Abstract

microRNA (MIR) -150 έχει αναφερθεί να ρυθμίζεται προς τα κάτω δραματικά σε ανθρώπινο επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών (EOC) σε ιστούς και στον ορό των ασθενών σε σύγκριση με φυσιολογικούς μάρτυρες. Η παρούσα μελέτη στοχεύει να διερευνήσει κλινική σημασία και μοριακών μηχανισμών του miR-150 στην EOC. Στην παρούσα μελέτη, ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR ανάλυση έδειξε ότι miR-150 ήταν σημαντικά προς τα κάτω σε ανθρώπινους ιστούς EOC σε σύγκριση με δείγματα φυσιολογικού ιστού. Στη συνέχεια, έχουμε καταδείξει τις σημαντικές ενώσεις του miR-150 προς τα κάτω ρύθμιση με την επιθετική κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά των ασθενών ΕΓΚ, συμπεριλαμβανομένων των υψηλών κλινικό στάδιο και παθολογικές βαθμό, και μικρότερη συνολική και χωρίς εξέλιξη της επιβίωσης. Το πιο σημαντικό, η πολυπαραγοντική ανάλυση εντοπίστηκαν miR-150 έκφρασης ως ανεξάρτητο προγνωστικό βιοδείκτη στο ΕΓΚ. Μετά από αυτό, λουσιφεράσης δημοσιογράφος απέδειξε ότι δακτύλου ψευδαργύρου E-Box Δεσμευτική ομοιοκυτίου 1 (ZEB1), ένα κρίσιμο ρυθμιστή των επιθηλιακών-to-μεσεγχυματικά μετάβασης (EMT), ήταν ένας άμεσος στόχος του miR-150 στα κύτταρα του ΕΓΚ. Επιπλέον, βρήκαμε ότι η έκτοπη έκφραση του miR-150 θα μπορούσε να αναστείλει αποτελεσματικά τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, την εισβολή και τη μετάσταση με καταστολή της έκφρασης του ZEB1. Επιπλέον, παρατηρήσαμε επίσης μια σημαντική αρνητική συσχέτιση μεταξύ του miR-150 και έκφραση ZEB1 mRNA σε ιστούς EOC (rs = -0,45, P & lt? 0.001). Συμπερασματικά, τα ευρήματα αυτά προσφέρουν την πειστικές αποδείξεις ότι παρεκκλίνουσα έκφραση του miR-150 μπορεί να παίζει ένα ρόλο στην πρόοδο του όγκου και την πρόγνωση σε ασθενείς με EOC. Επιπλέον, τα στοιχεία μας αποκαλύπτουν ότι miR-150 μπορεί να λειτουργήσει ως καταστολέας όγκου και ρυθμίζουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό EOC, και εισβολή από άμεσα και αρνητικά ρυθμίζουν ZEB1, υπονοώντας την επανέκφραση του miR-150 θα μπορούσε να είναι ένας πιθανός θεραπευτική στρατηγική για EOC.

Παράθεση: Jin Μ, Yang Z, Ye W, Xu η, Hua X (2014) microRNA-150 προβλέπει μια ευνοϊκή πρόγνωση σε ασθενείς με επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών, και αναστέλλει τον κυτταρικό εισβολή και Μετάσταση καταστέλλοντας μεταγραφικός καταστολέας ZEB1. PLoS ONE 9 (8): e103965. doi: 10.1371 /journal.pone.0103965

Επιμέλεια: Αμπντελιλάχ Aboussekhra, βασιλιά Faisal Specialist Νοσοκομείο & amp? Ερευνητικό κέντρο, τη Σαουδική Αραβία

Ελήφθη: May 25, 2014? Αποδεκτές: 9 Ιούλη του 2014? Δημοσιεύθηκε: 4 του Αυγούστου του 2014

Copyright: © 2014 Jin et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Σαγκάης Δημοτικό Γραφείο Υγείας (Νο 20114y079)? Ιατρικής και Μηχανικής του Ιδρύματος της Σαγκάης Jiaotong Πανεπιστημίου (Αρ YG2011MS33). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή καρκίνο των ωοθηκών

Επιθηλιακά (EOC) αντιπροσωπεύει το πέμπτο πιο θανατηφόρα γυναικολογικών κακοήθεια και προέρχεται από την επιφάνεια των ωοθηκών, κύστες συμπερίληψη στο παρέγχυμα των ωοθηκών, ή από το κοντινό περιφερικό επιθήλιο σάλπιγγας [1]. Επειδή υπάρχουν λίγες αποτελεσματικές βιοδείκτες και θεραπείες, ΕΓΚ είναι μια επιθετική ασθένεια που προκαλεί κατ ‘εκτίμηση 125.000 θανάτους σε όλο τον κόσμο κάθε χρόνο [2]. Πενταετής επιβίωση των ασθενών με ΕΓΚ εξαρτάται καθοριστικά από την κλινικό στάδιο κατά τη διάγνωση των ασθενών? εάν διαγνωστεί και αντιμετωπιστεί, ενώ εντοπισμένη (στάδια Ι και ΙΙ), τα ποσοστά επιβίωσης 5 ετών μπορεί να φτάσει πάνω από το 90% [3]. Ωστόσο, οι περισσότεροι EOC ασθενείς που διαγνώστηκαν ως προχωρημένο στάδιο της νόσου (στάδια ΙΙΙ και IV), όπου το 5-ετή επιβίωση είναι μόνο 30-40% [4]. Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι η κλινική έκβαση των ασθενών ΕΓΚ μπορεί να είναι σημαντικά υψηλότερο με την έγκαιρη διάγνωση, ωστόσο, προς το παρόν δεν υπάρχει μη επεμβατική μέθοδος για την ανίχνευση με ακρίβεια EOC σε πρώιμο στάδιο. Έχοντας αυτό το σενάριο, η ανάπτυξη νέων και αποτελεσματικών διαγνωστικών και προγνωστικών μοριακοί βιοδείκτες για EOC είναι αναγκαία.

Τα microRNAs (miRNAs), όπως μια νέα κατηγορία μικρών μη κωδικεύοντα μονόκλωνα RNAs, έχουν πρόσφατα δειχθεί να ρυθμίζουν γονίδιο έκφραση μετα-μεταγραφικά μέσω ζευγών βάσεων συμπληρωματικά με τις θέσεις πρόσδεσης για την 3′-UTR του mRNA στόχου, οδηγώντας σε στόχευση διάσπαση mRNA ή μεταφραστικά καταστολή [5]. Με τη δέσμευση με γονίδια στόχους τους, miRNAs εμπλέκονται σε διάφορες βιολογικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της πολλαπλασιασμό των κυττάρων, την απόπτωση καθώς και της διαφοροποίησης των κυττάρων [6]. Μια αυξανόμενες ενδείξεις ανέφερε ότι miRNAs μπορούν να διαδραματίσουν ουσιαστικό ρόλο στον καρκίνο των κυττάρων εισβολή και τη μετάσταση. Ειδικά στην EOC, Yeh et al. [7] έδειξε την προς τα κάτω ρύθμιση miRNA-138 στα υψηλά μεταστατικών κυττάρων, και τη λειτουργία του ως αναστολέας της μετανάστευσης των κυττάρων και εισβολή? Wang et al. [8] διαπιστώθηκε ότι miR-182 μπορεί να δρα ως ένα ογκογόνο miRNA και προάγουν την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων, εισβολή, και χημειοαντίσταση με στοχοθέτηση PDCD4 σε κύτταρα EOC? Wu et al. [9] πρότεινε ότι miR-145 μπορεί να ρυθμίζουν την ανάπτυξη και την εισβολή EOC καταστέλλοντας p70S6K1 και MUC1, λειτουργεί ως καταστολέας όγκου. Αυτές οι προηγούμενες μελέτες που προβλέπονται αρχικές ενδείξεις για τις συνεισφορές της απώλειας ή της λειτουργίας κέρδους των συγκεκριμένων miRNAs στην καρκινογένεση και την εξέλιξη του καρκίνου του ΕΓΚ.

MiR-150, εντοπίζεται στο χρωμόσωμα 19q13, έχει υποδειχθεί ως αιμοποιητικών ειδικά miRNA στην κακοήθες λέμφωμα και έχει παρατηρηθεί να ρυθμίζεται προς τα κάτω σημαντικά σε κύτταρα όγκου σε σχέση με τα υγιή κύτταρα [10]. Η ανώμαλη έκφραση του miR-150 έχει επίσης βρεθεί σε άλλους διάφορους ιστούς στερεού όγκου, όπως ο καρκίνος του πνεύμονα, γαστρικό καρκίνο, ορθοκολικό καρκίνο, καρκίνο του ενδομητρίου, EOC, και τον καρκίνο του παγκρέατος [11] – [16]. Ειδικά, Vang et al. [14] διαπίστωσε ότι το miR-150 εμφανίζεται χαμηλή έκφραση στους περισσότερους ιστούς πρωτογενούς ΕΓΚ? Shapira et al. [15] ανέφεραν επίσης ότι miR-150 έδειξαν τουλάχιστον 10-πλάσια μείωση στην έκφραση σε δείγματα προ-χειρουργικών πλάσματος από γυναίκες διαγιγνώσκονται με EOC σε σύγκριση με δείγματα πλάσματος από γυναίκες χωρίς ένα γνωστό πυελική μάζα (υγιείς μάρτυρες). Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν πιθανό ρόλο της miR-150 σε ανθρώπινα EOC, η οποία μας οδήγησε να προσδιορίσει και λειτουργικά επικυρώνει miR-150 που σχετίζεται με κλινική σημασία και μοριακών μηχανισμών σε EOC.

Υλικά και Μέθοδοι

ασθενείς και δείγματα ιστών

τα κλινικά δείγματα ελήφθησαν από Xinhua νοσοκομείο, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Κίνα. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς και η μελέτη εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας του Xinhua νοσοκομείο, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Κίνα.

Για ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR δοκιμασία, 100 δείγματα ιστών EOC και 10 κανονική δείγματα ωοθηκικού ιστού καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο και αποθηκεύονται στους -80 ° C μετά από χειρουργική επέμβαση που πραγματοποιήθηκε στο Τμήμα Μαιευτικής και Γυναικολογίας, Xinhua νοσοκομείο, Shanghai Jiaotong Ιατρική Σχολή του Πανεπιστημίου από το Δεκέμβριο του 2006 έως τον Ιανουάριο του 2008. Όλα τα 10 κανονική ωοθηκών ιστοί ελήφθησαν από γυναίκες που υποβλήθηκαν σε υστερεκτομή για καλοήθη ασθένεια. Όλα τα ΕΓΚ ασθενείς υποβλήθηκαν σε θεραπεία χωρίς προεγχειρητική ακτινοθεραπεία, χημειοθεραπεία, ή ορμονική θεραπεία. Χειρουργική σταδιοποίηση ιδρύθηκε σύμφωνα με τη Διεθνή Ομοσπονδία Γυναικολογίας και Μαιευτικής συστήματος (FIGO). Τα κλινικά χαρακτηριστικά των 100 ΕΓΚ ασθενείς συνοψίζονται στον Πίνακα 1.

Η

Τακτική παρακολούθηση (εύρος: 2,08 – 119,06 μήνες, 62,86 μήνες στη μέση, 62,66 μήνες κατά μέσο όρο) διεξήχθησαν μετά τη θεραπεία όλα τα 100 ΕΓΚ ασθενείς που συμμετείχαν στην παρούσα μελέτη, με το χρόνο επιβίωσής τους, την ημερομηνία θανάτου και η ημερομηνία της τελευταίας παρακολούθησης καταγράφονται. Η συνολική επιβίωση (OS) ορίστηκε ως το χρονικό διάστημα από την ημερομηνία της διάγνωσης στο κέντρο μας με την ημερομηνία θανάτου ή την τελευταία παρακολούθηση. Επιβίωση χωρίς εξέλιξη (PFS) ορίστηκε ως το χρονικό διάστημα από τη διάγνωση στο κέντρο μας στην προοδευτική ασθένεια, θάνατο οποιαδήποτε άλλη αιτία από την εξέλιξη, ή ένα δεύτερο πρωτοπαθή καρκίνο.

Κυτταρική καλλιέργεια

ανθρώπινα ωοθηκών υδαρής κυστική κυτταρική σειρά αδενοκαρκινώματος OVCAR3 και τα ανθρώπινα ορώδες θηλώδους κυστική κυτταρική γραμμή αδενοκαρκινώματος SKOV3 αγοράστηκαν από την American Type Tissue Collection (Manassas, VA). Αμφότερες οι κυτταρικές γραμμές είναι κατάλληλοι ξενιστές διαμόλυνση. Όλα τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (GIBCO) σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2 στους 37 ° C.

RNA και miRNA εκχύλιση

για τον ποσοτικό προσδιορισμό του mRNA, το σύνολο των RNAs από κυτταρικές σειρές και ιστούς εκχυλίσθηκαν χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για miRNA ποσοτικού προσδιορισμού, συνολικής miRNA εκχυλίσθηκε από κυτταρικές σειρές και ιστούς χρησιμοποιώντας το mirVana miRNA κιτ απομόνωσης (Ambion, Austin, ΤΧ, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR δοκιμασία

για mRNA και miRNA ποσοτικοποιήσεις, ποσοτική PCR δοκιμασία σε πραγματικό χρόνο για την ανίχνευση αντίστοιχα τα επίπεδα έκφρασης του miR-150 και ZEB1 σε κυτταρικές σειρές και ιστούς. Εν συντομία, 10 μg των μικρών RNA και 20 μg ολικού RNA υποβλήθηκε σε αντίστροφη μεταγραφή. Το cDNA χρησιμοποιήθηκε για την ενίσχυση του ώριμου miR-150, ZEB1 και των ενδογενών τους ελέγχους, U6 και β-ακτίνη, με PCR. Οι εκκινητές PCR που χρησιμοποιήθηκαν ήταν οι εξής: miR-150 προς τα εμπρός, 5′-CAG ΤΑΤ TCT CTC CCA ACC CTT GTA-3 ‘και αντίστροφη 5′-ΑΑΤ GGA TGA TCT CGT CAG TCT GTT-3′, U6 προς τα εμπρός, 5’ ΑΤΤ GGA ACG ΑΤΑ CAG AGA AGA ΤΤ-3 ‘και να αντιστραφεί, 5′-GGA ACG CTT CAC GAA ΤΤΤ G-3′? ZEB1 μπροστά 5’-CAG GCA GAT GAA GCA GGA TG-3 ‘και αντίστροφη 5′-CAG CAG TGT CTT GTT GTT GTA G-3′? β-ακτίνη προς τα εμπρός 5’-GGC GGC ACC ACC ATG TAC ΚΔ-3 ‘και αντίστροφη 5′-ΑΟΟ GGC CGG ACT CGT CAT ACT-3’. Οι συνθήκες PCR ήταν:. Αρχική μετουσίωση στους 95 ° C για 3 λεπτά, ακολουθούμενη από 40 κύκλους των 95 ° C για 15 s, 62 ° C για 30 s, και 72 ° C για 30 s

Σε πραγματικό time PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) σε ένα σύστημα πραγματικού χρόνου PCR ΑΒΙ 7300HT (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Πρότυπες καμπύλες παράχθηκαν, και η σχετική ποσότητα του miR-150 ή ZEB1 κανονικοποιήθηκε προς την ποσότητα του U6 ή β-ακτίνης, αντίστοιχα. Σχετική ποσοτικοποίηση της έκφρασης του γονιδίου-στόχου αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας το 2

-. △△ CT μέθοδο

Κατασκευή φορέων έκφρασης και επιμόλυνση κυττάρων

Το πλασμίδιο pcDNA_6.2-GW /EmGFP-miR διάνυσμα (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) με ένα γονίδιο ανθεκτικό σπεκτινομυκίνη χρησιμοποιήθηκε για να κατασκευαστεί ένα πλασμίδιο που υπερεκφράζουν miR-150. Ένα θραύσμα DNA 62 bp με ώριμη miR-150 ή ένας αρνητικός έλεγχος (NC) αταίριαστο αλληλουχία συνετέθη χημικώς και προστέθηκε σε αυτόν τον φορέα με Σαγκάη Shenggong Biotech (Shanghai, Κίνα).

κύτταρα EOC συλλέχθηκαν και τοποθετήθηκαν πάνω σε τρυβλία 6 φρεατίων με 70-80% συρροή όλη τη νύχτα πριν την επιμόλυνση. Ο φορέας HSA-miR-150 και NC επιμολύνθηκε με Lipofectamin 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) σε συγκέντρωση 100 ηΜ για 48 ώρες στους 37 ° C σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

ZEB1 siRNA και διαμόλυνσης κυττάρων

ZEB1 siRNA (siRNA-ZEB1) και τον έλεγχο siRNA (siRNA-NC) αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA) και διαμολύνθηκαν σε κύτταρα EOC κατά τη διάρκεια της λογαριθμικής φάσης ανάπτυξης, χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 λιπόσωμα (Invitrogen Οο, Carlsbad, CA, USA) σε συγκέντρωση 100 ηΜ για 48 ώρες στους 37 ° C σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το επίπεδο έκφρασης του ZEB1 ανιχνεύθηκε με στύπωμα Western για να προσδιοριστεί η επίδραση παρεμβολών για ZEB1.

Western ανάλυση κηλίδος

κύτταρα EOC συλλέχθηκαν 72 ώρες μετά τη παροδική επιμόλυνση και ανάλυση κηλίδας Western διεξήχθη για την ανίχνευση τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης ZEB1. Τα κύτταρα λύθηκαν χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό RIPA (50 mM Tris-HCl, ρΗ 8.8, 150 mM NaCl, 1% ΝΡ-40, 1% δεοξυχολικό νάτριο, 0,1% SDS). Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν επί μετουσιωτικής πηκτής πολυακρυλαμιδίου SDS και μετά μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης. Τα φίλτρα μπλοκαρίστηκαν σε PBS-Tween αποβουτυρωμένο γάλα και διερευνήθηκαν με αντίσωμα αντι-ZEB1 (αραίωση 1:1000, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA) ή ανιχνεύθηκαν με αντίσωμα αντι-β-ακτίνης (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA) . β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος για ομαλοποίηση των υποψηφίων γονιδίων. Οι μεμβράνες πλύθηκαν και επωάστηκαν με υπεροξειδάση (HRP), συζευγμένης δευτερεύοντα αντισώματα. Η έκφραση της πρωτεΐνης εκτιμήθηκε με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια και έκθεση σε φιλμ χημιφωταύγειας (Pierce Biotechnology).

λουσιφεράσης ανταποκριτής δοκιμασία

Το 3′-UTR του mRNA ZEB1 κλωνοποιήθηκε και εισάγεται καθοδικά του γονιδίου luciferse σε φορέα /λουσιφεράσης pGL3 (Promega, Madison, WI, USA). Το μεταλλαγμένο 3′-UTR του mRNA ZEB1 κλωνοποιήθηκε με τη χρήση του άγριου τύπου 3′-UTR ως εκμαγείο και εισάγεται εντός pGL3 /λουσιφεράσης όπως περιγράφεται για την άγριου τύπου 3′-UTR. κύτταρα EOC καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία 24 φρεατίων και συν-επιμολύνθηκαν με miR-150 μιμείται και pGL3-ZEB1-wt ή pGL3-ZEB1-mut. Στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, EOC κύτταρα συλλέχθηκαν και η δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας το Dual-Luciferase Reporter System Assay (Promega, Madison, WI, USA) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι δραστηριότητες της λουσιφεράσης Renilla χρησιμοποιήθηκαν ως εσωτερικός έλεγχος. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν ανεξάρτητα.

In vitro πολλαπλασιασμό των κυττάρων

δοκιμασία

Η in vitro κυτταρικό πολλαπλασιασμό των κυττάρων ΕΓΚ επιμολυσμένα με HSA-miR-150 φορέα και φορέα NC προσδιορίστηκε σε 24, 48 και 72 ώρες με τη χρήση του CellTiter 96 υδατικό One Solution κιτ δοκιμασίας κυτταρικού πολλαπλασιασμού (Promega, Madison, WI) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η απορρόφηση στα 490 nm μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα mquant καθολική Microplate Φασματοφωτόμετρο (BioTek, Winooski, VT). Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως η μέση τιμή για τα πειράματα εις τριπλούν.

In vitro εισβολή δοκιμασία

Η ικανότητα εισβολής των κυττάρων ΕΓΚ επιμολυσμένα με HSA-miR-150 φορέα και φορέα NC ελέγχθηκε σε Matrigel επικαλυμμένα κύτταρο θαλάμους καλλιέργειας (μέγεθος πόρων 8 μm, Millipore, Billerica, ΜΑ, USA). κύτταρα EOC επιμολύνθηκαν και καλλιεργήθηκαν μέχρι συρροής ή σχεδόν (& gt? 90%) συρροή σε 24-φρεατίων. Στη συνέχεια, τα κύτταρα EOC επαναιωρήθηκαν σε 200 μΐ 1640 άνευ ορού τοποθετήθηκαν μέσα στον ανώτερο θάλαμο του ενθέτου με Matrigel. Μέσο με 5% FBS προστέθηκε στο κάτω θαλάμους ως χημειοελκτικό. Μετά από 24 ώρες επώασης, τα κύτταρα που παραμένουν επί της άνω μεμβράνης αφαιρέθηκαν προσεκτικά. Τα κύτταρα που είχαν εισβάλει μέσω της μεμβράνης με το χέρι μετρήθηκαν στα 200 × μεγέθυνση από δέκα διαφορετικά πεδία του κάθε φίλτρου. Όλα τα πειράματα έγιναν εις τριπλούν.

In vitro μετανάστευση δοκιμασία

Η ικανότητα μετανάστευση κυττάρων ΕΓΚ επιμολυσμένα με HSA-miR-150 φορέα και φορέα NC ελέγχθηκε σε Corning Transwell ένθετο θαλάμους. Εν συντομία, 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα EOC επαναιωρήθηκαν σε 200 μΐ 1640 άνευ ορού τοποθετήθηκαν μέσα στον ανώτερο θάλαμο του ενθέτου χωρίς Matrigel. Μέσο με 5% FBS προστέθηκε στο κάτω θαλάμους ως χημειοελκτικό. Μετά από 24 ώρες επώασης, τα κύτταρα που παραμένουν επί της άνω μεμβράνης αφαιρέθηκαν προσεκτικά. Τα κύτταρα που είχαν μεταναστεύσει διαμέσου της μεμβράνης με το χέρι μετρήθηκαν στα 200 × μεγέθυνση από δέκα διαφορετικά πεδία του κάθε φίλτρου. Όλα τα πειράματα έγιναν εις τριπλούν.

Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± S.E. Οι συγκρίσεις μεταξύ των ομάδων πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία Kruskal- Wallis για τις συνεχείς μεταβλητές και το χ

2 τεστ για τις κατηγορικές μεταβλητές. Η μέθοδος Kaplan-Meier χρησιμοποιήθηκε για ανάλυση επιβίωσης, και οι διαφορές στην επιβίωση εκτιμήθηκαν χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία log-rank. Μια πολυπαραγοντική ανάλυση επιβίωσης πραγματοποιήθηκε για όλες τις παραμέτρους που ήταν σημαντικές στην μονοπαραγοντική ανάλυση με τη χρήση του μοντέλου παλινδρόμησης Cox. P & lt? 0,05 θεωρήθηκε σημαντική

Αποτελέσματα

Ελάττωση του miR-150 σε ανθρώπινους ιστούς ΕΓΚ

Το επίπεδο έκφρασης του miR-150 σε 100 δείγματα ιστών EOC και 10 φυσιολογικά ωοθηκών. δείγματα ιστών ανιχνεύθηκαν με qRT-PCR και ομαλοποιήθηκε ως προς RNU6B. Ως αποτέλεσμα, το επίπεδο έκφρασης της miR-150 σε ιστούς EOC ήταν σημαντικά χαμηλότερη από ότι σε φυσιολογικούς ιστούς ωοθηκών (EOC vs. Κανονικό: 2,38 ± 0,80 έναντι 3,83 ± 0,77, Ρ & lt? 0.001, Εικόνα 1). Η διάμεση τιμή (2.36) του miR-150 έκφραση σε όλους τους ιστούς EOC ανιχνεύεται με qRT-PCR χρησιμοποιήθηκε ως σημείο αποκοπής να ταξινομηθεί 100 EOC ασθενείς σε miR-150-χαμηλό (n = 58, 58.00%) και miR-150- . υψηλή ομάδες (n = 42, 42.00%) έκφραση

Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το επίπεδο έκφρασης του miR-150 σε ιστούς ΕΓΚ ήταν σημαντικά χαμηλότερη από ότι σε φυσιολογικούς ιστούς των ωοθηκών (EOC εναντίον κανονικό: 2,38 ± 0,80 έναντι 3,83 ± 0,77, P & lt?. 0.001)

Η

Ελάττωση του miR-150 συνδέεται με την επιθετική εξέλιξη του όγκου των ανθρωπίνων ΕΓΚ

Ο Πίνακας 1 έδειξε τις ενώσεις μεταξύ των διαφόρων κλινικοπαθολογική μεταβλητών και miR -150 επίπεδα έκφρασης σε δείγματα όγκων από ασθενείς EOC. Οι ιστοί ΕΓΚ με προχωρημένο κλινικό στάδιο (III~IV) συχνότερα έδειξαν χαμηλή έκφραση miR-150 από αυτούς με χαμηλά κλινικό στάδιο (I~II, Ρ = 0,005, Πίνακας 1). Επιπλέον, miR-150 έκφραση επέδειξε μία τάση που συσχετίζεται με παθολογικές Βαθμός (Ρ = 0,02, Πίνακας 1). Βρήκαμε ότι το miR-150 ήταν έκτροπα μειωτικά σε ιστούς όγκων με υψηλή παθολογική βαθμό σε σύγκριση με εκείνους με χαμηλή παθολογικό βαθμό. Ωστόσο, η έκφραση του miR-150 δεν συνδέονται με άλλες κλινικοπαθολογική μεταβλητές, όπως η ηλικία, το βαθμό, ιστολογικό τύπο και το υπολειπόμενο όγκο μετά από χειρουργική επέμβαση (όλα τα P & gt? 0,05).

Ελάττωση του miR-150 συνδέεται με κακή πρόγνωση σε ασθενείς με EOCs

OS και καμπύλες PFS χαράχθηκαν σύμφωνα με το επίπεδο έκφρασης του miR-150 σε δείγματα όγκων από ασθενείς ΕΓΚ με τη μέθοδο Kaplan-Meier. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2, οι ασθενείς ΕΓΚ με χαμηλή έκφραση miR-150 είχαν σημαντικά μικρότερη συνολική (Ρ & lt? 0.001, Σχήμα 2Α) (?, Σχήμα 2Β 0.001 Ρ & lt) επιβιώσεις από εκείνους με υψηλή έκφραση miR-150 άνοιξε

Τα επιθηλιακά ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών με χαμηλή έκφραση του miR-150 είχαν σημαντικά μικρότερη συνολική (P & lt? 0.001) και χωρίς εξέλιξη (P & lt? 0.001) επιβίωσης από εκείνους με υψηλή miR-150 έκφρασης έκανε

Η.

Η μονοπαραγοντική ανάλυση με μοντέλο Cox αναλογικών κινδύνων προσδιόρισε τρεις προγνωστικούς παράγοντες: κλινικό στάδιο, παθολογικές βαθμό και την έκφραση του miR-150. Τα άλλα κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά, όπως η ηλικία, το βαθμό, ιστολογικό τύπο και το υπολειμματικό όγκο μετά από χειρουργική επέμβαση, δεν ήταν στατιστικά σημαντικές προγνωστικοί παράγοντες (Πίνακας 2). Μια πολυπαραγοντική ανάλυση των παραγόντων πρόγνωση με Cox μοντέλο αναλογικού κινδύνου επιβεβαίωσε ότι το κλινικό στάδιο και η έκφραση του miR-150 ήταν δύο σημαντικές ανεξάρτητους προγνωστικούς παράγοντες τόσο του OS και PFS σε ασθενείς με EOC (Πίνακας 3).

Η

miRNA-150 στόχους ZEB1 στους ιστούς ΕΓΚ

Για να προσδιορίσετε πώς η ρύθμιση προς τα κάτω στο miR-150 έκφρασης μπορεί να προωθήσει την εξέλιξη του όγκου, τα γονίδια υποψήφιος στόχος του miR-150 συλλέχθηκαν από miRTarBase (Release 4.5: Νοέμβριος 1, 2013? https://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/), η οποία έχει συσσωρεύσει πάνω από πενήντα χιλιάδες αλληλεπιδράσεις miRNA-στόχου (MTIs), τα οποία συλλέγονται από το χέρι τοπογραφικά σχετική βιβλιογραφία μετά την εξόρυξη δεδομένων του κειμένου συστηματικά να φιλτράρετε ερευνητικά άρθρα που σχετίζονται με λειτουργικές μελέτες των miRNAs [17], [18]. Στην παρούσα μελέτη, έχουμε επιλέξει μόνο τα γονίδια υποψήφιος στόχος που επικυρώθηκαν πειραματικά με τη δοκιμασία ανταποκριτή, western blot και ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου. Ως αποτέλεσμα, τα τρία γονίδια, όπως ΜΥΒ, EGR2 και ZEB1, επιλέχθηκαν τα γονίδια υποψήφιος στόχος του miR-150. Επιπλέον, RNAhybrid (Έκδοση 2.1, https://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/submission.html) χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό της ελάχιστης ελεύθερης ενέργειας (MFE) του miRNA διπλής όψης: mRNA [19]. Η miRNA υβριδοποιείται προς το στόχο σε έναν ενεργητικά βέλτιστο τρόπο. RNAhybrid βελτιστοποιήθηκε για να δείξει την υβριδοποίηση στο 3’UTR των γονιδίων-στόχων. Το διπλό miRNA: mRNA με χαμηλότερη MFE είναι πιο σταθερό από ότι με υψηλότερες MFE. Ως αποτέλεσμα, οι τιμές MFE του miR-150: ΜΥΒ, miR-150: EGR2 και miR-150: ZEB1 ήταν αντίστοιχα -11.51 kcal /mol, -14.30 kcal /mol και -18.00 kcal /mol. Η αμφίδρομη miR-150: ZEB1 έχει το καλύτερο MFE, ως εκ τούτου, επιλέξαμε ZEB1 ως γονίδιο-στόχος υποψήφιος για miR-150 στην περαιτέρω πειράματα επικύρωσης

Για να επαληθεύσετε τον υποψήφιο στόχο της HSA-ΜΙΚ. 150, επιμολύναμε κύτταρα ΕΓΚ με φορέα HSA-miR-150, αρνητικό φορέα (NC), και κενό μέσο καλλιέργειας ελέγχου (mock), αντίστοιχα. Σε 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, ανάλυση κηλίδας Western διεξήχθη και τα αποτελέσματα στο Σχήμα 3A~B έδειξε ότι η επιβολή έκφραση του HSA-miR-150 οδήγησε σε αξιοσημείωτη μείωση στα επίπεδα έκφρασης της ενδογενούς πρωτεΐνης ZEB1 σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με ΕΓΚ NC ή εικονικές (ομάδες κυττάρων SKOV3 και OVCAR3: τόσο P & lt? 0.001). Επιπλέον, η δοκιμασία αναφοράς λουσιφεράσης εκτελέστηκε με συν-επιμόλυνση του miR-150 και ένα πλασμίδιο αναφοράς λουσιφεράσης που περιέχει την 3’UTR της ανθρώπινης ZEB1. Σύμφωνα με miRTarBase (Release 4.5: 1 του Νοεμβρίου 2013? https://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/), υπάρχουν ένα επικυρωμένες θέση πρόσδεσης και δύο προβλεπόμενες θέσεις για το miR-150 στην ZEB1 3’UTR δεσμευτική . Στην παρούσα μελέτη, αναλύσαμε μόνο την επικυρωμένη θέση δέσμευσης όπως φαίνεται στο Σχήμα 3D. Για να ελέγξετε αν μια άμεση αλληλεπίδραση εμπλέκεται μεταξύ miR-150 και του ογκογονιδίου στόχο ZEB1 της, πραγματοποιήσαμε λουσιφεράσης ανταποκριτή (Σχήμα 3Ε). Βρήκαμε ότι η συν-επιμόλυνση του miR-150, μαζί με τον άγριο τύπο 3’UTR του ZEB1 προκάλεσε σημαντική μείωση της δραστηριότητας της λουσιφεράσης σε σύγκριση με τους μάρτυρες (Σχήμα 3F και G).

(Α) Τα επίπεδα έκφρασης του miR -150 σε κύτταρα SKOV3 και OVCAR3 με δοκιμασία PCR ποσοτική πραγματικού χρόνου στις 24 ώρες μετά τη διαμόλυνση του φορέα miR-150. (B~C) Η πρωτεΐνη ZEB1 σε κύτταρα SKOV3 και OVCAR3 με κηλίδα western στις 24 ώρες μετά τη διαμόλυνση του miR-150 φορέα. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος φόρτωσης. «NC» αναφέρεται σε αρνητικό φορέα ελέγχου. (D) miR-150 θέσεις στο ZEB1 3′-UTR δεσμευτική. (Ε) ευθυγράμμιση ακολουθίας RNA που δείχνει το 3′-UTR της ZEB1 mRNA περιέχει ένα συμπληρωματικό χώρο για την περιοχή σπόρο του miR-150. ZEB1 mut είναι ένα μεταλλαγμένο με υποκαταστάσεις στην συμπληρωματική περιοχή ως αρνητικός μάρτυρας. (F και G) δοκιμασία έκθεση λουσιφεράσης έγινε για να επιβεβαιώσει την δεσμευτικού στόχου miR-150. Η δραστικότητα της λουσιφεράσης ανιχνεύθηκε μετά από συν-επιμόλυνση του pGL3-ZEB1-wt ή pGL3-ZEB1-mut, miR-150 φορέα ή αρνητικό φορέα ελέγχου (NC) σε κύτταρα SKOV3 και OVCAR3.

Η

ΜΙΚ 150 αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων των κυττάρων ΕΓΚ in vitro με τη στόχευση ZEB1

για να αξιολογηθεί η επίδραση του miR-150 σε κακοήθη φαινότυπο σε κύτταρα EOC, επιμολύναμε siRNA-ZEB1 να καταστείλουν ειδικώς έκφρασης ενδογενούς ZEB1. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4, η επιμόλυνση των siRNA-ZEB1 θα μπορούσε να αναστείλει αποτελεσματικά την έκφραση της πρωτεΐνης ZEB1 στις δύο κυτταρικές σειρές SKOV3 και OVCAR3 (τόσο Ρ & lt? 0.001). Επιπλέον, παρατηρήσαμε ότι η επιβολή έκφραση του miR-150 ανέστειλε σημαντικά κυτταρικό πολλαπλασιασμό των κυττάρων SKOV3 και OVCAR3, ωστόσο, αυτή η αλλοίωση επανήλθε από την επιμόλυνση του siRNA-ZEB1. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5, η εκτέλεση έκφραση του miR-150 ανέστειλε σημαντικά κυτταρικό πολλαπλασιασμό των κυττάρων SKOV3 και OVCAR3 επιμολυσμένα με siRNA-NC (αμφότερα Ρ = 0,006, Σχήμα 5Α και C), αλλά απέτυχε να πράξει σε κύτταρα SKOV3 και OVCAR3 επιμολυσμένα με siRNA-ZEB1 (αμφότερα Ρ & gt? 0,05, Σχήμα 5Β και D).

ανάλυση κηλίδος Western διεξήχθη για την ανίχνευση των επιπέδων έκφρασης των ZEB1 πρωτεΐνης σε siRNA-ZEB1 επιμολυσμένα, siRNA-NC επιμολυσμένα και μη-επιμολυσμένα (κενό ) SKOV3 (Α και Β) και OVCAR3 (C και D) κύτταρα. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος φόρτωσης.

Η

(Α και Β) Καμπύλες ανάπτυξης των κυττάρων SKOV3 και OVCAR3 επιμολυσμένα με siRNA-NC, και τα κύτταρα SKOV3 και OVCAR3 επιμολυσμένα με siRNA-NC και miR -150 φορέα. (Γ και Δ) Καμπύλες ανάπτυξης των κυττάρων SKOV3 και OVCAR3 επιμολυσμένα με siRNA-ZEB1 και κύτταρα SKOV3 και OVCAR3 επιμολυσμένα με siRNA-ZEB1 και miR-150 φορέα.

Η

MiR-150 αναστέλλει EOC κύτταρα μετανάστευση και την εισβολή in vitro με τη στόχευση ZEB1

Για την περαιτέρω ελέγξει αν miR-150 ανέστειλε την κυτταρική μετανάστευση και την εισβολή των κυτταρικών σειρών του ΕΓΚ με τη στόχευση ZEB1, μπορούμε επίσης γκρέμισε την έκφραση της ZEB1 από την επιμόλυνση του siRNA-ZEB1 στην τόσο SKOV3 και OVCAR3 κύτταρα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6, η αναγκαστική έκφραση του miR-150 ανέστειλε σημαντικά την κυτταρική μετανάστευση και εισβολή των κυττάρων SKOV3 και OVCAR3 επιμολυσμένα με siRNA-NC (αμφότερα Ρ = 0,01, Σχήμα 6Α και C), αλλά απέτυχε να πράξει SKOV3 και OVCAR3 κύτταρα επιμολυσμένα με siRNA-ZEB1 (αμφότερα Ρ & gt? 0,05, Σχήμα 6Β και D).

(Α και C) Transwell δοκιμασία μετανάστευσης και δοκιμασία εισβολής Matrigel κυττάρων ΕΓΚ επιμολυσμένα με siRNA-NC, και τα κύτταρα EOC επιμολυσμένα με siRNA-NC και του φορέα του miR-150. (Β και D) δοκιμασία μετανάστευσης Transwell και δοκιμασία εισβολής Matrigel κυττάρων ΕΓΚ επιμολυσμένα με siRNA-ZEB1 και κύτταρα επιμολυσμένα με ΕΓΚ siRNA-ZEB1 και miR-150 φορέα.

Η

αρνητική συσχέτιση μεταξύ miR-150 και τα επίπεδα έκφρασης του mRNA ZEB1 σε ανθρώπινους ιστούς EOC

για να αξιολογηθεί η σχέση μεταξύ miR-150 και έκφραση ZEB1 mRNA σε ιστούς EOC, ανιχνεύσαμε περαιτέρω τα επίπεδα έκφρασης του mRNA ZEB1 σε 100 δείγματα ιστών EOC και 10 φυσιολογικούς δείγματα ωοθηκικού ιστού από qRT-PCR και ομαλοποιήθηκε ως προς β-ακτίνης. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 7Α, το επίπεδο έκφρασης της ZEB1 mRNA σε ιστούς EOC ήταν σημαντικά υψηλότερη από ότι σε φυσιολογικούς ιστούς ωοθηκών (EOC vs. Κανονικό: 4,49 ± 1,52 έναντι 2,41 ± 0,49, Ρ & lt? 0.001, Εικόνα 7Α). Πιο ενδιαφέρον, η ανάλυση συσχέτισης Spearman έδειξε σαφώς αρνητική συσχέτιση μεταξύ του miR-150 και έκφραση ZEB1 mRNA σε ιστούς EOC (rs = -0,45, P & lt? 0.001, Εικόνα 7Β)

Το επίπεδο έκφρασης των ZEB1 mRNA σε ιστούς του ΕΓΚ. ήταν σημαντικά υψηλότερη από ότι σε φυσιολογικούς ιστούς των ωοθηκών (EOC εναντίον κανονικό: 4,49 ± 1,52 έναντι 2,41 ± 0,49, P & lt? 0.001, Α). Πιο ενδιαφέρον, η ανάλυση συσχέτισης Spearman έδειξε σαφώς αρνητική συσχέτιση μεταξύ του miR-150 και έκφραση ZEB1 mRNA σε ιστούς EOC (rs = -0,45, P & lt? 0.001, Β).

Η

Συζήτηση

ΕΓΚ εξακολουθεί να αποτελεί μείζον γυναικολογικό πρόβλημα με ποσοστό επιβίωσης χαμηλό 5 ετών και απειλεί σοβαρά την ανθρώπινη υγεία λόγω της απόστασης μεταστάσεις, παρά ρουτίνα χειρουργική επέμβαση και χημειοθεραπεία. Αυξανόμενες ενδείξεις εμφανίζουν την απορύθμιση των διαφόρων miRNAs στην EOC και συνεπάγεται ουσιαστικό ρόλο τους στην ογκογόνο διαδικασίες, συμπεριλαμβανομένων του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, την απόπτωση και την κινητικότητα. Έτσι, αποκαλύπτοντας τις μοριακές αλλαγές των miRNAs είναι ζωτικής σημασίας για την αντιμετώπιση αυτής της θανάσιμης ασθένειας. Προηγούμενες μελέτες έχουν αποδείξει ότι miR-150 είναι δραματικά μειωτικά σε ανθρώπινους ιστούς και ορό EOC ασθενών σε σύγκριση με φυσιολογικούς ελέγχους [14], [15]. Ωστόσο, οι ρόλοι του miR-150 στην έναρξη και την εξέλιξη της EOC και την κατιούσα ρύθμιση των miR-150 έκφρασης αυτού του καρκίνου είναι ακόμα ασαφής. Στην παρούσα μελέτη, που συνδέονται miR-150 προς γονίδιο στόχο ZEB1 της, και επέδειξε συμμετοχές τους στη ρύθμιση κακοήθη φαινοτύπους των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών. Εμείς επιβεβαίωσε το βασικό ρόλο του miR-150 ως καταστολέας των όγκων από άμεσα και αρνητικά στόχευση ZEB1 στην EOC. Τα αποδεικτικά στοιχεία για αυτό προέρχεται από τις ακόλουθες πηγές. Κατ ‘αρχάς, θα επικυρωθεί η ρύθμιση προς τα κάτω του miR-150 σε ιστούς ΕΓΚ χρησιμοποιώντας μια μεγάλη σειρά ασθενών EOC, και έδειξε ότι το χαμηλό επίπεδο έκφρασης του miR-150 ήταν πολύ χαμηλότερη σε εξαιρετικά επιθετική EOC ιστούς. Δεύτερον, η προς τα κάτω ρύθμιση των miR-150 ταυτοποιήθηκε ως ανεξάρτητος προγνωστικός δείκτης για τόσο συνολικά όσο και χωρίς εξέλιξη της επιβίωσης των ασθενών με ΕΓΚ. Τρίτον, η υπερέκφραση του miR-150 θα μπορούσε να αναστείλει δραματικά το κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την κινητικότητα των ωοθηκών καρκινικών κυττάρων in vitro και ουσιαστικά να καταστείλει την έκφραση πρωτεΐνης του ZEB1. Forth, ZEB1 αναγνωρίστηκε ως άμεσο στόχο miR-150, και knock-down της ZEB1 στα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών θα μπορούσε να μιμηθεί την αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, τη μετανάστευση και την εισβολή του miR-150. Επιπλέον, βρήκαμε μία σημαντικά αρνητική συσχέτιση μεταξύ miR-150 και έκφραση ZEB1 mRNA σε ιστούς EOC.

MiR-150 έχει αποδειχθεί ότι είναι ένα απαραίτητο miRNA ενοχοποιηθεί για την ανάπτυξη και την εξέλιξη των διαφόρων ανθρώπινων κακοηθειών. Για παράδειγμα, η μειωμένη έκφραση του miR-150 δρα ως αντι-αποπτωτικό παράγοντα σε ανθρώπινο διαχέονται γαστρικού καρκίνου και αδρενοκορτικοτροφική ορμόνη που εκκρίνουν οι όγκοι της υπόφυσης [20]? Η ένεση του miR-150-μεταγωγή κύτταρα λεμφώματος ποντικού σε ποντικούς με ανοσοανεπάρκεια μπορεί να παράγει λιγότερους όγκους από κύτταρα ελέγχου [21]? Η αναγκαστική έκφραση του miR-150 μπορεί να αναστέλλει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων in vitro και αναστέλλουν την ανάπτυξη του όγκου σε ζωικά μοντέλα μέσω απευθείας προς τα κάτω ρύθμιση DKC1 και ΑΚΤ2, μείωση του φωσφορυλιωμένου AKTser473 /4 και την αύξηση καταστολείς όγκου όπως Bim και ρ53, οδηγώντας σε ενεργοποίηση της τελομεράσης και αθανατοποίηση των καρκινικών κυττάρων [22]? έκφραση miR-150 είναι μειωμένη σε μη μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα και συνδέθηκε έντονα με το στάδιο του όγκου, το μέγεθος του όγκου και της επιβίωσης των ασθενών, όπως σημαντικά χαμηλή έκφραση σε προχωρημένο στάδιο, μεγάλου μεγέθους και φτωχή πρόγνωση όγκων σημειώθηκε [13]. Μειωμένη έκφραση του miR-150 παρατηρείται επίσης σε οισοφαγικό καρκίνωμα των πλακωδών κυττάρων και υποδεικνύεται να συνεισφέρει στον κακοήθη δυναμικό, όπως το βάθος του όγκου, λέμφο μετάσταση στους λεμφαδένες, λεμφικό εισβολή, φλεβική εισβολή, την κλινική σταδιοποίηση, και φτωχή πρόγνωση [23]. Στην παρούσα μελέτη, τα δεδομένα μας είναι σύμφωνες με αυτές τις προηγούμενες δημοσιευμένες μελέτες που παρέχουν αποδείξεις για τις αλλαγές στην έκφραση του miR-150 προωθώντας το σχηματισμό όγκων. Έχουμε αποδείξει ότι το miR-150 ήταν λειτουργικά εμπλέκονται στην καταστολή της ανάπτυξης των κυττάρων του ΕΓΚ, τη μετανάστευση και την εισβολή, η οποία υποστηρίχθηκε και από τις δύο μελέτες κυτταρικής καλλιέργειας και κλινικά δεδομένα. Σε πειράματα κυτταρικής καλλιέργειας, η υπερ-έκφραση του miR-150 οδήγησε σε μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και EOC κυτταρική κινητικότητα. Σε κλινικά δείγματα, miR-150 ήταν δραματικά κάτω-ρυθμίζονται EOC ιστούς με υψηλό κλινικό στάδιο και υψηλής παθολογικών ποιότητας σε σύγκριση με EOC ιστούς με χαμηλές κλινικό στάδιο και χαμηλή παθολογικές βαθμού, και χαμηλής miR-150 έκφραση σε όγκους συσχετίστηκε με κακή επιβίωση του ασθενείς με EOC

το πιο σημαντικό, τα οποία προσδιορίζονται miR-150 στόχος μας ήταν ZEB1, ένα μέλος της οικογένειας των δακτύλων ψευδαργύρου πρωτεϊνών [24] – [26].. ZEB1 είναι μία από τις μεταγραφικές επαγωγέα στη διαδικασία της μεταβάσεως επιθηλίου-μεσεγχύματος (ΕΜΤ) στον καρκίνο επιθηλιακής προέλευσης, όπως ο καρκίνος του μαστού, ο καρκίνος του πνεύμονα, οισοφαγικό καρκίνωμα πλακώδους κυττάρου, γαστρικό καρκίνωμα, παγκρεατικό καρκίνο, καρκίνο του τραχήλου της μήτρας, του καρκίνου του ενδομητρίου και του προστάτη καρκίνος [23], [27] – [31]. Ειδικά στην EOC, Chen et al. [32] ανέφερε ότι προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης ZEB1 με ένα φορέα έκφρασης που βασίζεται σε μικρές φουρκέτα RNA (shRNA) με στόχο ZEB1 (shZEB1) σε κύτταρα ΕΓΚ SKOV3 θα μπορούσε να αναστείλει EMT των κυττάρων shZEB1-SKOV3 και μπλοκ shZEB1-SKOV3 μετάσταση κυττάρων in vivo, γεγονός που υποδηλώνει το ρόλο της στην ενίσχυση της ΕΜΤ στα κύτταρα EOC. Παρατήρησαν επίσης ότι η shRNA μεσολάβηση κάτω ρύθμιση ZEB1 σε κύτταρα SKOV3 θα μπορούσε να μειωθεί σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου στους ποντικούς ξενομοσχεύματος. Τα δεδομένα μας εδώ έδειξε την αλλοίωση του miR-150 στα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών οδήγησε στην αντίθετη αλλαγή του ZEB1, τονίζοντας αρνητικά ρύθμισή τους.