα επίπεδα mRNA Ptch1 είχαν διπλάσια αύξηση έως και 250, ιδίως σε 48 και 72 ώρες (Σχήμα 4Α). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν με την ανθρώπινη Shh (Σχήμα 4Α). αγωγή Shh αυξήθηκε επίσης Gli1 και Ptch1 στο επίπεδο πρωτεΐνης (Σχήμα 4Β). Για να γνωρίζουμε αν πνεύμονα ινοβλάστες ανθρώπου από το περιβάλλον NSCLC θα μπορούσε επίσης να ανταποκρίνονται στην εξωγενή Shh, πρωτογενείς ινοβλάστες ανθρώπινου πνεύμονα απομονώθηκαν από μία εκτομή του πνεύμονα πλακώδους καρκινώματος. Είναι ενδιαφέρον ότι, τα επίπεδα Gli1 και Ptch1 mRNA αυξήθηκαν επίσης κατά την κατεργασία Shh σε αυτά τα κύτταρα (Σχήμα 4C). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι,

in vitro

, ινοβλάστες πνεύμονα είναι ιδιαίτερα Shh-αποκριτικά κύτταρα, σε αντίθεση με τα επιθηλιακά κύτταρα NSCLC.

Ποντίκια ινοβλάστες πνεύμονα CCL206 υποβλήθηκαν σε θεραπεία ή όχι με 500 ng /ml Shh ανασυνδυασμένου ποντικού ή 500 ng /ml ανθρώπινης Shh για 24, 48 και 72 ώρες. επίπεδα (Α) mRNA του Gli1, Gli2, Gli3 και Ptch1 κατά την κατεργασία εκτιμήθηκαν με RT-qPCR. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως πτυχή του διαφορές στα επίπεδα mRNA (2

∧∧Ct) των επεξεργασμένων κυττάρων σε σύγκριση με μη κατεργασμένα κύτταρα για κάθε χρονικό σημείο. * P & lt? 0,1? *** P & lt? 0,01. (Β) στύπωμα Western διεξήχθη για να αξιολογηθούν οι αλλαγές στα επίπεδα της πρωτεΐνης Gli1 και Ptch1 σε ινοβλάστες CCL206 αγωγή ή όχι με Shh ποντικού (500 ng /ml). β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (C) Πρωτογενής ανθρώπινους ινοβλάστες υποβλήθηκαν σε θεραπεία ή όχι με ανασυνδυασμένη ανθρώπινη Shh (500 ng /ml) για 24, 48 και 72 ώρες. RT-qPCR διεξήχθη για να εκτιμήσει τα επίπεδα του mRNA της Gli1, Gli2, Gli3 και Ptch1. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως πλάσια των διαφορών mRNA (2

∧∧Ct) σε κατεργασμένα κύτταρα σε σύγκριση με μη κατεργασμένα κύτταρα για κάθε χρονικό σημείο. * P & lt? 0,1? ** P & lt? 0,05? *** P & lt?. 0,01

Η

Για να διερευνηθεί αν η έλλειψη ανταπόκρισης σε εξωγενή Shh στα κύτταρα NSCLC οφείλεται σε ακατάλληλη υποδοχή του συνδέτη Shh στα κύτταρα αυτά, έχουμε αξιολογηθεί η έκφραση των υποδοχέων Ptch1, Ptch2 και Hhip, θεωρείται ως υποδοχέας δόλωμα, το Α549, H520 κύτταρα και CLL206 ινοβλάστες. έκφραση Ptch1 βρέθηκε να είναι υψηλότερη από ό, τι στις δύο Hhip NSCLC κυτταρικούς τύπους (Εικόνα S6). Επιπλέον, η σχετική έκφραση Ptch1 ήταν υψηλότερη σε Α549 και στα κύτταρα H520 ό, τι σε ινοβλάστες CCL206 ενώ η σχετική έκφραση του δολώματος υποδοχέα Hhip ήταν πιο σημαντικό σε ινοβλάστες πνεύμονα από ό, τι στα κύτταρα NSCLC (Σχήμα S6). Έτσι, η ισορροπία μεταξύ Ptch και έκφραση Hhip δεν φαίνεται να σχετίζεται (σε ​​επίπεδο mRNA) με τη μη ανταπόκριση των NSCLC σε εξωγενείς Shh. Ως ενδοκυτταρικές πρωτεΐνες όπως Sufu και Spop ρυθμίζουν με θετικό και με αρνητικό σταθερότητα σχήματος Gli αντίστοιχα, έχουμε συνέχεια αξιολογήθηκαν εάν μια ανισορροπία μεταξύ αυτών των ρυθμιστών Gli θα μπορούσε να εξηγήσει τη μη απόκριση του NSCLC σε εξωγενείς Shh. Δεν βρήκαμε διαφορές στην σχετική έκφραση του Sufu σε σύγκριση με την έκφραση του Spop για έναν ίδιο τύπο κυττάρων (Σχήμα S6). Τέλος, έχουμε αξιολογηθεί εάν η σχετική έκφραση των υποδοχέων HH και ρυθμιστικές Gli ήταν διαφορετικά μεταξύ NSCLC και του πνεύμονα ινοβλάστες κατά την αγωγή Shh. Δεν βρέθηκαν διαφορές στην έκφραση των Ptch1, Ptch2, Hhip, Sufu και Spop κατά την αγωγή Shh, σε μικρή (1, 3, 8 ώρες) ή περισσότερο χρονικά σημεία (24, 48 h) (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

πνεύμονα ινοβλάστες Απάντηση σε Shh εκκρίνεται από τα κύτταρα NSCLC H520

για να ελέγξετε αν η Shh που εκκρίνεται από πλακώδη κύτταρα H520 ήταν βιοδραστικά, ινοβλάστες πνεύμονα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με υπερκείμενο H520. Αυτό είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση των επιπέδων Gli1 και Ptch1 mRNA σε νεογέννητα ποντικού (Σχήμα 5Α) και σε ενήλικες ανθρώπινους ινοβλάστες πνεύμονα (Σχήμα 5Β). Προκειμένου να αξιολογηθεί αν η απόκριση που διαμεσολαβείται από Shh που εκκρίνονται από τα κύτταρα H520 και υπάρχει στο υπερκείμενο, siRNA της Shh εκτελέστηκε σε κύτταρα H520. Αυτή η μειωμένη σημαντικότερο ποσότητες Shh mRNA και την παρουσία του Ν-Shh στο υπερκείμενο (Σχήμα 5C) και επιπλέον, μειώνεται κατά 90% τα επίπεδα Gli1 και κατά 50% των επιπέδων Ptch1 στους ινοβλάστες σε επεξεργασία με υπερκείμενο H520 (Εικόνα 5D) .

. Lung ινοβλάστες ήταν τον ορό επί 24 ώρες και έπειτα υποβλήθηκε σε επεξεργασία ή όχι με το υπερκείμενο κυττάρων H520 για 24, 48 ή 72 ώρες. (Α) RT-qPCR διεξήχθη για να αναλυθεί Gli1, Gli2, Gli3 και τα επίπεδα mRNA σε Ptch1 CCL206 που έλαβαν θεραπεία με υπερκείμενο H520. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως πλάσια των επιπέδων RNA σε κατεργασμένα κύτταρα σε σύγκριση με μη κατεργασμένα κύτταρα για κάθε χρονικό σημείο. ** P & lt? 0,05? *** P & lt? 0,01. (Β) Πρωτογενής ινοβλάστες ανθρώπινου πνεύμονα από πλακώδες καρκίνωμα ήταν άνευ ορού για 24 ώρες και υποβλήθηκε σε επεξεργασία ή όχι με το υπερκείμενο H520 για τους υποδεικνυόμενους χρόνους. RT-qPCR διεξήχθη για να εκτιμήσει τα επίπεδα Gli1, Gli2, Gli3 και Ptch1 mRNA. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως πλάσια των επιπέδων mRNA σε κατεργασμένα κύτταρα σε σύγκριση με μη κατεργασμένα κύτταρα για κάθε χρονικό σημείο. * P & lt? 0,1, ** p & lt? 0,05. (Γ) Η knockdown της Shh εκτελέστηκε σε H520 κύτταρα με siRNA. Η αποτελεσματικότητα της Shh knockdown σε κύτταρα H520 επιβεβαιώθηκε με κηλίδα western πραγματοποιήθηκε με το υπερκείμενο κυττάρων H520 επιμολυσμένα με αρνητικό έλεγχο siRNA (NC) ή με το siRNA της Shh. (D) ινοβλάστες CCL206 υποβλήθηκαν σε θεραπεία για 24, 48 και 72 ώρες με το υπερκείμενο είτε H520 κύτταρα επιμολυσμένα με αρνητικό siRNA ελέγχου ή με το υπερκείμενο του H520 κύτταρα επιμολυσμένα με το siRNA της Shh. RT-qPCR διεξήχθη για να αξιολογήσει τις αλλαγές στα επίπεδα Gli1, Gli2, Gli3 και Ptch1 mRNA. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως πλάσια των επιπέδων mRNA (2

∧∧Ct) σε κύτταρα CCL206 αγωγή με το υπερκείμενο του H520 επιμολυσμένα με τον siRNA της Shh σε σύγκριση με ινοβλάστες σε επεξεργασία με το υπερκείμενο του H520 επιμολυσμένα με τον αρνητικό μάρτυρα siRNA. * P & lt? 0,1? ** P & lt? 0,05? *** P & lt?. 0,01

Η

Σσσς Διαδρομή Βελτιώνει πνεύμονα ινοβλαστών διάδοση των πυρηνικών όπλων, εισβολή και κολλαγόνο Εναπόθεση

Έχουμε δείξει εδώ ότι τα κύτταρα NSCLC δεν αισθητά ανταποκριθούν σε εξωγενή Shh, αλλά μπορεί να εκκρίνουν βιοδραστικό Shh που επάγει την ενεργοποίηση του Hedgehog σηματοδότησης σε ινοβλάστες πνεύμονα. Αυτά τα αποτελέσματα αποκαλύπτουν ότι η Shh παίζει σημαντικό ρόλο στη διαμεσολάβηση επιθηλιακό καρκίνο-στρωματικών αλληλοπαρεμβολές σε NSCLC. Σε αυτό το σκηνικό, ερευνήσαμε τις πιθανές βιολογικές επιδράσεις της ενεργοποίησης Shh σε ινοβλάστες πνεύμονα. Έχουμε επικεντρωθεί σε διάφορες πτυχές της ενδιαφέρον στο πλαίσιο του καρκίνου, όπως ο πολλαπλασιασμός, η μετανάστευση, την εισβολή και την εξωκυττάρια μήτρα αναδιαμόρφωση. Ενώ ανασυνδυασμένο Shh αυξημένη κυτταρική επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων των ινοβλαστών πνεύμονα (Σχήματα 6Α-C), κυκλοπαμίνη μειώθηκε (Σχήματα 6Δ-F). Αυτό το αποτέλεσμα φαίνεται να είναι ειδικώς οφείλεται στην αναστολή του μονοπατιού Hedgehog ως θεραπεία με κυκλοπαμίνη συσχετίζεται με μία μείωση στην έκφραση Gli1 και Ptch1 σε CCL206 ινοβλάστες (Σχήμα S7A). Είναι ενδιαφέρον ότι, το υπερκείμενο H520 ενισχυμένη επίσης πνευμονικών ινοβλαστών κυτταρικού πολλαπλασιασμού (Σχήμα S7B-D). Όπως έχουν ινοβλάστες έχουν δειχθεί ότι είναι σημαντική για τη διευκόλυνση της μετανάστευσης του καρκίνου και την εισβολή, πήγαμε σχετικά με τη διερεύνηση των επιπτώσεων της Shh σε αυτές τις διαδικασίες. Οι ινοβλάστες υποβλήθηκαν σε αγωγή είτε με Shh ή με κυκλοπαμίνη και τη μετανάστευση τους καταγράφηκε μέχρι και 72 ώρες μετά τη θεραπεία. Ενώ Shh αύξησε την απόσταση μετανάστευσης των ινοβλαστών, κυκλοπαμίνη αυτό (Σχήμα 7Α) μειώθηκαν σημαντικά. Προκειμένου να διερευνήσει εάν η Shh θα μπορούσε να επηρεάσει τη μετανάστευση των ινοβλαστών μετά από ένα ερέθισμα τραυματισμό που μπορεί να αντιπροσωπεύει καλύτερα τις αλλαγές που λαμβάνουν χώρα στην καρκινική ιστό, πραγματοποιήσαμε αναλύσεις επούλωση των πληγών. Σε μη επεξεργασμένα κύτταρα, ινοβλάστες μετανάστευσαν στην περιοχή του τραύματος με προοδευτικό τρόπο, με αποτέλεσμα το κλείσιμο της πληγής μετά από 30 ώρες. Σε Shh-επεξεργασμένα κύτταρα, αυτή η διαδικασία ήταν ταχύτερη και οδήγησε σε κλείσιμο του τραύματος μετά 26 ώρες (Σχήματα 7Β και C). Αντιθέτως, κυκλοπαμίνη μειωμένη μετανάστευση των ινοβλαστών προς την περιοχή του τραύματος και δεν οδήγησε σε κλείσιμο του τραύματος (Σχήματα 7Β και C). Στη συνέχεια προσπάθησε να διερευνήσει εάν η Shh θα μπορούσε να επηρεάσει ινοβλαστών εισβολή. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήσαμε transwells επικαλυμμένες με κολλαγόνο που μιμείται καλύτερα η εξωκυτταρική μήτρα και επομένως στο πλαίσιο του ιστού. Τα κύτταρα φορτώθηκαν στην κορυφή του transwell και μέσο με Shh ή κυκλοπαμίνη τοποθετήθηκε στον πυθμένα, επιτρέποντας το σχηματισμό μιας βαθμίδωσης. Ο αριθμός των κυττάρων διαμετακινήθηκαν αυξάνεται με την παρουσία της Shh ενώ κυκλοπαμίνης μειώθηκε ινοβλαστών εισβολή διαμέσου της επικαλυμμένη κολλαγόνο μεμβράνη (Εικόνα 7D). Ενώ Shh σηματοδότηση ρυθμίζει πνεύμονα μετανάστευση των ινοβλαστών και την εισβολή, οποιαδήποτε επίδραση βρέθηκε για είτε Shh ή κυκλοπαμίνης σε δοκιμασίες προσκόλλησης ινοβλαστών (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επειδή η αποδιοργάνωση και τις αλλαγές στην αρχιτεκτονική του μικροπεριβάλλον του όγκου είναι κρίσιμα χαρακτηριστικά του καρκίνου, ερευνήσαμε εάν η ενεργοποίηση του μονοπατιού Shh σε ινοβλάστες πνεύμονα θα μπορούσε να συνδεθεί με εξωκυττάρια μήτρα αναδιαμόρφωση. Εξωγενείς Shh αύξησε την έκφραση του μεταλλοπεπτιδάση μήτρας ΜΜΡ9 (Σχήμα 7Ε), ένα πρωτεολυτικό ένζυμο που παίζει βασικό ρόλο στην εξέλιξη του καρκίνου. Είναι ενδιαφέρον ότι, η θεραπεία Shh αύξησε επίσης τη σύνθεση του κολλαγόνου στην εξωκυτταρική μήτρα που σχηματίζεται από ινοβλαστών (Σχήμα 7F). Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η Shh αποσπάσει μια απόκριση σε ινοβλαστών πνεύμονος που μπορεί να συσχετιστεί με τη μετανάστευση, εισβολή και εξωκυττάρια μήτρα αναδιαμόρφωση.

Ο πολλαπλασιασμός των ινοβλαστών πνεύμονος CCL206 αξιολογήθηκε με απαρίθμηση κυττάρων (Α, D) και την επιβίωση των κυττάρων